KR101468830B1 - 식물 세포벽의 반응성을 변경하는 방법 - Google Patents

식물 세포벽의 반응성을 변경하는 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명에서는, 특히 식물 세포벽이 섬유 생산 식물의 천연 섬유에서 발견될 수 있으므로, 상기 세포벽 내로 양으로 하전된 올리고사카라이드 또는 폴리사카라이드를 포함시킴으로써 식물 세포벽의 반응성을 개질시키는 방법 및 수단을 제공한다. 이는 N-아세틸글루코스아민 트랜스퍼라제, 특히 식물 세포 중의 골지체 막에 표적화될 수 있는 N-아세틸글루코스아민 트랜스퍼라제를 암호화하는 키메틱 유전자를 발현시킴으로써 편리하게 성취될 수 있다.

Description

식물 세포벽의 반응성을 변경하는 방법{METHODS FOR ALTERING THE REACTIVITY OF PLANT CELL WALLS}
본 발명은 식물 세포벽, 특히 섬유 생산 식물의 천연 섬유에서 발견될 수 있는 2 차 식물 세포벽을 포함한 상기 식물 세포벽의 반응성의 개질에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 변경된 반응성을 갖는 면 섬유에 관한 것이다. 상기 개질된 반응성을, 식물 유래된 물질, 예를 들어 천연 섬유를 함유하는 세포벽을 섬유 반응성 염료를 사용하여 염색하는 방법에 적용하여, 예를 들어 염색 견뢰도(colorfastness)를 개선시키거나 상기 염색 과정 동안 사용된 폐수의 부피를 감소시킬 수 있다. 상기 개질된 반응성을 또한 상기 천연 섬유와 반응물, 예를 들어 난연제, 물, 발유제 및 방오제, 구김 방지제, 유연제, 정전기 방지제, 형광 증백제 등과의 반응성을 개선시키는데 사용할 수 있다.
식물로부터의 셀룰로스 함유 천연 섬유를 포함한 천연 섬유, 예를 들어 면 및 리넨은 5000년이 넘게 인류가 사용해 왔다. 그러나, 천연 셀룰로스 함유 섬유는 β-1-4 결합된 글루코스 단량체들로 이루어진 셀룰로스의 비교적 불활성인 성질로 인해 합성 섬유의 화학적 다면성을 갖지 못한다.
이러한 비교적 불활성인 성질은 예를 들어 면섬유 및 직물의 염색 과정에서 곧 알 수 있다. 일반적으로 2 가지 유형의 염료, 즉 직접 염료 및 섬유 반응성 염료(둘 다 음이온성 분자이다)가 면의 착색에 사용된다. 면 자체는 수중에서 음이온 전하를 나타내며, 따라서 특수 처리 없이는 상기 섬유 또는 직물에 의한 염료의 흡수가 매우 어렵다.
직접 염료는 상기 셀룰로스 중합체와 비교적 약한 수소 결합을 생성시켜 반 영구적인 부착을 형성한다. 직접 염료는 섬유 반응성 염료보다 사용이 더 용이하고 덜 비싸지만, 충분한 세척에 견디지 못한다. 섬유 반응성 염료는 하이드록실 그룹과의 반응을 통해 섬유와 강한 공유 결합을 형성하는 반응성 그룹과 발색단을 겸비하는 분자이다. 상기 공유 결합은 상기 염색된 섬유를 세탁에 잘 견디게 한다. 염색 견뢰도는 양이온 고정제를 사용하여 개선시킬 수 있다.
상기 염색 과정 동안, 상기 음이온 염료를 상기 음이온 섬유 전하로부터 차폐하기 위해서는 다량의 전해질이 필요하다. 반응하지 않은 염료(40% 이하)는 정련으로서 공지된 세척 단계에 의해 제거할 필요가 있는데, 이는 상기 언급한 전해질을 또한 함유하는 다량의 폐수를 발생시킨다.
따라서, 상기 셀룰로스 섬유에, 예를 들어 양으로 하전된 화학 화합물을 통합시켜 양 전하를 제공하는 것은 천연 셀룰로스 섬유의 염색성을 개선시킬 뿐만 아니라, 상기 개질된 셀룰로스 섬유와 음으로 하전된 화학 화합물과의 임의의 화학 반응을 개선시킬 수 있다. 산성 염료의 사용을 또한 가능하게 할 것이다.
여러 공보들에는 키토산 올리고머를 셀룰로스 섬유에 통합시키거나 또는 코팅시켜 키토산/셀룰로스 블렌드, 얀 또는 직물을 제조함이 개시되어 있다. 키토산은 예를 들어 알칼리 처리에 의한 키틴의 탈아세틸화에 의해 수득될 수 있는 글루코스아민의 양으로 하전된 중합체이다. 키틴 자체는 β-1-4 결합된 N-아세틸글루코스아민(GlcNAc)의 중합체이다.
미국 특허 출원 US2003/0134120에는 천연 섬유를 키토산으로 코팅함이 개시되어 있다.
문헌[Liu et al. Carbohydrate Polymers 44(2003) 233-238]에는 면사를 수중 60 ℃에서 칼륨 퍼요오데이트로 산화시키고 후속적으로 수성 아세트산 중의 키토산 용액으로 처리함으로써 면 섬유를 키토산으로 코팅하는 방법이 개시되어 있다. 상기 키토산 코팅을 사용하면, 상기 면 섬유 표면이 생리학적으로 및 생물학적으로 활성이 된다. 아미노 그룹의 화학 반응성은 셀룰로스 단량체의 하이드록실 그룹보다 더 크므로, 상기 섬유는 추가적인 화학적 개질의 가능성을 더 갖는다. 더욱이, 상기 면 섬유의 매끄러운 표면이 거칠어지는데, 이는 약물 흡수 및 그의 조절된 방출의 가능성이 더 큼을 암시한다.
예를 들어 피부 사상균을 억제함에 있어서 키토산의 생리학적 기능을 근거로, 다수의 기능성 의복, 직물 및 섬유들은 셀룰로스-키토산 블렌드 섬유, 셀룰로스 섬유-키토산 콘쥬게이트, 및 키토산 함유 수지로 코팅된 직물을 사용한다.
WO 00/09729는 세포벽을 산업적인 용도로 변경시키기 위해 식물에서 키틴 신타제 및 키틴 데아세틸라제 유전자를 발현시키며, 질병 내성이 개선됨을 개시하고 있다. 구체적으로 인용된 용도는 하기와 같다: 셀룰로스, 키틴 및 키토산의 단일 식물 공급원을 제공하고, 인장 강도를 증가시키고, 취성 스냅을 증가시킨다. 구체적으로 제시된 키틴 신타제 유전자는 진균 유기체로부터 유래한다. 식물 중의 키틴 또는 키토산의 생산에 대한 실험 데이터도, 식물 세포벽 중의 그의 통합에 대한 데이터도 제공되어 있지 않다.
따라서 종래 기술은 양으로 하전된 화학 그룹 및/또는 셀룰로스의 하이드록실 그룹보다 더 반응성인 화학 그룹을 함유하는 식물 세포벽, 특히 2 차 세포벽, 예를 들어 천연 섬유가 단리될 수 있는 식물을 획득하는 방법을 제공함에 있어서 여전히 불충분하다. 종래 기술은 또한 식물로부터 직접 수확할 수 있고, 양으로 하전된 화학 그룹 및/또는 셀룰로스의 하이드록실 그룹보다 더 반응성인 그룹을 함유하며, 상기와 같은 화학 그룹을 도입시키기 위해 추가로 화학 처리할 필요 없이 직접 사용할 수 있는 섬유를 제공함에 있어서 여전히 불충분하다. 상기 및 다른 문제들을 이후에 상이한 실시태양, 실시예 및 청구의 범위에 개시하는 바와 같이 해결한다.
발명의 요약
간단히, 하나의 실시태양에서, 본 발명은 식물 세포의 세포벽, 특히 2 차 세포벽 중에 양으로 하전된 올리고사카라이드 또는 폴리사카라이드의 양을 증가시키는 방법을 제공하며, 상기 방법은 키메릭 유전자를 상기 식물 세포에 도입시킴을 포함하고, 이때 상기 키메릭 유전자는 N-아세틸글루코스아민 트랜스퍼라제(바람직하게는 이때 상기 N-아세틸글루코스아민 트랜스퍼라제는 골지체 막에 표적화된다)를 암호화하는 DNA 부위에 작용적으로 결합된 식물 발현성 프로모터; 및 전사 종결 및 폴리아데닐화 부위를 포함한다. 특정한 실시태양에서, 상기 식물은 목화이며, 상기 양으로 하전된 올리고사카라이드 또는 폴리사카라이드는 면섬유를 구성하는 2 차 세포벽에 통합된다.
본 발명의 또 다른 실시태양에서, 식물 세포의 세포벽, 특히 2 차 세포벽 중에 양으로 하전된 올리고사카라이드 또는 폴리사카라이드의 양을 증가시키는 방법을 제공하며, 상기 방법은 키메릭 유전자를 상기 식물 세포에 도입시킴을 포함하며, 이때 상기 키메릭 유전자는 NODC 유형의 N-아세틸글루코스아민 트랜스퍼라제를 암호화하는 DNA 부위에 작용적으로 결합된 식물 발현성 프로모터; 및 전사 종결 및 폴리아데닐화 부위를 포함한다. 다시, 특정한 실시태양에서, 상기 식물은 목화이며, 상기 양으로 하전된 올리고사카라이드 또는 폴리사카라이드는 면섬유를 구성하는 2 차 세포벽에 통합된다.
본 발명의 더욱 또 다른 실시태양에서, 식물 세포의 세포벽, 특히 2 차 세포벽 중에 양으로 하전된 올리고사카라이드 또는 폴리사카라이드의 양을 증가시키는 방법을 제공하며, 상기 방법은
i. 키메릭 유전자를 상기 식물 세포에 도입시키고, 이때 상기 키메릭 유전자는 하기의 작용적으로 결합된 DNA 단편들을 포함하며:
1. 식물 발현성 프로모터;
2. 키틴 신타제를 암호화하는 DNA 부위; 및
3. 전사 종결 및 폴리아데닐화 부위;
ii. 상기 트랜스제닉 식물 세포에 유효량의 N-아세틸글루코스아민, 글루코스아민-6-포스페이트, N-아세틸글루코스아민-6-포스페이트, N-아세틸글루코스아민-1-포스페이트 또는 UDP-N-아세틸글루코스아민을 적용시킴
을 포함한다.
본 발명은 또한 증가된 양의 폴리사카라이드 또는 올리고사카라이드, 특히 양으로 하전된 올리고사카라이드, 예를 들어 올리고-N 아세틸글루코스아민 또는 올리고-글루코스아민, 바람직하게는 3 내지 10, 특히 3 내지 5의 중합도를 갖는 N-아세틸글루코스아민 또는 글루코스아민의 올리고머를 포함하는 식물 세포벽을 제공한다. 상기와 같은 식물 세포벽은 본 발명의 방법들에 의해 수득될 수 있다. 상기 식물 세포벽에 추가의 화학적 개질을 가할 수 있다.
특정한 실시태양에서, 본 발명은 본 발명에서 언급한 증가된 양의 양으로 하전된 올리고사카라이드를 포함하는 면 섬유, 및 상기와 같은 면 섬유를 포함하는 얀, 직물을 제공한다. 상기 면 섬유를 그 자체로 사용하거나 또는 상기 섬유에 추가적인 화학적 개질, 예를 들어 염색을 가할 수도 있다. 상기 면 섬유는 본 발명에 개시된 바와 같은 키메릭 N-아세틸글루코스아민 트랜스퍼라제 유전자를 함유하지 않는 동질 유전자 주의 목화로부터 수득한 면 섬유에 비해, 예를 들어 그의 콩고 레드를 포함한 음이온성 염료의 증가된 결합, 그의 맥아 아글루티닌의 증가된 결합 또는 그의 아민 반응성 염료와의 증가된 반응성을 통해 인지될 수 있다. 상기 면 섬유 중의 올리고사카라이드의 존재 및/또는 양을 또한 고성능 박층 크로마토그래피(HPTLC)를 통해 직접 측정할 수 있다.
또 다른 실시태양에서, 본 발명은 식물 세포의 세포벽 중에 양으로 하전된 올리고사카라이드의 양을 증가시키거나 또는 식물 세포벽의 화학적 개질을 위해 상기와 같은 식물 세포벽의 반응성을 증가시키기 위한, 상기 식물 세포의 골지체에 표적화 될 수 있는 N-아세틸글루코스아민 트랜스퍼라제를 암호화하는 DNA 부위의 용도에 관한 것이다.
본 발명은 또한 하기의 작용적으로 결합된 DNA 부위들을 포함하는 키메릭 유전자를 제공한다: 식물 발현성 프로모터; N-아세틸글루코스아민 트랜스퍼라제를 암호화하는 DNA 부위(상기 N-아세틸글루코스아민 트랜스퍼라제는 식물 세포에서 발현될 때 상기 식물 세포의 골지체에 표적화된다); 및 전사 종결 및 폴리아데닐화 부위. 상기 N-아세틸글루코스아민 트랜스퍼라제는 NODC 유형의 N-아세틸글루코스아민 트랜스퍼라제이거나, 또는 키틴 신타제, 특히 골지 정체 신호에 작용적으로 결합된 키틴 신타제일 수도 있다.
본 발명은 또한 의약 화합물의 조절된 방출; 폐수 정제에서 응집 장치(flocculent device)의 제조; 식품 산업에서 안정제로서 사용; 천공 시 냉각 유체로서의 사용; 위생 행위의 기능성 의복의 제조; 상처 치유용 천의 제조; 또는 종이의 제조를 위한 면 섬유를 제공한다.
본 발명은 식물 세포벽, 특히 섬유 생산 식물의 천연 섬유에서 발견될 수 있는 2 차 식물 세포벽을 포함한 상기 식물 세포벽의 반응성의 개질에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 식물 세포벽 내로 양으로 하전된 올리고사카라이드 또는 폴리사카라이드를 포함시킴으로써 식물 세포벽의 반응성을 개질시키는 방법 및 수단을 제공한다.
본 발명은 식물 세포에서 NODC 유형의 N-아세틸글루코스아민 트랜스퍼라제의 발현이 N-아세틸글루코스아민 올리고머의 식물 세포 벽 내로의 통합을 유도한다는 발견을 기본으로 한다. 상기 GlcNAc 올리고머는 뜻밖에도 세포벽과 매우 밀접하게 관련이 있었으며 다양한 처리에 의해서 상기 세포벽으로부터 용해되지 않았다. 놀랍게도, 상기 GlcNAc 올리고머의 합성은 다른 키틴 신타제의 경우 관찰된 바와 같은 GlcNAc의 생육 배지에의 외부 첨가를 요하지 않았다. 더욱 또한, 동시에 놀랍게도, 상기 NODC 단백질은 예상된 대로 세포막과의 관련 이외에 골지체 막과도 또한 밀접하게 관련되었다. 상기 NODC 유형의 N-아세틸글루코스아민 트랜스퍼라제가 목화에서 발현된 경우, 상기 GlcNAc 올리고머는 면 섬유에 통합되어 보다 반응성인 면 섬유를 생성시켰다.
따라서, 본 발명의 첫 번째 실시태양에서, 식물 세포의 세포벽, 특히 2 차 세포벽 중에 양으로 하전된 올리고사카라이드의 양을 증가시키는 방법을 제공하며, 이때 상기 방법은 키메릭 유전자를 상기 식물 세포에 도입시키는 단계를 포함하고, 상기 키메릭 유전자는 하기의 작용적으로 결합된 DNA 단편들을 포함한다:
- 식물 발현성 프로모터;
- NODC 유형의 N-아세틸글루코스아민 트랜스퍼라제를 암호화하는 DNA 부위; 및
- 전사 종결 및 폴리아데닐화 부위.
뿌리혹 착생 C 단백질("NODC 단백질") 및 그의 암호화 유전자는 리포키토올리고사카라이드 신호 또는 아세틸화된 키토올리고머(Nod 인자)의 합성에 관여하여 리조비아세아에와 콩과 식물 간 공생에 전형적인 뿌리혹을 형성시킨다.
이들 리포-키토-올리고사카라이드의 합성에 필요한 가장 중요한 nod 유전자 산물은 NODA, NODB 및 NODC이다. 다른 nod 유전자 산물의 부재 하에서, 상기는 N-결합된 아실 그룹을 수반하는 4 개 또는 5 개의 N-아세틸글루코스아민 잔기의 올리고머들로 이루어진 코어 신호를 형성할 수 있다. 상기 뿌리혹 착생 인자의 합성에서 상기 3 개 단백질 각각의 기능은 널리 공지되어 있다: NODC는 키토-올리고사카라이드 쇄를 생산하는 N-아세틸글루코스아미닐 트랜스퍼라제이고; 상기 키토-올리고사카라이드 쇄의 비 환원성 N-아세틸글루코스아민 잔기로부터의 N-아세틸 그룹은 NODB에 의해 제거되는데, 상기 NODB는 키틴 올리고사카라이드 데아세틸라제로서 작용하며; NODA는 NODB의 작용에 의해 생성되는 유리 아미노 그룹에의 아실 쇄의 부착에 관여한다. 다른 nod 유전자들에 의해 암호화되는 다른 Nod 인자들은 상이한 뿌리혹 착생 인자들을 구분하는 장식적인 화학 그룹들 중 임의의 것을 제공한다. 본 발명의 목적을 위해서, 단지 상기 NODC 단백질과 암호화 유전자들만이 관련성을 갖는다.
NODC 단백질은 잘 특성화된 단백질이다(고찰을 위해서 문헌[Kamst and Spaink, 1999, Trends in Glycoscience and Glycotechnology, 11, pp 187-199]을 참조하시오). 상기는 β-결합된 모노사카라이드 잔기를 함유하는 선형 폴리사카라이드의 합성에 관여하는 β-폴리사카라이드 신타제 단백질 족에 속한다. NODC와 구조적으로 가장 밀접하게 관련된 효소는 키틴(β-1-4 결합된 N-아세틸글루코스아민); 셀룰로스(β-1-4 결합된 글루코스 잔기의 중합체); 하이아루론산(N-아세틸글루코스아민 및 글루쿠론산의 공중합체) 및 지브라피시 배의 초기 발생 중에 생성되는 키틴 올리고사카라이드의 합성에 관련된 트랜스퍼라제이다. 이들 단백질 사이에 보존된 6 개의 짧은 부위들이 인지될 수 있다. NODC 단백질의 경우, 상기 짧은 서열들은 하기에 상응한다:
1) 서열식별번호 1의 23 번 위치의 K 잔기(아조리조븀 카우리노단스로부터의 NODC)
2) 서열식별번호 1의 86 내지 88 번 위치의 서열 DDG
3) 서열식별번호 1의 137 내지 141 번 위치의 서열 VDSDT
4) 서열식별번호 1의 207 내지 213 번 위치의 서열 GPCAMYR
5) 서열식별번호 1의 237 내지 242 번 위치의 서열 GEDRHL
6) 서열식별번호 1의 274 내지 278 번 위치의 서열 QQLRW
그러나, 일부 NODC 단백질 또는 그의 변체가 존재할 수도 있음을 아는 것이 중요하며, 이때 상기 언급한 공통 서열 중 하나 이상이 절대적으로 보존되는 것은 아니다.
NODC 단백질은 또한 흔히 막통과 영역을 나타내는 아미노산 잔기의 소수성 신장부를 특징으로 한다(Barney et al. 1996, Molecular Microbiology 19, pp 443-453). 상기 N-말단 소수성 영역은 Nout-Cin 배향으로 세균막에 걸쳐 있으며, 이때 상기 인접한 큰 친수성 영역은 세균 세포질에 노출되어 있다. 상기 배향은, 잠재적으로 3 개 막의 전장을 함유하는 C-말단 부근의 소수성 부위(들)의 존재에 따라 변하는 것으로 보이며, 따라서 상기 NODC의 C 말단은 통상적으로는 세균 원형질막 공간 중에 위치한다.
NODC의 큰 친수성 고리는 또한 다른 β-글루코실 트랜스퍼라제 중의 유사 부위에 대한 다른 구조 유사성을 갖는다. 상기 부위는 교번하는 β-시트와 α-나선으로 이루어진 A 영역(서열식별번호 4의 서열에서 약 45에서부터 140 잔기까지 연장되어 있다), 및 NOCD의 진행성(processivity)에 기여하는 것으로 생각되는 B 영역(서열식별번호 4의 잔기 215 내지 280에 상응함)으로 구성되는 것으로 제안되었다. 상기 A 영역에서, 2 개의 아스파테이트 잔기가 보존되어 있고(서열식별번호 4의 잔기 88 및 139); 상기 B 영역에는 하나의 아스파테이트 잔기 및 모티프 QXXRW(서열식별번호 4의 잔기 240 및 276-280)가 또한 보존되어 있으며, 촉매 활성에 중요한 것으로 생각된다.
상이한 NODC 단백질들을 서로 비교하는 경우, 보다 많이 보존된 아미노산 서열들이 밝혀졌다. 도 1a 및 1b는 서열식별번호 1, 2, 8, 4, 7, 5로부터의 상이한 NODC 단백질들의 배열을 나타내고, 하기를 포함한(순서대로) 상이한 NODC 단백질들 간의 다수의 보존된 잔기들을 가리킨다:
-서열 PXVDVIXPXXNE
-서열 VDDGSXN
-서열 GDXXLDVDSDTXXXXDV
-서열 GXXMGQ
-서열 DMEYWLACNEERXXQXRFGXVMXCXGXCXMYR
-서열 FRTXYXPXAXAXTXVP
-서열 YLXQQLRWARSTXRXTXL
-서열 QNXGXXLL
-서열 RFXFXXXHXXXNXXXLXPLKXYALXT
도 2a 및 2b는 상이한 NODC 단백질들의 부분집합의 배열을 나타내고, 하기와 같은 훨씬 더 많은 보존된 잔기들을 나타낸다:
-서열 WLTRLIDMEYWLACNEERXXQXRFGXVMCCCGPCAMYRRS
-서열 LLXXYEXQXFXGXPSXFGEDRHLTILMLXAGFRTXYVPXAXAXTXVP
-서열 YLRQQLRWARSTXRDTXLA
상이한 리조비아세아에에 의해 생산된 리포-키틴 올리고사카라이드에서 상기 올리고사카라이드 주쇄의 길이는 2 내지 6 개의 잔기로 다양하다. 상기 뿌리혹 착생 단백질 NODC는 키토-올리고사카라이드 쇄의 합성에서 키틴 올리고사카라이드 쇄 길이의 중요한 결정인자이다(Kamst et al., 1997, Journal of Bacteriology 179, p2103-2108).
상기 NODC 유형의 N-아세틸글루코스아민 트랜스퍼라제를 암호화하는 암호화 부위들을 리조븀 , 아조리조븀 , 브라디리조븀 , 메소리조븀 ( Mesorhizobium ), 랄스토니아( Ralstonia ), 쿠프리아비두스 ( Cupriavidus ), 스트렙토마이세스 ( Streptomyces ), 부르콜데리아( Burkholderia ) 또는 시노리조븀 ( Sinorhizobium ) 속에 속하는 세균으로부터 직접 수득할 수 있다. 그러나, 상기와 같은 암호화 부위들을 또한 심지어 식물, 특히 상기 NODC 유형 단백질을 과발현하는 키메릭 유전자가 도입되는 섬유 생산 식물에 적합한 코돈 용법을 사용하여 합성적으로 제조할 수 있다.
NODC 단백질에 대한 상이한 서열들을 하기의 수탁 번호로 나타내는 단백질 서열들과 같은 데이터베이스로부터 입수할 수 있다:
Figure 112013061315284-pat00001
전체 길이 NODC 단백질을 언급하는 UNIPROT 데이터베이스 중의 다른 엔트리들을 표 1에 요약한다. 수탁번호로 인용된 모든 언급된 아미노산 서열들은 본 발명에 참고로 인용된다.
Figure 112013061315284-pat00002
그러나, 하나 이상의 아미노산 잔기가 결실되거나, 치환되거나 삽입되었으며, 상기 언급한 아미노산 서열로부터 추론할 수 있는 NODC 단백질의 변체들을 또한, 효소 활성이 변하지 않은 한, 본 발명에 따른 방법들에 동일한 효과로 사용할 수 있다. 상기 변체 NODC 단백질은 본 발명에 언급된 NODC 단백질들 중 임의의 하나와 약 95%의 서열 동일성을 가질 수 있다. 생체 외에서 NODC 단백질의 효소 활성을 측정하는 방법이 예를 들어 문헌[Kamst et al., 1997 Journal of Bacteriology, 179, p2103-2108]에 개시되었다.
따라서, 본 발명에 사용된 바와 같이, "NODC 유형의 N-아세틸글루코스아민 트랜스퍼라제"는 UDP-GlcNAc로부터 GlcNAc 부분을 초기 키틴 올리고사카라이드로 전달하는 것을 촉진하는 N-아세틸글루코스아민 트랜스퍼라제이다. 바람직하게는 상기 단백질은 상이한 NODC 단백질들을 비교함으로써 발견할 수 있는 보존된 부위들을 함유한다.
본 발명의 방법에 특히 적합한 것은 서열식별번호 1 내지 서열식별번호 9에 실린 단백질, 특히 서열식별번호 1에 실린 단백질, 및 상기와 같은 단백질을 암호화하는 DNA 단편이다.
NODC 단백질은 식물 세포에서 발현 시 원형질막과 함께 국소화되는 것 이외에 골지체 막과도 함께 국소화된다. 식물 세포 벽 내로의 키토-올리고사카라이드의 통합에 도달하기 위해서, GlcNAc를 함께 공급할 필요는 없다. 그러나, 진균 기원의 키틴 신타제를 사용하는 경우, 상기 단백질은 골지체 막과 함께 국소화되지 않으며, 키토-올리고사카라이드를 세포벽 내로 현저히 통합시키기 위해서는 GlcNAc를 함께 공급하는 것이 필요하다. 본 발명을 특정한 작용 방식으로 제한하고자 하는 것은 아니지만, NODC 단백질의 막을 통과하여 걸쳐 있는 영역들은 상기 원형질막의 경우보다 골지체 막 내로 삽입하기가 더 용이할 수 있으며 이러한 단백질들의 위치는 GlcNac의 외부 공급 필요성을 면하게 하는 것으로 생각된다. 키틴 신타제를 골지체 막에 재배치하기 위해서 키틴 신타제 단백질, 예를 들어 진균 기원의 키틴 신타제, 예를 들어 뉴로스포라 크라사 키틴신타제를 개질시키는 것이면 상기 외부적인 GlcNAc 공급의 필요성을 없애기에 충분하다. 상기와 같은 재배치는 키틴 신타제 단백질을 신호 고정 펩타이드에 결합시켜 상기 결합된 단백질을 골지체 막에 표적화함으로써 성취되었다.
따라서, 본 발명의 또 다른 실시태양에서, 식물 세포의 세포벽, 특히 2 차 세포벽 중에 양으로 하전된 올리고사카라이드의 양을 증가시키는 방법을 제공하며, 이때 상기 방법은 키메릭 유전자를 상기 식물 세포에 도입시키는 단계를 포함하고, 상기 키메릭 유전자는
- 식물 발현성 프로모터;
- 골지체 막에 표적화되는 N-아세틸글루코스아민 트랜스퍼라제를 암호화하는 DNA 부위; 및
- 전사 종결 및 폴리아데닐화 부위
를 포함한다.
본 발명에 사용된 바와 같이, 상기 N-아세틸글루코스아민 트랜스퍼라제는 NODC 유형 단백질로 제한되지 않을 뿐만 아니라 키틴 신타제(키틴 UDP-아세틸-글루코스아미닐 트랜스퍼라제), 예를 들어 진균 기원의 키틴 신타제를 포함한다. 상기와 같은 키틴 신타제의 아미노산 서열의 예를 하기 식별자들(수탁 번호)을 갖는 아미노산 서열을 포함한 상이한 데이터베이스들에서 찾을 수 있다: 아젤로마이세스 카프술라타(히스토플라스마 카프술라툼)로부터의 CHS1_AJECA(P30576) 키틴 신타제 1(EC 2.4.1.16)(키틴-UDP 아세틸-글루코스아미닐 트랜스퍼라제 1)(I 부류 키틴 신타제 1); 아젤로마이세스 더마티티디스(블라스토마이세스 더마티티디스)로부터의 CHS1_AJEDE(P30579) 키틴 신타제 1(EC 2.4.1.16)(키틴-UDP 아세틸-글루코스아미닐 트랜스퍼라제 1)(I 부류 키틴 신타제 1); 아스퍼질러스 니거로부터의 CHS1_ASPNG(P30581) 키틴 신타제 1(EC 2.4.1.16)(키틴-UDP 아세틸-글루코스아미닐 트랜스퍼라제 1)(I 부류 키틴 신타제 1); 보트리티스 시네레아(노블 부패 진균)(보트리오티니아 푸켈리아나)로부터의 CHS1_BOTCI(P49603) 키틴 신타제 1(EC 2.4.1.16)(키틴-UDP 아세틸-글루코스아미닐 트랜스퍼라제 1)(I 부류 키틴 신타제 1); 칸디다 알비칸스(효모)로부터의 CHS1_CANAL(P23316) 키틴 신타제 1(EC 2.4.1.16)(키틴-UDP 아세틸-글루코스아미닐 트랜스퍼라제 1); {유전자: 명칭 = CHS1} - 크립토코커스 네오포르만스 변종 그루비(필로바시디엘라 네오포르만스 변종 그루비)로부터의 CHS1_CRYNV(O13356) 키틴 신타제 1(EC 2.4.1.16)(키틴-UDP 아세틸-글루코스아미닐 트랜스퍼라제 1)(IV 부류 키틴 신타제 1); {유전자: 명칭 = chs1} - 에메리셀라 니둘란스(아스퍼질러스 니둘란스)로부터의 CHS1_EMENI(P30583) 키틴 신타제 1(EC 2.4.1.16)(키틴-UDP 아세틸-글루코스아미닐 트랜스퍼라제 1)(I 부류 키틴 신타제 1)(단편); {유전자: 명칭 = CHS1} - 엑소피알라 더마티티디스(완지엘라 더마티티디스)로부터의 CHS1_EXODE(P30600) 키틴 신타제 1(EC 2.4.1.16)(키틴-UDP 아세틸-글루코스아미닐 트랜스퍼라제 1)(II 부류 키틴 신타제 1); {유전자: 명칭 = CHS1} - 엑소피알라 제안셀메이로부터의 CHS1_EXOJE(P30585) 키틴 신타제 1(EC 2.4.1.16)(키틴-UDP 아세틸-글루코스아미닐 트랜스퍼라제 1)(I 부류 키틴 신타제 1)(단편); {유전자: 명칭 = chs-1; ORF명칭 = B11H24.170, NCU03611.1} - 뉴로스포라 크라사로부터의 CHS1_NEUCR(P29070) 키틴 신타제 1(EC 2.4.1.16)(키틴-UDP 아세틸-글루코스아미닐 트랜스퍼라제 1)(III 부류 키틴 신타제 3); {유전자: 명칭 = CHS1} - 파에오코코마이세스 엑소피알라에로부터의 CHS1_PHAEX(P30590) 키틴 신타제 1(EC 2.4.1.16)(키틴-UDP 아세틸-글루코스아미닐 트랜스퍼라제 1)단편); {유전자: 명칭 = chs1} - 피코마이세스 블라케슬레아누스로부터의 CHS1_PHYBL(P87073) 키틴 신타제 1(EC 2.4.1.16)(키틴-UDP 아세틸-글루코스아미닐 트랜스퍼라제 1)(II 부류 키틴 신타제 1); {유전자: 명칭 = CHS1} - 리노클라디엘라 아트로비렌스로부터의 CHS1_RHIAT(P30592) 키틴 신타제 1(EC 2.4.1.16)(키틴-UDP 아세틸-글루코스아미닐 트랜스퍼라제 1)(I 부류 키틴 신타제 1)(단편); {유전자: 명칭 = CHS1} - 리조푸스 올리고스포루스로부터의 CHS1_RHIOL(P30594) 키틴 신타제 1(EC 2.4.1.16)(키틴-UDP 아세틸-글루코스아미닐 트랜스퍼라제 1); {유전자: 명칭 = CHS1} - 리조뮤코르 라세모수스(뮤코르 시르시넬로이데스 에프 루시타니쿠스)로부터의 CHS1_RHIRA(Q12632) 키틴 신타제 1(EC 2.4.1.16)(키틴-UDP 아세틸-글루코스아미닐 트랜스퍼라제 1)(II 부류 키틴 신타제 1); {유전자: 명칭 = CHS1} - 시조필룸 콤뮨(브락켓 진균)으로부터의 CHS1_SCHCO(P30596) 키틴 신타제 1(EC 2.4.1.16)(키틴-UDP 아세틸-글루코스아미닐 트랜스퍼라제 1)(단편); {유전자: 명칭 = chs1; ORF명칭 = SPAC13G6.12c, SPAC24B11.01c} - 시조사카로마이세스 폼베(분열 효모)로부터의 CHS1_SCHPO(P30597) 키틴 신타제 1(EC 2.4.1.16)(키틴-UDP 아세틸-글루코스아미닐 트랜스퍼라제 1); {유전자: 명칭 = CHS1} - 투베르 운시나툼(벌군디 송로)으로부터의 CHS1_TUBUN(P55003) 키틴 신타제 1(EC 2.4.1.16)(키틴-UDP 아세틸-글루코스아미닐 트랜스퍼라제 1)(단편); {유전자: 명칭 = CHS1} - 우스틸라고 마이디스(스머트 진균)로부터의 CHS1_USTMA(P30598) 키틴 신타제 1(EC 2.4.1.16)(키틴-UDP 아세틸-글루코스아미닐 트랜스퍼라제 1)(단편); {유전자: 명칭 = CHS1} - 자일로히파 반티아나로부터의 CHS1_XYLBA(P30603) 키틴 신타제 1(EC 2.4.1.16)(키틴-UDP 아세틸-글루코스아미닐 트랜스퍼라제 1)(단편); {유전자: 명칭 = CHS1; 사카로마이세스 세레비지아에(빵 효모)}로부터의 CHS1_YEAST(P08004) 키틴 신타제 1(EC 2.4.1.16)(키틴-UDP 아세틸-글루코스아미닐 트랜스퍼라제 1); 아젤로마이세스 카프술라타(히스토플라스마 카프술라툼)로부터의 CHS2_AJECA(P30577) 키틴 신타제 2(EC 2.4.1.16)(키틴-UDP 아세틸-글루코스아미닐 트랜스퍼라제 2)(III 부류 키틴 신타제 2); {유전자: 명칭 = CHS2} - 아젤로마이세스 더마티티디스(블라스토마이세스 더마티티디스)로부터의 CHS2_AJEDE(P30580) 키틴 신타제 2(EC 2.4.1.16)(키틴-UDP 아세틸-글루코스아미닐 트랜스퍼라제 2)(II 부류 키틴 신타제 2); {유전자: 명칭 = chs2} - 아스퍼질러스 니거로부터의 CHS2_ASPNG(P30582) 키틴 신타제 2(EC 2.4.1.16)(키틴-UDP 아세틸-글루코스아미닐 트랜스퍼라제 2)(II 부류 키틴 신타제 2)(단편); {유전자: 명칭 = CHS2} - 칸디다 알비칸스(효모)로부터의 CHS2_CANAL(P30572) 키틴 신타제 2(EC 2.4.1.16)(키틴-UDP 아세틸-글루코스아미닐 트랜스퍼라제 2); {유전자: 명칭 = CHS2} - 엑소피알라 더마티티디스(완지엘라 더마티티디스)로부터의 CHS2_EXODE(P30601) 키틴 신타제 2(EC 2.4.1.16)(키틴-UDP 아세틸-글루코스아미닐 트랜스퍼라제 2)(I 부류 키틴 신타제 2); {유전자: 명칭 = CHS2} - 엑소피알라 제안셀메이로부터의 CHS2_EXOJE(P30586) 키틴 신타제 2(EC 2.4.1.16)(키틴-UDP 아세틸-글루코스아미닐 트랜스퍼라제 2)(단편); {유전자: 명칭 = chs-2; ORF명칭 = NCU05239.1} - 뉴로스포라 크라사로부터의 CHS2_NEUCR(P30589) 키틴 신타제 2(EC 2.4.1.16)(키틴-UDP 아세틸-글루코스아미닐 트랜스퍼라제 2); {유전자: 명칭 = CHS2} - 파라콕시디오이데스 브라실리엔시스로부터의 CHS2_PARBR(Q92444) 키틴 신타제 2(EC 2.4.1.16)(키틴-UDP 아세틸-글루코스아미닐 트랜스퍼라제 2)(II 부류 키틴 신타제 2); {유전자: 명칭 = CHS2} - 파에오코코마이세스 엑소피알라에로부터의 CHS2_PHAEX(P30591) 키틴 신타제 2(EC 2.4.1.16)(키틴-UDP 아세틸-글루코스아미닐 트랜스퍼라제 2)(II 부류 키틴 신타제 1)(단편); {유전자: 명칭 = CHS2} - 리노클라디엘라 아트로비렌스로부터의 CHS2_RHIAT(P30593) 키틴 신타제 2(EC 2.4.1.16)(키틴-UDP 아세틸-글루코스아미닐 트랜스퍼라제 2)(III 부류 키틴 신타제 2)(단편); {유전자: 명칭 = CHS2} - 리조푸스 올리고스포루스로부터의 CHS2_RHIOL(P30595) 키틴 신타제 2(EC 2.4.1.16)(키틴-UDP 아세틸-글루코스아미닐 트랜스퍼라제 2); {유전자: 명칭 = chs2; ORF명칭 = SPBC1709.01, SPBC1734.17} - 시조사카로마이세스 폼베(부패 효모)부터의 CHS2_SCHPO(O74756) 키틴 신타제형 단백질 2; {유전자: 명칭 = CHS2} - 우스틸라고 마이디스(스머트 진균)로부터의 CHS2_USTMA(P30599) 키틴 신타제 2(EC 2.4.1.16)(키틴-UDP 아세틸-글루코스아미닐 트랜스퍼라제 2)(단편); {유전자: 명칭 = CHS2} - 자일로히파 반티아나로부터의 CHS2_XYLBA(P30604) 키틴 신타제 2(EC 2.4.1.16)(키틴-UDP 아세틸-글루코스아미닐 트랜스퍼라제 2)(II 부류 키틴 신타제 2)(단편); {유전자: 명칭 = CHS2; 정렬된 유전자좌 명칭 = YBR038W; ORF명칭 = YBR0407} - 사카로마이세스 세레비지아에(빵효모)로부터의 CHS2_YEAST(P14180) 키틴 신타제 2(EC 2.4.1.16)(키틴-UDP 아세틸-글루코스아미닐 트랜스퍼라제 2); {유전자: 명칭 = CHS3} - 아젤로마이세스 카프술라타(히스토플라스마 카프술라툼)로부터의 CHS3_AJECA(P30578) 키틴 신타제 3(EC 2.4.1.16)(키틴-UDP 아세틸-글루코스아미닐 트랜스퍼라제 3)(II 부류 키틴 신타제 3)(단편); {유전자: 명칭 = CHS3} - 칸디다 알비칸스(효모)로부터의 CHS3_CANAL(P30573) 키틴 신타제 3(EC 2.4.1.16)(키틴-UDP 아세틸-글루코스아미닐 트랜스퍼라제 3)(IV 부류 키틴 신타제 3); {유전자: 명칭 = CHS3} - 엑소피알라 더마티티디스(완지엘라 더마티티디스)로부터의 CHS3_EXODE(P30602) 키틴 신타제 3(EC 2.4.1.16)(키틴-UDP 아세틸-글루코스아미닐 트랜스퍼라제 3)(III 부류 키틴 신타제 3); {유전자: 명칭 = CHS3} - 엑소피알라 제안셀메이로부터의 CHS3_EXOJE(P30587) 키틴 신타제 3(EC 2.4.1.16)(키틴-UDP 아세틸-글루코스아미닐 트랜스퍼라제 3)(III 부류 키틴 신타제 3)(단편); {유전자: 명칭 = chs-3; ORF명칭 = G65A3.040} - 뉴로스포라 크라사로부터의 CHS3_NEUCR(P30588) 키틴 신타제 3(EC 2.4.1.16)(키틴-UDP 아세틸-글루코스아미닐 트랜스퍼라제 3); {유전자: 명칭 = CHS3; 유사물 = CAL1, CSD2, DIT101, KIT2; 정렬된 유전자좌 명칭 = YBR023C; ORF명칭 = YBR0305} - 사카로마이세스 세레비지아에(빵효모)로부터의 CHS3_YEAST(P29465) 키틴 신타제 3(EC 2.4.1.16)(키틴-UDP 아세틸-글루코스아미닐 트랜스퍼라제 3)(IV 부류 키틴 신타제 3); {유전자: 명칭 = CHS4} - 마그나포르테 그리세아(도열병 진균)(피리쿨라리아 그리세아)로부터의 CHS4_MAGGR(O13353) 키틴 신타제 4(EC 2.4.1.16)(키틴-UDP 아세틸-글루코스아미닐 트랜스퍼라제 4)(IV 부류 키틴 신타제 4); {유전자: 명칭 = chs4; ORF명칭 = NCU09324.1} - 뉴로스포라 크라사로부터의 CHS4_NEUCR(Q01285) 키틴 신타제 4(EC 2.4.1.16)(키틴-UDP 아세틸-글루코스아미닐 트랜스퍼라제 4)(IV 부류 키틴 신타제 4); {유전자: 명칭 = CHS5} - 우스틸라고 마이디스(스머트 진균)로부터의 CHS5_USTMA(O13394) 키틴 신타제 5(EC 2.4.1.16)(키틴-UDP 아세틸-글루코스아미닐 트랜스퍼라제 5)(IV 부류 키틴 신타제 5); {유전자: 명칭 = CHS6} - 우스틸라고 마이디스(스머트 진균)로부터의 CHS6_USTMA(O13395) 키틴 신타제 6(EC 2.4.1.16)(키틴-UDP 아세틸-글루코스아미닐 트랜스퍼라제 6)(V 부류 키틴 신타제 6); {유전자: 명칭 = CHSA} - 암펠로마이세스 퀴스쿠알리스로부터의 CHSA_AMPQU(Q12564) 키틴 신타제 A(EC 2.4.1.16)(키틴-UDP 아세틸-글루코스아미닐 트랜스퍼라제 A)(I 부류 키틴 신타제 A); {유전자: 명칭 = chsA; 유사물 = chs2} - 에메리셀라 니둘란스(아스퍼질러스 니둘란스)로부터의 CHSA_EMENI(P30584) 키틴 신타제 A(EC 2.4.1.16)(키틴-UDP 아세틸-글루코스아미닐 트랜스퍼라제 A)(II 부류 키틴 신타제 A); {유전자: 명칭 = chsB} - 에메리셀라 니둘란스(아스퍼질러스 니둘란스)로부터의 CHSB_EMENI(Q00757) 키틴 신타제 B(EC 2.4.1.16)(키틴-UDP 아세틸-글루코스아미닐 트랜스퍼라제 B)(III 부류 키틴 신타제 B); {유전자: 명칭 = chsC} - 아스퍼질러스 푸미가투스(사토리아 푸미가타)로부터의 CHSC_ASPFU(Q92197) 키틴 신타제 C(EC 2.4.1.16)(키틴-UDP 아세틸-글루코스아미닐 트랜스퍼라제 C)(III 부류 키틴 신타제 C); {유전자: 명칭 = chsD} - 아스퍼질러스 푸미가투스(사토리아 푸미가타)로부터의 CHSD_ASPFU(P78746) 키틴 신타제 D(EC 2.4.1.16)(키틴-UDP 아세틸-글루코스아미닐 트랜스퍼라제 D)(VI 부류 키틴 신타제 D); {유전자: 명칭 = chsD} - 유사물 = chsE} - 에메리셀라 니둘란스(아스퍼질러스 니둘란스)로부터의 CHSD_EMENI(P78611) 키틴 신타제 D(EC 2.4.1.16)(키틴-UDP 아세틸-글루코스아미닐 트랜스퍼라제 D)(V 부류 키틴 신타제 D); {유전자: 명칭 = chsG} - 아스퍼질러스 푸미가투스(사토리아 푸미가타)로부터의 CHSG_ASPFU(P54267) 키틴 신타제 G(EC 2.4.1.16)(키틴-UDP 아세틸-글루코스아미닐 트랜스퍼라제 G)(III 부류 키틴 신타제 G); {유전자: 명칭 = CHS1} - 우스틸라고 마이디스(스머트 진균)로부터의 CHSX_USTMA(Q99126) 키틴 신타제 1(EC 2.4.1.16)(키틴-UDP 아세틸-글루코스아미닐 트랜스퍼라제 1); {유전자: 명칭 = CHS2} - 우스틸라고 마이디스(스머트 진균)로부터의 CHSY_USTMA(Q99127) 키틴 신타제 2(EC 2.4.1.16)(키틴-UDP 아세틸-글루코스아미닐 트랜스퍼라제 2) 또는 {유전자: 명칭 = CHS} - 사프로레그니아 모노이카로부터의 CHS_SAPMO(P48017) 키틴 신타제(EC 2.4.1.16)(키틴-UDP 아세틸-글루코스아미닐 트랜스퍼라제). 모든 서열들은 본 발명에 참고로 인용된다.
키틴 신타제는 바람직하게는 상기 키틴 신타제를 골지체 막에 표적화하는 (이종) 신호 고정 서열을 갖추어야 한다. α-2,6-사이알릴트랜스퍼라제(특히 그의 처음 44 개 또는 52 개 아미노산; Munro et al. 1991, EMBO Journal, 10:3577-3588)의 막통과 분절 내 및 그에 인접한 서열; 인간 갈락토실 트랜스퍼라제(특히 그의 처음 60 개 아미노산)으로부터의 신호 고정 서열 또는 효모 HDEL 수용체(AtERD2)의 아라비도프시스 동족체로부터의 신호 고정 서열(Saint-Jore et al., 2002, The Plant Journal, 29:661-678), β1,2-자일로실트랜스퍼라제 단백질(특히 그의 처음 36 개 아미노산; Pagny et al., 2003, The Plant Journal 33:189-203)로부터의 신호 고정 서열 또는 N-아세틸-글루코스아미닐 트랜스퍼라제 I(특히 그의 처음 77 개 아미노산; Essl et al. 1999, FEBS Lett. 453:169-173)의 신호 고정 서열을 포함한 상기와 같은 서열들이 당해 분야에 공지되어 있다. 상기 N-아세틸글루코스아민 트랜스퍼라제의 C-말단에서 융합에 의해 사용되는 다른 골지 표적화 신호들에는 아라비도프시스 DAGAT1 단백질에서 발견될 수 있는 바와 같은 아미노산 서열 "YYHDL" 또는 아라비도프시스 DAGAT2에서 발견될 수 있는 바와 같은 "LKLEI"가 있다. 상기 각각의 폴리펩타이드를 암호화하는 DNA 단편을 결합시킴으로써 키틴 신타제에 상기와 같은 신호 고정 서열을 융합시키는 것은 표준 재조합 DNA 기법을 사용하여 성취할 수 있다. 상기 NODC 유형의 N-아세틸글루코스아민 트랜스퍼라제를 또한 상기 골지체를 표적화하는 신호 고정 서열에 작용적으로 결합시킬 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시태양에서, 식물 세포의 세포벽, 특히 2 차 세포벽 중에 양으로 하전된 올리고사카라이드의 양을 증가시키는 방법을 제공하며, 상기 방법은 키메릭 유전자를 상기 식물 세포에 도입시키는 단계를 포함하고, 이때 상기 키메릭 유전자는 하기의 작용적으로 결합된 DNA 단편:
- 식물 발현성 프로모터;
- 바람직하게는 진균 기원의 키틴 신타제(키틴 UDP-아세틸글루코스아민 트랜스퍼라제)를 암호화하는 DNA 부위; 및
- 전사 종결 및 폴리아데닐화 부위
를 포함하며, 유효량의 N-아세틸글루코스아민 또는 N-아세틸글루코스아민-1-포스페이트 또는 N-아세틸글루코스아민-6-포스페이트 또는 글루코스아민-6-포스페이트를 상기 식물 세포 또는 상기 식물에 적용시키는 단계를 또한 포함한다.
본 발명에 따른 키메릭 유전자는 식물 발현성 프로모터를 포함한다. 본 발명에 사용된 바와 같은 "프로모터"란 용어는 전사 개시 중에 DNA-의존성 RNA-폴리머라제에 의해 인식되고 결합되는(직접 또는 간접적으로) 임의의 DNA를 나타낸다. 프로모터는 전사 개시 부위, 및 전사 개시 인자 및 RNA 폴리머라제에 대한 결합 부위를 포함하고, 다양한 다른 부위들(예를 들어 증강인자)(여기에서 유전자 발현 조절 단백질들이 결합할 수 있다)을 포함한다.
본 발명에 사용된 바와 같은 "식물 발현성 프로모터"란 용어는 식물 세포에서 전사를 조절(개시)할 수 있는 DNA 서열을 의미한다. 상기는 식물 기원의 임의의 프로모터를 포함하지만, 또한 식물 세포에서 전사를 조정할 수 있는 비 식물 기원의 임의의 프로모터, 즉 바이러스 또는 세균 기원, 예를 들어 CaMV35S의 몇몇 프로모터, 지하 클로버 바이러스 프로모터 No 4 또는 No 7, 또는 T-DNA 유전자 프로모터 등을 포함한다.
우선적으로 섬유 세포에서 전사의 개시 및 유지를 조절하는 식물 발현성 프로모터는 작용적으로 결합된 DNA 부위의 전사를 식물의 다른 세포 또는 조직에서보다 섬유 세포 및 하부 표피에서 더 높은 수준으로 조종하는 프로모터이다. 상기와 같은 프로모터는 섬유 특이적 β-튜불린 유전자로부터의 목화로부터의 프로모터(WO0210377에 개시된 바와 같다), 섬유 특이적 액틴 유전자로부터의 목화로부터의 프로모터(WO0210413에 개시된 바와 같다), 목화로부터의 섬유 특이적 지질 전달 단백질 유전자로부터의 프로모터(US5792933에 개시된 바와 같다), 목화로부터의 익스팬신(expansin) 유전자로부터의 프로모터(WO9830698) 또는 목화에서 키티나제 유전자로부터의 프로모터(US2003106097) 또는 US6259003 또는 US6166294에 개시된 섬유 특이적 유전자의 프로모터를 포함한다.
본 발명은 또한 식물 세포벽을 제공하며, 상기는 본 발명에 따른 방법을 사용하여 식물 세포로부터 수득한 상기와 같은 세포벽을 포함하는 섬유를 포함한다. 상기와 같은 식물 세포벽은 셀룰로스 내에 매몰된, 양으로 하전된 올리고- 또는 폴리사카라이드, 예를 들어 N-아세틸글루코스아민 올리고머 또는 키틴을 포함한다. 상기 식물 세포벽을 글루코스아민 잔기를 포함하는 올리고머가 수득되도록 추가로 개질시킬 수 있고, 예를 들어 부분적으로 또는 완전히 탈아세틸화시킬 수 있다. 생성되는 글루코스아민의 아미노 그룹은 N-아세틸글루코스아민의 아미노아세틸 그룹 또는 셀룰로스의 하이드록실 그룹보다 화학적으로 더 반응성이다.
본 발명에 따라 수득된 식물 세포벽, 특히 탈아세틸화 단계를 가한 것들을 추가로 화학적으로 개질시킬 수 있다. 상기와 같은 식물 세포벽을 함유하는 생성물들, 예를 들어 섬유, 얀 또는 직물은 당해 분야에 개시된 셀룰로스-키토산 블렌드의 것들을 닮은 성질들, 예를 들어 개선된 염색성, 예를 들어 피부 사상균의 개선된 억제, 조절된 약물 방출 등을 갖는다.
특정한 실시태양에서, 본 발명은 본 발명의 방법에 따라 목화 식물로부터 수득하거나 수득할 수 있는 면 섬유를 제공한다. 즉, 면 섬유를 그의 세포의 게놈, 예를 들어 핵 게놈 중에 N-아세틸글루코스아민 트랜스퍼라제를 암호화하는 DNA 부위에 작용적으로 결합된 식물 발현성 프로모터를 포함하는 키메릭 유전자를 포함하는 목화로부터 제공하거나(여기에서 상기 N-아세틸글루코스아민 트랜스퍼라제는 골지체막에 표적화 된다) 또는 면 섬유를 그의 세포의 게놈, 예를 들어 핵 게놈 중에 상기 NODC 유형의 N-아세틸글루코스아민 트랜스퍼라제를 암호화하는 DNA 부위에 작용적으로 결합된 식물 발현성 프로모터를 포함하는 키메릭 유전자를 포함하는 목화로부터 제공하거나, 또는 면 섬유를 그의 세포의 게놈, 예를 들어 핵 게놈 중에 키틴 신타제를 암호화하는 DNA 부위에 작용적으로 결합된 식물 발현성 프로모터를 포함하는 키메릭 유전자를 포함하는 목화로부터 제공한다. 특히 후자의 경우에, 상기 식물 세포 또는 식물에 유효량의 N-아세틸글루코스아민 또는 N-아세틸글루코스아민-1-포스페이트 또는 N-아세틸글루코스아민-6-포스페이트 또는 글루코스아민-6-포스페이트를 적용하는 것이 유리할 수 있다. 목화 내로 전달되는 키메릭 유전자 중에 포함된 DNA 암호화 부위 또는 프로모터에 대한 특정한 실시태양들은 본 문헌의 다른 어딘 가에 개시한 바와 같다.
본 발명에 따른 면 섬유는 음이온 염료(예를 들어 콩고 레드)에 의한 염색의 증가에 대한 상기와 같은 섬유의 능력, 아민 반응성 염료(예를 들어 테트라플루오로페닐 에스터)에 의한 염색의 증가에 대한 상기와 같은 섬유의 능력에 의해, 천연 면 섬유, 즉 본 발명에 따른 키메릭 유전자를 포함하지 않는 동질 유전자 주로부터 수득된 면 섬유와 구분될 수 있다. 본 발명에 따른 면 섬유는 또한 키토-올리고머와 결합하는 맥아 아글루티닌의 결합 능력을 갖는다. 본 발명에 따른 면 섬유는 또한, 바람직하게는 상기 섬유 세포 벽 물질을 키티나제로 처리한 후에 N-아세틸글루코스아민 및 GlcNAc 올리고머의 직접적인 검출에 의해 천연 면 섬유와 구분될 수 있다. 본 발명에 따른 면 섬유는 또한 그의 증가된 질소 함량에 의해 구분될 수 있다.
본 발명에 따른 면 섬유는 또한 양으로 하전된 올리고머가 상기 섬유를 구성하는 2 차 식물 세포 벽에 다소 고르게 분포된다는 점에서, 키토산 코팅된 섬유 또는 키토산/셀룰로스 혼방된 얀과 구분될 수 있다. 따라서, 이후에 개시되는 바와 같이 예를 들어 WGA 또는 콩고 레드 또는 테트라플루오로페닐로 염색된 면 섬유의 현미경 관찰 섹션에서, 상기 염료는 상기 면 섬유를 구성하는 세포벽 전체를 통해 다소 고르게 분포될 것인 반면, 키토산 코팅된 섬유에서 염색은 상기 처리된 섬유의 표면에서 시트로서 배치된 키토산 도막에 집중될 것이다.
본 발명에 따른 면 섬유는 또한 면 섬유와 관련된 식물 물질 중에 남아있는 핵산 중에 키메릭 유전자를 포함하는 N-아세틸글루코스아민 트랜스퍼라제의 검출에 의해 다른 면 섬유와 구분될 수 있다.
본 발명에 따른 식물 세포벽 물질의 음이온 염료, 예를 들어 콩고 레드에 의한 증가된 염색을, 예를 들어 균일한 양의 물질을 표준 조건 하에서 염색하고, 상기 물질을 표준화된 영역(예를 들어 다중웰 플레이트 중의 웰) 위에 펴 바르고, 상기 영역의 사진을 착색된 물질 층의 회색 등급으로 디지털화함으로써 정량화할 수 있다. 회색이 적을수록 상기 식물 세포벽 물질은 더 염색된 것이다. 이렇게 하여, 본 발명에 따른 면 섬유 및 세포벽 물질은 N-아세틸글루코스아민 트랜스퍼라제 암호화 유전자가 없는 동질 유전자 식물 주로부터의 대조용 세포벽 물질 또는 섬유에 비해 콩고 레드에 의한 염색에서 약 5% 이상의 증가를 보였다.
맥아 아글루티닌(커플링된 형광표지 그룹에 의해 검출 가능함)과 특이적으로 결합하는 신규의 면 섬유의 능력은 천연 면 섬유에 대한 상기 제공된 신규 면 섬유의 분명히 눈에 띄는 특징이다. 매우 낮은 배경 형광을 제외하고, 천연 면 섬유는 WGA-알렉사 플루오르 488 또는 555로 처리 시 염색/형광을 발하지 않는다. 면 섬유의 형광성은 키토-올리고머가 존재할 때 5 배 이상 증가한다. 따라서, 본 발명은 맥아 아글루티닌, 또는 형광표지에 커플링된 WGA, 예를 들어 WGA 알렉사 488 또는 WGA 알렉사 555와 특이적으로 결합할 수 있거나, 또는 WGA 알렉사 488 또는 WGA 알렉사 555로 처리 시 UV 광 하에서 밝은 형광을 제공하는 면 섬유를 제공한다. 상기 형광은 상기 면 섬유의 표면으로 국한되지 않고 상기 섬유 세포의 세포벽 전체를 통해 분포된다.
면 섬유를 포함한, 본 발명에 따른 식물 세포벽 물질은 전형적으로는 세포벽 물질 ㎎당 0.1 ㎍ 이상, 바람직하게는 1 ㎍ 이상, 바람직하게는 5 ㎍ 이상의 농도로 키토-올리고사카라이드를 갖는다.
본 발명은 또한 본 발명에 개시된 바와 같은 키메릭 유전자, 및 상기와 같은 키메릭 유전자를 함유하는 식물 세포 또는 식물을 제공한다.
본 발명의 방법이 식물 세포 중에 키메릭 유전자의 도입에 관한 것이면 어디에서든지, 상기와 같은 방법을 상기 식물 세포가 성숙한 식물 내로 통합되는 경우에도 또한 적용할 수 있음은 명백할 것이다. 예를 들어 트랜스제닉 세포를 확립된 방법에 따라 트랜스제닉 식물 내에 재생시킬 수 있다.
식물 세포 및 식물의 형질전환 방법은 당해 분야에 널리 공지되어 있다. 목화의 형질전환 방법도 또한 당해 분야에 널리 공지되어 있다. 목화의 아그로박테리움 매개된 형질전환이 예를 들어 미국 특허 제 5,004,863 호 또는 미국 특허 제 6,483,013 호에 개시되어 있고 입자 충격에 의한 목화 형질전환은 예를 들어 WO 92/15675에 보고되어 있다.
상기 키메릭 유전자, 예를 들어 Coker 312, Coker 310, Coker 5Acala SJ-5, GSC25110, FiberMax 819, Siokra 1-3, T25, GSA75, Acala SJ2, Acala SJ4, Acala SJ5, Acala SJ-C1, Acala B1644, Acala B1654-26, Acala B1654-43, Acala B3991, Acala GC356, Acala GC510, Acala GAM1, Acala C1, Acala Royale, Acala Maxxa, Acala Prema, Acala B638, Acala B1810, Acala B2724, Acala B4894, Acala B5002, non Acala "피커" Siokra, "스트립퍼" 변종 FC2017, Coker 315, STONEVILLE 506, STONEVILLE 825, DP50, DP61, DP90, DP77, DES119, McN235, HBX87, HBX191, HBX107, FC 3027, CHEMBRED A1, CHEMBRED A2, CHEMBRED A3, CHEMBRED A4, CHEMBRED B1, CHEMBRED B2, CHEMBRED B3, CHEMBRED C1, CHEMBRED C2, CHEMBRED C3, CHEMBRED C4, PAYMASTER 145, HS26, HS46, SICALA, PIMA S6 및 ORO BLANCO PIMA, 화이버맥스(Fibermax)(등록상표) FM5013, FM5015, FM5017, FM989, FM832, FM966 및 FM958, FM989, FM958, FM832, FM991, FM819, FM800, FM960, FM966, FM981, FM5035, FM5044, FM5045, FM5013, FM5015, FM5017 또는 FM5024를 배 발생 유상조직이 유도될 수 있는 목화 및 상기로부터 유래된 유전자형을 갖는 식물에서 형질전환에 의해 도입시킬 수 있다.
본 발명에 사용된 "목화"는 고시퓸 히르수툼 ( Gossypium hirsutum ), 고시퓸 바르바덴세(barbadense), 고시퓸 아르보레움(arboreum) 및 고시퓸 헤르바세움(herbaceum) 또는 상기와 같은 종들 간 교배로부터의 자손을 포함한다.
본 발명의 방법 및 수단을 또한 다른 식물 종들, 예를 들어 대마, 황마, 아마 및 목질 식물, 예를 들어 비 제한적으로 피누스 종( Pinus spp .), 포풀루스 종( Populus spp .), 피세아 종( Picea spp .), 유칼립투스 종( Eucalyptus spp .) 등에 사용할 수 있다.
상기 수득된 형질전환된 식물을 통상적인 육종 계획에 사용하여 동일한 특징을 갖는 보다 많은 형질전환된 식물을 생산하거나 본 발명에 따른 키메릭 유전자를 상기 동일하거나 관련된 식물 종의 다른 품종 또는 하이브리드 식물에 도입시킬 수 있다. 상기 형질전환된 식물로부터 수득한 종자는 안정한 게놈 삽입물로서 본 발명의 키메릭 유전자를 함유하며 상기는 또한 본 발명에 포함된다.
본 발명에 사용된 바와 같은 "포함하는"은 서술된 특징, 언급된 정수, 단계 또는 성분들의 존재를 명시하는 것으로서 해석되어야 하지만, 하나 이상의 특징, 정수, 단계 또는 성분, 또는 이들의 그룹의 존재 또는 첨가를 제외하는 것은 아니다. 따라서, 예를 들어 뉴클레오타이드 또는 아미노산의 서열을 포함하는 핵산 또는 단백질은 실제로 인용된 것들보다 더 많은 뉴클레오타이드 또는 아미노산을 포함할 수 있다. 즉 보다 큰 핵산 또는 단백질 중에 매몰될 수 있다. 작용적으로 또는 구조적으로 한정된 DNA 부위를 포함하는 키메릭 유전자는 추가적인 DNA 부위 등을 포함할 수 있다.
하기의 비 제한적인 실시예들은 식물 세포벽의 변경 방법을 개시한다. 실시예에서 달리 나타내지 않는 한, 모든 재조합 DNA 기법들을 문헌[Sambrook et al.(1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY and in Volumes 1 and 2 of Ausubel et al.(1994) Current Protocols in Molecular Biology, Current Protocols, USA]에 개시된 바와 같은 표준 프로토콜에 따라 수행한다. 식물 분자 연구를 위한 표준 물질 및 방법들이 문헌[R.D.D. Croy, Plant Molecular Biology Labfax(1993)](BIOS Scientific Publication Ltd(UK) 및 Blackwell Scientific Publications, UK에 의해 공동으로 출판됨)에 개시되어 있다.
상기 설명 및 실시예 전체를 통해, 서열 목록에 나타낸 하기의 서열들을 참고로 한다:
서열식별번호 1: 아조리조븀 카우리노단스의 뿌리혹 착생 단백질 C
서열식별번호 2: 브라디리조븀 자포니쿰의 뿌리혹 착생 단백질 C
서열식별번호 3: 리조븀 갈레가에(Rhizobium galegae)의 뿌리혹 착생 단백질 C
서열식별번호 4: 리조븀 레구미노사룸(바이오바 비시아에)의 뿌리혹 착생 단백질 C
서열식별번호 5: 리조븀 멜릴로티(Rhizobium meliloti)의 뿌리혹 착생 단백질 C
서열식별번호 6: 리조븀 트로피치(Rhizobium tropici)의 뿌리혹 착생 단백질 C
서열식별번호 7: 리조븀 레구미노사룸(바이오바 파세올리)의 뿌리혹 착생 단백질 C
서열식별번호 8: 리조븀 종 균주 N33의 뿌리혹 착생 단백질
서열식별번호 9: 리조븀 로티(Rhizobium loti)의 뿌리혹 착생 단백질
서열식별번호 10: pTGK42의 T-DNA
서열식별번호 11: pTGK44의 T-DNA
서열식별번호 12: pTDBI5의 T-DNA
서열식별번호 13: pTDBI37의 T-DNA
서열식별번호 14: pTDBI50의 T-DNA
서열식별번호 15: 골지 표적화 신호에 결합된 합성 키틴 신타제
본원발명의 식물 세포의 세포벽, 특히 2 차 세포벽 중에 양으로 하전된 올리고사카라이드 또는 폴리사카라이드의 양을 증가시키는 방법을 사용하면 식물세포벽의 반응성을 개질시킬 수 있다. 특히, 본원발명을 사용하면 변경된 반응성을 갖는 면 섬유를 제공할 수 있다.
또한, 본원발명의 방법은, 식물 유래된 물질, 예를 들어 천연 섬유를 함유하는 세포벽을 섬유 반응성 염료를 사용하여 염색하는 방법에 적용하여, 예를 들어 염색 견뢰도(colorfastness)를 개선시키거나 상기 염색 과정 동안 사용된 폐수의 부피를 감소시킬 수 있다.
또한, 본원발명의 방법은 상기 천연 섬유와 반응물, 예를 들어 난연제, 물, 발유제 및 방오제, 구김 방지제, 유연제, 정전기 방지제, 형광 증백제 등과의 반응성을 개선시키는데 사용할 수 있다.
도 1a 및 1b는 상이한 NODC 단백질들의 아미노산 서열의 배열이다. 모든 단백질들에 보존된 아미노산 잔기들을 굵게 나타낸다. ROT _ NODC _ RHILP: 리조븀 레구 미노사룸( Rhizobium leguminosarum )(바이오바 파세올리)으로부터의 NODC 단백질; ROT_NODC_BRAJA: 브라디리조븀 자포니쿰( Bradyrhizobium japonicum )으로부터의 NODC 단백질(서열식별번호..); ROT _ NODC _ RHIS3: 리조븀 종( Rhizobium sp .)(균주 N33)로부터의 NODC 단백질; ROT _ NODC _ RHISN: 리조븀 종( Rhizobium sp .)로부터의 NODC 단백질; ROT _ NODC _ RHILV: 리조븀 레구미노사룸( Rhizobium leguminosarum )(바이오바 비시아에)으로부터의 NODC 단백질; 및 ROT _ NODC _ AZOCA: 아조리조븀 카우리노단스( Azorhizobium caulinodans)로부터의 NODC 단백질.
도 2a 및 2b는 상이한 NODC 단백질들의 아미노산 서열의 배열이다. 모든 단백질들에 보존된 아미노산 잔기들을 굵게 나타낸다. ROT _ NODC _ BRAJA: 브라디리조븀 자포니쿰( Bradyrhizobium japonicum )으로부터의 NODC 단백질(서열식별번호..); ROT_NODC_RHIS3: 리조븀 종( Rhizobium sp .)(균주 N33)로부터의 NODC 단백질; ROT_NODC_RHISN: 리조븀 종( Rhizobium sp .)로부터의 NODC 단백질; ROT _ NODC _ RHILV: 리조븀 레구미노사룸( Rhizobium leguminosarum )(바이오바 비시아에)으로부터의 NODC 단백질; 및 ROT _ NODC _ AZOCA: 아조리조븀 카우리노단스( Azorhizobium caulinodans)로부터의 NODC 단백질.
도 3은 35S::NodC 키메릭 유전자를 함유하는 모상근으로부터의 근모 세포 상에서 수행된 형광 현미경검사의 사진이다. 패널 A: 칼코플루오르(Calcofluor)로 염색된 근모 세포의 광학 섹션; 패널 B: N-아세틸글루코스아민의 존재에 대해 면역조직화학적으로 염색된 근모 세포의 광학 섹션; C: 패널 A 및 패널 B의 광학 섹션들의 중첩.
도 4는 35S::NODC-EGFP 키메릭 유전자를 함유하는 모상근으로부터의 근모 세포 상에서 수행된 형광 현미경검사의 사진이다. 패널 A: 패널 B, C 및 D의 광학 섹션들의 중첩; B: 칼코플루오르로 염색된 근모 세포의 광학 섹션; C: 골지체를 가시화하기 위해 염색된 근모 세포의 광학 섹션; D: EGFP에 의해 형광성을 가시화하는 근모 세포의 광학 섹션.
도 5는 35S::키틴 신타제 키메릭 유전자를 함유하는 모상근으로부터의 근모 세포 상에서 수행된 형광 현미경검사의 사진이다. 패널 A: N-아세틸글루코스아민의 존재에 대해 염색된, 50 mM N-아세틸글루코스아민의 존재 하에서 배양된 모상근의 광학 섹션; 패널 B: 세포벽 중의 N-아세틸글루코스아민의 존재에 대해 염색된, 여분의 N-아세틸글루코스아민의 부재 하에서 배양된 모상근의 광학 섹션.
도 6은 아라비도프시스 모상근으로부터 단리된 세포벽 물질로부터의 키토-올리고머의 고성능 박층 크로마토그램이다.
2 개의 바깥 레인(1, 12)의 샘플은 N-아세틸글루코스아민, 키토바이오스, 키토트라이오스, 키토테트라오스 및 키토펜타오스의 표준 용액들이다. 레인 2 내지 5: nodC 암호화 부위에 결합된 CaMV35S 프로모터를 포함하는 키메릭 유전자를 갖는 아그로박테리움 라이조젠에 의해 개시된 모상근 배양물로부터 추출된 세포벽 물질; 레인 6 내지 9: eGFP에 융합된 nodC 암호화 부위에 결합된 CaMV35S 프로모터를 포함하는 키메릭 유전자를 갖는 아그로박테리움 라이조젠에 의해 개시된 모상근 배양물로부터 추출된 세포벽 물질; 레인 10 및 11: 포스피노트리신 아세틸트랜스퍼라제 암호화 부위에 결합된 CaMV35S 프로모터를 포함하는 키메릭 유전자를 갖는 아그로박테리움 라이조젠( Agrobacterium rhizogene )에 의해 개시된 모상근 배양물로부터 추출된 세포벽 물질. TLC를 아세토나이트릴(76):물(24):0.5% 붕산(10) 중에서 수행하였다.
도 7은 키티나제 절단이 가해진 아라비도프시스 모상근으로부터 단리된 세포벽 물질에 대한 2 차원 HPTLC이다.
대조용 세포벽 물질(좌측 패널)을 포스피노트리신 아세틸트랜스퍼라제 암호화 부위에 결합된 CaMV35S 프로모터를 포함하는 키메릭 유전자를 갖는 아그로박테리움 라이조젠에 의해 개시된 모상근 배양물로부터 추출하였고; 실험용 세포벽 물질(우측 패널)은 eGFP에 융합된 nodC 암호화 부위에 결합된 CaMV35S 프로모터를 포함하는 키메릭 유전자를 갖는 아그로박테리움 라이조젠에 의해 개시된 모상근 배양물로부터 추출하였다. 단량체 사카라이드(N-아세틸글루코스아민) 및 이량체 키토-사카라이드(키토바이오스)를 상기 실험용 물질에서 검출할 수 있지만 상기 대조용 물질에서는 검출할 수 없다. TLC를 아세토나이트릴(76):물(24):0.5% 붕산(10) 중에서 수행하였다.
도 8은 트랜스제닉 아라비도프시스 식물로부터 단리된 세포벽 물질의 HPTLC이다.
레인 1: 표준 용액 키토-올리고사카라이드; 레인 2: 0.1 글루코스아민; 레인 3 및 4: 각각 4 ㎕ 및 8 ㎕의 대조용 아라비도프시스 싹으로부터 단리된 세포벽 물질; 레인 5 및 6: 각각 4 ㎕ 및 8 ㎕의, CaMV35S::nod C 키메릭 유전자를 포함하는 트랜스제닉 아라비도프시스 싹으로부터 단리된 세포벽 물질; 레인 7 및 8: 각각 4 ㎕ 및 8 ㎕의, CaMV35S::nod C-eGFP 키메릭 유전자를 포함하는 트랜스제닉 아라비도프시스 싹으로부터 단리된 세포벽 물질. 점선은 특히 레인 5 및 6에서 증가된 양의 키토-트라이오스를 가리킨다.
도 9는 알렉사 플루오르(Alexa fluor) 555에 접합된 맥아 아글루티닌(WGA)과 반응한 면 섬유의 형광 현미경사진이다.
좌측 패널: CaMV35S::NodC 유전자를 함유하는 트랜스제닉 목화로부터의 면 섬유. 우측 패널: 대조용 목화로부터의 면 섬유. UV 광 하에서, 상기 트랜스제닉 목화로부터의 섬유에서 밝은 형광을 관찰할 수 있으며, 이는 상기 섬유 중의 키토-올리고머의 존재를 가리킨다.
실시예 1: N- 아세틸글루코스아민 트랜스퍼라제 단백질을 암호화하는 키메릭 식물 발현성 유전자의 제작
표준 재조합 DNA 기법을 사용하여, 하기의 작용적으로 결합된 DNA 단편을 함유하는 식물 발현성 NODC 키메릭 유전자를 제작하였다:
·CaMV로부터의 35S 프로모터 부위
·번역되지 않은 리더 서열(5'Cab22L)을 암호화하는 DNA 단편
·아조리조븀 카우리노단스의 NODC를 암호화하는 DNA 단편
·NODC 및 EGFP를 포함하는 융합 단백질이 제조되도록, NODC 암호화 ORF와 함께 인 프레임 클로닝된 EGFP(증강된 유전자 형광 단백질)를 암호화하는 DNA 단편
·CaMV(3'35S)의 35S 전사물로부터의 전사 종결 및 폴리아데닐화 신호.
상기 키메릭 유전자를 포스피노트리신에 대한 내성을 제공하는 키메릭 bar 유전자와 함께 T-DNA 벡터의 T-DNA 경계 사이에 도입시켰다. 생성된 T-DNA 벡터를 pTGK44라 명명하였다. 상기 벡터의 T-DNA의 서열을 서열식별번호 11에 제공한다. 상기 T-DNA 벡터는 상기 NODC-EGFP 융합 단백질의 국소화에 대한 조직화학적 분석을 허용하였다.
하기의 작용적으로 결합된 DNA 단편을 함유하는 또 다른 키메릭 유전자를 제작하였다:
·CaMV로부터의 35S 프로모터 부위
·번역되지 않은 리더 서열(5'Cab22L)을 암호화하는 DNA 단편
·아조리조븀 카우리노단스의 NODC를 암호화하는 DNA 단편
·CaMV(3'35S)의 35S 전사물로부터의 전사 종결 및 폴리아데닐화 신호.
상기 키메릭 유전자를 포스피노트리신에 대한 내성을 제공하는 키메릭 bar 유전자와 함께 T-DNA 벡터의 T-DNA 경계 사이에 도입시켰다. 생성된 T-DNA 벡터를 pTGK42라 명명하였다. 상기 벡터의 T-DNA의 서열을 서열식별번호 10에 제공한다. 상기 T-DNA 벡터는 상기와 같은 식물 세포의 세포벽과 관련된 키토-올리고사카라이드가 생산되었는 지의 여부를 분석하기 위해, 식물 세포에서 NODC를 발현하게 하였다.
하기의 작용적으로 결합된 DNA 단편을 함유하는, 상기 NODC 유형 단백질과 상이한 N-아세틸글루코스아민 트랜스퍼라제를 암호화하는 대조용 키메릭 유전자를 또한 제작하였다:
·CaMV로부터의 35S 프로모터 부위
·번역되지 않은 리더 서열(5'Cab22L)을 암호화하는 DNA 단편
·뉴로스포라 크라사의 키틴 신타제를 암호화하는 DNA 단편
·CaMV(3'35S)의 35S 전사물로부터의 전사 종결 및 폴리아데닐화 신호.
상기 키메릭 유전자를 포스피노트리신에 대한 내성을 제공하는 키메릭 bar 유전자와 함께 T-DNA 벡터의 T-DNA 경계사이에 도입시켰다. 생성된 T-DNA를 pTGK43이라 명명하였다. 상기 벡터의 T-DNA의 서열을 서열식별번호 12에 제공한다. 상기 T-DNA 벡터는 상기와 같은 식물 세포의 세포벽과 관련된 키토-올리고사카라이드가 생산되었는 지의 여부를 분석하기 위해, 식물 세포에서 키틴 신타제를 발현하게 하였다.
상기 T-DNA 벡터를 아그로박테리움 튜메파시엔스( Agrobacterium tumefaciens) C58C1Rif(pEHA101)에 도입시켰다. 대조용 실험을 위해서, 오직 키메릭 bar 유전자만을 함유하는 T-DNA 벡터를 상기 동일한 아그로박테리움 균주 내에 도입시켰다.
상기 아그로박테리움 튜메파시엔스 (A. tumefaciens ) 균주를 후속적으로 하기의 프로토콜에 따라 상이한 T-DNA 벡터들을 수반하는 아그로박테리움 라이조젠 ATCC 15834와 아그로박테리움 튜메파시엔스 균주를 함께 잎의 원반상 조직에 동시 형질전환시킴으로써 아라비도프시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana)로부터의 모상근 배양물을 생성시키는데 사용하였다.
하기의 배지를 사용하였다:
발아 배지: MS 염/2, B5 비타민, 1.5% 슈크로스, pH 5.8, 0.7% 아가(Difco)
표준 배지: MS 배지, 0.5 g/L MES, 2% 글루코스, pH 5.8, 0.7% 아가(Difco)
유상조직 유도 배지: MS 배지, 0.5 g/L MES, 2% 글루코스, pH 5.8, 0.7% 아가(Difco), 0.2 ㎎/L, 2,4D 및 0.2 ㎎/L 키네틴
모상근 신장 배지: MS 배지, 2% 슈크로스, pH 6.2, 0.7% 아가(Difco)
뿌리 배양 배지: B5 배지, 3% 슈크로스, pH 5.5.
생체 외 아라비도프시스 싹을 하기 방식으로 살균된 종자로부터 배양하였다.
종자를 2 분간 70% EtOH로 처리한 다음 6% 활성 염소 + 0.05% 트윈 20으로 10 분 표백하고 살균 수돗물로 5 회 세척하였다. 종자를 살균 수돗물(9 ㎝ Falcon Optilux Petridish, nr. 1005 중의 약 10 내지 12 ㎖ 수돗물) 중에서 24 ℃에서 24 시간 동안 빛(30 내지 50 μEinstein m-2 초-1) 아래에서 예비 발아시켰다.
예비 발아된 종자를 발아 배지 상에 놓고 하기의 빛 관리 하에서 성장시켰다: 약 2 내지 3 주간 23 내지 24 ℃에서 12 시간 명/12 시간 암 또는 16 시간 명/8 시간 암(30 내지 50 μEinstein m-2 초-1). 아그로박테리움 라이조젠(A. rhizobene) 균주를 YEB 배지가 있는 아가 플레이트 상에서 배양한 반면, 아그로박테리움 튜메파시엔스 균주는 상기 T-DNA 벡터의 유지를 선택하기에 적합한 항생제와 함께 minA 배지가 보충된 아가 플레이트 상에서 성장시켰다.
형질전환을 위해서, 잎들을 절반씩 절단하고 유상조직 유도 배지 상에 놓았다. 아그로박테리움 라이조젠 및 아그로박테리움 튜메파시엔스 세균을 표준 배지에 재 현탁시켜 약 0.2 내지 0.3의 OD600을 획득하고, 1:1 비로 혼합하고, 약 5 분간 상기 잎 조각들의 배양에 사용하였다. 그 후에, 상기 세균 현탁액을 제거하고 감염된 잎 조각들을 표준 배지 상에 놓고 약 3 일간 배양하였다(23 내지 24 ℃; 30 μEinstein m-2 초-1; 12 시간 명/12 시간 암 또는 16 시간 명/8 시간 암).
그 후에, 잎 외식체를 500 ㎎/L의 트리카실린(Duchefa)을 함유하는 '표준 배지'로 3 회 세척하고 20 내지 30 ㎎/L 글루포시네이트 및 500 ㎎/L 트리카실린을 함유하는 (20 내지 30 ㎎/L 글루포시네이트) '표준 배지'로 옮기고 23 내지 24 ℃; 30 μEinstein m-2 초-1; 12 시간 명/12 시간 암 또는 16 시간 명/8 시간 암에서 추가 배양하였다. 잎 외식체를 매주 새로운 배지로 옮겼다. 3 내지 4 주 후에, 발아하는 뿌리를 절단하고 '모상근 신장 배지'로 옮겼다. 상기 뿌리가 수 센티미터가 되었을 때, 50 ㎖의 '뿌리 배양 배지' + 250 ㎎/L 트리카실린을 함유하는 250 ㎖ 삼각 플라스크에서 모상근 배양을 시작하였다. 상기 배양물을 23 내지 24 ℃ 암실에서 진탕하고(110 rpm) 매주 계대 배양하였다. 상기 트리카실린 농도를 점차적으로 감소시켰다.
상기 뿌리가 잘 자라고 있을 때, 상기 뿌리를 약 1.5 ㎝의 조각으로 절단하고 상기 외식체를 여러 개의 삼각 플라스크 상에 분배하였다.
모상근 배양물을 또한 고체 배지 상에서 배양할 수 있었으며, 이때 상기 배양물을 매 2주마다 새로운 '모상근 신장 배지'로 옮겼다.
유사한 프로토콜을 사용하여 목화로부터 모상근 배양물을 생성시킬 수 있다.
실시예 2: 모상근 배양물의 조직화학적 분석
실시예 1에 개시된 상이한 T-DNA 벡터를 수반하는 아그로박테리움 라이조젠과 아그로박테리움 투메파시엔스 간의 동시 감염에 의해 수득된 상이한 모상근 배양물의 근모를 상기 세포의 상이한 화합물들을 가시화하기 위해 조직화학적으로 염색하고 현미경에 의해 분석하였다.
NODC-EGFP 융합 단백질의 국소화를 상기 GFP 부분의 녹색 형광을 사용하여 가시화할 수 있다. N-아세틸글루코스아민을 N-아세틸글루코스아민(BIODESIGN)에 대한 IgM 단클론 항체와 면역학적으로 반응시킨 후에 검출하거나 또는 맥아 아글루틴 알렉사 플루오르 488을 사용하여 검출할 수 있다. 소포체를 ER-트랙커 블루 화이트(Tracker Blue White) DPX 염료를 사용하여 염색하였다. 골지체를 BODIPY-TR을 사용하여 가시화하였다. 세포벽을 칼코플루오르 화이트(Calcofluor White)(형광 증백제 28)를 사용하여 염색하였다. 핵을 훽스트 33342를 사용하여 염색하였다.
상기 조직화학적으로 염색된 근모 세포를 광학 섹션을 허용하기 위해 아포톰(Apotome)(Zeiss)이 구비된 액시오플란(Axioplan) 2 현미경(Zeiss, Jena, Germany)을 사용하여 형광 현미경 검사에 의해 검사하였다. 액시오 비젼(Axio Vision) 4.2(Zeiss)를 상 처리에 사용하였다.
하기의 프로토콜을 상이한 조직화학적 방법들에 사용하였다:
A. 세포벽의 칼코플루오르 염색.
칼코플루오르 화이트(또는 형광 증백제 28)는 자외선 조사(λmax = 350 ㎚) 하에서 투명한 청색을 띤 색상의 형광을 발하는 무색 유기 화합물이다.
염색하려는 시편을 15 내지 30 분간 50 ㎍/㎖의 최종 농도로 형광 증백제 28을 포함하는 배양 배지 또는 PBS(완충 용액)에 침지시킨다. 이어서 상기 시편을 배지 또는 완충액으로 세척하고, 샘플들을 자이스(Zeiss) 필터 세트 18을 사용하는 형광 현미경 검사를 위해 준비된 현미경을 사용하여 검사한다. 세포벽은 투명한 청색을 띤 색상의 형광을 발한다.
B. 살아있는 세포 중의 골지 복합체 및 소포제의 조직화학적 염색
골지 복합체의 염색을 위해서, 액체 뿌리 배양 배지 중에서 약 5 일간 배양한 뿌리를 사용하였다. 상기 뿌리를 신선한 뿌리 배양 배지로 세정하고 1 μM BODIPY TR C5-세라마이드(Molecular probes, Cat No B-34400)와 함께 4 ℃에서 약 30 분간 배양하였다. 상기 뿌리를 뿌리 배양 배지로 수 회 세정하고 서서히 진탕시키면서 30 분간 실온에서 신선한 뿌리 배양 배지 중에서 배양하였다. 이어서 상기 뿌리를 신선한 뿌리 배양 배지로 세정하고 필터 세트 00(여기: BP530/585; 방출: LP615)을 사용하여 형광 현미경 액시오플란 2(Zeiss, Jena, Germany)로 검사하였다.
상기 ER을 염색하기 위해서, 액체 뿌리 배양 배지에서 약 5 일간 배양한 뿌리를 사용하였다. 상기 뿌리를 신선한 뿌리 배양 배지로 세정하고 서서히 진탕시키면서 약 2 시간 동안 뿌리 배양 배지에 용해된 ER-트랙커 블루 화이트 DPX(100 nM)와 함께 배양하였다. 상기 뿌리를 뿌리 배양 배지로 수 회 세정하고 필터 세트 02(여기: G365; 방출: LP420)를 사용하여 형광 현미경 액시오플란 2(Zeiss, Jena, Germany)로 검사하였다.
C. 뿌리의 세포벽 중에 통합된 N- 아세틸글루코스아민의 전체 표본( whole mount ) 면역조직화학적 검출
상이한 모상근 배양물의 뿌리를, 50 mM GlcNAc를 보충하거나 또는 어떠한 보충도 없이 6 일간 액체 배양액에서 증식시켰다. 상기 뿌리를 하기 방식으로 고정하고 탈수시키고, 재수화시키고, 세포벽 침투시켰다.
샘플을 N-아세틸글루코스아민과 함께 배양한 경우, 과잉의 N-아세틸글루코스아민을 PBS 용액으로 4 회 10 분 배양시켜 세척한다.
샘플을 AA 용액의 배양 및 진공 침투에 의해 고정시켰다(배양: 4 회 1 시간, 매번 이어서 5 분 진공 침투를 수행하였다). AA 용액은 50% EtOH 및 5% 아세트산을 함유한다.
다음 단계에서 샘플을 50% EtOH로 세정하고 50% EtOH로 2 x 30 분 세척한 다음 70% EtOH 중에서 60 분 배양하여 탈수시킨다. 샘플을 상기 단계에서 -20 ℃에서 보관할 수 있다.
후속적으로, 상기 샘플을 50% EtOH로 5 분 세척, PBT(0.1% 트윈 20을 갖는 PBS)로 2 x 5 분 세척, PBT + 0.3% 트리톤 X100으로 2 x 5 분 세척 및 최종적으로 PBS(150 mM NaCl; 10 mM Na-포스페이트 완충액; pH 7.4)로 2 x 5 분 세척에 의해 세포벽 침투를 수행하였다.
침투된 뿌리를 MQ-수를 함유하는 페트리디쉬로 옮기고 "벡타보인(Vectaboin)-처리된" 현미경 슬라이드 상에 올려놓는다. 상기 슬라이드를 TLC 플레이트 가열기 상에서 55 ℃에서 45 분간 굽는다. 상기 슬라이드를 1 시간 동안 차단 용액(PBT 중의 1% BSA)과 함께 배양하여 차단 단계를 수행한다. 그 후에, 상기 1% 차단 용액을 N-아세틸글루코스아민(차단 용액 중의 1 ㎍/㎖; BIODESIGN, Cat No H67108M)에 대한 약 400 ㎕의 IgM 단클론 항체로 대체하고 1 시간 동안 배양한다. 상기 슬라이드를 후속적으로 5 내지 10 분간 차단 용액으로 3 회 세척한다. 이어서 상기 차단 용액을 알렉사 플루오르 488(차단 용액 중의 3 ㎍/㎖; Molecular Probes, Cat No A-21042))로 표지한 약 400 ㎕의 염소 항-마우스 IgM 항체로 대체하고 1 시간 동안 배양한다. 그 후에, 슬라이드를 차단 용액으로 5 내지 10 분 세척하고, PBT로 5 내지 10 분 2 회 세척하고, PBS로 수 회 세척하여 트윈 20을 제거한다. 결과를 필터 세트 38(여기: BP470/40; 방출: BP525/50)을 사용하는 액시오플란 2 현미경(Zeiss, Jena, Germany)을 사용하여 형광 현미경 검사에 의해 평가한다.
D. N- 아세틸글루코스아민의 밀 아글루틴 매개된 검출
상기 상이한 모상근 배양물의 뿌리를 50 mM GlcNAc를 보충하거나 임의의 보충물 없이 6 일간 액체 배양액 중에서 증식시켰다. 상기 뿌리를 상기 섹션 C에 개시한 바와 같이 고정하고 탈수시키고, 재수화시키고 세포벽 침투시켰다.
맥아 아글루티닌은 N-아세틸글루코스아민 및 N-아세틸뉴라민산 잔기에 선택적으로 결합한다. N-아세틸뉴라민산은 식물 중에 존재하지 않는다. 따라서, 식물에서 맥아 아글루티닌을 사용하여 N-아세틸글루코스아민 잔기를 특이적으로 검출할 수 있다.
침투된 뿌리를 PBT를 함유하는 9 ㎝ 페트리 디쉬에 놓았다. 그 후에 상기 뿌리를 PBT 중에 알렉사 플루오르 488(Molecular Probes, Cat No W-11261)로 표지한 맥아 아글루티닌 약 1.7 ㎍/㎖을 함유하는 6-웰 배양 플레이트의 웰로 옮기고 약 1 시간 동안 배양하였다. 상기 샘플을 후속적으로 PBT로 3 x 10 분간 및 PBS로 5 분간 2 회 세척하였다(트윈 20을 제거하기 위해서). 상기 샘플을 PBS 한 방울을 떨어뜨린 '벡타본드-처리된' 또는 '조직 택' 현미경 슬라이드 상에 놓았다. 대부분의 PBS를 제거한 후에, 커버슬라이드를 올려놓았다. 결과를 필터 세트 38(여기: BP470/40; 방출: BP525/50)을 사용하는 형광 현미경 액시오플란 2(Zeiss, Jena, Germany)를 사용하여 형광 현미경 검사에 의해 평가하였다.
E. GFP 분석
EGFP 형광성을 필터 세트 38(여기: BP470/40; 방출: BP525/50)을 사용하는 액시오플란 2 현미경(Zeiss, Jena, Germany)을 사용하여 형광 현미경 검사에 의해 평가하였다.
결과
1. 세포벽 중의 N- 아세틸글루코스아민의 국소화
키메릭 NODC 유전자를 포함하는 근모 세포를 N-아세틸글루코스아민의 존재에 대해 면역조직화학적으로 염색하고 후속적으로 칼코플루오르로 염색하여 세포벽을 가시화하였다. 도 3은 형광 현미경을 사용한 광학 섹션의 전형적인 사진 세트를 나타내며, 이때 패널 A는 세포벽을 가시화하는 (청색) 형광을 나타내고, 패널 B는 N-아세틸글루코스아민을 가시화하는 (녹색) 형광을 나타낸다. 패널 C의 두 광학 섹션의 중첩으로부터 알 수 있는 바와 같이, N-아세틸글루코스아민의 존재는 오로지 상기 근모 세포의 세포벽에서만 검출된다.
2. NODC 단백질 및 골지체의 공동 국소화
NODC-EGFP 융합 단백질을 발현하는 키메릭 유전자를 포함하는 근모 세포를 골지체의 가시화를 위해 염색하고 후속적으로 세포벽의 가시화를 위해 칼코플루오르로 염색하였다. 도 4는 형광 현미경을 사용한 광학 섹션의 전형적인 사진 세트를 나타내며, 이때 패널 B는 세포벽을 가시화하는 (청색) 형광을 나타내고, 패널 C는 골지체와 관련된 (적색) 형광을 나타내고, 패널 D는 NODC-EGFP 융합 단백질을 가시화하는 (녹색) 형광을 나타낸다. 패널 A 중의 광학 섹션들의 중첩으로부터 알 수 있는 바와 같이, 상기 NODC-EGFP 융합 단백질의 국소화는 근모 세포 중의 골지체의 국소화와 일치한다.
3. 식물 세포에서 키틴 신타제 발현은 세포벽에서 N- 아세틸글루코스아민을 검출하기 위해 GlcNAc를 외부에서 공급할 것을 요한다.
뉴로스포라 크라사로부터 키메릭 키틴 신타제를 발현하는 뿌리를, 외부에서 첨가되는 N-아세틸글루코스아민의 존재 또는 부재 하에서 상술한 바와 같이 배양하였다. 조심스럽게 세척한 후에, 상기 뿌리를 조직화학적으로 염색하여 N-아세틸글루코스아민을 검출하였다. 도 5, 패널 A(외부 GlcNAc가 공급된 모상근)에서, 다수의 녹색 형광 반점들이 검출될 수 있는 반면, 패널 B(외부 GlcNAc가 공급되지 않은 모상근)에서 매우 적은 녹색 형광 반점이 검출될 수 있었다.
실시예 3: 아라비도프시스 p35S :: NODC 모상근의 세포벽에서 키틴형 올리고머의 생화학적 증명
T-DNA 벡터 pTGK42를 사용하여 수득한 p35S:NODC-p35S:bar에 대한 트렌스제닉인 아라비도프시스 탈리아나(Co1-0) 모상근 및 pTCO192(대조용)를 사용하여 수득한, p35S:bar에 대한 트렌스제닉인 대조용 아라비도프시스 탈리아나(Co1-0) 모상근을 모간 엘슨(Morgan-Elson) 분석을 사용하여 N-아세틸글루코스아민의 존재에 대해 분석하였다.
이를 위해서, 약 100 ㎎의 모상근을 약 20 ㎕의 완충액(25 nM K-포스페이트 완충액 pH 6.0) 중에 수확하고 바닷모래로 분쇄하고, 침전시키고 상기 추출물의 단백질 함량을 측정하였다(표준화를 위해서). 상등액을 제거하고 뿌리를 완충액 100 ㎕에 재현탁시켰다. 1 단위의 셀룰라제(트리코더마 비리데(Trichoderma viride)로부터의 셀룰라제 "Onozuka R-10"(Serva, Cat No16419): 완충액 중의 10 U/㎖) 또는 1 단위의 키티나제(세라티아 마르세센스( Serratia marcescens)로부터의 키티나제(Sigma, Cat No C1650): 완충액 중의 10 U/㎖) 또는 상기 둘을 모두 상이한 샘플들에 첨가하고 25 ℃에서 밤새 배양하였다.
N-아세틸글루코스아민을 측정하기 위해서 모간 엘슨 분석을 다음날 아침 상기 샘플들에 대해 수행하였다. 사용된 비색측정 방법(모간 엘슨 반응을 기본으로 한다)에서, 상기 N-아세틸글루코스아민 환원 단부를 100 ℃에서 알칼리 조건 하에 색원체 I 및 II로 연속적으로 전환시킨다. 후속적으로 농축된 HCl 및 농축된 황산의 혼합물로 처리한 결과 물이 제거되어 상기 모건 엘슨 반응의 색원체 III이 생성된다. 상기 반응의 최종 단계에서, 색원체 III을 DMAB, p-다이메틸아미노벤즈알데하이드(얼리치(Ehrlich) 시약)와 반응시켜 적색 생성물이 형성되고, 그의 농도를 585 ㎚에서 흡광도를 측정하여 측정할 수 있다.
UDP N-아세틸글루코스아민, 및 N-아세틸글루코스아민-1-포스페이트는 이들을 먼저 산으로 가수분해시키지 않는 한 시험할 수가 없다. 상기 뉴클레오타이드들을 100 ℃에서 0.01 N 산 중에서 15 분간 가열하여 가수분해시킬 수 있으나, 당 포스페이트는 보다 엄격한 조건, 예를 들어 100 ℃에서 0.1 N HCl 중에서 5 분을 요한다.
결과를 표 2에 요약한다.
Figure 112013061315284-pat00003
상기 결과로부터 키틴형 중합체들이 세포벽 중에 매몰되어 있다는 결론을 내릴 수 있다.
실시예 4: HPTLC 를 사용한 식물 세포벽 물질 중의 키토 -올리고 및 모노사카라이드의 분석
실시예 1의 아라비도프시스 모상근(35S::NODC; 35S::NODC_EGFP) 및 35S::bar 모상근의 세포벽을 하기 프로토콜에 따라 제조하였다.
세포벽의 제조
-모상근 수확; 조직을 갖는 배지의 대부분을 회수한다
-조직을 PBS 완충액으로 세척한다
-약 1 g의 조직을 튜브에 넣는다
-액체 질소로 동결시킨다
-조직을 막자사발에서 분쇄한다
-분쇄된 조직을 치즈 보가 있는 깔때기로 옮긴다
-수 리터의 탈염수로 세척한다
-상기 치즈 보를 밀봉하고 500 ㎖ 에탄올을 함유하는 500 ㎖ 병으로 옮긴다
-에탄올 500 ㎖로 15 분 세척하고, 에탄올로 깨끗하게 하고, 추가로 15 분간 세척한다
-에탄올을 에테르 250 ㎖로 대체하고 15 분간 세척한다.
남은 물질이 '세포벽 물질'이다. 상기 세포벽 물질을 건조 및 칭량하고 상기를 튜브로 옮긴다.
세포벽 물질로부터 키토 올리고의 추출
-MQ-수 300 ㎕를 세포벽 물질 10 ㎎(25 또는 50 ㎖ 튜브를 사용한다)에 가하고, 3 분간 비등시키고, 80 ℃에서 2 시간 동안 배양한다(진탕시킨다). 상기 세포벽 물질을 키티나제 및 β-N-아세틸글루코스아미니다제 효소 혼합물: 125 mM Na-포스페이트-2 mM CaCl2(pH 6) 50 ㎕ 중의 0.5 U 키티나제(Chitinase Sigma C7809 또는 C6137 → (키토-올리고)사카라이드가 N-아세틸글루코스아민으로 매우 급속히 절단된다. Chitinase BioLabs P5206S → 펜타-N-아세틸키토스가 다이- 및 트라이- 키토-올리고로 절단된다(서서히))로 절단시킬 수 있다
-효소 혼합물 100 ㎕를 약 5 ㎎의 세포벽 물질에 가한다
-25 ℃에서 밤새 배양한다
-원심분리에 의해 완충액을 상기 세포벽 물질로부터 분리시킬 수 있다.
추출 후에, 상기 키토-올리고를 함유하는 완충액을 H2O 중의 키토-올리고사카라이드 표준 용액의 혼합물과 함께 HPTLC 플레이트(HPTLC 플레이트 NH2(형광 지시자 부재) 10 x 20 ㎝(Merck, Art. 12572)) 상에 스폿팅한다. 상기 표준 용액은 N-아세틸글루코스아민, 키토바이오스, 키토트라이오스, 키토테트라오스 및 키토펜타오스를 포함한다.
하기의 전개 용매를 사용할 수 있다:
·n-부탄올(70):아세트산(20):H2O(10)(완충액 D)
·아세토나이트릴(76):H2O(24):0.5% 붕산 수용액(10)(완충액 A)
·아세토나이트릴(10):아이소프로판올(67):50 mM KCl(23)(완충액 B)
·n-부탄올(50):에탄올(30):H2O(20)(완충액 C)
크로마토그래피
-플레이트를 메탄올로 전개시켜 깨끗이 한다
-약 6 ㎜ 길이의 밴드 중에 1(-2) ㎕의 표준 용액(기부로부터 15 ㎜) 및 1 내지 5 ㎕의 샘플을 스폿팅한다
-플레이트를 'CAMAG 트윈 쓰루 챔버'에서 전개시킨다: 7 내지 7.5 ㎝ 이동 거리
-트윈 쓰루 챔버: 10 x 10 ㎝ 플레이트 → 10 ㎖ 전개액
20 x 10 ㎝ 플레이트 → 20 ㎖ 전개액
-플레이트를 통풍기로 건조시킨다
-플레이트를 약 150 ℃에서 20 분간 가열한다(TLC 플레이트 가열기)
-당을 UV(366 ㎚)로 가시화한다.
2D-크로마토그래피
-플레이트를 메탄올로 전개시켜 깨끗이 한다
-3 ㎜의 밴드 중에 1 내지 5 ㎕의 샘플을 스폿팅한다: 플레이트에 직각(기부에서부터 15 ㎜ 및 장소로부터 15 ㎜)
-플레이트를 'CAMAG 트윈 쓰루 챔버'에서 첫 번째 방향으로 전개시킨다: 7 내지 7.5 ㎝ 이동 거리
-트윈 쓰루 챔버: 10 x 10 ㎝ 플레이트 → 10 ㎖ 전개액
-플레이트를 통풍기로 건조시킨다
-플레이트를 다른 방향으로 전개시킨다
-플레이트를 통풍기로 건조시킨다
-플레이트를 약 150 ℃에서 20 분간 가열한다(TLC 플레이트 가열기)
-당을 UV(366 ㎚)로 가시화한다.
도 6은 1 차원 HPTLC의 결과를 나타내며, 이때 세포벽 물질은 추출하였지만 키티나제로 추가 절단은 하지 않았다. 도 7은 키티나제로 절단 후의 2 차원 HPTLC의 결과를 나타낸다. 키토 올리고머를 대조용 식물에서 검출할 수 없지만, N-아세틸글루코스아민 트랜스퍼라제 유전자를 포함하는 식물 중에는 상당량의 키토 올리고머가 존재한다.
트랜스제닉 아라비도프시스 식물을 또한 실시예 1에 개시한 키메릭 유전자를 사용하여 생성시켰다. 상기 물질은 상술한 모상근 배양물보다 더 균일하다. 세포벽 물질을 제조하고, 키토 올리고사카라이드를 개시한 바와 같이 추출하였으며, HPTLC를 본 발명에 개시한 바와 같이 완충액 A에서 수행하였다. 결과를 도 8에 나타낸다.
트랜스제닉 35S::NodC 아라비도프시스 싹으로부터의 세포벽 물질은 약 5 ㎍/㎎의 세포벽 물질 또는 0.01%의 신선한 잎 물질인 표준 용액에 대해 비교 평가 시, 다량의 키토-트라이오스를 나타내었다.
실시예 5: 아라비도프시스 모상근 배양물로부터 식물 세포벽 물질의 염색
아라비도프시스 모상근 배양물을 실시예 1에서와 같이 생성시켰으며, 그의 세포벽 물질을 실시예 5에 개시한 바와 같이 제조하고 -20 ℃에서 보관하였다. 상기 세포벽 물질을 음이온성 염료(콩고 레드) 또는 아미노 반응성 염료(알렉사 플루오르 488 테트라플루오로페닐 에스터)로 염색하였다.
A. 콩고 레드 염색
- -20 ℃에서 보관한, NODC 모상근 또는 대조용 식물로부터의 세포벽 물질을 아세테이트 완충액(pH 5)(50 ㎎ 세포벽 물질/튜브)에서 재수화시켰다
- 상기 물질을 아세테이트 완충액(pH 5)에 용해된 0.03% 콩고 레드로 염색하였다
- 상기 세포벽 물질을 아세테이트 완충액(pH 5) 및 PBS 완충액으로 수 회 세척하였다
- 모든 세포벽 물질을 48 다중 웰 플레이트의 웰로 옮겼다
- 표준 조명 조건 하에서, 개별적인 웰로부터 디지털 상을 취하고 상기 디지털 상의 평균 회색 값을 측정하였다.
결과:
Figure 112013061315284-pat00004
키메릭 NodC 유전자를 함유하는 모상근으로부터의 세포벽 물질은 대조용 식물로부터의 세포벽 물질보다 더 진하게 재현가능하게 염색되었다. 상기 세포벽 물질의 회색 값은 대조용 식물의 경우보다 약 5 내지 10% 더 낮았다.
B. 알렉사 플루오르 488 테트라플루오로페닐 에스터 염색
- -20 ℃에서 보관한, NODC 모상근 또는 대조용 식물로부터의 세포벽 물질을 PBS 완충액(pH 5)(50 ㎎ 세포벽 물질/튜브)에서 재수화시키고 56 ℃에서 밤새 프로테이나제 K(100 ㎍/㎖)로 처리하였다
- 상기 물질을 PBS 완충액으로 철저히 세척하고 알렉사 플루오르 488 테트라플루오로페닐 에스터로 표지하였다. 알렉사 플루오르 488 TFP 에스터는 키트(알렉사 플루오르 488 단클론 항체 표지화 키트(Molecular Probes, A-20181))로서 입수할 수 있다
- 상기 염색된 물질을 예를 들어 자이스 필터 38을 갖는 형광 현미경 검사를 사용하여 검사할 수 있다.
키메릭 NodC 유전자를 함유하는 모상근으로부터의 세포벽 물질은 대조용 식물로부터의 세포벽 물질보다 더 진하게 재현가능하게 염색되었다.
실시예 6: 트랜스제닉 목화
실시예 1에 개시한 바와 같은 키메릭 NODC 유전자, 또는 F285 섬유 선택성 프로모터의 조절 하의 키메릭 NODC 유전자(US2003/106097에 개시한 바와 같이)를 포함하는 트랜스제닉 목화를 US6483013에 개시한 바와 같은 방법을 사용하여 생성시킨다.
상기 트랜스제닉 목화들로부터의 섬유를 단리하고, 이를 사용하여 개선된 반응성, 예를 들어 개선된 염색성을 갖는 얀 및 직물을 제조한다.
실시예 7: 증가된 반응성을 갖는 면 섬유
CaMV35S 프로모터에 작용적으로 결합된 키메릭 NodC 암호화 부위를 포함하는 트랜스제닉 목화를 실시예 6에 개시한 바와 같이 생성시켰다. 성숙한 면 섬유를 상기 식물로부터 수확하고 콩고 레드로 염색하거나 WGA-알렉사 플루오르 555와 반응시켰다.
A. 콩고 레드 염색
성숙한 면 섬유를 키메릭 NodC 유전자를 포함하는 트랜스제닉 목화뿐만 아니라 키메릭 NodC 유전자를 포함하지 않는 대조용 식물로부터 수확하였다. 지질을 에탄올 및 에테르 세척에 의해 상기 섬유로부터 제거하였다. 상기 면 섬유를 건조시켰다.
25 ㎎의 섬유를 아세테이트 완충액(pH 5)으로 재수화시키고 아세테이트 완충액(pH 5) 중에 용해된 0.03% 콩고 레드로 염색하였다. 상기 세포벽 물질을 아세테이트 완충액(pH 5) 및 PBS 완충액으로 수 회 세척하였다.
상기 염색된 섬유를 명시야 현미경 검사 및 형광 현미경 검사(Zeiss filter 18)에 의해 분석하였다. 48 다중 웰 플레이트 중의 염색된 섬유의 디지털 상을 또한 실시예 5A에 개시된 바와 같이 분석하였다.
명 시야 현미경 검사 하에서, 상기 NodC 트랜스제닉 목화로부터 수확한 면 섬유는 비 트랜스제닉 식물로부터의 면 섬유보다 더 진한 적색을 나타내었다. 이러한 차이는 상기 섬유들을 형광 현미경 검사 하에서 분석할 때 훨씬 더 현저하였다.
상기 트랜스제닉 NodC 식물로부터의 콩고 레드 염색된 면 섬유에 대해 수득한 평균 회색 값이 또한 비 트랜스제닉 식물로부터의 면 섬유의 경우보다 현저하게 더 낮았으며, 이는 상기 트랜스제닉 목화의 섬유들이 음이온성 염료에 의해 보다 진하게 염색됨을 입증하였다.
Figure 112013061315284-pat00005
상기 염색 차는 유지되었으며 섬유를 한 시간 이상 고온 NaOH(80 ℃에서 60%)로 처리한 경우 심지어 증대되었다. 이러한 처리는 단백질, 펙틴 물질 및 왁스를 제거하며, 키토 올리고머를 탈아세틸화시킬 수 있다.
상기 진해진 콩고 레드 염색은 개별적인 섬유 세포의 실제 현미경검사 섹션을 제조한 경우 관찰할 수 있는 바와 같이 세포벽 중에 더욱 고르게 분포되었다.
B. WGA - 알렉사 555 염색
트랜스제닉 NodC 식물로부터의 면 섬유 중의 N-아세틸글루코스아민 올리고머의 검출을 필수적으로 실시예 2에 개시한 바와 같이 수행하였다. 면 섬유는 탈수 또는 침투시킬 필요가 없다. 대신에, 상기 섬유를 클로로폼:메탄올 혼합물(1:1)로 10 분간 3 회 처리한 다음 아세톤으로 10 분간 2 회 처리하고 에테르로 5 분간 2 회 처리함으로써 지질 및 왁스를 제거하였다. 상기 섬유를 공기 건조시켰다.
섬유를 WGA-알렉사555, WGA-알렉사488 또는 WGA-테트라메틸로다민으로 염색하였다.
상기 섬유를 차단 용액(150 mM NaCl, 10 mM 나트륨포스페이트 완충액 pH 7.4; 0.1% 트윈 20 및 1% 소 혈청 알부민)에 넣고 1 시간 동안 배양하였다. 그 후에, 상기 완충액을 WGA-형광색소를 함유하는 상기 동일 완충액으로 대체하고 4 시간 동안 배양하였다. 상기 WGA-형광색소 용액을 차단 용액으로 대체하고, 10 분 세척한 다음 BSA가 없는 차단 용액으로 3 회 10 분 세척하고 BSA 및 트윈이 없는 차단 용액으로 2 회 5 분 세척하였다. 상기 염색된 섬유들을 현미경 슬라이드 상에 올려놓고, 알렉사 플루오르 488 콘쥬게이트의 경우 필터세트 38(여기: BP470/40; 방출: BP525/50) 또는 알렉사 플루오르 555 또는 테트라메틸로다민 콘쥬게이트의 경우 필터세트 20(여기: BP546/12; 방출: BP575-640)을 사용하는 현미경 검사(액시오플란 2(Zeiss, Jena, Germany))에 의해 평가하였다.
비 트랜스제닉 식물로부터의 면 섬유 중에서 특정한 형광을 검출할 수 없는 반면, 키메릭 NodC 유전자 포함 목화로부터의 면 섬유에서는 밝은 형광을 검출할 수 있었다(도 9 참조). 상기 면 섬유의 실제 현미경검사 섹션은 WGA-플루오르555가 상기 면 섬유 세포의 2 차 세포벽 전체를 통해 고르게 분포되어 있음을 나타내었다.
실시예 9: 뉴로스포라 크라사로부터의 키틴 신타제를 포함하는 아라비도프시스 모상근의 세포벽의 골지 표적화 신호와의 반응성
표준 재조합 DNA 기법을 사용하여, 하기 작용적으로 결합된 DNA 단편을 함유하는 이종 골지 표적화 신호 서열을 포함하는 식물 발현성 N-아세틸글루코스아민 트랜스퍼라제를 제작하였다:
·CaMV로부터의 35S 프로모터 부위
·번역되지 않은 리더 서열(5'Cab22L)을 암호화하는 DNA 단편
·아라비도프시스 탈리아나로부터의 β-1,2-자일로실트랜스퍼라제의 35 N-말단 아미노산을 암호화하는 DNA 단편
·선행 DNA 단편과 인 프레임 클로닝된 뉴로스포라 크라사( Neurospora crassa)의 CHS2(키틴 신타제)를 암호화하는 DNA 단편
·CaMV(3'35S)의 35S 전사물로부터의 전사 종결 및 폴리아데닐화 신호.
상기 키메릭 유전자를 포스피노트리신에 대한 내성을 제공하는 키메릭 bar 유전자와 함께 T-DNA 벡터의 T-DNA 경계 사이에 도입시켰다. 생성된 T-DNA 벡터를 pTDBI37이라 명명하였다. 상기 벡터의 T-DNA의 서열을 서열식별번호 13에 제공한다.
상기 T-DNA 벡터를 아그로박테리움 튜메파시엔스에 도입시키고 이를 사용하여 실시예 1에 개시된 바와 같은 모상근 배양물을 제조하였다.
N-아세틸글루코스아민 올리고머를 형광 현미경 검사에 의해, 플루오레세인에 공액된 키틴 결합 영역과 함께 배양 후에 상기 모상근 세포벽의 배양물 중에서 검출할 수 있었다.
N-아세틸글루코스아민 올리고머를 또한 실시예 2에 개시된 바와 같이 WGA-알렉사555를 사용하여 모상근 세포벽의 배양물에서 검출할 수 있었다. 또한, 상기 골지체에 상응하는, 세포질 중의 소구체들과 관련된 형광을 또한 관찰할 수 있었다.
실시예 9: 면 섬유의 질소 함량의 측정
성숙한 목화 볼을 실시예 7의 트랜스제닉 목화로부터 수확하였다. 각각의 볼로부터, 20 ㎎의 깨끗한 섬유를 분석하였다. 이를 위해서, 지질 및 왁스를 클로로폼:메탄올(1:1) 혼합물 중에서 3 회 20 분; 아세톤 중에서 2 회 20 분; 에테르 중에서 2 회 5 분 세척하여 상기 섬유로부터 제거하고 공기 건조시켰다.
상기 섬유 표면의 총 질소를 '총 질소' 분석 키트 및 HANNA 인스트루먼츠(Rhode Island, USA)의 C214 다중 매개변수 벤치 광도계를 사용하여 측정하였다.
하기의 결과를 획득하였다:
Figure 112013061315284-pat00006
상기 트랜스제닉 주로부터의 목화 볼의 섬유는 표면에서 야생형 목화 볼의 섬유보다 통계학적으로 현저하게 더 많은 질소를 함유하였다.
실시예 10: 목화에서 키틴 신타제의 섬유 특이적 발현
표준 재조합 DNA 기법을 사용하여, 하기의 작용적으로 결합된 DNA 단편을 함유하는 이종 골지 표적화 신호 서열을 포함하는 식물 발현성 N-아세틸글루코스아민 트랜스퍼라제를 제작하였다:
·목화로부터의 섬유 특이적 프로모터 부위
·번역되지 않은 리더 서열(5'Cab22L)을 암호화하는 DNA 단편
·아라비도프시스 탈리아나로부터의 β-1,2-자일로실트랜스퍼라제의 35 N-말단 아미노산을 암호화하는 DNA 단편
·선행 DNA 단편과 인 프레임 클로닝된 뉴로스포라 크라사의 CHS2(키틴 신타제)를 암호화하는 DNA 단편
·CaMV(3'35S)의 35S 전사물로부터의 전사 종결 및 폴리아데닐화 신호.
상기 키메릭 유전자를 포스피노트리신에 대한 내성을 제공하는 키메릭 bar 유전자와 함께 T-DNA 벡터의 T-DNA 경계 사이에 도입시켰다. 생성된 T-DNA 벡터를 pTDBI50이라 명명하였다. 상기 벡터의 T-DNA의 서열을 서열식별번호 14에 제공한다.
상기 T-DNA 벡터를 아그로박테리움 튜메파시엔스에 도입시키고 이를 사용하여 트랜스제닉 목화를 제조한다. 트랜스제닉 식물의 목화 볼로부터 단리된 섬유는 세포벽 전체를 통해 다소 균일하게 분포된, 증가된 양의 N-아세틸글루코스아민 올리고머를 갖는다.
SEQUENCE LISTING <110> Bayer BioScience N.V. De Block, Marc Meulewaeter, Frank Koch, Rainhard Essigmann, Bernd <120> Methods for altering the reactivity of plant cell walls <130> BCS 05-2016-WO1 <150> EP 05076488.5 <151> 2005-06-24 <150> US 60/698182 <151> 2005-07-11 <150> EP 06008463.9 <151> 2006-04-25 <160> 15 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 395 <212> PRT <213> Azorhizobium caulinodans <400> 1 Met Ser Val Val Asp Val Ile Gly Leu Leu Ala Thr Ala Ala Tyr Val 1 5 10 15 Thr Leu Ala Ser Ala Tyr Lys Val Val Gln Phe Ile Asn Val Ser Ser 20 25 30 Val Thr Asp Val Ala Gly Leu Glu Ser Asp Ala Leu Pro Leu Thr Pro 35 40 45 Arg Val Asp Val Ile Val Pro Thr Phe Asn Glu Asn Ser Ser Thr Leu 50 55 60 Leu Glu Cys Val Ala Ser Ile Cys Ala Gln Asp Tyr Arg Gly Pro Ile 65 70 75 80 Thr Ile Val Val Val Asp Asp Gly Ser Thr Asn Lys Thr Ser Phe His 85 90 95 Ala Val Cys Asp Lys Tyr Ala Ser Asp Glu Arg Phe Ile Phe Val Glu 100 105 110 Leu Asp Gln Asn Lys Gly Thr Ala Ala Gln Met Glu Ala Ile Arg Arg 115 120 125 Thr Asp Gly Asp Leu Ile Leu Asn Val Asp Ser 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gggcagcccg atgacagcga ccacgctctt gaagccctgt 540 gcctccaggg acttcagcag gtgggtgtag agcgtggagc ccagtcccgt ccgctggtgg 600 cggggggaga cgtacacggt cgactcggcc gtccagtcgt aggcgttgcg tgccttccag 660 gggcccgcgt aggcgatgcc ggcgacctcg ccgtccacct cggcgacgag ccagggatag 720 cgctcccgca gacggacgag gtcgtccgtc cactcctgcg gttcctgcgg ctcggtacgg 780 aagttgaccg tgcttgtctc gatgtagtgg ttgacgatgg tgcagaccgc cggcatgtcc 840 gcctcggtgg cacggcggat gtcggccggg cgtcgttctg ggtccatggt tatagagaga 900 gagatagatt tatagagaga gactggtgat ttcagcgtgt cctctccaaa tgaaatgaac 960 ttccttatat agaggaaggg tcttgcgaag gatagtggga ttgtgcgtca tcccttacgt 1020 cagtggagat gtcacatcaa tccacttgct ttgaagacgt ggttggaacg tcttcttttt 1080 ccacgatgct cctcgtgggt gggggtccat ctttgggacc actgtcggca gaggcatctt 1140 gaatgatagc ctttccttta tcgcaatgat ggcatttgta ggagccacct tccttttcta 1200 ctgtcctttc gatgaagtga cagatagctg ggcaatggaa tccgaggagg tttcccgaaa 1260 ttatcctttg ttgaaaagtc tcaatagccc tttggtcttc tgagactgta tctttgacat 1320 ttttggagta gaccagagtg tcgtgctcca ccatgttgac gaagattttc ttcttgtcat 1380 tgagtcgtaa aagactctgt atgaactgtt cgccagtctt cacggcgagt tctgttagat 1440 cctcgatttg aatcttagac tccatgcatg gccttagatt cagtaggaac taccttttta 1500 gagactccaa tctctattac ttgccttggt ttatgaagca agccttgaat cgtccatact 1560 ggaatagtac ttctgatctt gagaaatatg tctttctctg tgttcttgat gcaattagtc 1620 ctgaatcttt tgactgcatc tttaaccttc ttgggaaggt atttgatctc ctggagattg 1680 ttactcgggt agatcgtctt gatgagacct gctgcgtagg aacgcggccg ctgtacaggg 1740 cccgggcata tggcgcgccg gtacccaacc tctcgagctg ccatattggg tttttcacta 1800 cccacctctt cattaaatgt atcttcaacc tctcaactcc tttcaccacc agacgaatct 1860 tctttagcaa aatcaaaatg accttatgaa aatttagcac gtccacctcc agattcaaag 1920 gctgtgaatc cccaacttcg gaaattgttc atctccacat tcaagaataa tgagttcctc 1980 aatttgtttt aactgattag ccgatattaa gcgagttaga ctccatggaa ataaaatcac 2040 cctaataaat agcaacgctt ttgaacgtct ctaggttcca agcgtgctaa ggagcgccag 2100 taacttcaat ccaagttgtg cgaaaacgta tgaaatggaa ctgagaccag cgttcaacat 2160 cgatgaaaat ttgttttaac aatgagaact gcaaatcctc catagtcttc taacatttca 2220 acattcgaaa tctcgaaaag aaattggctt gatatgattt atttagggtg ttaattttat 2280 gtattataat aatgcacaaa ttgatatttt atgcatcaca tttaatattt ttaaagtata 2340 taatatcaaa tcattttatg aaaataaaaa taccaaataa tacataaatt gatagttcaa 2400 gtatttcatt aaaaattttc aaaatataaa tatcatattg aaacatttta taaaagaata 2460 gataccaaat atgacatcat cccctgttga gagtaaccaa acactgtttt catccagccc 2520 atgagaagta tttggcccaa aagcaaaagt ttcagtacaa tgaattatga atcccaaaaa 2580 aaccccaagt ggtccaggtc caagccagtc tagggctgag gaaagaaatg gaaaaattga 2640 aaagtaattc cagggtctga ttcaatttta ttaaatttag tttgattttg gtttcggttc 2700 ataaatttaa aaataatttt aaaatgttat ataaaactgt tttttaaaaa taaattaatc 2760 aataatctaa aacgataaaa atggcgattt gaattaagct catattttga aaaaaaaata 2820 aaaattatct catccagaac tgattaaaac cgaaccgatg aatcctagaa gccaagccaa 2880 gtgtgcagag taagaataga acatcaacat tttgctttaa gcttttcgtt gcttgcactc 2940 taagaagcat aaaacgcaag caaaacttga cactagtgtg agtgtgagtg cccatcattc 3000 atcaaccctg aaaatcgccc ttcccctaat cagttctaac ctcactttct aacactttca 3060 ctgcagcact caaaaacatt cgccgaatct ttactataaa ctcccagtgt tggtttctcc 3120 actccaaacc caaaccacga ccaccacatt ttgcttcgta tctttgatat ctagatctcc 3180 cgggagctca tttctctatt acttcagcca taacaaaaga actcttttct cttcttatta 3240 aaccaaaacc atggatgagt aaacggaatc cgaagattct gaagattttt ctgtatatgt 3300 tacttctcaa ctctctcttt ctcatcatct acttcgtttt tcactcatcg tcgttttcag 3360 ccaaaaccat ggagtccaga atcagcaacc ggttatcgag ttccgccaca aggacggtac 3420 gagccttcag aaatcgatgt catgccaggc cagggacacc gggatcgagt tacggaaatg 3480 cgaggcgacc gcttccctcg gcaccagcgc ctttacacta caatagccca agtcgcgcag 3540 cgagtcatta tccacggtac catggaggtt atgcggacga cgtgacagtt agcatgggac 3600 cggacgacga tcgtacagat atctttggcc ccgaaaccga tctcagcgaa acgcgccacc 3660 tcaacgacgc atacgggttt cggtcatccc agatcaccct cagcgaagat ccccacggca 3720 cccacgcgcg ttcccggtac gacgacgaag acgatgtgag caccacttat tcctccaaca 3780 cgggcaccag cgcttcaggt gtcgacaagt tcgagcatta cggtcccatt ccggaggaag 3840 gcaagcacga gcggcgcggc gtgcgaccac cacagatgtc gaggaaggaa gtccagctca 3900 tcaacggcga actcgttctc gagtgcaaga ttccgactat attgtattcg tttttgccca 3960 ggagagacga agtggagttt acgcacatgc ggtacacagc cgtcacttgt gaccctgatg 4020 actttgttgc caggggttac aagttgcgcc agaatatcgg tcgtaccgcc agggagacgg 4080 agctgttcat ctgcgtgacc atgtacaacg aggacgagtt cggattcaca cggactatgc 4140 acgcagtcat gaagaacatt tcgcattttt gttcccgaaa caagagtagg acgtggggag 4200 cggatgggtg gcagaagatt gtggtctgtg tggtttcgga tggacgagag atcattcacc 4260 cccggacctt ggacgccctc gcagccatgg gcgtttacca gcacggtatc gccaagaact 4320 ttgtcaacca gaaggcggtg caggcccacg tttacgagta cacgacacaa gtgtctctgg 4380 acagcgacct caagttcaag ggcgccgaga agggcatcgt gccctgccag atgatttttt 4440 gcttgaagga gaagaaccaa aagaaactca actcgcatag atggttcttc aacgcctttg 4500 gcaaagcctt gaacccgaat gtgtgtatcc tcctagacgt cggcacccgc cccggcggca 4560 caagtctcta ccatctctgg aaagccttcg acacggattc caacgtggcg ggggcctgcg 4620 gggaaatcaa agcgatgaag gggcggtttg gcgggaattt gctcaaccct ctggtggcta 4680 gtcagaactt tgagtacaag atgagcaata ttctggacaa accgttggag tcggtgtttg 4740 ggtacatcac ggtgttgccg ggcgccttgt cggcgtatcg gtaccatgcg ctgcagaacg 4800 atgagacggg ccatgggccg ttgagtcagt atttcaaggg cgagacgctc catgggcagc 4860 acgcggatgt gtttacggcg aacatgtact tggccgagga ccgaattctg tgttgggagt 4920 tggtggccaa gaggggtgag aggtgggtgt tgaagtatgt gaaggggtgt acgggtgaga 4980 cggatgtgcc tgacaccgtc ccggaattcg tctcgcaacg tcgtcgttgg ctcaacggtg 5040 ccttcttcgc cgccgtctac tccctcgtcc actttcgaca aatctggaaa accgaccaca 5100 cctttatgcg caaagccctt ctccacgtcg aattcctcta ccacctcctg caactcctct 5160 tcacctactt ctccctggcc aacttctacc tcgccttcta ctttatcgcc ggcggtctcg 5220 ccgatcccca cgtcgaccct tttaactcgg acggccacgt cgcgcgcatc atcttcaaca 5280 tcctccgcta cgtctgcgtc ctgctgatct gcacacaatt catcttgtcc ctcggcaacc 5340 gtccgcaggg tgccaaaaga atgtatctcg catccatgat catctacgcc gtcatcatgg 5400 tgtacaccac cttcgccacc atcttcatcg tcgtgcgaca aatccaaccc tctcaaaaat 5460 ccgacgacaa gcccgacctc gaactcggca acaacgtctt caccaacctg atcgtctccg 5520 tggctagtac cctcgggctc tacttcgtca tgtcctttct ctatctcgac ccctggcaca 5580 tgttcacctc ggccatccag tactttgtcc tgctgccttc ctacatctgc acgctccaga 5640 tctacgcctt ttgcaacacc cacgacgtca catggggcac caaaggcgac aacgtgatgc 5700 gcaccgatct cggaggcgcc attggcaagg gaagcaccgt cgaactggaa atgccttcgg 5760 accaactcga catcgactcg ggatacgacg aatgtctacg taatctccgc gatcgcgtca 5820 tggtccctgc cgttcccgtg tccgaggacc agctgcagca ggattactac aagtcggtgc 5880 gcacgtacat ggtggtgtcg tggatggtgg ccaacgcgac gctggccatg gcggtctcgg 5940 aagcgtatgg cgattcggaa attggggata atttttactt gcggtttatc ctgtgggcgg 6000 tggcggccct ggcgctgttt agagcgttgg ggtcgacgac gtttgcggcg attaatctgg 6060 tgagtgctct cgtggagggc agggtcaggc tgaggttgaa tatgaaaggg tttaggtgga 6120 ttaaggagaa gtggggggat gcggatgtga agggcaagtt tgaggggttg ggggatcggg 6180 cgagggggtt ggcgaggcgg tgagctagca agcttggaca cgctgaaatc accagtctct 6240 ctctacaaat ctatctctct ctattttctc cataataatg tgtgagtagt tcccagataa 6300 gggaattagg gttcctatag ggtttcgctc atgtgttgag catataagaa acccttagta 6360 tgtatttgta tttgtaaaat acttctatca ataaaatttc taattcctaa aaccaaaatc 6420 cagtactaaa atccagatca tgcatggtac agcggccgcg ttct 6464 <210> 15 <211> 982 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Chitin synthase operably linked to XylT Golgi targeting signal <400> 15 Met Ser Lys Arg Asn Pro Lys Ile Leu Lys Ile Phe Leu Tyr Met Leu 1 5 10 15 Leu Leu Asn Ser Leu Phe Leu Ile Ile Tyr Phe Val Phe His Ser Ser 20 25 30 Ser Phe Ser Ala Lys Thr Met Glu Ser Arg Ile Ser Asn Arg Leu Ser 35 40 45 Ser Ser Ala Thr Arg Thr Val Arg Ala Phe Arg Asn Arg Cys His Ala 50 55 60 Arg Pro Gly Thr Pro Gly Ser Ser Tyr Gly Asn Ala Arg Arg Pro Leu 65 70 75 80 Pro Ser Ala Pro Ala Pro Leu His Tyr Asn Ser Pro Ser Arg Ala Ala 85 90 95 Ser His Tyr Pro Arg Tyr His Gly Gly Tyr Ala Asp Asp Val Thr Val 100 105 110 Ser Met Gly Pro Asp Asp Asp Arg Thr Asp Ile Phe Gly Pro Glu Thr 115 120 125 Asp Leu Ser Glu Thr Arg His Leu Asn Asp Ala Tyr Gly Phe Arg Ser 130 135 140 Ser Gln Ile Thr Leu Ser Glu Asp Pro His Gly Thr His Ala Arg Ser 145 150 155 160 Arg Tyr Asp Asp Glu Asp Asp Val Ser Thr Thr Tyr Ser Ser Asn Thr 165 170 175 Gly Thr Ser Ala Ser Gly Val Asp Lys Phe Glu His Tyr Gly Pro Ile 180 185 190 Pro Glu Glu Gly Lys His Glu Arg Arg Gly Val Arg Pro Pro Gln Met 195 200 205 Ser Arg Lys Glu Val Gln Leu Ile Asn Gly Glu Leu Val Leu Glu Cys 210 215 220 Lys Ile Pro Thr Ile Leu Tyr Ser Phe Leu Pro Arg Arg Asp Glu Val 225 230 235 240 Glu Phe Thr His Met Arg Tyr Thr Ala Val Thr Cys Asp Pro Asp Asp 245 250 255 Phe Val Ala Arg Gly Tyr Lys Leu Arg Gln Asn Ile Gly Arg Thr Ala 260 265 270 Arg Glu Thr Glu Leu Phe Ile Cys Val Thr Met Tyr Asn Glu Asp Glu 275 280 285 Phe Gly Phe Thr Arg Thr Met His Ala Val Met Lys Asn Ile Ser His 290 295 300 Phe Cys Ser Arg Asn Lys Ser Arg Thr Trp Gly Ala Asp Gly Trp Gln 305 310 315 320 Lys Ile Val Val Cys Val Val Ser Asp Gly Arg Glu Ile Ile His Pro 325 330 335 Arg Thr Leu Asp Ala Leu Ala Ala Met Gly Val Tyr Gln His Gly Ile 340 345 350 Ala Lys Asn Phe Val Asn Gln Lys Ala Val Gln Ala His Val Tyr Glu 355 360 365 Tyr Thr Thr Gln Val Ser Leu Asp Ser Asp Leu Lys Phe Lys Gly Ala 370 375 380 Glu Lys Gly Ile Val Pro Cys Gln Met Ile Phe Cys Leu Lys Glu Lys 385 390 395 400 Asn Gln Lys Lys Leu Asn Ser His Arg Trp Phe Phe Asn Ala Phe Gly 405 410 415 Lys Ala Leu Asn Pro Asn Val Cys Ile Leu Leu Asp Val Gly Thr Arg 420 425 430 Pro Gly Gly Thr Ser Leu Tyr His Leu Trp Lys Ala Phe Asp Thr Asp 435 440 445 Ser Asn Val Ala Gly Ala Cys Gly Glu Ile Lys Ala Met Lys Gly Arg 450 455 460 Phe Gly Gly Asn Leu Leu Asn Pro Leu Val Ala Ser Gln Asn Phe Glu 465 470 475 480 Tyr Lys Met Ser Asn Ile Leu Asp Lys Pro Leu Glu Ser Val Phe Gly 485 490 495 Tyr Ile Thr Val Leu Pro Gly Ala Leu Ser Ala Tyr Arg Tyr His Ala 500 505 510 Leu Gln Asn Asp Glu Thr Gly His Gly Pro Leu Ser Gln Tyr Phe Lys 515 520 525 Gly Glu Thr Leu His Gly Gln His Ala Asp Val Phe Thr Ala Asn Met 530 535 540 Tyr Leu Ala Glu Asp Arg Ile Leu Cys Trp Glu Leu Val Ala Lys Arg 545 550 555 560 Gly Glu Arg Trp Val Leu Lys Tyr Val Lys Gly Cys Thr Gly Glu Thr 565 570 575 Asp Val Pro Asp Thr Val Pro Glu Phe Val Ser Gln Arg Arg Arg Trp 580 585 590 Leu Asn Gly Ala Phe Phe Ala Ala Val Tyr Ser Leu Val His Phe Arg 595 600 605 Gln Ile Trp Lys Thr Asp His Thr Phe Met Arg Lys Ala Leu Leu His 610 615 620 Val Glu Phe Leu Tyr His Leu Leu Gln Leu Leu Phe Thr Tyr Phe Ser 625 630 635 640 Leu Ala Asn Phe Tyr Leu Ala Phe Tyr Phe Ile Ala Gly Gly Leu Ala 645 650 655 Asp Pro His Val Asp Pro Phe Asn Ser Asp Gly His Val Ala Arg Ile 660 665 670 Ile Phe Asn Ile Leu Arg Tyr Val Cys Val Leu Leu Ile Cys Thr Gln 675 680 685 Phe Ile Leu Ser Leu Gly Asn Arg Pro Gln Gly Ala Lys Arg Met Tyr 690 695 700 Leu Ala Ser Met Ile Ile Tyr Ala Val Ile Met Val Tyr Thr Thr Phe 705 710 715 720 Ala Thr Ile Phe Ile Val Val Arg Gln Ile Gln Pro Ser Gln Lys Ser 725 730 735 Asp Asp Lys Pro Asp Leu Glu Leu Gly Asn Asn Val Phe Thr Asn Leu 740 745 750 Ile Val Ser Val Ala Ser Thr Leu Gly Leu Tyr Phe Val Met Ser Phe 755 760 765 Leu Tyr Leu Asp Pro Trp His Met Phe Thr Ser Ala Ile Gln Tyr Phe 770 775 780 Val Leu Leu Pro Ser Tyr Ile Cys Thr Leu Gln Ile Tyr Ala Phe Cys 785 790 795 800 Asn Thr His Asp Val Thr Trp Gly Thr Lys Gly Asp Asn Val Met Arg 805 810 815 Thr Asp Leu Gly Gly Ala Ile Gly Lys Gly Ser Thr Val Glu Leu Glu 820 825 830 Met Pro Ser Asp Gln Leu Asp Ile Asp Ser Gly Tyr Asp Glu Cys Leu 835 840 845 Arg Asn Leu Arg Asp Arg Val Met Val Pro Ala Val Pro Val Ser Glu 850 855 860 Asp Gln Leu Gln Gln Asp Tyr Tyr Lys Ser Val Arg Thr Tyr Met Val 865 870 875 880 Val Ser Trp Met Val Ala Asn Ala Thr Leu Ala Met Ala Val Ser Glu 885 890 895 Ala Tyr Gly Asp Ser Glu Ile Gly Asp Asn Phe Tyr Leu Arg Phe Ile 900 905 910 Leu Trp Ala Val Ala Ala Leu Ala Leu Phe Arg Ala Leu Gly Ser Thr 915 920 925 Thr Phe Ala Ala Ile Asn Leu Val Ser Ala Leu Val Glu Gly Arg Val 930 935 940 Arg Leu Arg Leu Asn Met Lys Gly Phe Arg Trp Ile Lys Glu Lys Trp 945 950 955 960 Gly Asp Ala Asp Val Lys Gly Lys Phe Glu Gly Leu Gly Asp Arg Ala 965 970 975 Arg Gly Leu Ala Arg Arg 980

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  15. 식물 세포벽을 포함하는 면 섬유로서,
    상기 식물 세포벽은 상기 식물 세포벽의 셀룰로스에 매몰된, 올리고-N-아세틸글루코스아민, 키틴 및 올리고-글루코스아민으로부터 선택되는 양으로 하전된 올리고사카라이드를 포함하고,
    상기 올리고사카라이드의 농도는 세포벽 물질 mg당 0.1㎍ 이상이어서, 콩고 레드에 의한 염색을 5% 이상 증가시키는, 면 섬유.
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  22. 제 15 항에 따른 면 섬유로부터 제조된 얀.
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  26. a. 의약 화합물의 조절된 방출;
    b. 폐수 정제에서 응집 장치(flocculent device)의 제조;
    c. 식품 산업에서 안정제로서 사용;
    d. 천공 시 냉각 유체로서의 사용;
    e. 위생 행위의 기능성 의복의 제조;
    f. 상처 치유용 천의 제조; 또는
    g. 종이의 제조
    를 위한, 제 15 항에 따른 면 섬유.
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  44. 제 15 항에 있어서,
    올리고-N-아세틸글루코스아민이 키토-올리고사카라이드이고, 상기 키토-올리고사카라이드의 농도가 세포벽 물질 mg 당 0.1㎍ 이상인, 면 섬유.
  45. 제 15 항에 있어서,
    올리고-N 아세틸글루코스아민 또는 올리고-글루코스아민이 3 내지 10의 중합도를 갖는, 면 섬유.
  46. 제 15 항에 따른 면 섬유로부터 제조된 직물.
  47. a. 의약 화합물의 조절된 방출;
    b. 폐수 정제에서 응집 장치의 제조;
    c. 식품 산업에서 안정제로서의 사용;
    d. 천공 시 냉각 유체로서의 사용;
    e. 위생 행위의 기능성 의복의 제조;
    f. 상처 치유용 천의 제조; 또는
    g. 종이의 제조
    를 위한, 제 22 항에 따른 얀.
  48. a. 의약 화합물의 조절된 방출;
    b. 폐수 정제에서 응집 장치의 제조;
    c. 식품 산업에서 안정제로서의 사용;
    d. 천공 시 냉각 유체로서의 사용;
    e. 위생 행위의 기능성 의복의 제조;
    f. 상처 치유용 천의 제조; 또는
    g. 종이의 제조
    를 위한, 제 46 항에 따른 직물.
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