KR101559888B1

KR101559888B1 - 발효마늘추출물을 유효성분으로 포함하는 간 기능 개선용 조성물

Info

Publication number: KR101559888B1
Application number: KR1020140032638A
Authority: KR
Inventors: 이승현; 이성진; 최지휘; 유희종; 김기호; 이희섭; 조홍연
Original assignee: 주식회사 바이오랜드
Priority date: 2014-03-20
Filing date: 2014-03-20
Publication date: 2015-10-15
Also published as: KR20150111384A

Abstract

본 발명은 발효마늘추출물을 유효성분으로 함유하는 간 기능 개선용 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 따르면, 발효와 효소분해 단계가 적용된 발효마늘추출물의 경우, 단독 마늘추출물 또는 발효만 적용된 발효마늘추출물보다 더 높은 사이클로알리인(cycloalliin)의 함량을 나타낼 뿐만 아니라 알코올성 지방간 개선 효과도 있다.

Description

발효마늘추출물을 유효성분으로 포함하는 간 기능 개선용 조성물{Composition for improving hepatoprotective activity comprising fermented garlic extracts}

본 발명은 발효마늘추출물을 유효성분으로 포함하는 간 기능 개선용 조성물에 관한 것으로, 더욱 구체적으로 마늘추출물을 유산균으로 발효시킨 후 섬유소분해효소로 분해시킨 발효마늘추출물을 유효성분으로 포함하는 간 기능 개선용 조성물에 관한 것이다.

간은 인체에서 가장 중요한 장기 중의 하나로 외부에서 유입되는 독성물질을 해독시키는 중요한 역할을 담당하고 있다. 사회적인 문제로 대두 되는 만성적인 알코올의 섭취는 간세포에 산화 스트레스에 의한 독성을 유발한다. 간에서 알코올의 대사 과정 중에 유도되는 cytochrome P450 2E1(CYP2E1)은 활성산소를 생성하여 산화 스트레스를 야기하고, 지질과산화, 미토콘드리아 기능저하, DNA 손상을 일으킨다. 이러한 간질환은 한국인에 있어서 암, 당뇨병과 함께 가장 발생빈도가 높은 것으로 조사되고 있다.

우리나라의 경우 20세 이상 성인 남자의 음주율은 83.3%로 매우 높고 여성의 음주율 또한 54.9%로 급격히 증가하는 추세에 있으며, 잘못된 음주문화로 인하여 과음에 심각하게 노출되어 있다. 알코올의 과다 섭취로 인한 폐해는 간질환을 비롯하여 각종 질환의 병인이 됨은 물론 개인, 가정, 사회의 정서와 생활에 부정적인 영향을 미침으로써 국가적으로 막대한 경제, 사회적 손실을 야기하고 있다.

마늘은 다량의 유기황화합물을 함유하는 대표적인 천연물이다. 마늘의 유기황화합물은 활성산소 소거능과 세포내 항산화효소의 활성을 증가시킴으로써 뛰어난 항산화활성을 나타낸다(Environ Mol Mutagen 50;247-265, 2009). 이에 알코올성 지방간 동물모델을 이용하여 혈청효소분석 및 조직학적 분석을 통해 발효마늘추출물의 간보호 효능을 확인하고자 하였다. 이에 따라 알코올성 지방간을 유발시킨 마우스에 발효마늘추출물을 경구투여하고 식이에 따른 체중변화 확인 및 채혈을 통하여 혈청 내의 GPT(glutamate-pyruvate transminase), GOT(glutamate-oxaloacetlate transminase), AP(alkaline phosphatase), g-GT(gamma-glutamyl phosphatase), TBIL(total bilirubin), DBIL(direct-bilirubin)등 6가지의 혈액수치를 측정함으로써 간 보호 효과를 확인하고자 하였으며 간 조직 적출을 통하여 글루타치온 함량측정을 통한 항산화효과 확인과 지방간 생성 여부 등의 조직학적 분석을 수행하였다.

한국 등록특허 제 10-0479736호는 천연 식물체 유래의 혼합분말 또는 추출물을 포함하는 지방간 예방용 식품에 관한 것으로, 상기 천연 식물체의 혼합분말 중 일성분으로 마늘을 포함하고 이를 포함하는 식품의 경우 지방간 예방 및 개선에 효과가 기재되어 있으나 본원발명에서 기재하고 있는 발효마늘추출물과는 상이하며 발효마늘추출물이 마늘추출물보다 더 뛰어난 간 기능 개선 효과를 나타내는 것은 어디에도 기재되어 있지 않다. 또한, 한국 등록특허 제 10-1091833호는 유산균을 이용한 SAC 고함량 마늘 발효물의 제조방법에 관한 것으로, 마늘 추출물에 유산균을 접종한 마늘 추출물의 경우 SAC의 함량이 증가 되는 것을 기재하고 있으나 본원발명은 발효 후 효소분해처리를 한 발효마늘추출물의 간 기능 개선용도에 관한 것으로 상기 선행문헌에는 기재되어 있지 않다.

이에, 본 발명자들은 상기 종래기술들의 문제점들을 극복하기 위하여 예의 연구노력한 결과, 발효와 효소분해 단계가 적용된 발효마늘추출물의 경우, 단독 마늘추출물 또는 발효만 적용된 발효마늘추출물보다 더 높은 사이클로알리인(cycloalliin)의 함량을 나타낼 뿐만 아니라 알코올성 지방간 개선 효과가 있음을 확인하고, 본　발명을 완성하게 되었다.

(특허문헌 1) KR10-0479736 B

(특허문헌 2) KR10-1091833 B

따라서, 본 발명의 주된 목적은 단독 마늘추출물 또는 발효만 적용된 발효마늘추출물보다 더 높은 사이클로알리인(cycloalliin)의 함량을 나타낼 뿐만 아니라 알코올성 지방간 개선 효과를 갖는 발효마늘추출물을 유효성분으로 포함하는 간 기능 개선용 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 마늘추출물을 유산균으로 발효시킨 후 섬유분해효소로 분해시킨 발효마늘추출물을 유효성분으로 포함하는 간 기능 개선용 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 한 양태에 따르면, 본 발명은 발효마늘추출물을 유효성분으로 함유하는 간 기능 개선용 조성물을 제공한다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명에서 상기 발효마늘추출물은 마늘추출물을 유산균으로 발효시킨 후 섬유소분해효소로 분해시킨 것을 특징으로 하는 간 기능 개선용 조성물을 제공한다.

종래의 마늘추출물의 경우에는 일반적인 추출방법을 통해 추출한 마늘추출물을 다른 식물추출물과 혼합함으로써 간 기능을 개선하는 효과를 나타내고 있는 것이 일반적이다. 또한, 마늘추출물의 효과를 더 향상시키기 위해 유산균을 이용하여 마늘추출물을 발효시켜 마늘의 유효성분을 향상시킨 발효마늘추출물을 제공하고 있다. 그러나, 본원발명은 상기 발효마늘추출물과는 달리 마늘추출물을 유산균으로 발효시킨 후 섬유분해효소로 분해시키는 단계를 적용한 발효마늘추출물에 관한 것으로 마늘추출물 또는 유산균만 적용된 발효마늘추출물보다 간 기능 개선에 더 뛰어난 효과를 갖는 것을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 발효마늘추출물은 마늘을 100~120℃에서, 50~300rpm으로 교반하면서 3시간 동안 열처리한다. 열처리액에 락토바실러스 플란타럼 BL2(Lactobacillus plantarum BL2 KCCM11019P)의 종균배양액을 접종하여 37℃, 교반속도 10~100rpm, 24~48시간 배양하였다. 배양액을 90~100℃에서 살균한 후 셀룰라아제를 1~10%를 첨가하고, 바람직하게는 3~7%를 첨가하여 40~50℃, 교반속도 100~200rpm, 16~20시간 효소분해 하였다. 효소분해액을 실활하고 여과하여 고형분 60%까지 농축하여 제조하였다.

본 발명에 있어서. 상기 유산균은 페디오코코스 펜토사세우스 BLJH 102(Pediococcus pentosaceus BLJH102 KCCM11004P), 락토바실러스 플란타럼 BLJH 103(Lactobacillus plantarum BLJH103 KCCM11019P), 락토바실러스 루테리 (Lactobacillus reuteri KCCM 40717), 락토바실러스 카세이 (Lactobacillus casei KCCM 12452), 락토바실러스 퍼멘텀 (Lactobacillus fermentum KCCM 35469), 류코노스톡 멘센테리커스 (Leuconostoc mensentericus KCTC 3506), 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis), 사카로마이세스 세리비세 (Saccharomyces cerevisiase)로 발효할 수 있으며 바람직하게는 락토바실러스 플란타럼 BLJH 103(Lactobacillus plantarum BLJH103 KCCM11019P)인 것을 특징으로 한다.

본 발명의 실시예에 따르면, 상기 락토바실러스 플란타럼은 멸균된 Lactobacilli MRS 액체배지에 접종하여 종배양액을 제조 후 마늘추출물에 처리하여 발효시킨다.

본 발명에 있어서, 상기 섬유소분해효소는 셀룰라아제, 크실라아제, 펙티나아제로 분해할 수 있으며 바람직하게는 셀룰라아제인 것을 특징으로 한다.

본 발명에 있어서, 상기 발효마늘추출물은 사이클로알리인(cycloalliin)의 함량이 2.5~4.5mg/g인 것을 특징으로 한다. 사이클로알리인은 유기황화합물 중 하나로 중성지질의 합성 억제효과, 혈행개선 효과 등을 나타내는 물질이다. 따라서 이러한 사이클로알리인은 지질과 지단백의 대사에 관여하는 간에 영향을 미치지 않고 혈중 중성지질을 저해하고(Nutrition, 2003:19, 140-143) 산화활성(J Agric Food Chem, 2002: 50, 2488-2493)의 효능은 알콜성 지방간의 산화, 지방축적을 저해할 것으로 판단된다.

본 발명의 실험예에 따르면, 마늘추출물(비교예 1), 발효만 적용된 마늘추출물(실시예 1) 및 발효 및 효소분해가 적용된 발효마늘추출물(실시예 2)의 사이클로알리인의 함량을 분석한 결과, 마늘 추출물(비교예 1)에 비해 발효만 적용된 마늘추출물(실시예 1)은 11% 이상, 발효 및 효소분해가 적용된 발효마늘추출물(실시예 2)은 110% 이상 더 높은 사이클로알리인 함량을 갖는 것을 확인하였다. 이러한 결과로 볼 때, 약리 효과를 나타내는 사이클로알리인을 가장 많이 함유하고 있는 본 발명의 발효마늘추출물(실시예 2)이 마늘추출물(비교예 1) 또는 발효만 적용된 마늘추출물(실시예 1)보다 더 향상된 간 기능 개선효과를 나타낼 수 있음을 의미한다(실험예 1 참조).

본 발명에 있어서, 상기 발효마늘추출물은 g-GT(gamma-glutamyl phosphatase), GPT(glutamate-pyruvate transminase), GOT(glutamate-oxaloacetlate transminase), AP(alkaline phosphatase), TBIL(total bilirubin) 및 DBIL(direct-bilirubin)을 저하시키는 것을 특징으로 한다.

간질환에 사용되는 효소로는 g-GT, GPT, GOT, ALP 검사가 가장 많이 이용된다. 이들 효소 활성치의 증가는 세포장애 정도와 비교적 상관성이 좋을 뿐만 아니라 다른 혈중 유출 효소에 비하여 민감하게 변동한다. 또한, GPT와 GOT증가와 비율의 차이로 간질환의 진단뿐만 아니라 다른 질환과의 감별 등에 널리 이용되고 있다. g-GT의 경우 고도로 증가 되어 있다면 만성 담즙울체일 것이고 담도성 간경변증이나 경화성 담관염을 추정 진단할 수 있다. 경도의 증가인 경우에는 알코올, 과체중, 약물투여 등으로 볼 수 있다. AP는 간담도계 질환, 골질환 등에서 증가하며 특히, 간질환에서 고도의 증가를 보이게 된다. TBIL이 혈중에 증가하는 경우에는 간에서 담도로 배설이 되지 않는 폐쇄성 황달로 볼 수 있고, 비포합 빌리루빈이 증가하는 경우에는 간에서의 포합이 되지 않는 간실질성 질환을 의심할 수 있다. 이와 같은 여러 가지 항목들을 측정하여 종합적으로 판단함으로써 간 기능의 이상여부, 개선 여부를 확인할 수 있다.

본 발명의 실험예에 따르면, 혈액 생화학적 분석을 통해 간 기능 개선에 효과적인지 확인해 본 결과, 정상식이 군에 비해 알코올성 지방간 모델인 에탄올식이 군에서 g-GT, GPT, GOT, AP, TBIL 및 DBIL가 모두 증가하여 유도된 반면에 본 발명의 발효마늘추출물(실시예 2)의 경우, GOT, GPT 및 AP에서 개선되는 효과를 확인할 수 있으며 g-GT, TBIL 및 DBIL에서도 에탄올식이 군에 비해 개선되는 효과를 확인할 수 있다. 또한, 본 발명의 발효마늘추출물은 마늘추출물(비교예 1)에 비해 g-GT, GPT, GOT, AP, TBIL 및 DBIL를 더 개선하는 효과를 나타내었다. 이러한 결과로 볼 때, 본 발명의 발효마늘추출물은 간 기능 개선에 효과적이며 따라서 간 기능 개선용 조성물로서 적합하다는 것을 의미힌다(실험예 5 및 도 2 내지 7 참조).

본 발명에 있어서, 상기 발효마늘추출물은 알코올성 지방간을 억제하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 실험예에 따르면, 알코올성 지방간이 유도된 마우스 모델로부터 혈액 생화학적 분석 및 조직학적 분석을 통해 본 발명의 발효마늘추출물(실시예 2)이 알코올성 지방간을 억제 또는 개선 시키는 것을 확인하였다. 이러한 결과로 볼 때, 본 발명의 발효마늘추출물은 알코올성 지방간을 억제하는데 효과적이라는 것을 알 수 있다(실험예 5 및 6 참조).

본 발명에 있어서, 상기 조성물은 건강기능식품 조성물 또는 약학 조성물인 것을 특징으로 하는 한다.

본 발명에 있어서, 건강기능식품 또는 약학 조성물은 분말(podwer), 환제(pill), 과립제(granules), 캡슐제(capsule), 정제(tablet), 또는 음료(drink)중에서 선택된 어느 하나의 제형을 갖는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 발효마늘추출물을 유효성분으로 포함하는 간 기능 개선용 약학 조성물의 투여방법으로는 일반적으로 비강 내 또는 비경구 투여에 의해 전신적으로 또는 국소적으로 투여될 수 있다. 투여 경로는 경구, 경피, 정맥내, 구강내, 비강내, 시상하부내(Intrahypothalamic), 뇌실내(Intracerebrove-ntricular), 경막내(Intrathecal), 소장내, 직장내, 결장내, 혹은 안구내(Intraoc-ular) 투여가 가능하지만 이에 국한되지는 않는다.

본 발명에 따른 약학 조성물을 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제한다. 경구 투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 발효마늘추출물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(Calcium carbonate), 수크로스(Sucrose) 또는 락토오스(Lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제한다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크와 같은 윤활제도 사용된다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(Propylene glycol), 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 발효마늘추출물을 유효성분으로 포함하는 간 기능 개선용 약학 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나 바람직한 효과를 위해서 본 발명의 조성물은 1일 10 내지 3,000㎎/㎏으로, 바람직하게는 0.001 내지 100㎎/㎏으로 투여하는 것이 좋다. 외용투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고 수회 나누어 투여할 수도 있다. 그러나 상기한 투여량은 예시하기 위한 일예에 불과하며 상기 범위에 한정되진 않는다.

본 발명의 발효마늘추출물을 유효성분으로 포함하는 간 기능 개선용 건강기능식품 조성물에서 발효마늘추출물을 첨가할 수 있는 식품으로는 각종 식품류, 예를 들어 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강보조 식품류 등이 있으며, 환제, 분말, 과립, 침제, 정제, 캡슐 또는 음료인 형태로 사용할 수 있다.

이때 식품 또는 음료 중의 상기 발효마늘추출물의 양은 일반적으로 본 발명의 식품 조성물의 경우 전체 식품 중량의 0.0001 내지 20 중량%로 가할 수 있으며, 건강음료 조성물의 경우 100㎖을 기준으로 0.0001 내지 20 중량%를 가할 수 있다.

본 발명에서 정의되는 식품보조첨가제는 당업계에서 통상적으로 사용되는 식품첨가제, 예를 들어 향미제, 풍미제, 착색제, 충진제, 안정화제 등을 포함하며 하기에 예시한다.

본 발명의 식품 조성물이 음료 형태인 경우 지시된 비율로 상기 추출물을 필수 성분으로 함유하는 것 이외에 액체 성분에 대한 특별한 제한은 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예로는 포도당, 과당 등의 모노사카라이드와 말토스, 슈크로스 등의 디사카라이드 그리고 덱스트린, 시클로덱스트린 등의 폴리사카라이드 등 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알코올이 있다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어, 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 식품 조성물 100㎖당 일반적으로 약 1 내지 20g, 바람직하게는 약 5 내지 12g이다.

상기 외에 본 발명의 식품 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 본 발명의 식품 조성물들은 천연 과일쥬스 및 과일쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 첨가제의 비율은 그렇게 중요하지는 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부 당 0.01 내지 약 20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

이하, 본 발명을 보다 구체적으로 설명한다.

본 발명의 발효마늘추출물을 함유하는 식품첨가제에는 구연산, 후말산, 아디픽산, 젖산, 사과산 등의 유기산이나 인산나트륨, 인산칼륨, 산성피로인산염, 폴리인산염 (중합인산염) 등의 인산염이나 폴리페놀, 카테킨 (catechin), 알파-토코페롤, 로즈마리 추출물 (rosemary extract), 비타민 C, 녹차 추출물, 감초 추출물, 키토산, 탄닌산, 피틴산 등의 천연 항산화제 중 어느 하나 또는 하나 이상을 추가로 포함할 수 있다.

마찬가지로, 본 발명의 발효마늘추출물을 함유하는 식품첨가제는 유당 카제인, 덱스트린, 포도당, 설탕, 솔비톨 중 어느 하나 또는 하나 이상을 추가로 포함할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 발효마늘추출물을 함유하는 식품첨가제를 식품에 보존료, 살균제, 산화 방지제, 향신료, 조미료, 감미료, 착향료, 팽창제, 강화제, 개량제, 유화제, 여러 가지 영양제, 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색료, 발색제, 중진제(치즈, 초콜렛 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 소포제, 용제, 이형제, 방부제, 품질 개량제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등 또는 기타 식품제조용 첨가제 및 식품소재(부원료)의 필수원료로 사용하는 것을 특징으로 하는 식품첨가제의 이용방법을 제공한다. 이때 식품첨가제는 식품에 침지, 분무 또는 혼합하여 상기 식품에 첨가할 수 있으며, 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부 당 0.01 내지 약 90 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

본 발명에서 적용가능한 식품으로는 과일, 야채, 과일이나 야채의 건조제품이나 절단제품, 과일쥬스, 야채쥬스, 이들의 혼합쥬스이거나 칩류, 면류, 축산가공식품, 수산가공식품, 유가공식품, 발효유식품, 두류식품, 곡류식품, 미생물발효식품, 제과제빵, 양념류, 육가공류, 산성음료수, 감초류, 허브류 중 어느 하나 또는 하나 이상이고, 보다 구체적으로 껌, 캔디, 비스켓, 아이스크림, 초콜렛 중 어느 하나 또는 하나 이상이다.

이들을 각각 구체적으로 설명하면 하기와 같다.

껌 제조시, 본 발명의 식품첨가제 0.5 중량%, 껌베이스 25 중량%, 솔비톨 72 중량%를 60 내지 70 ℃로 예비 가열한 믹서에 넣어 혼합한 후, 믹서 내부 온도를 55 ℃로 유지시키면서 페퍼민트 향료를 2.5 중량% 첨가한 다음 30분 혼합한 다음 추출하여 압연하고, 24-48시간 숙성시킨 후 재단하고 포장하여 껌을 제조할 수 있다.

또한 제과제빵 제조과정에서 반죽할 때 첨가 사용하며, 소스, 양념장에도 첨가 사용하고, 또한 발효유 또는 요구르트 등에 분말이나 액상을 첨가하여 기능성 또는 기호성 식품으로 사용할 수 있다. 발효마늘추출물을 김치, 젓갈, 야채 가공에 직접 투입하여 맛 보존성, 항산화, 변색 방지의 목적으로 사용할 수도 있다. 육가공에서 햄, 소세지 등에 침지 또는 분무 살포하여 사용하며, 분말 또는 과립 형태의 본 발명에 따른 식품첨가제를 마늘, 파, 생강, 허브(herb), 감초 등을 섞어 향신료를 만들어 사용할 수 있고, 수산가공식품인 어묵, 생선, 조미어포, 젓갈 등에도 침지, 분무 및 첨가 방법으로 사용하며, 김치, 단무지, 깍두기, 야채 절임 등에도 침지, 분무 및 첨가할 수 있다.

이상 설명한 바와 같이, 본 발명의 발효마늘추출물의 경우 알코올성 지방간에 대한 간 기능 보호 활성을 나타냄으로 알코올성 지방간의 억제 또는 개선을 위한 건강기능식품 또는 의약 조성물에서 다양하게 이용될 수 있다.

도 1은 실험종료 후 체중대비 간 무게의 비율에 대한 도표이다.
도 2는 g-GT(gamma-glutamyl phosphatase)를 분석한 도표이다.
도 3은 GPT(glutamate-pyruvate transminase)를 분석한 도표이다.
도 4는 GOT(glutamate-oxaloacetlate transminase)를 분석한 도표이다.
도 5는 AP(alkaline phosphatase)를 분석한 도표이다.
도 6은 TBIL(total bilirubin)를 분석한 도표이다.
도 7은 DBIL(direct-bilirubin)을 분석한 도표이다.
도 8은 간 조직을 분석한 도표이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.

비교예 1 : 마늘추출물

경남가월영농조합법인으로부터 구입한 깐마늘 10kg과 상수 20kg을 가하고 온도 100 ~ 110℃, 교반속도 100 ~ 200rpm, 3시간 추출하였다. 추출액을 여과한 후 고형분 60%까지 농축하여 농축액 2.6kg을 얻었다.

실시예 1 : 발효만 적용된 마늘추출물

멸균된 Lactobacilli MRS 액체배지 600g에 Lactobacillus plantarum 균주(KCCM11019P)를 접종하여 온도 37℃, 24시간 정치 배양하여 종배양액을 제조하였다.

Lactobacillus plantarum 균주는 숙성한 김치에서 분리하여 10% 마늘멸균액에 접종한 후 37℃에서, 1일간 배양하여, 1.0 × 10⁸ CFU/mL 이상의 생균력을 보이는 균주를 MRS 한천 배지에 접종하여 37℃, 2일 배양 후, 단일 콜로니를 확보하고 이를 (사)한국종균협회에 균주동정분석을 의뢰하여 생화학적 패턴으로 균체를 동정하는 방법인 API 분석을 통해 Lactobacillus plantarum과 99.9%의 유사성이 있음을 확인하였다. 상기균주를 (사)한국종균협회에 국제특허균주로서 기탁하였으며 균주번호는 Lactobacillus plantarum KCCM11019P로 부여받았다. 발효조에 깐마늘 10kg과 상수 20kg을 가하고 온도 100 ~ 110℃, 교반속도 100 ~ 200rpm, 3시간 멸균 하였다. 열처리된 마늘추출액에 종배양액을 접종하여 온도 37℃, 교반속도 10 ~ 100rpm, 24시간 배양하였다. 배양액을 온도 90 ~ 100℃에서 1시간 살균하고 여과하였다. 여과액을 고형분 60%까지 농축하여 발효마늘추출물 3.1kg을 제조하였다.

실시예 2 : 발효와 효소분해가 순차적으로 적용된 마늘추출물

멸균된 Lactobacilli MRS 액체배지 600g에 Lactobacillus plantarum 균주(KCCM11019P)를 접종하여 온도 37℃, 24시간 정치 배양하여 종배양액을 제조하였다. 발효조에 깐마늘 10kg과 상수 20kg을 가하고 온도 100 ~ 110℃, 교반속도 100 ~ 200rpm, 3 시간 멸균하였다. 열처리된 마늘추출액에 종배양액을 접종하여 온도 37℃, 교반속도 10 ~ 100rpm, 24시간 배양하였다. 배양액을 온도 90 ~ 100℃에서 1시간 살균하고, 온도를 40 ~ 50℃까지 냉각 후 셀룰라아제를 50g 가하여 온도 40 ~ 50℃, 교반속도 100 ~ 200rpm, 24시간 효소분해 하였다. 효소분해액을 90℃ 30분 가열하여 효소를 실활하고 여과하였다. 여과액을 고형분 60%까지 농축하여 발효마늘추출물 4.2kg을 제조하였다.

시험예 1 : 고성능액체크로마토그래피를 이용한 추출물의 cycloalliin 분석

상기 비교예 1과 실시예 1, 2에서 제조한 마늘추출물에 함유된 cycloalliin 성분의 함량을 측정하기 위해, 고성능액체크로마토그래피(Ultra Performance Liquid Chromatography, UPLC, Waters)를 이용하였다. 사이클로알리인의 함량 측정을 위한 실험과정은 하기에 자세히 나타내었다.

먼저, 비교예 1, 실시예 1 및 실시예 2를 각각 1g을 50㎖의 매스플라스크에 정량하여 넣은 후, 메탄올로 용해하였다. 상기용해액을 0.45㎛ filter로 여과하여 분석 시 사용하였다. 표준액으로는 cycloalliin hydrochloride monohydrate(wako 035-21151, Tokyo, Japan)를 각각 1㎎/㎖의 농도로 메탄올에 녹여 스톡(stock) 용액으로 하여 200, 100, 20 ㎍/㎖의 검액을 제조하여 검량선용 표준용액으로 사용하여 검량선을 작성하였다. 그 외에 분석조건은 다음 표 1에 나타내었으며 그 결과는 하기 표 2에 나타내었다.

항 목	조 건
기기	Waters HPLC Alliance
검출기 파장	210nm
시료주입량	20uL
컬럼온도	30℃
이동상	A : 0.2% phosphoric acid, B : 100% Acetonitrile
유량	1.0ml/분
칼럼	TSKgel amide-80 (4.5 x 250mm, 5um) 또는 이와 동등한 것

	cycloalliin (mg/g)
비교예 1	1.8
실시예 1	2.0
실시예 2	3.9

그 결과, 상기 표 2에 나타나는 바와 같이 마늘추출물의 cycloalliin의 함량은 1.8㎎/g이고 유산균발효만 적용했을 경우 2.0㎎/g, 유산균발효와 효소분해를 순차적으로 적용했을 경우 사이클로알리인의 함량이 3.9mg/g으로 약 210%의 함량이 증가하였다.

시험예 2 : 실험동물

본 실험에 이용한 마우스는 7주령의 20-22g인 C57BL/6J계 수컷으로 대한바이오링크(DBL. Co. Ltd., Eumseong, Korea)에서 공급받았다. 동물 입수 후 온도 21-24℃, 상대습도 50-70%, 12시간마다 낮과 밤이 반복되도록 빛을 조절하여 일주일 간 순화시켰다. 순화기간 동안 일반 식이를 공급하였으며 멸균수를 자유롭게 섭취하도록 하였다. 본 시험은 고려대학교 동물실험윤리규정을 준수하여 실시하였다.

시험예 3 : 시험물질 조제 및 투여방법

유도식이는 알코올성 지방간을 유도하기 위해 Leiber-Decarli 액상식이(Dyets Inc., PA, USA)를 구입하여 실험에 사용하였다. 유도식이의 조제는 투여 직전에 실시하였다. 투여경로는 자유로이 섭취할 수 있게 특수 제작된 feeding tube(Dyets Inc., PA, USA)를 사용하였다. 정상식이 대조군을 제외한 모든 실험군에서 고체 식이를 배제하고 액상식이만을 공급하였으며, 에탄올 식이에 대한 거부감을 줄이기 위해 최초 0.5% 농도부터 2일 단위로 0.5%씩 증량시켜 최종적으로 5% 농도까지 상승시키는 적응기간을 두었다. 식이는 매일 잔량을 체크 후 교체하였다. 시험물질은 칭량한 후 증류수에 희석하여 조제하였다. 시험물질의 조제는 투여직전에 실시하였다. 투여경로는 경구투여를 선택하였다. 투여방법은 동물을 경배부 피부 고정법으로 고정하고 경구 투여용 존데를 이용하여 위 내에 직접 주입하였다. 경구투여량은 하기 표 3에 나타낸 바와 같이 마늘추출물(비교예 1), 발효마늘추출물(실시예 2)을 200mg/kg으로 투여하였고, 양성대조군으로 실리마린을 200mg/kg으로 비교하였다. 시료의 투여는 액상식이 공급일과 동시에 시작하였으며, 시료 모두 1일 1회 투여로 적응기간 포함 총 8주간 투여하였다.

그룹	개체수	식이	투여량
정상식이	1-5	정상식이 + 증류수	1회/일
에탄올식이	6-15	에탄올식이	1회/일
마늘추출물(비교예1)	16-25	에탄올식이 + 200 mg/kg	1회/일
발효마늘추출물(실시예 2)	26-35	에탄올식이 + 200 mg/kg	1회/일
실리마린	36-45	에탄올식이 + 200 mg/kg	1회/일

시험예 4 : 체중당 간 무게의 비율

모든 동물에 대하여 1일 1회 증상관찰을 실시하였다. 체중은 매주 1회 일정한 시간에 동물용 체중계를 이용하여 측정하였다. 그리고, 최종 부검 전 체중을 측정하고, 간조직을 적출하여 체중 대비 간조직의 비율을 측정하였다.

그 결과 도 1에서와 같이 시험기간 동안 체중은 전체적으로 상승하였으나 일반식이군에 비해서 상승폭은 둔화 되었으며 나머지 대조식이 및 에탄올 식이군 사이의 유의차는 나타나지 않았다. 적출된 간 무게를 측정한 결과, 에탄올 식이군의 경우 무게가 유의적으로 증가해 있었으며, 마늘추출물은 정상식이군에 비해 약 5% 증가하였고, 발효마늘추출물의 식이군은 에탄올식이에 비해 약 8%, 정상식이군에 비해서도 약 1% 감소하였다. 지방간을 유도하는 에탄올식이인 Lieber-Decarli 액상식이에 지방간 유발이 되었으며 발효마늘추출물의 경구투여에 의하여 에탄올 식이로 유발된 지방간 증상을 완화시킬 수 있는 것이다. 도 1에서 마늘추출은 비교예 1, 발효마늘추출물은 실시예 2에서 추출한 추출물이다.

시험예 5 : 혈액 생화학적 분석결과

시험이 종료된 후 채혈된 혈액을 상온에 30분 정치시킨 후 6000rpm 으로 10분간 원심분리하여 혈청을 분리한 다음 혈청효소를 혈청자동분석기(Dri-chem 2000, Fujifilm, Tokyo, Japan)를 이용하여 분석하였다. 혈청효소의 종류는 GPT, GOT, AP, g-GT, TBIL 및 DBIL로 총 6가지를 측정하였다. 알코올성 지방간 모델에서 발효마늘추출물의 간 보호효과는 도 2 내지 7과 같다. 혈액학적 지표의 분석결과, 알코올성 지방간 모델에서 유의적으로 유도된 마커는 GPT, GOT, AP, TBIL 및 DBIL이 유도되는 것으로 확인되었다. GOT/GPT의 비율은 과량의 알콜섭취의 경우 약 1이고 알코올성 질환을 야기할 때 1 이상인 것을 통계적으로 확인하였다(Alcohol Alcohol 39;336-336, 2004). 본 실험에서의 GOT/GPT의 비율이 1.5 ~ 1.7로 알콜성 지방간의 손상을 확인할 수 있었다. GOT의 경우 에탄올 투여군에 23.3% 억제되었고, AP의 경우 에탄올 투여군에 비해 34.7% 개선되었다. 혈청효소의 억제효능으로 보아 지방간 축적 및 지방성 염증으로 인한 간세포의 손상을 시료를 투여한 군에서 유의적으로 회복시켜 주었다. 또한, AP 수치는 간세포의 손상/회복 사이클이 올라갈수록 상승하는 수치로 GPT 억제를 뒷받침하는 지표로써, 발효마늘추출물을 투여한 군에서 효과적인 억제능을 보였으며 이는 시료들의 GOT나 bilirubin 수치 억제 활성을 뒷받침하는 지표가 된다고 할 수 있다. 또한, 발효마늘추출물이 TBIL 및 DBIL 수치를 유의적으로 억제하는 것을 확인할 수 있었다. TBIL이 혈중에 증가하는 경우는 간에서 담도로 배설이 되지 않는 폐쇄성 황달로 볼 수 있고, DBIL이 증가하는 경우에는 간에서 포함이 되지 않는 간질성 질환일 가능성이 있다. 모든 지표들이 발효마늘추출물에서 마늘추출물에 비해 10 ~ 40% 더 개선되는 것을 확인하였다. 도 2 내지 7에서 마늘추출은 비교예 1, 발효마늘추출물은 실시예 2에서 추출한 추출물이다.

시험예 6 : 조직학적 분석결과

간 조직을 적출하여 좌엽과 우엽으로 절취하고, 좌엽은 조직학적 분석을 위하여 고정하였다. 고정된 좌엽은 H&E staining 후 조직 내 지방 축적 및 지방성 염증, 담관계 이상 유무를 판독하였다. 우엽은 균질화하여, 조직 내의 산화환원 기능에 관여하는 환원형 글루타치온(GSH)과 산화형 글루타치온(GSSG)의 함량을 측정하여 시료의 항산화능을 확인하였다.

조직학적 분석 결과, 도 8에서와 같이 대조식이군에 비해 알코올 식이군의 간 조직내에서 lipid droplet이 많이 축적되어 있는 것을 관찰할 수 있었으며, 지방성 염증의 형태로 보이는 neutorophil 또한 peripheral 영역에서 관찰할 수 있었다. 유산균발효마늘추출물을 투여한 군에서 저농도부터 농도 의존적으로 지방간이 억제되어 있는 것을 관찰할 수 있었다. 또한, 대조식이 군에 비해 알코올 식이 군의 간 조직내의 total GSH 및 GSSG의 함량이 저하되어 있는 것을 관찰할 수 있었으며, 발효마늘추출물을 투여한 군에서 GSH의 함량이 회복되는 것을 관찰할 수 있었다(표 4). GSSG/total GSH의 비율은 간조직 세포내 산환환원반응에 따른 해독작용의 지표이다. GSSG/total GSH의 비율은 양성대조군인 실리마린은 에탄올 투여군과 유의적인 차이가 없었고, 발효마늘추출물을 투여한 군에서 유의족으로 감소하였다. 발효마늘추출물이 생체 내에서 산화환원반응에 중요한 역할을 하는 GSSG의 양을 줄이고 GSH의 양을 증가시켜서 항산화력을 증진시키는 것을 확인할 수 있었다.

그룹	Total GSH	Reduced GSH	GSSG/Total GSH
정상식이	4.603 ± 0.7028	3.804 ± 0.5667	0.1730 ± 0.0097
에탄올식이	4.066 ± 0.2448	3.223 ± 0.2307	0.2077 ± 0.0134
마늘추출물	4.375 ± 0.4068	3.548 ± 0.4250	0.1948 ± 0.0317
발효마늘추출물	4.558 ± 0.2646	3.778 ± 0.2789	0.1718 ± 0.0173
실리마린	3.947 ± 0.6563	3.165 ± 0.6253	0.2017 ± 0.0313

Claims

마늘추출물을 유산균으로 발효시킨 후 섬유소분해효소로 분해시킨 발효마늘 추출물을 유효성분으로 함유하는 알코올성 지방간 개선용 조성물.
삭제
제 1항에 있어서, 상기 유산균은 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum)인 것을 특징으로 하는 알코올성 지방간 개선용 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 섬유소분해효소는 셀룰라아제인 것을 특징으로 하는 알코올성 지방간 개선용 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 발효마늘추출물은 사이클로알리인(cycloalliin)의 함량이 2.5~4.5mg/g인 것을 특징으로 하는 알코올성 지방간 개선용 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 발효마늘추출물은 g-GT(gamma-glutamyl phosphatase), GPT(glutamate-pyruvate transminase), GOT(glutamate-oxaloacetlate transminase), AP(alkaline phosphatase), TBIL(total bilirubin) 및 DBIL(direct-bilirubin)을 저하시키는 것을 특징으로 하는 알코올성 지방간 개선용 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 발효마늘추출물은 알코올성 지방간을 억제하는 것을 특징으로 하는 알코올성 지방간 개선용 조성물.
제 1항, 제 3항 내지 제 7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 건강기능식품 조성물 또는 약학 조성물인 것을 특징으로 하는 알코올성 지방간 개선용 조성물.
제 8항에 있어서, 상기 건강기능식품은 분말(podwer), 환제(pill), 과립제(granules), 캡슐제(capsule), 정제(tablet), 또는 음료(drink)중에서 선택된 어느 하나의 제형을 갖는 것을 특징으로 하는 알코올성 지방간 개선용 조성물.