CN101203612B

CN101203612B - 改进植物细胞壁反应性的方法

Info

Publication number: CN101203612B
Application number: CN2006800226800A
Authority: CN
Inventors: M·德布洛克; F·莫伊伦韦特; R·柯赫; B·埃西格曼
Original assignee: Bayer CropScience NV
Priority date: 2005-06-24
Filing date: 2006-06-19
Publication date: 2013-03-20
Anticipated expiration: 2026-06-19
Also published as: EP2314705A3; US8507755B2; US20130312141A1; CN101203612A; KR101409553B1; US9404119B2; AU2006261276B2; EP2314705A2; PE20070104A1; MX2008000097A; US20090028837A1; WO2006136351A2; HK1120825A1; CA2613160A1; US20120030844A1; WO2006136351A3; KR20080028883A; EP1896596B1; KR101468830B1; US8008544B2

Abstract

本发明提供了用于改进植物细胞壁的反应性的方法和手段，特别是可以通过将带正电荷的寡糖或多糖加入细胞壁来在产生纤维的植物的天然纤维中得到改进反应性的植物细胞壁。可以通过表达编码N-乙酰葡萄糖胺转移酶，尤其是能够定位于植物细胞中的高尔基体膜的N-乙酰葡萄糖胺转移酶的嵌合基因来方便地实现这个目的。

Description

改进植物细胞壁反应性的方法

发明领域

本发明涉及植物细胞壁反应性的改进，包括次级植物细胞壁，特别是见于产纤维植物的天然纤维中的植物细胞壁和次级植物细胞壁。本发明尤其涉及具有改变反应性的棉花纤维。改进的反应性可应用于多种方法，利用纤维反应性染料来染色含细胞壁的植物来源物质如天然纤维，以改进例如染色牢度，或减少染色过程中所使用的废水量。改进的反应性还可以应用于改善天然纤维与反应物如阻燃剂、水、油和防污剂、抗皱剂、软化剂、抗静电剂、荧光增白剂等的反应性。

背景技术

天然纤维，包括来自植物如棉花和亚麻的含纤维素的天然纤维，已为人类使用5000多年。然而，由于由β-1-4连接的葡萄糖单体组成的纤维素的相对惰性性质，含有天然纤维素的纤维不具有合成纤维的化学上的通用性。

例如，在棉花纤维和织物的染色步骤中，该相对的惰性性质明显。通常使用两类染料使棉花着色：直接染料和纤维反应性染料，两者均为阴离子分子。棉花本身在水中呈阴离子电荷，从而不经特殊处理，纤维或织物的染料上染是相当复杂的。

直接染料与纤维素聚合物产生相对弱的氢键，形成半永久性的附着。直接染料比纤维反应性染料更易于应用并且价格不是太贵，但是经不起充分洗涤。纤维反应性染料是将发色团与反应性基团细合在一起的分子，所述反应性基团通过与羟基基团反应而与纤维形成强共价键。所述共价键为染色纤维提供优良的抗洗熨抗性。可以利用阳离子固定剂来改进染色牢度。

在染色过程中，需要大量的电解液来将阴离子染料与阴离子纤维的电荷相屏蔽。需要通过被称为精练(scouring)的洗涤步骤除去未反应的染料(达40％)，产生大量的同样包含上述电解液的废水。

例如通过掺入带正电荷的化合物来获得带有正电荷的纤维素纤维，可以因此改进天然纤维素纤维的染色性能，并改进修饰纤维素纤维与带负电荷化合物的任何化学反应。这也使酸性染料的利用成为可能。

若干文献已经描述了将脱乙酰壳多糖寡聚物掺入或包在纤维素纤维上来制备脱乙酰壳多糖/纤维素混合物、纱线或织物。脱乙酰壳多糖是带正电荷的葡糖胺聚合物，其可以通过壳多糖的脱乙酰作用，例如通过碱处理来获得。壳多糖本身是β-1-4连接的N-乙酰葡萄糖胺(GlcNAc)聚合物。

美国专利申请US2003/0134120描述了用脱乙酰壳多糖包被天然纤维。

Liu等人(Carbohydrate Polymers 44(2003)233-238)描述了一种用脱乙酰壳多糖包被棉花纤维的方法：在60℃水中用高碘酸钾氧化棉线，随后在醋酸水溶液中用脱乙酰壳多糖溶液处理。随着脱乙酰壳多糖的包被，棉花纤维表面在生理学和生物学上活化。因为氨基的化学反应能力比纤维素单体的羟基更大，所以纤维具有更大的潜力来进行进一步的化学修饰。而且，棉花纤维的光滑表面变得粗糙，说明具有更大的潜力来进行药物吸收及其控制释放。

根据脱乙酰壳多糖在抑制例如皮肤癣菌方面的生理功能，很多功能性的衣服、织物和纤维制品使用纤维素-脱乙酰壳多糖混合纤维、纤维素纤维-脱乙酰壳多糖缀合物以及包被含脱乙酰壳多糖树脂的织物。

WO00/09729描述了在植物中表达壳多糖合酶和壳多糖脱乙酰酶基因以改变细胞壁用于工业应用，并改进疾病抗性。具体引述的应用是：提供纤维素、壳多糖和脱乙酰壳多糖的单一植物来源、增强拉伸强度，以及增强脆断。具体提出壳多糖合酶基因来源于真菌生物。对于在植物中生产壳多糖或脱乙酰壳多糖以及将其掺入植物细胞壁中，都没有提供实验数据。

现有技术因此在提供用于获得植物的方法方面存在不足，可以从所述植物中分离到植物细胞壁，尤其是次生细胞壁，例如天然纤维，其包含带正电荷的化学基团和/或比纤维素的羟基更具有反应性的化学基团。现有技术在提供纤维方面也存在不足，其可以直接由植物获得且包含带正电荷的化学基团和/或比纤维素的羟基更具有反应性的化学基团，其可直接使用，而无需进一步进行化学处理以***这样的化学基团。如以下在不同的实施方案、实施例和权利要求中所述来解决这些及其它的问题。

发明概述

简短地说，在一个实施方案中，本发明提供了一种用于增加植物细胞的细胞壁，尤其是次生细胞壁中带正电荷寡糖或多糖量的方法，包括将嵌合基因引入植物细胞，由此嵌合基因包含与编码N-乙酰葡萄糖胺转移酶的DNA区有效连接的植物可表达启动子；以及转录终止和多聚腺苷酸区，优选其中N-乙酰葡萄糖胺转移酶靶向高尔基体膜。在特定的实施方案中，植物是棉花，并将带正电荷的寡糖或多糖掺入构成棉花纤维的次生细胞壁中。

在本发明的另一个实施方案中，提供了一种用于增加植物细胞的细胞壁，尤其是次生细胞壁中带正电荷寡糖或多糖量的方法，包括将嵌合基因引入植物细胞，所述嵌合基因包含与编码NODC型的N-乙酰葡萄糖胺转移酶的DNA区有效连接的植物可表达启动子；以及转录终止和多聚腺苷酸区。同样，在特定的实施方案中，植物是棉花，并将带正电荷的寡糖或多糖掺入构成棉花纤维的次生细胞壁中。

又在本发明的另一实施方案中，提供了一种用于增加植物细胞的细胞壁，尤其是次生细胞壁中带正电荷寡糖或多糖量的方法，该方法包括：

i.将嵌合基因引入植物细胞，所述嵌合基因包含下列有效连接的DNA片段：

1.植物可表达启动子；

2.编码壳多糖合酶的DNA区；和

3.转录终止和多聚腺苷酸区。

ii.对转基因植物细胞施加有效量的N-乙酰葡萄糖胺、葡糖胺-6-磷酸、N-乙酰葡萄糖胺-6-磷酸、N-乙酰葡萄糖胺-1-磷酸或UDP-N-乙酰葡萄糖胺。

本发明也提供了这样的植物细胞壁，包含增加量的多糖或寡糖，尤其是带正电荷的寡糖，例如寡聚-N-乙酰葡萄糖胺或寡聚-葡糖胺，优选聚合度为3到10、特别是3到5的N-乙酰葡萄糖胺或葡糖胺的寡聚物。这样的植物细胞壁可由本发明的方法获得。可对这些植物细胞壁进行进一步的化学修饰。

在特定的实施方案中，本发明提供了包含此处提到的增加量的带正电荷寡糖的棉花纤维，以及包含这样的棉花纤维的纱线、织物。棉花纤维可如此应用或可受到进一步的化学修饰，包括染色。可如下识别这些棉花纤维：例如，当与从不含如本文所述嵌合N-乙酰葡萄糖胺转移酶基因的同基因系棉花植物中获得的棉花纤维相比时，其与阴离子染料，包括刚果红的结合增加，其与麦胚凝集素的结合增加，或其对胺反应性染料的反应性增加。还可以通过例如高效薄层层析(HPTLC)来直接测定棉花纤维中寡糖的存在和/或量。

在另一个实施方案中，本发明涉及编码能够靶向植物细胞的高尔基体的N-乙酰葡萄糖胺转移酶的DNA区用于增加植物细胞的细胞壁中带正电荷的寡糖量或用于对此类植物细胞壁进行化学修饰以提高植物细胞壁的反应性的用途。

本发明也提供了包含下列有效连接的DNA区的嵌合基因：植物可表达启动子；编码N-乙酰葡萄糖胺转移酶的DNA区，当所述N-乙酰葡萄糖胺转移酶在植物细胞中表达时，靶向于所述植物细胞的高尔基体；以及转录终止和多聚腺苷酸区。N-乙酰葡萄糖胺转移酶可以是NODC型的N-乙酰葡萄糖胺转移酶，或者还可以是壳多糖合酶，尤其是已经与高尔基滞留信号有效连接的壳多糖合酶。

附图的简短说明

图1：不同NODC蛋白的氨基酸序列比对。用粗体字标明在所有蛋白中保守的氨基酸残基。ROT_NODC_RHILP：来自豌豆根瘤菌(Rhizobiumleguminosarum)(菜豆生物型)的NODC蛋白；ROT_NODC_BRAJA：来自大豆慢生型根瘤菌(Bradyrhizobium japonicum)(SEQ ID No..)的NODC蛋白；ROT_NODC_RHIS3：来自根瘤菌属物种(Rhizobium sp.)(N33菌株)的NODC蛋白；ROT_NODC_RHISN：来自根瘤菌属物种的NODC蛋白；ROT_NODC_RHILV：来自豌豆根瘤菌(蚕豆生物型)的NODC蛋白；以及ROT_NODC_AZOCA：来自茎瘤固氮根瘤菌(Azorhizobium caulinodans)的NODC蛋白。

图2：不同NODC蛋白的氨基酸序列比对。用粗体字标明在所有蛋白中保守的氨基酸残基。ROT_NODC_BRAJA：来自大豆慢生型根瘤菌(SEQ ID No..)的NODC蛋白；ROT_NODC_RHIS3：来自根瘤菌属物种(N33菌株)的NODC蛋白；ROT_NODC_RHISN：来自根瘤菌属物种的NODC蛋白；ROT_NODC_RHILV：来自豌豆根瘤菌(蚕豆生物型)的NODC蛋白；以及ROT_NODC_AZOCA：来自茎瘤固氮根瘤菌的NODC蛋白。

图3：根毛细胞的荧光显微术照片，所述根毛细胞来自含35S::NodC嵌合基因的毛状根。

图A：用Calcofluor染色的根毛细胞的光学切片；B：经免疫组织化学染色以示N-乙酰葡萄糖胺存在的根毛细胞光学切片；C：图A和图B的光学切片的叠加图像。

图4：根毛细胞的荧光显微术照片，所述根毛细胞来自含35S::NodC-EGFP嵌合基因的毛状根。

图A：图B、C和D的光学切片的叠加。B：用Calcofluor染色的根毛细胞的光学切片；C：经染色以显示高尔基体的根毛细胞的光学切片；D：通过EGFP显现荧光的根毛细胞的光学切片。

图5：根毛细胞的荧光显微术照片，所述根毛细胞来自含35S::壳多糖合酶嵌合基因的毛状根。

图A：经染色以示N-乙酰葡萄糖胺存在的毛状根光学切片，所述毛状根是在50mM N-乙酰葡萄糖胺存在的条件下培养的；图B：经染色以示细胞壁中N-乙酰葡萄糖胺存在的毛状根光学切片，所述毛状根是在没有额外的N-乙酰葡萄糖胺存在的条件下培养的。

图6：壳寡糖的高效薄层层析图，所述壳寡糖来自从拟南芥(Arabidopsis)毛状根中分离的细胞壁材料。

两个边缘泳道(1，12)的样品是N-乙酰葡萄糖胺、壳二糖、壳三糖、壳四糖和壳五糖的标准溶液。泳道2到5：从发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)所引发的毛状根培养物中提取的细胞壁材料，所述发根农杆菌具有的嵌合基因包含与nodC编码区连接的CaMV35S启动子；泳道6到9：从发根农杆菌所引发的毛状根培养物中提取的细胞壁材料，所述所引发的具有的嵌合基因含与融合到eGFP的nodC编码区连接的CaMV35S启动子；泳道10到11：从发根农杆菌所引发的毛状根培养物中提取的细胞壁材料，所述发根农杆菌具有的嵌合基因包含与膦丝菌素乙酰转移酶编码区连接的CaMV35S启动子；薄层层析(TLC)在乙腈(76)∶水(24)∶0.5％硼酸(10)中进行。

图7：细胞壁材料的双向高效薄层层析(HPTLC)，所述细胞壁材料分离自经壳多糖酶消化的拟南芥毛状根。

对照细胞壁材料(左图)提取自发根农杆菌所引发的毛状根培养物，所述的发根农杆菌具有的嵌合基因包含与膦丝菌素乙酰转移酶编码区连接的CaMV35S启动子；实验细胞壁材料(右图)提取自发根农杆菌所引发的毛状根培养物，所述的发根农杆菌具有的嵌合基因包含与融合到eGFP的nodC编码区连接的CaMV35S启动子。可在实验物质中而不是在对照物质中检测到单体糖(N-乙酰葡萄糖胺)和壳糖二聚体(壳二糖)。薄层层析(TLC)在乙腈(76)∶水(24)∶0.5％硼酸(10)中进行。

图8：分离自转基因拟南芥植物的细胞壁材料的高效薄层层析(HPTLC)。

泳道1：壳多糖-寡糖标准溶液；泳道2：0.1葡糖胺；泳道3和4：分别为4μl和8μl分离自对照拟南芥芽的细胞壁材料；泳道5和6：分别为4μl和8μl分离自包含CaMV35S::nodC嵌合基因的转基因拟南芥芽的细胞壁材料；泳道7和8：分别为4μl和8μl分离自包含CaMV35S::nodC-eGFP嵌合基因的转基因拟南芥芽的细胞壁材料。虚线表示尤其是在泳道5和6中壳三糖量的增加。

图9：与缀合于Alexa fluor 555的麦胚凝集素(WGA)反应的棉花纤维的荧光显微镜检。

左图：来自含CaMV35S::NodC基因的转基因棉花植物的棉花纤维。右图：来自对照棉花植物的棉花纤维。在紫外光下，在来自转基因棉花植物的纤维中可以观察到明亮的荧光，表明在这些纤维中存在壳寡糖。

本发明不同实施方案的详细说明

本发明基于这样的发现：在植物细胞中表达NODC型N-乙酰葡萄糖胺转移酶导致N-乙酰葡萄糖胺寡聚物掺入植物细胞壁。GlcNAc寡聚物与细胞壁出乎意料地极其紧密地缔合，并且不会因多种处理而从细胞壁上溶解下来。令人惊讶的是，GlcNAc寡聚物的合成不需要像在其它壳多糖合酶中所观察到的那样，将GlcNAc外加到生长培养基中。而且同样令人惊讶的是，NODC蛋白除了如预期的那样与细胞膜缔合之外，也与高尔基体膜紧密地缔合。当在棉花植物中表达NODC型N-乙酰葡萄糖胺转移酶时，GlcNAc寡聚物掺入棉花纤维，产生更具有反应性的棉花纤维。

因此，在本发明的第一个实施方案中，提供了用于增加植物细胞的细胞壁，尤其是次生细胞壁中带正电荷寡糖量的方法，其中该方法包括将嵌合基因引入植物细胞的步骤，并且该嵌合基因包含下列有效连接的DNA片段：

-植物可表达启动子

-编码N-乙酰葡萄糖胺转移酶的DNA区，其中N-乙酰葡萄糖胺转移酶是NODC型的；和

-转录终止和多聚腺苷酸区。

结瘤C蛋白(“NODC蛋白”)及其编码基因涉及脂壳寡糖(lipochitooligosacccharide)信号或乙酰化壳寡糖(Nod因子)的合成，导致根瘤菌和豆科植物共生体中典型的根瘤的形成。

这些脂壳寡糖合成所需的最重要的nod基因产物是NODA、NODB和NODC。在缺乏其它nod基因产物的情况下，它们可以形成核心信号，由携带N-连接的酰基的四个或五个N-乙酰葡萄糖胺残基的寡聚物组成。在结瘤因子合成中这三个蛋白各自的功能是众所周知的：NODC是产生壳寡糖链的N-乙酰葡萄糖氨基转移酶；NODB作为壳多糖寡糖脱乙酰酶，从壳寡糖链的非还原N-乙酰葡萄糖胺残基上除去N-乙酰基；NODA参与将酰基链附着到在NODB作用下产生的游离氨基上。由其它nod基因编码的其它Nod因子提供了与不同的结瘤因子相区别的任何修饰化学基团。就本发明的目的而言，只涉及NODC蛋白及其编码基因。

NODC蛋白是经充分表征的蛋白(综述参见Kamst和Spaink，1999，Trendsin Glycoscience and Glycotechnology，11，第187-199页)。其属于β-多糖合酶蛋白家族，参与含β-连接的单糖残基的线性多糖的合成。在结构上与NODC最密切相关的酶是参与如下物质合成的转移酶：壳多糖(β-1-4连接的N-乙酰葡萄糖胺)；纤维素(β-1-4连接的葡萄糖残基的聚合物)；透明质酸(N-乙酰葡萄糖胺和葡萄糖醛酸的共聚物)和在斑马鱼胚胎的发育早期产生的壳多糖寡糖。可以识别在这些蛋白之间保守的六个短区域。就NODC蛋白而言，这些短序列对应于：

1)SEQ ID No 1(来自茎瘤固氮根瘤菌的NODC)的第23位的K残基

2)SEQ ID No 1第86-88位的序列DDG

3)SEQ ID No 1第137-141位的序列VDSDT

4)SEQ ID No 1第207-213位的序列GPCAMYR

5)SEQ ID No 1第237-242位的序列GEDRHL；以及

6)SEQ ID No 1第274-278位的序列QQLRW

然而，重要的是要认识到可能存在一些这样的NODC蛋白或其变体，其中一个或多个上述共有序列不是绝对保守的。

NODC蛋白也常常以代表跨膜结构域的疏水氨基酸残基链为特征(Barney等人，1996，Molecular Microbiology 19，第443-453页)。N末端疏水结构域以N_出-C_入的取向跨越细菌膜，而相邻的大亲水结构域暴露于细菌细胞质。此种取向似乎有赖于靠近C末端的疏水区的存在，潜在地包含三个膜跨距，从而NODC的C-末端通常位于细菌的周质中。

NODC的大亲水环与其它β-葡糖基转移酶中相似区域也具有其它的结构相似性。认为该区域由A结构域和B结构域组成：A结构域(从SEQ ID No 4序列的大约第45位残基延伸至第140位残基)由交替的β-折叠和α-螺旋组成，B结构域(对应于SEQ ID No 4第215-280位残基)据认为负责NODC的延伸能力。在A-结构域中，两个天冬氨酸残基是保守的(SEQ ID No.4的第88和139位残基)；在B-结构域中一个天冬氨酸残基和基序QXXRW(SEQ ID No.4第的240和276-280位残基)也是保守的，并且据认为对于催化反应性至关重要。

当在不同的NODC蛋白当中进行比较时，可以揭示较为保守的氨基酸序列。图1表示来自SEQ ID No 1、2、8、4、7、5的不同NODC蛋白的比对，并标明了不同NODC蛋白之间的一些保守残基，其包含(按次序)：

-序列PXVDVIXPXXNE

-序列VDDGSXN

-序列GDXXLDVDSDTXXXXDV

-序列GXXMGQ

-序列DMEYWLACNEERXXQXRFGXVMXCXGXCXMYR

-序列FRTXYXPXAXAXTXVP

-序列YLXQQLRWARSTXRXTXL

-序列QNXGXXLL

-序列RFXFXXXHXXXNXXXLXPLKXYALXT

图2表示不同NODC蛋白亚型的比对，显示较为保守的残基，例如：

-序列WLTRLIDMEYWLACNEERXXQXRFGXVMCCCGPCAMYRRS

-序列LLXXYEXQXFXGXPSXFGEDRHLTILMLXAGFRTXYVPXAXAXTXVP

-序列YLRQQLRWARSTXRDTXLA

由不同的根瘤菌科(Rhizobiaceae)产生的脂壳寡糖的寡糖主链长度为两个到六个残基不等。已表明结瘤蛋白NODC在壳寡糖链合成中是壳多糖寡糖链长度的重要决定因素(Kamst等人，1997，Journal of Bacteriology 179，第2103-2108页)。

可从属于根瘤菌属(Rhizobium)、固氮根瘤菌属(Azorhizoboium)、慢生根瘤菌属(Bradyrhizobium)、中慢生根瘤菌属(Mesorhizobium)、雷尔氏菌属(Ralstonia)、贪铜菌属(Cupriavidus)、链霉菌属(Streptomyces)、伯克霍尔德氏菌属(Burkholderia)或中华根瘤菌属(Sinorhizobium)的细菌中直接获得编码NODC型N-乙酰葡萄糖胺转移酶的编码区。不过，明白无疑的是：也可以合成制备这样的编码区，甚至是使其密码子使用情况适合于植物，特别是欲向其中引入过表达NODC型蛋白的嵌合基因的产纤维植物。

可由数据库获得NODC蛋白的不同序列，例如由下列登录号标识的蛋白质序列：CAA67139、CAA608779、CAA51774、CAA51773、CAA25811、CAA25810、CAA25814、CAA68619、CAA2350、CAD31533、CAC05896、CAH04369、CAB56055、NP 629203、P26024、P17862、BAB524500、AAX30050、AAX30049、E38180、JQ0396、ZZZRC4、ZZZRCL、A95321、C23766、C26813、NP_659761、NP_443883、NP_106714、NP_768667、NP_435719、BAC47292、AAU11365、AAU11364、AAU11363、AAU11362、AAU11361、AAU11360、AAU11359、AAU11358、AAU11357、AAU11356、AAU11355、AAU11354、AAU11353、AAU11352、AAU11351、AAU11350、AAU114349、AAU11348、AAU11347、AAU11346、AAU11345、AAU11344、AAU11343、AAU11342、AAU11341、AAU11340、AAU11339、AAU11338、AAK65131、AAS91748、P04679_2、P04679_1、P04679、P72334、Q53513、P50357、P04678、P50536、P53417、Q07755、P04341、P04340、P24151、P04677、CAD90588、CAD90587、CAD90586、CAD90585、CAD90584、CAD90583、CAD90257、CAD43933、AAM54775、AAN62903、S34305、S09522、S07304、AAL88670、CAD29957、CAD29956、CAD29955、CAD29954、CAD29953、CAD29952、CAD29951、CAD29950、CAD29949、CAC42489、AAK53549、AAK53548、AAK50872、AAK39967、AAK39966、AAK39965、AAK39964、AAK39963、AAK39962、AAK39961、AAK39960、AAK39959、AAK39958、AAK39957、AAK39956、AAG44125、AAK00157、AAG60998、AAB71694、AAB16897、AAV80567、AAB95329、BAA24092、BAA06089、BAA06086、BAA06085、BAA06083、BAA06090、BAA06082、BAA06087、BAA06088、BAA06084、AAB91695、AAB51164、AAB47353、AAB34509、AAB24745、1615305E、1615305D、165305C、CAA26311、CAA26310，CAA3731，AAA63602或26226(并入本文作为参考)。

UNIPROT数据库中涉及全长NODC蛋白的其它记录总结于表1中。以这些登录号引用的所有提到的氨基酸序列并入本文作为参考。

表1：全长NODC蛋白

UniProt/UniParc ID	UniProt登录号	物种名称	长度
				NODC_BRAJA	P26024	大豆慢生型根瘤菌	485
NODC_AZOCA	O07755	茎瘤固氮根瘤菌	395
				Q6PTX8_9RHIZ	Q6PTX8	根瘤菌属物种SIN-1	408
Q70YC2_9BURK	Q70YC2	台湾贪铜菌(Cupriavidus taiwanensis)	450

Q6EX51_SINSB	Q6EX51	中华根瘤菌属物种	452
				NODC_RHIS3	P72334	根瘤菌属物种	450
NODC_RHILP	P24151	豌豆根瘤菌	428
				Q8GNH5_RHIME	O8GNH5	苜蓿根瘤菌(Rhizobium meliloti)	421
Q53254_RHITR	Q53254	热带根瘤菌(Rhizobium tropici)	452
				Q9AQ23_BRASW	Q9AQ23	慢生根瘤菌属物种	452
NODC_RHISN	P50357	根瘤菌属物种	413
				Q8KLG3_RHIET	Q8KLG3	埃特里根瘤菌(Rhizobium etli)	443
Q9RAN5_MESS7	Q9RAN5	中慢生根瘤菌属物种	416
				Q9Z3I6_BRASS	Q9Z3I6	慢生根瘤菌属物种	481
NODC_RHILO	P17862	百脉根根瘤菌(Rhizobium loti)	424
				Q8KJI5_RHILO	Q8KJI5	百脉根根瘤菌	424
NODC_RHIGA	P50356	山羊豆根瘤菌(Rhizobium galegae)	433
				NODC_RHIME	P04341	苜蓿根瘤菌	426
Q9R614_RHIME	Q9R614	苜蓿根瘤菌	424
				O52478_RHIME	O52478	苜蓿根瘤菌	402
Q52971_RHIME	Q52971	苜蓿根瘤菌	402
				NODC_RHILV	P04340	豌豆根瘤菌	424

但是，显然只要酶促活性没有改变的话，还可以使用NODC蛋白的变体来获得与根据本发明的方法中同样的效果，其中缺失、取代或***了一个或多个氨基酸残基，这可由上述氨基酸序列推导出来。这些变体NODC蛋白与本文提到的任一NODC蛋白可具有大约95％的序列同一性。例如，Kamst等人，1997Journal of Bacteriology，179，第2103-2108页已经描述了用于体外测定NODC蛋白酶促活性的方法。

因此，如本文所用，“NODC型N-乙酰葡萄糖胺转移酶”是催化GlcNAc部分从UDP-GlcNAc转移至新生壳多糖寡糖的N-乙酰葡萄糖胺转移酶。该蛋白优选含有可通过比较不同的NODC蛋白而得到的保守区。

尤其适合于本发明方法的是SEQ ID No 1到SEQ ID No 9所列的蛋白，尤其是SEQ ID No 1所列的蛋白，以及编码此类蛋白的DNA片段。

已经观察到(参见实验部分)，当NODC蛋白在植物细胞中表达时，除了与质膜共定位以外，还与高尔基体膜共定位。为将壳寡糖掺入植物细胞壁，无需补加GlcNAc。但是，当使用真菌来源的壳多糖合酶时，这些蛋白不是与高尔基体膜共定位的，并需要补加GlcNAc以将壳寡糖显著地掺入细胞壁。并非旨在将本发明限于特定的作用方式，据认为NODC蛋白的跨膜结构域与***质膜相比可能更易于***高尔基体膜中，而且这些蛋白的定位避免外部补加GlcNAc的需求。修饰壳多糖合酶蛋白[例如真菌来源的壳多糖合酶，如粗糙链孢霉(Neurosporacrassa)壳多糖合酶]，从而将壳多糖合酶再定位于高尔基体的膜上，这足以消除外部补加GlcNAc的需求。通过将壳多糖合酶蛋白与信号锚定肽相连，已经实现了这样的再定位，所述信号锚定肽将所连的蛋白靶向高尔基体膜。

因此，在本发明的另一个实施方案中，提供了用于增加植物细胞的细胞壁，尤其是次生细胞壁中带正电荷寡糖量的方法，包括将嵌合基因引入植物细胞的步骤，所述嵌合基因包含

-植物可表达启动子

-编码N-乙酰葡萄糖胺转移酶的DNA区，其中N-乙酰葡萄糖胺转移酶靶向于高尔基体膜；以及

-转录终止和多聚腺苷酸区。

如本文所用，N-乙酰葡萄糖胺转移酶不限于NODC型蛋白，还包括壳多糖合酶(壳多糖-UDP-乙酰-葡萄糖氨基转移酶)，如真菌来源的壳多糖合酶。这样的壳多糖合酶的氨基酸序列的实例可见于不同的数据库，包括具有下列标识符(登录号)的氨基酸序列：来自荚膜阿耶罗菌(Ajellomyces capsulata)(荚膜组织胞浆菌(Histoplasma capsulatum))的CHS1_AJECA(P30576)壳多糖合酶1(EC2.4.1.16)(壳多糖-UDP乙酰-葡萄糖氨基转移酶1)(I类壳多糖合酶1)；来自皮炎阿耶罗菌(Ajellomyces dermatitidis)(皮炎芽生菌(Blastomyces dermatitidis))的CHS1_AJEDE(P30579)壳多糖合酶1(EC 2.4.1.16)(壳多糖-UDP乙酰-葡萄糖氨基转移酶1)(I类壳多糖合酶1)；来自黑曲霉(Aspergillus niger)的CHS1_ASPNG(P30581)壳多糖合酶1(EC 2.4.1.16)(壳多糖-UDP乙酰-葡萄糖胺基转移酶1)(I类壳多糖合酶1)；来自灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)(珍萎(Noble rot)真菌)的CHS1_BOTCI(P49603)壳多糖合酶1(EC 2.4.1.16)(壳多糖-UDP乙酰-葡萄糖胺基转移酶1)(I类壳多糖合酶1)；来自白假丝酵母(Candida albicans)(酵母)的CHS1_CANAL(P23316)壳多糖合酶1(EC 2.4.1.16)(壳多糖-UDP乙酰-葡萄糖胺基转移酶1)；CHS1_CRYNV(O13356)壳多糖合酶1(EC 2.4.1.16)(壳多糖-UDP乙酰-葡萄糖胺基转移酶1)(IV类壳多糖合酶1){基因：名称＝CHS1}-新生隐球菌grubii变种(Cryptococcus neoformans var.grubii)(新生线状黑粉菌grubii变种(Filobasidiella neoformans var.grubii)；CHS1_EMENI(P30583)壳多糖合酶1(EC2.4.1.16)(壳多糖-UDP乙酰-葡萄糖胺基转移酶1)(I类壳多糖合酶1)(片段){基因：名称＝chs1}-构巢裸胞壳(Emericella nidulans)(构巢曲霉(Aspergillus nidulans))；CHS1_EXODE(P30600)壳多糖合酶1(EC 2.4.1.16)(壳多糖-UDP乙酰-葡萄糖胺基转移酶1)(II类壳多糖合酶1){基因：名称＝CHS1}-皮炎外瓶霉(Exophialadermatitidis)(皮炎王氏霉(Wangiella dermatitidis))；CHS1_EXOJE(P30585)壳多糖合酶1(EC 2.4.1.16)(壳多糖-UDP乙酰-葡萄糖胺基转移酶1)(I类壳多糖合酶1)(片段){基因：名称＝CHS1}-甄氏外瓶霉(Exophiala jeanselmei)；CHS1_NEUCR(P29070)壳多糖合酶1(EC 2.4.1.16)(壳多糖-UDP乙酰-葡萄糖胺基转移酶1)(III类壳多糖合酶3){基因：名称＝chs-1；ORF名称＝B11H24.170，NCU03611.1}-粗糙链孢霉；CHS1_PHAEX(P30590)；壳多糖合酶1(EC 2.4.1.16)(壳多糖-UDP乙酰-葡萄糖胺基转移酶1)(片段){基因：名称＝CHS1}-外瓶暗色球孢霉(Phaeococcomyces exophialae)；CHS1_PHYBL(P87073)壳多糖合酶1(EC2.4.1.16)(壳多糖-UDP乙酰-葡萄糖胺基转移酶1)(II类壳多糖合酶1){基因：名称＝chs1}-布拉克须霉(Phycomyces blakesleeanus)；CHS1_RHIAT(P30592)壳多糖合酶1(EC 2.4.1.16)(壳多糖-UDP乙酰-葡萄糖胺基转移酶1)(I类壳多糖合酶1)(片段){基因：名称＝CHS1}-墨绿色喙枝霉(Rhinocladiella atrovirens)；CHS1_RHIOL(P30594)壳多糖合酶1(EC 2.4.1.16)(壳多糖-UDP乙酰-葡萄糖胺基转移酶1){基因：名称＝CHS1}-少孢根霉(Rhizopus oligosporus)；CHS1_RHIRA(Q12632)壳多糖合酶1(EC 2.4.1.16)(壳多糖-UDP乙酰-葡萄糖胺基转移酶1)(II类壳多糖合酶1){基因：名称＝CHS1}-总状根霉(Rhizomucor racemosus)(卷枝毛霉(Mucorcircinelloides f.lusitanicus))；CHS1_SCHCO(P30596)；壳多糖合酶1(EC2.4.1.16)(壳多糖-UDP乙酰-葡萄糖胺基转移酶1)(片段){基因：名称＝CHS1}-普通裂褶菌(Schizophyllum commune)(多孔菌(Bracket fungus))；CHS1_SCHPO(P30597)壳多糖合酶1(EC 2.4.1.16)(壳多糖-UDP乙酰-葡萄糖胺基转移酶1){基因：名称＝chs1；ORF名称＝SPAC13G6.12c，SPAC24B11.01c}-粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)(裂殖酵母)；CHS1_TUBUN(P55003)壳多糖合酶1(EC 2.4.1.16)(壳多糖-UDP乙酰-葡萄糖胺基转移酶1)(片段){基因：名称＝CHS1}-秋块菌(Tuber uncinatum)(勃艮第块菌(Burgundy truffle))；CHS1_USTMA(P30598)壳多糖合酶1(EC 2.4.1.16)(壳多糖-UDP乙酰-葡萄糖胺基转移酶1)(片段){基因：名称＝CHS1}-玉米黑粉菌(Ustilago maydis)(黑粉菌(Smut fungus))；CHS1_XYLBA(P30603)壳多糖合酶1(EC 2.4.1.16)(壳多糖-UDP乙酰-葡萄糖胺基转移酶1)(片段){基因：名称＝CHS1}-斑替木丝霉(Xylohypha bantiana)；CHS1_YEAST(P08004)壳多糖合酶1(EC 2.4.1.16)(壳多糖-UDP乙酰-葡萄糖胺基转移酶1){基因：名称＝CHS1；酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)(贝克氏酵母(Baker′s yeast))；CHS2_AJECA(P30577)壳多糖合酶2(EC 2.4.1.16)(壳多糖-UDP乙酰-葡萄糖胺基转移酶2)(III类壳多糖合酶2)荚膜阿耶罗菌(英膜组织胞浆菌)；CHS2_AJEDE(P30580)壳多糖合酶2(EC 2.4.1.16)(壳多糖-UDP乙酰-葡萄糖胺基转移酶2)(II类壳多糖合酶2){基因：名称＝CHS2}-皮炎阿耶罗菌(皮炎芽生菌)；CHS2_ASPNG(P30582)；壳多糖合酶2(EC 2.4.1.16)(壳多糖-UDP乙酰-葡萄糖胺基转移酶2)(II类壳多糖合酶2)(片段){基因：名称＝chs2}-黑曲霉；CHS2_CANAL(P30572)壳多糖合酶2(EC 2.4.1.16)(壳多糖-UDP乙酰-葡萄糖胺基转移酶2){基因：名称＝CHS2}-白假丝酵母(酵母)；CHS2_EXODE(P30601)壳多糖合酶2(EC 2.4.1.16)(壳多糖-UDP乙酰-葡萄糖胺基转移酶2)(I类壳多糖合酶2){基因：名称＝CHS2}-皮炎外瓶霉(皮炎王氏霉)；CHS2_EXOJE(P30586)壳多糖合酶2(EC 2.4.1.16)(壳多糖-UDP乙酰-葡萄糖胺基转移酶2)(片段){基因：名称＝CHS2}-甄氏外瓶霉；CHS2_NEUCR(P30589)；壳多糖合酶2(EC 2.4.1.16)(壳多糖-UDP乙酰-葡萄糖胺基转移酶2){基因：名称＝chs-2；ORF名称＝NCU05239.1}-粗糙链孢霉；CHS2_PARBR(Q92444)壳多糖合酶2(EC2.4.1.16)(壳多糖-UDP乙酰-葡萄糖胺基转移酶2)(II类壳多糖合酶2){基因：名称＝CHS2}-巴西副球孢子菌(Paracoccidioides brasiliensis)；CHS2_PHAEX(P30591)；壳多糖合酶2(EC 2.4.1.16)(壳多糖-UDP乙酰-葡萄糖胺基转移酶2)(II类壳多糖合酶2)(片段){基因：名称＝CHS2}-外瓶暗色球孢霉；CHS2_RHIAT(P30593)壳多糖合酶2(EC 2.4.1.16)(壳多糖-UDP乙酰-葡萄糖胺基转移酶2)(III类壳多糖合酶2)(片段){基因：名称＝CHS2}-墨绿色喙枝霉；CHS2_RHIOL(P30595)壳多糖合酶2(EC 2.4.1.16)(壳多糖-UDP乙酰-葡萄糖胺基转移酶2){基因：名称＝CHS2}-少孢根霉；CHS2_SCHPO(O74756)壳多糖合酶样蛋白2.{基因：名称＝chs2；ORF名称＝SPBC1709.01，SPBC1734.17}-粟酒裂殖酵母(裂殖酵母)；CHS2_USTMA(P30599)壳多糖合酶2(EC 2.4.1.16)(壳多糖-UDP乙酰-葡萄糖胺基转移酶2)(片段){基因：名称＝CHS2}-玉米黑粉菌(黑粉菌)；CHS2_XYLBA(P30604)壳多糖合酶2(EC 2.4.1.16)(壳多糖-UDP乙酰-葡萄糖胺基转移酶2)(II类壳多糖合酶2)(片段){基因：名称＝CHS2}-斑替木丝霉；CHS2_YEAST(P14180)；壳多糖合酶2(EC 2.4.1.16)(壳多糖-UDP乙酰-葡萄糖胺基转移酶2){基因：名称＝CHS2；顺序基因座名称＝YBR038W；ORF名称＝YBR0407}-酿酒酵母(贝克氏酵母)；CHS3_AJECA(P30578)壳多糖合酶3(EC 2.4.1.16)(壳多糖-UDP乙酰-葡萄糖胺基转移酶3)(II类壳多糖合酶3)(片段){基因：名称＝CHS3}-荚膜阿耶罗菌(荚膜组织胞浆菌)；CHS3_CANAL(P30573)壳多糖合酶3(EC 2.4.1.16)(壳多糖-UDP乙酰-葡萄糖胺基转移酶3)(IV类壳多糖合酶3){基因：名称＝CHS3}-白假丝酵母(酵母)；CHS3_EXODE(P30602)壳多糖合酶3(EC 2.4.1.16)(壳多糖-UDP乙酰-葡萄糖胺基转移酶3)(III类壳多糖合酶3){基因：名称＝CHS3}-皮炎外瓶霉(皮炎王氏霉)；CHS3_EXOJE(P30587)；壳多糖合酶3(EC 2.4.1.16)(壳多糖-UDP乙酰-葡萄糖胺基转移酶3)(III类壳多糖合酶3)(片段){基因：名称＝CHS3}-甄氏外瓶霉；CHS3_NEUCR(P30588)壳多糖合酶3(EC 2.4.1.16)(壳多糖-UDP乙酰-葡萄糖胺基转移酶3){基因：名称＝chs-3；ORF名称＝G65A3.040}-粗糙链孢霉；CHS3_YEAST(P29465)壳多糖合酶3(EC 2.4.1.16)(壳多糖UDP乙酰-葡萄糖胺基转移酶3)(IV类壳多糖合酶3){基因：名称＝CHS3；同义词＝CAL1，CSD2，DIT101，KIT2；顺序基因座名称＝YBR023C；ORF名称＝YBR0305}-酿酒酵母(贝克氏酵母)；CHS4_MAGGR(O13353)；壳多糖合酶4(EC 2.4.1.16)(壳多糖-UDP乙酰-葡萄糖胺基转移酶4)(IV类壳多糖合酶4){基因：名称＝CHS4}-灰色大角间座壳(Magnaporthe grisea)(稻瘟病菌(Rice blast fungus))(灰梨孢菌(Pyriculariagrisea))；CHS4_NEUCR(Q01285)壳多糖合酶4(EC 2.4.1.16)(壳多糖-UDP乙酰-葡萄糖胺基转移酶4)(IV类壳多糖合酶4){基因：名称＝chs-4；ORF名称＝NCU09324.1}-粗糙链孢霉；CHS5_USTMA(O13394)壳多糖合酶5(EC2.4.1.16)(壳多糖-UDP乙酰-葡萄糖胺基转移酶5)(IV类壳多糖合酶5){基因：名称＝CHS5}-玉米黑粉菌(黑粉菌)；CHS6_USTMA(O13395)壳多糖合酶6(EC2.4.1.16)(壳多糖-UDP乙酰-葡萄糖胺基转移酶6)(V类壳多糖合酶6){基因：名称＝CHS6}-玉米黑粉菌(黑粉菌)；CHSA_AMPQU(Q12564)；壳多糖合酶A(EC2.4.1.16)(壳多糖-UDP乙酰-葡萄糖胺基转移酶A)(I类壳多糖合酶A){基因：名称＝CHSA}-白粉寄生孢(Ampelomyces quisqualis)；CHSA_EMENI(P30584)壳多糖合酶A(EC 2.4.1.16)(壳多糖-UDP乙酰-葡萄糖胺基转移酶A)(II类壳多糖合酶A){基因：名称＝chsA；同义词＝chs2}-构巢裸胞壳(构巢曲霉)；CHSB_EMENI(Q00757)壳多糖合酶B(EC 2.4.1.16)(壳多糖-UDP乙酰-葡萄糖胺基转移酶B)(III类壳多糖合酶B){基因：名称＝chsB}-构巢裸胞壳(构巢曲霉)；CHSC_ASPFU(Q92197)壳多糖合酶C(EC 2.4.1.16)(壳多糖-UDP乙酰-葡萄糖胺基转移酶C)(III类壳多糖合酶C){基因：名称＝chsC}-烟曲霉(Aspergillus fumigatus)(烟萨托菌(Sartorya fumigata))；CHSD_ASPFU(P78746)壳多糖合酶D(EC 2.4.1.16)(壳多糖-UDP乙酰-葡萄糖胺基转移酶D)(VI类壳多糖合酶D){基因：名称＝chsD}-烟曲霉(烟萨托菌)；CHSD_EMENI(P78611)壳多糖合酶D(EC 2.4.1.16)(壳多糖-UDP乙酰-葡萄糖胺基转移酶D)(V类壳多糖合酶D){基因：名称＝chsD；同义词＝chsE}-构巢裸胞壳(构巢曲霉)；CHSG_ASPFU(P54267)；壳多糖合酶G(EC 2.4.1.16)(壳多糖-UDP乙酰-葡萄糖胺基转移酶G)(III类壳多糖合酶G){基因：名称＝chsG}-烟曲霉(烟萨托菌)；CHSX_USTMA(Q99126)壳多糖合酶1(EC 2.4.1.16)(壳多糖-UDP乙酰-葡萄糖胺基转移酶1){基因：名称＝CHS1}-Ustilago maydis(黑粉菌)；CHSY_USTMA(Q99127)壳多糖合酶2(EC 2.4.1.16)(壳多糖-UGP乙酰-葡萄糖胺基转移酶2){基因：名称＝CHS2}-玉米黑粉菌(黑粉菌)或CHS_SAPMO(P48017)壳多糖合酶(EC 2.4.1.16)(壳多糖-UDP乙酰-葡萄糖胺基转移酶){基因：名称＝CHS}-同丝水霉(Saprolegnia monoica)。将所有的序列并入本文作为参考。

应优选使壳多糖合酶配有(异源)信号锚定序列，以将壳多糖合酶定位于高尔基体膜。在本领域已知这样的序列，包括在α-2，6-唾液酸转移酶的跨膜区段之内及附近的序列(特别是其头44或52个氨基酸；Munro等人，1991，EMBO Journal，10：3577-3588)；来自人的半乳糖转移酶(特别是其头60个氨基酸)或来自酵母HDEL受体拟南芥同源物(AtERD2)的信号锚定序列(Saint-Jore等人，2002，ThePlant Journal，29：661-678)，来自β-1，2-木糖基转移酶蛋白的信号锚定序列(特别是其头36个氨基酸；Pagny等人，2003，The Plant Journal 33：189-203)或N-乙酰-葡萄糖氨基转移酶I的信号锚定序列(特别是其头77个氨基酸；Essl等人，1999，FEBS Lett.453：169-173)(所有出版物并入此处作为参考)。可通过融合至N-乙酰葡萄糖胺转移酶的C-末端所采用的其它高尔基体靶向信号包括可见于拟南芥DAGAT1蛋白的氨基酸序列“YYHDL”，或可见于拟南芥DAGAT2的“LKLEI”。利用标准重组DNA技术，通过连接编码相应多肽的DNA片段，能够实现此类信号锚定序列与壳多糖合酶的融合。NODC型N-乙酰葡萄糖胺转移酶也可以有效连接于靶向高尔基体的信号锚定序列。

在本发明的另一个实施方案中，提供了用于增加植物细胞的细胞壁，尤其是次生细胞壁中带正电荷寡糖量的方法，包括将嵌合基因引入植物细胞的步骤，其中该嵌合基因包含下列有效连接的DNA片段：

-植物可表达启动子；

-编码壳多糖合酶(壳多糖UDP-乙酰葡萄糖胺转移酶)的DNA区，所述壳多糖合酶优选真菌来源；以及

-转录终止和和多聚腺苷酸区；

并且还包括向植物细胞或植物施加有效量的N-乙酰葡萄糖胺或N-乙酰葡萄糖胺-1-磷酸或N-乙酰葡萄糖胺-6-磷酸或葡糖胺-6-磷酸的步骤。

根据本发明的嵌合基因包含植物可表达启动子。如本文所用，术语“启动子”表示在转录起始过程中由DNA依赖性RNA聚合酶(直接地或间接地)识别和结合的任何DNA。启动子包括转录起始位点，以及转录起始因子和RNA聚合酶的结合位点，并且可以包含基因表达调控蛋白可在此结合的多种其它位点(如增强子)。

如本文所用，术语“植物可表达启动子”指能够在植物细胞中控制(起始)转录的DNA序列。这不仅包括植物来源的任何启动子，而且包括能够在植物细胞中直接转录的非植物来源的任何启动子，即：病毒或细菌来源的某些启动子例如CaMV35S、地下三叶草病毒启动子No 4或No 7、或T-DNA基因启动子等。

优先在纤维细胞中控制起始和转录维持的植物可表达启动子是驱动有效连接的DNA区在纤维细胞和下层表皮细胞中的转录比在植物的其它细胞或组织中处于更高水平的启动子。这样的启动子包括来自棉花的纤维特异性β-微管蛋白基因的启动子(如WO0210377所述)，来自棉花的肌动蛋白基因的纤维特异性启动子(如WO0210413所述)，来自棉花的脂质转移蛋白基因的纤维特异性启动子(如US5792933所述)，棉花的膨胀素(expansin)基因的启动子(WO9830698)或棉花壳多糖酶基因的启动子(US2003106097)或US6259003或US 6166294中所述的纤维特异性基因的启动子。

本发明进一步提供了植物细胞壁，包括应用根据本发明的方法从植物细胞中获得的包括此类细胞壁的纤维。此类植物细胞壁包括嵌入纤维素的带正电荷的寡糖或多糖，例如N-乙酰葡萄糖胺寡聚物或壳多糖。可对这些植物细胞壁进一步进行修饰，例如部分或完全脱乙酰化，从而获得包含葡糖胺残基的寡聚物。所得葡糖胺的氨基在化学上比N-乙酰葡萄糖胺的氨乙酰基或纤维素的羟基更具有反应性。

可以进一步化学修饰根据本发明获得的植物细胞壁，尤其是经脱乙酰化步骤的植物细胞壁。含此类植物细胞壁的产物，例如纤维、纱线或织物，具有与本领域所描述的纤维素-脱乙酰壳多糖混合物相似的品质，包括改进的染色性能、改进的对于例如皮肤癣菌的抑制、控制药物释放等。

在特定的实施方案中，本发明提供了根据本发明方法获得的或可从棉花植物中获得的棉花纤维。换句话说，提供了来自棉花植物的棉花纤维，所述棉花植物在其细胞的基因组，例如核基因组中含有嵌合基因，所述嵌合基因包含与编码N-乙酰葡萄糖胺转移酶的DNA区有效连接的植物可表达启动子，其中N-乙酰葡萄糖胺转移酶靶向于高尔基体膜；或提供了来自棉花植物的棉花纤维，所述棉花植物在其细胞的基因组，例如核基因组中含有嵌合基因，所述嵌合基因包含与编码NODC型N-乙酰葡萄糖胺转移酶的DNA区有效连接的植物可表达启动子；或提供了来自棉花植物的棉花纤维，所述棉花植物在其细胞的基因组，例如核基因组中含有嵌合基因，所述嵌合基因包含与编码壳多糖合酶的DNA区有效连接的植物可表达启动子。尤其是在后面的情况中，向植物细胞或植物施加有效量的N-乙酰葡萄糖胺或N-乙酰葡萄糖胺-1-磷酸或N-乙酰葡萄糖胺-6-磷酸或葡糖胺-6-磷酸可能是有利的。转移至棉花植物的嵌合基因中所含的DNA编码区或启动子的具体实施方案描述在本文献的其它部分。

根据本发明的棉花纤维在此类纤维增强阴离子染料(包括例如刚果红)染色的能力上、在此类纤维增强胺反应性染料(包括例如四氟苯酯)染色的能力上能够区别于天然存在的棉花纤维，即从不含根据本发明的嵌合基因的同基因系中获得的棉花纤维。根据本发明的棉花纤维还具有结合麦胚凝集素的能力，麦胚凝集素与壳寡糖相结合。通过直接检测N-乙酰葡萄糖胺和GlcNAc寡聚物如壳二糖，也能够区分根据本发明的棉花纤维与天然存在的棉花纤维，优选是在用壳多糖酶处理纤维细胞壁材料之后进行直接检测。还可以通过其增加的氮含量来辨别根据本发明的棉花纤维。

根据本发明的棉花纤维还有别于脱乙酰壳多糖包被的纤维或脱乙酰壳多糖/纤维素混纺纱线，这是因为带正电荷的寡聚物或多或少地均匀分布于构成纤维的次级植物细胞壁中。因此，在用如下所述的例如WGA或刚果红或四氟苯染色的棉花纤维的显微切片上，染料或多或少地均匀分布于构成棉花纤维的整个细胞壁中，而在脱乙酰壳多糖包被的纤维中，染色将集中在位于所处理纤维表面的一层脱乙酰壳多糖涂层上。

还可以通过检测留存在棉花纤维相关植物物质中的核酸中的嵌合基因来区分根据本发明的棉花纤维与其它棉花纤维，所述嵌合基因包含N-乙酰葡萄糖胺转移酶。

可以定量由阴离子染料例如刚果红对于根据本发明的植物细胞壁材料的增强染色，例如通过在标准条件下染色均量的物质，将所述物质铺展到标准化区域(例如多孔板的孔)，对该区域照片的物质色层灰度进行数字化处理。灰度越低，植物细胞壁材料染色越强。通过这种方法，在刚果红染色中，根据本发明的棉花纤维和细胞壁材料与来自不含有N-乙酰葡萄糖胺转移酶编码基因的同基因植物系的对照细胞壁材料或纤维相比，显示出至少大约5％的增加。

新型棉花纤维特异性结合麦胚凝集素的能力(通过偶联的荧光基团可检测)是新型棉花纤维与天然存在的棉花纤维相比所具有的明显区别特征。当用WGA-alexa Fluor 488或555处理时，除了极低的本底荧光以外，天然存在的棉花纤维没有染色/荧光。当存在壳寡糖时，棉花纤维的荧光增加至少5倍。因此，本发明提供了能够特异性结合麦胚凝集素、或偶联于荧光基团的WGA如WGAAlexa 488或WGA Alexa 555的棉花纤维，或用WGA Alexa 488或WGA Alexa555处理时在紫外光下产生明亮荧光的棉花纤维。该荧光不限于棉花纤维的表面，也分布于整个纤维细胞的细胞壁上。

根据本发明的植物细胞壁材料包括棉花纤维，其一般具有以下浓度的壳寡糖：至少0.1μg/mg细胞壁材料，优选至少1μg/mg细胞壁材料，优选至少5μg/mg细胞壁材料。

本发明还提供了如本文所述的嵌合基因，以及含此类嵌合基因的植物细胞或植物。

当本发明的方法涉及在植物细胞中引入嵌合基因时，显然此类方法还可以适用于将植物细胞掺入成熟植物的情况。例如，可根据确立的方法将转基因细胞再生为转基因植物。

转化植物细胞和植物的方法在本领域中是众所周知的。转化棉花植物的方法在本领域中也是众所周知的。在美国专利5,004,863或在美国专利6,483,013中已经描述了农杆菌介导的棉花转化，并且例如在WO92/15675中报道了用粒子轰击的棉花转化。

可通过转化将嵌合基因引入可从中得到胚愈伤组织的棉花植物，例如：Coker312、Coker310、Coker5Acala SJ-5、GSC25110、FiberMax 819、Siokra1-3、T25、GSA75、Acala SJ2、Acala SJ4、Acala SJ5、Acala SJ-C1、Acala B1644、Acala B1654-26、Acala B1654-43、Acala B3991、Acala GC356、Acala GC510、Acala GAM1、Acala C1、Acala Royale、Acala Maxxa、Acala Prema、Acala B638、Acala B1810、Acala B2724、Acala B4894、Acala B5002、non Acala“picker”Siokra、“stripper”变种FC2017、Coker 315、STONEVILLE 506、STONEVILLE825、DP50、DP61、DP90、DP77、DES119、McN235、HBX87、HBX191、HBX107、FC 3027、CHEMBRED A1、CHEMBRED A2、CHEMBRED A3、CHEMBREDA4、CHEMBRED B1、CHEMBRED B2、CHEMBRED B3、CHEMBRED C1、CHEMBRED C2、CHEMBRED C3、CHEMBRED C4、PAYMASTER 145、HS26、HS46、SICALA、PIMA S6和ORO BLANCO PIMA、FibermaxFM5013、FM5015、FM5017、FM989、FM832、FM966和FM958、FM989、FM958、FM832、FM991、FM819、FM800、FM960、FM966、FM981、FM5035、FM5044、FM5045、FM5013、FM5015、FM5017或FM5024以及具有由其衍生的基因型的植物。

如本文所用的“棉花”包括陆地棉(Gossypium hirsutum)、海岛棉(Gossypiumbarbadense)、树棉(Gossypium arboreum)和草棉(Gossypium herbaceum)或来自这些物种之间杂交的后代。

本发明的方法和手段还可用于其它植物物种，如***、黄麻、亚麻和木本植物，包括但不限于松属物种(Pinus spp.)、杨属物种(Populus spp.)、云杉属物种(Picea spp.)、桉树属物种(Eucalyptus spp.)等。

可将获得的转化植物用于常规的育种方案，以产生更多具有相同特征的转化植物，或将根据本发明的嵌合基因引入相同或相关的植物品种的其它变种或杂种植物。从转化植物中获得的种子含有作为稳定基因组***物的本发明的嵌合基因，并且也囊括在本发明中。

如本文所用的“包含”解释为指明存在所述及的特征、整体、步骤或组分，但不排除存在或增加一个或多个特征、整体、步骤或组分或其组别。因此，例如，包含核苷酸或氨基酸序列的核酸或蛋白质可能包含比实际列举的更多的核苷酸或氨基酸，即：将其嵌入较大的核酸或蛋白质。包含功能或结构定义的DNA区的嵌合基因可包含额外的DNA区等。

下列非限制性实施例描述了用于改变植物细胞壁的方法。在这些实施例中除非另有说明，所有的重组DNA技术根据Sambrook等人(1989)《分子克隆：实验手册》(Molecular Cloning：A Laboratory Manual)，第二版，冷泉港实验室出版社，纽约和Ausubel等人(1994)Current Protocols in Molecular Biology，CurrentProtocols(美国)，卷1和卷2所述的标准方案来进行。用于植物分子操作的标准材料和方法如R.D.D.Croy的Plant Molecular Biology Labfax(1993)所述，其由BIOS科技出版社有限公司(BIOS Scientific Publications Ltd)(英国)和Blackwell科技出版社(Blackwell Scientific Publications)(英国)联合出版。

序列表说明

在整个说明书和实施例中，涉及序列表中所示的下列序列：

SEQ ID No 1：茎瘤固氮根瘤菌的结瘤蛋白C

SEQ ID No 2：大豆慢生型根瘤菌的结瘤蛋白C

SEQ ID No 3：山羊豆根瘤菌的结瘤蛋白C

SEQ ID No 4：豌豆根瘤菌(蚕豆生物型)的结瘤蛋白C

SEQ ID No 5：苜蓿根瘤菌的结瘤蛋白C

SEQ ID No 6：热带根瘤菌的结瘤蛋白C

SEQ ID No 7：豌豆根瘤菌(菜豆生物型)的结瘤蛋白C

SEQ ID No 8：根瘤菌属物种菌株N33的结瘤蛋白

SEQ ID No 9：百脉根根瘤菌的结瘤蛋白

SEQ ID No 10：pTGK42的T-DNA

SEQ ID No 11：pTGK44的T-DNA

SEQ ID No 12：pTDBI5的T-DNA

SEQ ID No 13：pTDBI37的T-DNA

SEQ ID No 14：pTDBI50的T-DNA

SEQ ID No 15：与高尔基体靶向信号相连的合成壳多糖合酶

实施例

实施例1：编码N-乙酰葡萄糖胺转移酶蛋白的嵌合植物可表达基因的构建

应用标准的重组DNA技术，将植物可表达的NODC嵌合基因构建为含有下列有效连接的DNA片段：

●来自CaMV的35S启动子区

●编码非翻译前导序列的DNA片段(5’Cab22L)

●编码茎瘤固氮根瘤菌NODC的DNA片段

●与NODC编码ORF同读框克隆的编码EGFP(增强的绿色荧光蛋白)的DNA片段，从而制备包含NODC和EGFP的融合蛋白

●来自CaMV的35S转录物的转录终止和多聚腺苷酸信号(3’35S)。

将嵌合基因连同提供膦丝菌素抗性的嵌合bar基因一起***T-DNA载体的T-DNA边界之间。将产生的T-DNA载体命名为pTGK44。该载体的T-DNA序列由SEQ ID No 11提供。该T-DNA载体容许进行NODC-EGFP融合蛋白定位的组织化学分析。

将另一个嵌合基因构建为包含下列有效连接的DNA片段：

●来自CaMV的35S启动子区

●编码非翻译前导序列的DNA片段(5′Cab22L)

●编码茎瘤固氮根瘤菌NODC的DNA片段

●来自CaMV的35S转录物的转录终止和多聚腺苷酸信号(3′35S)

将嵌合基因连同提供膦丝菌素抗性的嵌合bar基因一起***T-DNA载体的T-DNA边界之间。将产生的T-DNA载体命名为pTGK42。该载体的T-DNA序列由SEQ ID No 10提供。该T-DNA载体容许在植物细胞中表达NODC，以分析是否产生了与此类植物细胞的细胞壁缔合的壳寡糖。

还将编码不同于NODC型蛋白的N-乙酰葡萄糖胺转移酶的对照嵌合基因构建为包含下列有效连接的DNA片段：

●来自CaMV的35S启动子区

●编码非翻译前导序列的DNA片段(5′Cab22L)

●编码粗糙链孢霉壳多糖合酶的DNA片段

●来自CaMV的35S转录物的转录终止和多聚腺苷酸信号(3′35S)

将嵌合基因连同提供膦丝菌素抗性的嵌合bar基因一起***T-DNA载体的T-DNA边界之间。将产生的T-DNA载体命名为pTGK43。了该载体T-DNA的序列由SEQ ID No 12提供。该T-DNA载体容许在植物细胞中表达壳多糖合酶，以分析是否产生了与此类植物细胞的细胞壁缔合的壳寡糖。

将T-DNA载体引入根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)C58C1Rif(PEHA101)。就对照实验而言，将仅含嵌合bar基因的T-DNA载体引入相同的农杆菌菌株。

随后用发根农杆菌ATCC15834和携带不同T-DNA载体的根癌农杆菌菌株根据下列方案共转化拟南芥叶盘，利用所述根癌农杆菌菌株产生拟南芥毛状根培养物。

使用下列培养基：

发芽培养基：MS盐/2，B5维生素，1.5％蔗糖，pH 5.8，0.7％琼脂(Difco)

标准培养基：MS培养基，0.5g/L MES，2％葡萄糖，pH 5.8，0.7％琼脂(Difco)

愈伤组织诱导培养基：MS培养基，0.5g/L MES，2％葡萄糖，pH 5.8，0.7％琼脂(Difco)，0.2mg/L 2，4D和0.2mg/L细胞***素。

毛状根伸长培养基：MS培养基，2％蔗糖，pH 6.2，0.7％琼脂(Difco)

根培养基：B5培养基，3％蔗糖，pH 5.5。

用下列方式由消毒种子在体外培养拟南芥芽。

种子用70％EtOH处理2分钟，接着用6％活性氯+0.05％吐温20漂白10分钟，并用无菌自来水洗涤5次。在无菌自来水(约10-12mL自来水，9厘米FalconOptilux培养皿，nr.1005)中于24℃光照(30-50μEinstein m^-2sec^-1)24小时，使种子预发芽。

将预发芽的种子置于发芽培养基上，以下列光照方案使之生长：在23-24℃以12小时光照/12小时黑暗或16小时光照/8小时黑暗(30-50 μEinstein m^-2sec^-1)大约2-3周。在YEB培养基琼脂板上培养发根农杆菌菌株，而在补充适于选择维持T-DNA载体的抗生素的minA培养基琼脂板上培养根癌农杆菌菌株。

为进行转化，将叶子一切为二，并置于愈伤组织诱导培养基中。将发根农杆菌和根癌农杆菌细菌重悬于标准培养基，以获得约0.2-0.3的OD₆₀₀，以1∶1的比例混合，并与叶片一起孵育大约5分钟。之后，除去细菌悬液，将感染的叶片置于标准培养基中并孵育大约3天(23-24℃；30μEinstein m^-2sec^-1；12小时光照/12小时黑暗或16小时光照/8小时黑暗)。

随后，将叶外植体用含500mg/L替卡西林(tricarcillin)(Duchefa)的“标准培养基”洗涤3次，并转移至含20-30mg/L草丁膦(gluphosinate)和500mg/L替卡西林的(20-30mg/L草丁膦)“标准培养基”中，并于23-24℃、30μEinstein m^-2sec^-1、以12小时光照/12小时黑暗或16小时光照/8小时黑暗进一步培养。

每周将叶外植体转移到新鲜的培养基中。在3-4周之后出现的根变得浓密，并转移到“毛状根伸长培养基”中。当根长几厘米时，在含50mL“根培养基”+250mg/L替卡西林的250mL锥形瓶中起始毛状根的培养。培养物在23-24℃摇动(110rpm)暗培养，且每周继代培养。逐渐降低替卡西林的浓度。当根生长良好时，将其断成大约1.5cm的片段，并将外植体分散在几个锥形瓶中。

还可以在固体培养基上培养毛状根培养物，其中每两周将培养物转移到新鲜的“毛状根伸长培养基”中。

类似的方案可用于产生棉花的毛状根培养物。

实施例2：毛状根培养物的组织化学分析

将在实施例1中所述通过发根农杆菌和携带不同T-DNA载体的根癌农杆菌共感染而获得的不同毛状根培养物的根毛进行组织化学染色，以显示细胞的不同化合物，并通过显微镜检分析。

可以利用GFP部分的绿色荧光来显示NODC-EGFP融合蛋白的定位。可以在与N-乙酰葡萄糖胺的IgM单克隆抗体(BIODESIGN)进行免疫反应之后检测N-乙酰葡萄糖胺，或利用麦胚凝集素-Alexa Fluor 488来检测。利用ER-TrackerBlue White DPX染料来染色内质网。利用BODIPY-TR显示高尔基体。利用Calcofluor White(荧光增白剂28)染色细胞壁。利用Hoechst 33342染色细胞核。

借助于荧光显微镜检，利用配备有容许光学切片的Apotome(Zeiss)的Axioplan 2显微镜(Zeiss，耶拿，德国)来检测组织化学染色的根毛细胞。利用AxioVision 4.2(Zeiss)进行图像处理。

不同的组织化学方法利用如下方案：

A.细胞壁的Calcofluor染色

Calcofluor White(或荧光增白剂28)是在紫外线辐照下(λ_max＝350nm)发出明显微蓝色荧光的无色有机化合物。

将待染色的样品浸入含50μg/mL终浓度荧光增白剂28的培养基或PBS(缓冲液)中15到30分钟。然后用培养基或缓冲液洗涤样品，并利用配备的显微镜来检测样品，利用Zeiss filter set 18进行荧光显微镜检。细胞壁发出明显微蓝色的光。

B.活细胞中高尔基复合体和内质网的组织化学染色

为染色高尔基复合体，使用在液体根培养基中培养大约5天的根。这些根用新鲜的根培养基清洗，然后与1μM BODIPY TR C5-神经酰胺(Molecular probes，Cat No B-34400)在4℃孵育大约30分钟。根用根培养基清洗几次，然后在新鲜的根培养基中于室温轻摇孵育30分钟。然后用新鲜的根培养基清洗根，然后利用Filterset 00(激发：BP530/585；发射：LP615)通过荧光显微镜Axioplan 2(Zeiss，耶拿，德国)来进行检测。

为染色内质网，使用在液体根培养基中培养大约5天的根。这些根用新鲜的根培养基清洗，然后与溶于根培养基的ER-Tracker Blue-White DPX(100nM)轻摇孵育大约2小时。根用根培养基清洗几次，然后利用Filterset 02(激发：G365；发射：LP420)通过荧光显微镜Axioplan 2(Zeiss，耶拿，德国)来进行检测。

C.根(根毛)细胞壁中引入的N-乙酰葡萄糖胺的整体免疫组织化学检测

将不同毛状根培养物的根在液体培养基中培养6天，补充50mM GlcNAc或不作任何补充。通过如下方法固定根、脱水、再水合并透化细胞壁。

当样品与N-乙酰葡萄糖胺孵育时，通过与PBS溶液孵育4次10分钟洗掉过量的N-乙酰葡萄糖胺。

由AA溶液的孵育和真空渗透来固定样品(孵育：1小时4次，每次继之以5分钟真空渗透)。AA溶液含50％EtOH和5％乙酸。

下一步时样品进行脱水：用50％EtOH清洗，并用50％EtOH洗涤2×30分钟，随后在70％EtOH中孵育60分钟。此阶段样品可储存在-20℃。

随后对样品进行细胞壁透化：用50％EtOH洗涤5分钟，用PBT(具有0.1％Tween20的PBS)洗涤2×5分钟，用PBT+0.3％Triton X100洗涤2×5分钟，最后用PBS(150mM NaCl；10mM磷酸钠缓冲液；pH 7.4)洗涤2×5分钟。

将透化的根转入含MQ水的培养皿中，并将其放在“Vectaboin处理的”显微镜载玻片上。在TLC平板加热器上55℃烘烤载玻片45分钟。通过用封闭液(1％BSA，PBT液)孵育载玻片1小时来完成封闭步骤。然后，将1％封闭液替换为大约400μL N-乙酰葡萄糖胺的IgM单克隆抗体(1μg/mL封闭液；BIODESIGN，Cat No H67108M)，并孵育1小时。随后用封闭液洗涤载玻片3次5到10分钟。然后将封闭液替换为大约400μL用Alexa Fluor 488(3μg/mL封闭液中；Molecular Probes，Cat No A-21042)标记的山羊抗小鼠IgM抗体，并孵育1小时。此后，将载玻片用封闭液洗涤5到10分钟，用PBT洗涤2次5到10分钟，然后用PBS洗涤几次以除去吐温20。借助于荧光显微镜检利用Filterset38(激发：BP470/40；发射：BP525/50)通过Axioplan 2显微镜来评价结果。

D.小麦凝集素介导的N-乙酰葡萄糖胺检测

将不同毛状根培养物的根在液体培养基中培养6天，补充50mM GlcNAc或没有任何补充。如以上C部分所述来固定根、脱水、再水合并透化细胞壁。

麦胚凝集素选择性地结合N-乙酰葡萄糖胺和N-乙酰神经氨酸残基。植物中不存在N-乙酰神经氨酸。因此，在植物中，麦胚凝集素可用于特异性地检测N-乙酰葡萄糖胺残基。

将透化的根置于含PBT的9厘米培养皿中。此后将根转入6孔培养板的孔中，并孵育1小时，孔中含有大约1.7μg/mL溶于PBT的Alexa Fluor 488(Molecular Probes，Cat No W-11261)标记的麦胚凝集素。样品随后用PBT洗涤3×10分钟，然后用PBS洗涤两次5分钟(以除去吐温20)。将样品置于“Vectabond处理的”或“Tissue Tack”显微镜载玻片的PBS液滴中。在除去大部分PBS之后，放上盖玻片。借助于荧光显微镜检利用Filterset 38(激发：BP470/40；发射：BP525/50)通过荧光显微镜Axioplan 2(Zeiss，耶拿，德国)来评价结果。

E.GFP分析

借助于荧光显微镜检利用Filterset 38(激发：BP470/40；发射：BP525/50)通过Axioplan 2显微镜(Zeiss，耶拿，德国)来评价EGFP荧光。

结果

1.N-乙酰葡萄糖胺在细胞壁中的定位

对含有嵌合NODC基因的根毛细胞进行免疫组织化学染色以观察N-乙酰葡萄糖胺的存在，随后用Calcofluor染色来显示细胞壁。图3显示了一组有代表性的荧光显微镜光学切片照片，其中图A表示显示细胞壁的(蓝色)荧光，而图B表示显示N-乙酰葡萄糖胺的(绿色)荧光。根据图C中两个光学切片的叠加图像，可以看到仅在根毛细胞的细胞壁中检测到了N-乙酰葡萄糖胺的存在。

2.NODC蛋白和高尔基体的共定位

对含有表达NODC-EGFP融合蛋白的嵌合基因的根毛细胞进行染色以显示高尔基体，随后用Calcofluor染色来显示细胞壁。图4显示了一组有代表性的荧光显微镜光学切片照片，其中图B表示显示细胞壁的(蓝色)荧光，图C表示与高尔基体相关的(红色)荧光，而图D表示显示NODC-EGFP融合蛋白的(绿色)荧光。根据图A中光学切片的叠加图像，可以看到NODC-EGFP融合蛋白的定位与高尔基体在根毛细胞中的定位重合。

3.在植物细胞中表达壳多糖合酶需要外部补加GlcNAc，以便在细胞壁中检测N-乙酰葡萄糖胺

如上所述在存在或不存在外加N-乙酰葡萄糖胺的条件下培养表达嵌合粗糙链孢霉壳多糖合酶的根。在小心洗涤之后，对根进行组织化学染色来检测N-乙酰葡萄糖胺。在图5的图A(外部补加GlcNAc的毛状根)中，能够检测到众多的绿色荧光斑点，而在图B(末经外部补加GlcNAc的毛状根)中能够检测到极少的绿色荧光斑点。

实施例3：拟南芥p35S::NODC毛状根细胞壁中壳多糖样寡聚物的生物化学验证

应用Morgan-Elson测定法来分析利用T-DNA载体pTGK42获得的p35S：NODC-p35S：bar转基因拟南芥(Col-0)毛状根和利用pTCO192(对照)获得的p35S：bar转基因对照拟南芥(Col-0)毛状根中N-乙酰葡萄糖胺的存在。

为此，在大约20μL缓冲液(25mM磷酸钾缓冲液pH 6.0)中收集大约100mg毛状根，以海砂垫底(ground with seasand)，沉淀并测定提取物中的蛋白质含量(用于标准化的目的)。除去上清液，将根重悬于100μL缓冲液中。向不同的样品中加入1单位的纤维素酶(来自绿色木霉(Trichoderma viride)的纤维素酶“Onozuka R-10””(Serva，Cat No16419)：溶于缓冲液，10U/mL)或1单位的壳多糖酶(来自粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)的壳多糖酶(Sigma，Cat NoC1650)：在缓冲液中10U/mL)或两者兼而有之，然后在25℃孵育过夜。

第二天早晨对样品进行Morgan-Elson测定以检测N-乙酰葡萄糖胺。在所采用的基于Morgan-Elson反应的比色法中，在100℃碱性条件下将N-乙酰葡萄糖的还原端依次变成色原I和II。随后用浓盐酸和浓硫酸的混合物处理，导致水分脱除，产生Morgan-Elson反应的色原III。在该反应的最后一步，使色原III与DMAB即对二甲氨基苯甲醛(埃利希试剂)反应来形成红色产物，其浓度可以通过测量585nm的吸光来确定。

UDP N-乙酰葡萄糖胺和N-乙酰葡萄糖胺-1-磷酸不能进行该测试，除非对其预先用酸水解。核苷酸可于100℃在0.01N酸中加热15分钟水解，但是糖磷酸需要更严格的条件，例如于100℃在0.01N HCl中水解5分钟。

结果总结于表2。

表2.经Morgan-Elson测定后的OD₅₈₅值

毛状根培养物	缓冲液	纤维素酶	壳多糖酶	纤维素酶壳多糖酶
					对照	0.070	0.100	0.117	0.157
P35S：NODC	0.056	0.096	0.100	0.252

根据这些结果，可以得出壳多糖样聚合物已嵌入细胞壁中的结论。

实施例4：应用HPTLC分析植物细胞壁材料中的壳寡糖和单糖

根据下列方案制备实施例1拟南芥毛状根(35S::NODC；35S::NODC_EGFP)和35S::bar对照毛状根的细胞壁。

细胞壁的制备

-收获毛状根；除去大部分具有组织的培养基

-用PBS缓冲液洗涤组织

-将大约1g组织放在管中

-用液氮冷冻

-在研钵中磨碎组织

-将磨碎的组织转入具有粗滤布的漏斗中

-用几升去离子水洗涤

-缝上粗滤布，然后转入含500mL乙醇的500mL瓶中

-用500mL乙醇洗涤15分钟，更换乙醇然后再洗涤15分钟

-用250mL***代替乙醇，然后洗涤15分钟。

残留的物质是“细胞壁材料”。干燥并称重细胞壁材料，然后将其转移到管中。

从细胞壁材料中提取壳寡糖

-向10mg细胞壁材料中加入300μL MQ水(使用25或50ml的管)，煮沸3分钟，然后在80℃(摇动)孵育2小时。可以用壳多糖酶和β-N-乙酰葡萄糖氨基转移酶混合物来消化细胞壁材料：溶于50μL 125mM磷酸钠-2mM CaCl₂-pH 6的0.5U壳多糖酶(壳多糖酶Sigma C7809或C6137→将(壳寡糖)糖极快地消化为N-乙酰葡萄糖胺；壳多糖酶BioLabs P5206S→将五-N-乙酰壳糖(penta-N-acetylchitose)(缓慢)消化为壳二糖和壳三糖)

-向大约5mg细胞壁材料中加入100μL酶混合物

-在25℃孵育过夜

-可通过离心从细胞壁材料中分离缓冲液

在提取之后，将含壳寡糖的缓冲液与壳寡糖混合物的标准水溶液一起在HPTLC板上(HPTLC板NH2(无荧光指示剂)10×20cm(Merck，Art.12572))点样。标准液含N-乙酰葡萄糖胺、壳二糖、壳三糖、壳四糖和壳五糖。

可使用下列显影溶剂：

■正丁醇(70)∶乙酸(20)∶水(10)(缓冲液D)

■乙腈(76)∶水(24)∶0.5％硼酸水性溶液(10)(缓冲液A)

■乙腈(10)∶异丙醇(67)∶50mM KCl(23)(缓冲液B)

■正丁醇(50)∶乙醇(30)∶水(20)(缓冲液C)

层析

-透明板用甲醇显影

-将1(-2)μL标准液(从底部以上15mm)和1-5μL样品在大约6mm长的带内点样

-在“CAMAG Twin Through Chamber”中显影板：7-7.5cm移动距离

-用于10×10cm板的Twin Through Chamber→10mL显影液

用于20×10cm板的Twin Through Chamber→20mL显影液

-用风扇干燥板

-在大约150℃加热板20分钟(TLC板加热器)

-用紫外线(366nm)显示糖类

双向层析

-透明板用甲醇显影

-将1-5μL样品在大约3mm长的带内点样：板右角(从底部向上15mm并且从各点间隔15mm)

-在“CAMAG Twin Through Chamber”第一向上显影板：7-7.5cm移动距离

-用于10×10cm板的Twin Through Chamber→10mL显影液

-用风扇干燥板

-在其它方向上显影板

-用风扇干燥板

-在大约150℃加热板20分钟(TLC板加热器)

-用紫外线(366nm)显示糖类

图6显示单向HPTLC的结果，其中提取的细胞壁材料而未用壳多糖酶进一步消化。图7显示在用壳多糖酶消化之后双向HPTLC结果。在对照植物中未检测到壳寡糖，但是含N-乙酰葡萄糖胺转移酶基因的植物中存在显著量的壳寡糖。

利用在实施例1中所述的嵌合基因还产生了转基因拟南芥植物。该材料比上述的毛状根培养物更为均一。制备细胞壁材料，如所述提取壳寡糖，然后如本文所述在缓冲液A中进行HPTLC。结果如图8所示。

来自转基因35S::NodC拟南芥芽的细胞壁材料显示高含量的壳三糖，这是通过与大约5μg/mg细胞壁材料或0.01％新鲜叶材料的标准溶液相比较而估算的。

实施例5：拟南芥毛状根培养物的植物细胞壁材料的染色

如实施例1所述产生拟南芥毛状根培养物，如实施例5所述制备其细胞壁材料，然后储存在-20℃。将细胞壁材料用阴离子染料(刚果红)或胺反应性染料(AlexaFluor 488四氟苯酯)染色。

A.刚果红染色

-将储存在-20℃的NODC毛状根或对照植物的细胞壁材料在pH 5的醋酸缓冲液中再水合(50mg细胞壁材料/管)

-用溶于pH 5的醋酸缓冲液的0.03％刚果红染色所述材料

-用pH 5的醋酸缓冲液洗涤细胞壁材料，然后用PBS缓冲液洗涤几次

-将全部的细胞壁材料转入48孔平板的孔中

-在标准照明条件下，对单个孔拍摄数字图象，然后确定数字图象的平均灰度值

结果：

样品1：

	平均值	最小值	最大值	IntDen	中位数
						NodC对照	89.39097.761	7683	126136	34601863784246.000	8997

样品2：

	平均值	最小值	最大值	IntDen	中位数
						NodC对照	101.548108.109	8690	130139	34793553704154	101108

样品3：

	平均值	最小值	最大值	IntDen	中位数
						NodC对照	97.866104.634	8185	120134	36500123902418	98104

含嵌合NodC基因的毛状根的细胞壁材料与对照植物的细胞壁材料相比，具有更为强烈的可再现性染色。细胞壁材料的灰度值比对照植物低大约5-10％。

B.Alexa Fluor 488四氟苯酯染色

-将储存在-20℃来自NODC毛状根或对照植物的细胞壁材料在pH 5的PBS缓冲液中再水合(50mg细胞壁材料/管)，然后在56℃用蛋白酶K(100μg/ml)处理过夜。

-用PBS缓冲液彻底洗涤所述材料，并用Alexa Fluor 488四氟苯酯标记。Alexa Fluor 488四氟苯酯可作为试剂盒(Alexa Fluor 488单克隆抗体标记试剂盒(Molecular Probes，A-20181))获得。

-可以应用例如具有Zeiss filter 38的荧光显微镜检来检测染色材料。

含嵌合NodC基因的毛状根的细胞壁材料与对照植物的细胞壁材料相比，具有更为强烈的可再现性染色。

实施例6：转基因的棉花植物

应用如US6483013所述的方法产生含有如下嵌合NODC基因的转基因棉花植物：如实施例1所述的嵌合NODC基因，或处于F285纤维选择性启动子(如US2003/106097所述)的控制下的嵌合NODC基因。

分离来自这些转基因棉花植物的纤维，然后用于生产具有改进的反应性，例如改进的染色性能的纱线和织物。

实施例7：具有增强的反应性的棉花纤维

如实施例6所述产生含有与CaMV35S启动子有效连接的嵌合NodC编码区的转基因棉花植物。从这些植物中收获成熟的棉花纤维，然后用刚果红染色或与WGA-Alexa Fluor 555反应。

A.刚果红染色

从含有嵌合NodC基因的转基因棉花植物中，以及从不包含嵌合NodC基因的对照植物中获得成熟的棉花纤维。通过乙醇和***洗涤从纤维中除去脂质。干燥棉花纤维。

在醋酸盐缓冲液pH 5中再水合25mg纤维，然后用溶于醋酸盐缓冲液pH 5的0.03％刚果红染色。用醋酸盐缓冲液pH 5和PBS缓冲液洗涤细胞壁材料几次。

用亮视野显微镜检和荧光显微镜检(Zeiss filter 18)分析染色纤维。也如实施例5A所述分析48孔平板中染色纤维的数字图象。

在亮视野显微镜检中，从NodC转基因棉花植物获得的棉花纤维比来自非转基因植物的棉花纤维显示更强烈的红色。当以荧光显微镜检分析纤维时，该差别更加突出。

来自转基因NodC植物的刚果红染色的棉花纤维得到的平均灰度值也显著低于来自非转基因植物的棉花纤维，证实了阴离子染料对转基因棉花植物纤维的更强的染色。

范围	平均值	最小值	最大值	IntDen	中位数
						NodC 38958对照 38958	81.38886.558	7279	179160	31707163372108	8085

当用热NaOH(80℃60％)处理纤维至少1个小时时，染色上的差异得以维持，并且甚至得到强化。该处理除去了蛋白质、果胶质和蜡质，并且能够使壳寡糖脱乙酰化。

另外当产生了单根纤维细胞的实际组织切片时，如可观察到的，强化的刚果红染色均匀分布于细胞壁。

R.WGA-Alexa 555染色

基本上如实施例2所述对来自转基因NodC植物的棉花纤维中N-乙酰葡萄糖胺寡聚物进行检测。不需要干燥或透化棉花纤维。相反，在氯仿∶甲醇混合物(1∶1)中处理纤维3次10分钟以除去脂质和蜡质，接着在丙酮中处理两次10分钟，然后在***中处理两次5分钟。使纤维风干。

用WGA-Alexa555、WGA-Alexa 488或WGA-四甲基罗丹明对纤维进行染色。

将纤维置于封闭液(150mM NaCL，10mM磷酸钠缓冲液pH 7.4；0.1％吐温20和1％牛血清白蛋白)中，然后孵育1小时。此后，缓冲液用含WGA-荧光染料的相同缓冲液替换，然后孵育4小时。用封闭液替代WGA-荧光染料溶液，洗涤10分钟，随后用不含BSA的封闭液洗涤3次10分钟，然后用不含BSA且不含吐温的封闭液洗涤2次5分钟。将染色纤维放在显微镜载玻片上，然后借助于荧光显微镜检(Axioplan 2(Zeiss，耶拿，德国))来评价，其中对于Alexa Fluor 488缀合物使用Filterset 38(激发：BP470/40；发射：BP525/50)或对于Alexa Fluor 555或四甲基罗丹明缀合物使用Filterset 20(激发：BP546/12；发射：BP575-640)。

在来自非转基因植物的棉花纤维中检测不到特异性荧光，而在来自包含嵌合NodC基因的棉花植物的棉花纤维中可检测到明亮的荧光(见图9)。棉花纤维的实际显微切片表明WGA-fluor 555均匀分布于棉花纤维细胞的次生细胞壁上。

实施例9：包含具有高尔基体靶向信号的粗糙链孢霉壳多糖合酶的拟南芥毛状根的细胞壁的反应性

应用标准的重组DNA技术，将含有异源高尔基体靶向信号序列的植物可表达N-乙酰葡萄糖胺转移酶构建成包含下列有效连接的DNA片段：

●来自CaMV的35S启动子区

●编码非翻译前导序列的DNA片段(5’Cab22L)

●编码来自拟南芥的β-1，2-木糖基转移酶的35个N末端氨基酸的DNA片段

●与上述DNA片段同读框克隆的编码粗糙链孢霉CHS2(壳多糖合酶)的DNA片段

●来自CaMV的35S转录物的转录终止和多聚腺苷酸信号(3’35S)

将嵌合基因连同提供膦丝菌素抗性的嵌合bar基因一起***T-DNA载体的T-DNA边界之间。将产生的T-DNA载体命名为pTDBI37。在SEQ ID No 13中提供了该载体T-DNA的序列。

将该T-DNA载体引入根癌农杆菌，并如实施例1所述用于产生毛状根培养物。

在与缀合于荧光素的壳多糖结合结构域孵育之后，可以通过荧光显微镜检来检测毛状根培养物细胞壁中的N-乙酰葡萄糖胺寡聚物。

还可以如实施例2所述，利用WGA-Alexa 555检测毛状根培养物细胞壁中的N-乙酰葡萄糖胺寡聚物。另外，还可以观察到与细胞质中相当于高尔基体的小球缔合的荧光。

实施例9：棉花纤维氮含量的测定

从实施例7的转基因棉花植物中获得成熟的棉桃。对于每个棉桃，测定20mg清洁纤维。为此，通过在氯仿∶甲醇(1∶1)混合物中洗涤3次20分钟；在丙酮中2次20分钟；在***中2次5分钟来从纤维中除去脂类和蜡质，然后使之风干。

利用“总氮”分析试剂盒和HANNA Instruments(罗得岛，美国)的C124多参数台式光度计(Multiparameter Bench Photometer)测量纤维表面上的总氮。

获得了下列结果：

	野生型	转基因型
			平均值	56mg/L N	85mg/L N
棉桃数量	9	10
			标准误差	2.6mg/L N	5.1mg/L N

			t检验(α＝0.05)
P双尾检验	2.2×10^-4

来自转基因系的棉桃纤维表面与野生型棉桃纤维相比，包含统计学意义上更多的氮。

实施例10：棉花中壳多糖合酶的纤维特异性表达

●来自棉花的纤维特异性启动子区

●编码非翻译前导序列的DNA片段(5′Cab22L)

●编码拟南芥β-1，2-木糖基转移酶的35个N-末端氨基酸的DNA片段

●与上述DNA片段同读框克隆的编码粗糙链孢霉的CHS2(壳多糖合酶)的DNA片段

●来自CaMV的35S转录物的转录终止和多聚腺苷酸信号(3′35S)

将嵌合基因连同提供膦丝菌素抗性的嵌合bar基因一起***T-DNA载体的T-DNA边界之间。将产生的T-DNA载体命名为pTDBI50。在SEQ ID No 14中提供了该载体T-DNA的序列。

将该T-DNA载体引入根癌农杆菌，并用于产生转基因棉花。从转基因植物的棉桃中分离的纤维具有增加量的N-乙酰葡萄糖胺低聚物，且或多或少均匀分布于整个细胞壁中。

Claims

1.用于增加植物细胞壁中带正电荷的寡糖或多糖量的方法，所述方法包括

i.向植物细胞引入或提供嵌合基因使该嵌合基因在该植物细胞中表达，所述嵌合基因包含：

1.植物可表达启动子；

2.编码N-乙酰葡萄糖胺转移酶的DNA区，其中所述N-乙酰葡萄糖胺转移酶是包含用于靶向到高尔基体膜上的信号锚定序列的壳多糖合酶或者其中所述N-乙酰葡糖胺转移酶是NODC型；以及

3.转录终止和多聚腺苷酸区；

其中所述植物细胞来自棉花、***、亚麻、拟南芥属物种、杨属物种或桉树属物种。

2.权利要求1的方法，其中所述壳多糖合酶包含选自如下的信号锚定序列：大鼠唾液酸转移酶的信号锚定序列、人半乳糖转移酶的信号锚定序列、酵母HDEL受体拟南芥同源物的信号锚定序列、α-2，6-唾液酸转移酶的信号锚定序列、来自拟南芥的β1，2-木糖基转移酶的信号锚定序列、来自烟草的N-乙酰葡萄糖氨基转移酶I的信号锚定序列或氨基酸序列YYHDL或LKLEI。

3.权利要求1或2的方法，其中所述的壳多糖合酶包含SEQ ID No.15第1位至第35位的氨基酸序列。

4.权利要求1或2的方法，其中所述的壳多糖合酶由SEQ ID No.15的氨基酸序列组成。

5.权利要求1的方法，其中所述的DNA区编码能从根瘤菌属(Rhizobium)物种、固氮根瘤菌属(Azorhizobium)物种、慢生根瘤菌属(Bradyrhizobium)物种、中慢生根瘤菌属(Mesorhizobium)物种、雷尔氏菌属(Ralstonia)物种、链霉菌属(Streptomyces)物种、伯克霍尔德氏菌属(Burkholderia)物种、贪铜菌属(Cupriavidus)物种或中华根瘤菌属(Sinorhizobium)物种中获得的NODC型N-乙酰葡萄糖胺转移酶。

6.权利要求1或5的方法，其中所述的NODC型的N-乙酰葡萄糖胺转移酶由下述氨基酸序列组成：SEQ ID No 1、SEQ ID No 2、SEQ ID No 3、SEQ ID No 4、SEQ ID No 5、SEQ ID No 6、SEQ ID No 7、SEQ ID No 8、SEQ ID No 9、CAA67139、CAA608779、CAA51774、CAA51773、CAA25811、CAA25810、CAA25814、CAA68619、CAA2350、CAD31533、CAC05896、CAH04369、CAB56055、NP_629203、P26024、P17862、BAB524500、AAX30050、AAX30049、E38180、JQ0396、ZZZRC4、ZZZRCL、A95321、C23766、C26813、NP_659761、NP_443883、NP_106714、NP_768667、NP_435719、BAC47292、AAU11365、AAU11364、AAU11363、AAU11362、AAU11361、AAU11360、AAU11359、AAU11358、AAU11357、AAU11356、AAU11355、AAU11354、AAU11353、AAU11352、AAU11351、AAU11350、AAU114349、AAU11348、AAU11347、AAU11346、AAU11345、AAU11344、AAU11343、AAU11342、AAU11341、AAU11340、AAU11339、AAU11338、AAK65131、AAS91748、P04679_2、P04679_1、P04679、P72334、Q53513、P50357、P04678、P50536、P53417、Q07755、P04341、P04340、P24151、P04677、CAD90588、CAD90587、CAD90586、CAD90585、CAD90584、CAD90583、CAD90257、CAD43933、AAM54775、AAN62903、S34305、S09522、S07304、AAL88670、CAD29957、CAD29956、CAD29955、CAD29954、CAD29953、CAD29952、CAD29951、CAD29950、CAD29949、CAC42489、AAK53549、AAK53548、AAK50872、AAK39967、AAK39966、AAK39965、AAK39964、AAK39963、AAK39962、AAK39961、AAK39960、AAK39959、AAK39958、AAK39957、AAK39956、AAG44125、AAK00157、AAG60998、AAB71694、AAB16897、AAV80567、AAB95329、BAA24092、BAA06089、BAA06086、BAA06085、BAA06083、BAA06090、BAA06082、BAA06087、BAA06088、BAA06084、AAB91695、AAB51164、AAB47353、AAB34509、AAB24745、1615305E、1615305D、165305C、CAA26311、CAA26310、CAA3731、AAA63602或26226。

7.权利要求1、2和5中任一项的方法，其中所述的植物可表达启动子是选自如下的启动子：来自棉花的β-微管蛋白基因的纤维特异性启动子、来自棉花的肌动蛋白基因的纤维特异性启动子、来自棉花的脂质转移蛋白基因的纤维特异性启动子、来自棉花的膨胀素基因的启动子或来自棉花的壳多糖酶基因的启动子。

8.权利要求3的方法，其中所述的植物可表达启动子是选自如下的启动子：来自棉花的β-微管蛋白基因的纤维特异性启动子、来自棉花的肌动蛋白基因的纤维特异性启动子、来自棉花的脂质转移蛋白基因的纤维特异性启动子、来自棉花的膨胀素基因的启动子或来自棉花的壳多糖酶基因的启动子。

9.权利要求4的方法，其中所述的植物可表达启动子是选自如下的启动子：来自棉花的β-微管蛋白基因的纤维特异性启动子、来自棉花的肌动蛋白基因的纤维特异性启动子、来自棉花的脂质转移蛋白基因的纤维特异性启动子、来自棉花的膨胀素基因的启动子或来自棉花的壳多糖酶基因的启动子。

10.权利要求1、2、5、8、9中任一项的方法，其中所述的植物选自棉花、***或亚麻。

11.权利要求3的方法，其中所述的植物选自棉花、***或亚麻。

12.权利要求4的方法，其中所述的植物选自棉花、***或亚麻。

13.权利要求7的方法，其中所述的植物选自棉花、***或亚麻。

14.权利要求10的方法，其中在所述棉花植物中的植物细胞壁包含纤维。

15.权利要求11-13任一项的方法，其中在所述棉花植物中的植物细胞壁包含纤维。

16.权利要求1的方法，其还包括用碱溶液处理所述细胞壁的步骤，处理的时间足以使所述由N-乙酰葡萄糖胺单体组成的寡糖脱乙酰化。

17.权利要求1或2的方法，还包括分离所述植物细胞壁或包含所述植物细胞壁的纤维的步骤。

18.权利要求3的方法，还包括分离所述植物细胞壁或包含所述植物细胞壁的纤维的步骤。

19.权利要求4的方法，还包括分离所述植物细胞壁或包含所述植物细胞壁的纤维的步骤。

20.权利要求1或2的方法，其中所述的植物细胞壁是次生植物细胞壁。

21.权利要求3的方法，其中所述的植物细胞壁是次生植物细胞壁。

22.权利要求4的方法，其中所述的植物细胞壁是次生植物细胞壁。

23.植物细胞壁，包含增加量的带正电荷的寡糖，其中在所述植物细胞中表达包含用于靶向到高尔基体膜上的信号锚定序列的壳多糖合酶或者NODC型的N-乙酰葡糖胺转移酶，其中所述增加是当所述植物细胞壁与没有所述包含用于靶向到高尔基体膜上的信号锚定序列的壳多糖合酶或者没有所述NODC型的N-乙酰葡糖胺转移酶的同基因植物系的植物细胞壁相比时；并且其中所述植物细胞来自棉花、***、亚麻、拟南芥属物种、杨属物种或桉树属物种。

24.权利要求23的植物细胞壁，其中所述带正电荷的寡糖为寡聚-N-乙酰葡萄糖胺或寡聚-葡糖胺。

25.权利要求24的植物细胞壁，其中所述带正电荷的寡糖为聚合度为3到10的N-乙酰葡萄糖胺或葡糖胺的寡聚物。

26.权利要求24的植物细胞壁，其中所述带正电荷的寡糖为聚合度为3到5的N-乙酰葡萄糖胺或葡糖胺的寡聚物。

27.能通过权利要求1到22中任一项的方法获得的植物细胞壁，其中在所述植物细胞中表达包含用于靶向到高尔基体膜上的信号锚定序列的壳多糖合酶或者NODC型的N-乙酰葡糖胺转移酶。

28.权利要求23的植物细胞壁，其能够自根细胞或纤维细胞获得。

29.能够特异性结合麦胚凝集素的次生植物细胞壁，其中在所述植物细胞中表达包含用于靶向到高尔基体膜上的信号锚定序列的壳多糖合酶或者NODC型的N-乙酰葡糖胺转移酶，其中所述植物细胞来自棉花、***、亚麻、拟南芥属物种、杨属物种或桉树属物种。

30.能通过权利要求17-19中任一项的方法获得的棉花纤维，其中所述棉花纤维所来源的棉花植物细胞中表达包含用于靶向到高尔基体膜上的信号锚定序列的壳多糖合酶或者NODC型的N-乙酰葡糖胺转移酶。

31.能够特异性结合麦胚凝集素的棉花纤维，其中所述棉花纤维所来源的棉花植物细胞中表达包含用于靶向到高尔基体膜上的信号锚定序列的壳多糖合酶或者NODC型的N-乙酰葡糖胺转移酶。

32.权利要求31的棉花纤维，其中所述的结合的麦胚凝集素均匀分布于所述纤维的整个次生细胞壁。

33.由权利要求23到29中任一项的植物细胞壁或根据权利要求30到32中任一项的棉花纤维所制备的纱线或织物，其中所述纱线或织物所来源植物细胞中表达包含用于靶向到高尔基体膜上的信号锚定序列的壳多糖合酶或者NODC型的N-乙酰葡糖胺转移酶。

34.根据权利要求23到29中任一项的植物细胞壁、根据权利要求30到32中任一项的棉花纤维或根据权利要求33的纱线或织物在以下方面的用途：

a.用于制备废水净化中絮凝装置；

b.在食品工业中作为稳定剂；

c.在钻孔中作为冷却液；

d.用于制备卫生功能服；

e.用于制备伤口愈合织物；或者

f.用于造纸。

35.权利要求34的用途，其中所述在食品工业中作为稳定剂的用途是增加冻融稳定性。

36.编码包含用于靶向到高尔基体膜上的信号锚定序列的壳多糖合酶的DNA区的用途，其在植物中表达时用于增加植物细胞的细胞壁中带正电荷寡糖的量或用于对这样的植物细胞壁进行化学修饰以提高植物细胞壁的反应性，其中所述植物细胞来自棉花、***、亚麻、拟南芥属物种、杨属物种或桉树属物种。

37.编码NODC型N-乙酰葡萄糖胺转移酶的DNA区的用途，其在植物中表达时用于增加植物细胞的细胞壁中带正电荷的寡糖量，其中所述植物为棉花、***、亚麻、拟南芥属物种、杨属物种或桉树属物种。

38.编码NODC型N-乙酰葡萄糖胺转移酶的DNA区的用途，其在植物中表达时用于对植物细胞壁进行化学修饰以提高植物细胞壁的反应性，其中所述植物为棉花、***、亚麻、拟南芥属物种、杨属物种或桉树属物种。

39.嵌合基因，包含下列有效连接的DNA区：

a.植物可表达启动子；

b.编码N-乙酰葡萄糖胺转移酶的DNA区，其中所述N-乙酰葡萄糖胺转移酶是包含用于靶向到高尔基体膜上的信号锚定序列的壳多糖合酶或者其中所述N-乙酰葡糖胺转移酶是NODC型；以及

c.转录终止和多聚腺苷酸区。

40.根据权利要求39的嵌合基因，其中所述信号锚定序列选自大鼠唾液酸转移酶的信号锚定序列、人半乳糖转移酶的信号锚定序列、酵母HDEL受体拟南芥同源物的信号锚定序列、α-2，6-唾液酸转移酶的信号锚定序列、来自拟南芥的β1，2-木糖基转移酶的信号锚定序列、来自烟草的N-乙酰葡萄糖氨基转移酶I的信号锚定序列或氨基酸序列YYHDL或LKLEI。

41.根据权利要求39的嵌合基因，其中所述的N-乙酰葡萄糖胺转移酶包含SEQ ID No.15第1位至第35位的氨基酸序列。

42.根据权利要求39的嵌合基因，其中所述的N-乙酰葡萄糖胺转移酶由SEQID No.15的氨基酸序列组成。

43.根据权利要39的嵌合基因，其中所述的N-乙酰葡萄糖胺转移酶是NODC型N-乙酰葡萄糖胺转移酶。

44.根据权利要求43的嵌合基因，其中所述NODC型N-乙酰葡萄糖胺转移酶能够从根瘤菌属物种、固氮根瘤菌属物种、慢生根瘤菌属物种、中慢生根瘤菌属物种、雷尔氏菌属物种、链霉菌属物种、伯克霍尔德氏菌属物种或中华根瘤菌属物种中获得。

45.根据权利要求43的嵌合基因，其中所述的NODC型N-乙酰葡萄糖胺转移酶由下述氨基酸序列组成：SEQ ID No 1、SEQ ID No 2、SEQ ID No 3、SEQ IDNo 4、SEQ ID No 5、SEQ ID No 6、SEQ ID No 7、SEQ ID No 8、SEQ ID No 9、CAA67139、CAA608779、CAA51774、CAA51773、CAA25811、CAA25810、CAA25814、CAA68619、CAA2350、CAD31533、CAC05896、CAH04369、CAB56055、NP_629203、P26024、P17862、BAB524500、AAX30050、AAX30049、E38180、JQ0396、ZZZRC4、ZZZRCL、A95321、C23766、C26813、NP_659761、NP_443883、NP_106714、NP_768667、NP_435719、BAC47292、AAU11365、AAU11364、AAU11363、AAU11362、AAU11361、AAU11360、AAU11359、AAU11358、AAU11357、AAU11356、AAU11355、AAU11354、AAU11353、AAU11352、AAU11351、AAU11350、AAU114349、AAU11348、AAU11347、AAU11346、AAU11345、AAU11344、AAU11343、AAU11342、AAU11341、AAU11340、AAU11339、AAU11338、AAK65131、AAS91748、P04679_2、P04679_1、P04679、P72334、Q53513、P50357、P04678、P50536、P53417、Q07755、P04341、P04340、P24151、P04677、CAD90588、CAD90587、CAD90586、CAD90585、CAD90584、CAD90583、CAD90257、CAD43933、AAM54775、AAN62903、S34305、S09522、S07304、AAL88670、CAD29957、CAD29956、CAD29955、CAD29954、CAD29953、CAD29952、CAD29951、CAD29950、CAD29949、CAC42489、AAK53549、AAK53548、AAK50872、AAK39967、AAK39966、AAK39965、AAK39964、AAK39963、AAK39962、AAK39961、AAK39960、AAK39959、AAK39958、AAK39957、AAK39956、AAG44125、AAK00157、AAG60998、AAB71694、AAB16897、AAV80567、AAB95329、BAA24092、BAA06089、BAA06086、BAA06085、BAA06083、BAA06090、BAA06082、BAA06087、BAA06088、BAA06084、AAB91695、AAB51164、AAB47353、AAB34509、AAB24745、1615305E、1615305D、165305C、CAA26311、CAA26310、CAA3731、AAA63602或26226。

46.根据权利要求39到45中任一项的嵌合基因，其中所述的启动子是纤维选择性启动子。

47.根据权利要求46的嵌合基因，其中所述纤维选择性启动子选自：来自棉花的β-微管蛋白基因的纤维特异性启动子、来自棉花的肌动蛋白基因的纤维特异性启动子、来自棉花的脂质转移蛋白基因的纤维特异性启动子、来自棉花的膨胀素基因的启动子或来自棉花的壳多糖酶基因的启动子。

48.根据权利要求23到29中任一项的植物细胞壁或根据权利要求30到32中任一项的纤维在对所述植物细胞壁或所述纤维进行进一步化学修饰中的用途。

49.编码N-乙酰葡萄糖胺转移酶的DNA区在对植物细胞壁进行化学修饰以提高植物细胞壁的反应性中的用途，其中所述N-乙酰葡萄糖胺转移酶是包含用于靶向到高尔基体膜上的信号锚定序列的壳多糖合酶或者其中所述N-乙酰葡糖胺转移酶是NODC型，其中所述植物细胞来自棉花、***、亚麻、拟南芥属物种、杨属物种或桉树属物种。

50.编码N-乙酰葡萄糖胺转移酶的DNA区对棉花纤维进行化学修饰以提高棉花纤维的反应性中的用途，其中所述N-乙酰葡萄糖胺转移酶是包含用于靶向到高尔基体膜上的信号锚定序列的壳多糖合酶或者其中所述N-乙酰葡糖胺转移酶是NODC型。