KR101393718B1 - 비알레르기성 프로바이오틱 박테리아 배양물의 제조 방법 및 관련 용도 - Google Patents
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Abstract
본 발명의 목적은 비알레르기성 프로바이오틱 박테리아 배양물의 제조방법을 제공하는데 있다.
Description
본 발명의 목적은 비알레르기성(anallergic) 프로바이오틱(probiotic) 박테리아 배양물의 제조방법이다.
인간 위장관은 거의 모든 장기들 및 숙주 기능과 관련하여 국부적 위장관 수준에서 영향을 미칠 뿐 아니라, 간접적으로 일반적인 전신 수준에도 영향을 미치는, 서로 다른 작용을 할 수 있는 엄격한 혐기성 박테리아로 주로 구성된 미생물 균총이라 불리는 복잡한 미생물, 군집을 포함하는 것으로 알려져 있다.
섭취된 음식의 입자들과 장 점막 모두를 군집화 (colonize)할 수 있는 많은 다양한 상이 종(400-500)들로 구성되어 있는 장의 미생물균총 (microflora)은 그리하여 개체의 건강을 강하게 조절할 수 있다.
장 미생물균총의 조성물은 연령, 개체의 생리학적 상태, 상이한 병상의 존재, 스트레스 및 특히 식이요법을 비롯한 몇몇 인자에 의해 변경될 수 있다.
내생적 및 외생적 부정적 인자의 결과로, 유용한 박테리아 (소장 내 젖산균 및 대장 내 비피도박테리아에 속하는 전형적인 박테리아)가 감소하고, 병원성 엔테로박테리아, 스트렙토코시, 클로스트리디아가 증가된다.
특수 의약품, 음식물(dietetics), 첨가물(integrator) 및 상기 모든 식품 [소위 "기능성(functional)" 식품 또는 "영양보조(nutraceutic)" 식품]을 통하여 프로바이오틱을 투여하면, 최적의 장 기능성이 복구되어 숙주의 미생물균총이 재평형화된다.
"프로바이오틱 (probiotic)"이라는 용어는 일반적으로 건강한 개체의 장 미생물균총으로부터 선택된 살아있는 미생물과 관련된 것으로 이것은 적절한 시간에 적절한 양으로 일단 투여되는 것이며, 또한 일시적으로, 서로 다른 장관에 콜로니를 형성시키고, 숙주 유기체의 건강에 유익한 효과를 준다.
프로바이오틱에 속하는 것은 주로 락토바실러스 (Lactobacillus) 속, 비피도박테리움 (Bifidobacterium) 속, 스트렙토코커스 (Streptococcus) 속, 페디오코커스 (Pediococcus) 속, 락토코커스 (Lactococcus) 속, 프로피오니박테리움 (Propionibacterium) 속, 류코노스톡 (Leuconostoc) 속 및 낮은 수준으로 사카로마이세스 (Saccharomyces) 속, 바실러스 (Bacillus) 속 및 엔테로코커스 (Enterococcus) 속의 몇몇 종들이다.
전세계에서 실행되는 엄격한 임상 테스트에 의해 나타난 프로바이오틱의 섭취에 의한 소비자로부터 유도된 건강한 효과 및 유익한 효과 중에는,
1. 면역 시스템의 자극
2. 항유전독성 효과 및 항돌연변이의 유도
3. 예컨대,
-대장 암종
-유방 암종
-방광암
으로 언급되는 항종양 및 항전이 작용;
4. 영양분 흡수의 개선
5. 유당분해효소결핍증 (lactose intolerance) 증상의 감소;
6. pH를 강하에 의한 장 운동의 개선 및 변비 감소;
7. 콜레스테롤 및 지방 흡수 감소;
8. 여성 비뇨생식기계의 감염을 억제하는 항설사 (Antidiarrhoic), 항고혈압, 항당뇨병 활성
9. 노인병 병리의 활성 방지
가 언급될 수 있다.
경구 용도의 프로바이오틱은 다음의 일반적이고 기능적인 요건에 의해 특징될 수 있다:
i) 인간 장 기원; 양호한 건강 상태에서의 개체로부터;
ii) 생체안전성 (biosafety); 약해진 또는 면역력이 저하된 사람들에게 특히 부작용을 일으켜서는 안된다;
iii) 저항성 및 생존력; 회장 및 대장에 손상되지 않는 방법으로 완벽하게 살아남아서 도달할 수 있도록 위액, 췌장 및 담즙분비액에서 살아남을 수 있는 저항 능력을 가져야 한다.
프로바이오틱 미생물과 병원성 미생물균총 간에 시작되는 경쟁은 프로바이오틱 미생물들이 일단 섭취되어, 위산 및 높은 농도의 담즙산염에서 살아 남아 장관에 도달하는 경우에만 개시된다. 일반적으로, 장관 (intestinal tract)에 일단 도달하면, 단백질 및/또는 탄수화물이 장 융모 (villi)에 특정하게 부착하는 기능과 관련된 부착 메커니즘을 통해 시작하는 것으로 언급된다.
산업적 수준에서, 프로바이오틱스는 동결 건조된 박테리아 배양 형태로 생산되고, 주로 적절한 배지에서 세포들의 성장이 결정되고 (발효), 다음으로, 바이오매스의 농축 및 정제 단계 이후에, 동결 건조에 의해 탈수가 수행된다. 그러한 공정은 적절한 수로 박테리아가 그 자신을 번식시키게 하고 (발효 단계), 오랜 시간 동안 그 자신을 보존하도록 (동결 건조단계) 하기 위해 필요하다.
발효 공정이 적절한 생산량으로 성공적으로 실행되기 위해서, 세포들은 적절한 양의 탄소 및 질소원, 올리고-원소 (oligo-element) 및 생체활성물질 (bioactivator)의 공급을 필요로 한다.
전통적으로, "젖산균"을 취급할 경우, 질소원으로 사용되는 선택된 기질들은 혈청, 유청 단백질, 가수분해물들 및 카세인 펩톤, 카세이네이트들 등이고, 반면에 탄소원으로는 거의 모든 살아있는 유기체들로부터 쉽게 대사화되기 때문에 락토스 및 글루코스가 보통 이용된다.
지난 몇 년간, 유럽을 비롯한 서방 세계에서는 아마도 단백질 및 지질이 지나치게 풍부하고 지나치게 단조로운 식단 때문에 아마도 알레르기 형태의 건강이상 (pathology)으로 고생하는 다수의 사람들의 예민한 (sensitive) 증가가 기록되어왔다.
IV형 또는 IgE-매개의 면역 반응은 "알레르기성 (allergic)"으로 칭해지는데, 첫번째 민감화 접촉 (생애의 어느 순간에 일어날 수 있고 또한 태아기에도 일어날 수 있는) 후에 특정 IgE들이 히스타민-매개된 메커니즘과 함께 생산된다.
그러한 반응들은 또한 "알레르겐"이라고 불리우는 분자들의 극히 적은 분량에 의해서도 또한 일어날 수 있는데, 단순한 약한 피부 반응들로부터 과민성 (anaphylactic) 쇼크 및 사망에까지 이를 수 있는 진단적 결과를 보인다.
몇몇 사람들에게는 이러한 물질들이 매우 위험하기 때문에, 유럽 공동체는 다음 분류들 [하기 지침의 부칙 III 비스 (bis)]에 속하는 식품의 경우, 라벨에 "식품 제조에 사용하거나 식품 중에 존재함"을 명시하여야 한다는 규칙을 채택하였다 (지침 2000/13/EC 제6조제10항, 2003/89/EC지침에 의해 개정됨).
글루텐-함유 곡류들 [밀, 호밀, 보리, 귀리, 스펠트 (spelt), 카무트 (kamut) 또는 그 혼성화된 종들] 및 유래된 제품들; 갑각류 및 갑각류에 기초한 식품들; 계란 및 계란 기초된 식품들; 어류 및 어류 기초된 식품들; 땅콩 및 땅콩 기초된 식품들; 콩 및 콩 기초된 식품들; 우유 및 우유 기초된 식품들 (락토즈 함유); 껍질 (shell) 있는 과일, 즉 아몬드 (Amigdalus communis L.), 헤이즐넛 (Corylus avellana), 일반적인 호두 (Juglans regia), 아카기우 호두 (acagiu walnuts) (Western Anacardium), 피칸 호두 [Carya illinoiesis ( Wangenh ) K. Koch], 브라질 호두 (Bertholletia excelsa), 피스타치오 너트 (Pistacia vera), 퀸즈랜드 호두 (Macadamia ternifolia) 및 유래된 식품들; 셀러리 및 셀러리에 기초한 제품들; 머스타드 및 머스타드에 기초한 제품들; 참깨 및 참깨 기초된 제품들; SO2로 표현되는 10mg/kg 또는 10mg/l 보다 높은 농도에서의 이산화황 및 아황산염.
프로바이오틱의 생산에는, 우유 (질소원으로) 및 주로 전분 (밀전분 포함)으로부터 유래하는 글루코스 (탄소원으로), 이들의 유도체에 기초한 기질이 사용되기 때문에, 만일 프로바이오틱스가 특히 민감한 대상에게 투여될 경우에는, 심지어 이들이 실제로 (우유 및/또는 글루텐으로부터 유래된) 알레르겐을 기껏해야 미량 포함하는 경우라도, 매우 위험한 것으로 간주될 수 있다.
우유의 경우에, 이 음식에 반대 반응을 일으키는 두 가지 원인으로 개별화될 수 있다; 소의 우유 단백질 알레르기 (APLV) 및 유당 분해효소 결핍증 (lactose intolerance).
계란과 함께 우유는 알레르기를 더 많이 일으키는 음식이다; 이러한 그 특징은 그것이 포함된 단백질 물질에 의해 결정되고, 이것은 주로 알파-락토알부민, 베타-락토글로블린 및 카세인이다.
소의 우유 단백질에 대한 알레르기는 생후 1년 동안에는 비교적 자주 일어나는 병상 (frequent pathology)이다. 종합적인 증상은, 이러한 경우들의 50-70%에서, 소화계질환이나, 그 경우의 50-70%에서는 피부 질환, 20-30%는 호흡 질환, 5-9%는 전신성 질환 (과민증)이다.
생후 1년이 지나면 APLV는 저절로 감소하여, 10세까지 사라지고, 성인에게서는 보기 드문 일이다.
반대로 유당 분해효소 결핍증의 경우, 생후 1년 동안은 매우 보기 드물지만, 성인에게서는 매우 빈번한데, 특히 몇몇 집단 (아프리카, 아시아, 아메리카 인디안)에서는 매우 자주 일어난다.
신생아들은 유당, 락토스를 간단한 요소인 글루코스 및 갈락토스로 분해하는데 필수적인 효소를 이미 생산하기 때문에 우유는 기본적인 식품이다. 생후 1년이 지나면, 젖은 덜 중요한 식품이 되어, 락타아제는 자발적으로 감소되고, 많은 성인들이 우유에 대해 불내성 (intolerance) (알레르기성은 아님)이 된다.
셀리악병 (celiac disease)은 몇몇 곡물에 자연적으로 포함되어 있는 "저장" 단백질인 글루텐의 섭취에 의하여 일어나는, 장질환성의 (enterophatic) 만성 면역 매개형 염증 질병이다.
이러한 음식 불내증은 밀가루 글루텐, 스펠트 (밀가루의 일종), 카무트(kamut) 및 스펠라 (밀가루의 일종), 보리, 호밀, 라이밀 (밀가루와 호밀의 교잡종) 및 그 파생물의 전형적인 단백질 분획들의 섭취에 비정상적인 방법으로 반응하는 면역 시스템을 갖는 유전학적 소인이 있는 (predisposed) 사람들에게 영향을 미친다. 몇몇 개인들은 귀리 단백질에 대해 불내성인 경우도 있다.
기술적으로 "글루텐"이라는 용어는 "글리아딘"이라고 불리우는 간단한 프로라미닉 (prolaminic) (프롤린이 풍부한) 단백질과 상기에서 언급한 곡물들의 단백질인 "글루테닌"이라고 불리우는 글루테리닉 (glutelinic) (글루타민이 풍부한) 단백질의 조합을 말한다.
셀리악병과 관련하여 "글루텐"은 글루텐을 형성하는 다양한 단백질 분획을 비롯하여, 흔히 곡물에 포함되는 단백질들을 통칭하는데 이용되며, 이 중에서 글리아딘이 가장 유해한 것으로 여겨진다.
셀리악병에 걸린 사람들의 경우, 작은 양으로 글루텐을 섭취하는 것은 면역 시스템의 비정상적인 반응을 일으킬 수 있다: 장 점막 조직에서 존재하는 효소인 트랜스글루타미네이즈는 글리아딘과 결합하고, 탈아미드화반응을 통해, 그것을 T 세포 (단백질 항원에 대한 모든 면역 반응을 매개할 수 있는 면역계 세포)를 활성화시킬 수 있는 분자로 변형시켜, 안티트랜스 글루타미네이즈 IgG 및 IgA와 안티-엔도미즈 IgA 이뮤노글로블린을 생산한다.
초기 단계에서 장관 상피세포의 활성화된 T 세포들이 증가되는데, 병의 진행과 함께 그러한 활성화 T 세포의 증가는 융모를 감축하는 메탈로포르테나제의 생산과 함께 그 라미나의 침투된 플라즈마 세포 및 림포사이트와 그에 따른 장 점막에 미치는 손상과 모두 관련있다.
셀리악병의 발달을 예방하거나 치료할 가능성은 지금까지는 존재하지 않았으므로, 전 생애에 걸쳐 엄격하게 무글루텐 식사를 하는 것만이 셀리악병에 걸린 사람들에게 완벽한 건강을 보장해줄 수 있는 유일한 치료법이다.
셀리악 환자들은 위험한 곡물들의 가루의 최소량의 흔적량까지도 제거해야만 하는데, 그 이유는 글루텐의 섭취가 최소한의 양이라도 자가면역 반응을 일으킬 (unbridle) 수 있기 때문이다.
장 수준에서 유도된 독소 효과에 대한 글루텐의 섭취량의 비율이 아직 결정되지 않음에 따라, "흔적량 (trace)"이라는 용어는 식품 입법 계획에 있어 밀접한 관계를 갖고 또한 셀리악병의 치료에서 근본적이고 실질적인 중요성을 가지는데, 그 이유는 셀리악 환자에게 적절한 식품에 있어서 "허용가능한" 글루텐 (임계치)의 최대 한계와 연관되어 있기 때문이다. 하루에 글루텐 200mg과 동등한, 100mg의 글리아딘, 즉 빵 3g의 복용은 대부분의 셀리악병에 걸린 사람들에게 있어서 계속되는 장 염증의 때 이른 징후 (sign)인 장의 상피 내 백혈구 증가를 일으키기에 충분하다는데 당업자들 모두가 동의한다.
최소 역치 (minimum threshold)와 관련하여 이제까지의 몇몇 과학적 연구에 의하면, 하루 10 밀리그램 이하의 글리아딘 [글루텐 100만당 20파트 (part)와 동등한] 섭취는 장 점막에 민감하게 손상을 주지 않지만, 소수의 경우에 위장 증상이 발생하는 것으로 나타났다.
국제적 입법 수준에서, 구 기준인 "무글루텐 식품의 코덱스 기준 (Codex Standard for Gluten-Free Foods)" 역시 여전히 시행중이고, 음식물-치료 제품에서 최대 글루텐 함량으로서 (밀가루 녹말에 관하여) 건조 중량 100g당 0.05의 질소를 나타내고, 이것은 글루텐 분획 약 500ppm에 해당한다.
그러나, 앞서 언급한 가이드 라인의 올바르고 적절한 검토로부터, 무글루텐 천연 성분으로부터 만든 무글루텐 음식은 글루텐 20ppm 이상을 함유할 수 없는 반면, 글루텐이 있는 곡물로부터 유래된 무글루텐 음식은 최대 한계 200ppm의 글루텐을 가질 수 있는 것을 예견할 수 있다.
* 앞서 언급한 가이드라인이 심의중에 있는 프랑스, 영국 및 네덜란드에서는, 무글루텐 제품의 최대 한계로 200 ppm이 고려되고 있다.
국내의 경우, 현행 규정은 유럽공동체 및 국제적인 기준에 비해 좀 더 예방적인데, 실상 글루텐이 없는 천연 원료로 만들어진 식품과 이러한 물질로부터 정제된 식품 모두에 있어서, "20 ppm (parts per million)"이 최대 한계로 정해져 있다.
이러한 규정에 따라, 만약 식품 조성 중에 또는 그러한 식품을 형성하는 하나 이상의 성분 (향신료, 첨가제 또는 공동-아쥬반트)의 조성 중에 글루텐 또는 글루텐 유래 물질을 함유하는 곡물이 존재 및/또는, 식품 생산공정에 의해 생산되는 최종 제품 중의 글루텐의 양이 분석학적으로 측정시 20 ppm을 초과할 경우, 그러한 제품에는 성분 목록의 말미에 잘 보이게끔 "글루템-함유 식품임"이라는 표시를 붙여야만 한다.
* 그러나 음식물로부터의 글루텐의 완벽한 배제는, 제분 산업 단계에서 천연 무글루텐인 곡물 및 그 파생물 (녹말, 밀가루, 녹말 가루 등)의 교차 오염이 이미 일어날 수 있다는 것을 고려해볼 때, 실행하기 쉽지 않다.
이러한 제품들은 식품 산업에 의해 서로 다른 기원 및 성질을 갖는 여러 기술적 성분들, 첨가제 및 공동-아쥬반트에 기초한 복합 식품들의 제조에 이용된다.
최근 연구는 "이론상" 무글루텐 제품의 6%까지가 보고된 성분들에 기초하여 실제로 최종 제품 100g 당 30mg 이상의 글리아딘, 글루텐 600ppm과 동등한 양을 함유한다는 것을 나타냈다.
따라서, 가능한 글루텐-오염의 배제를 목적으로 각각 상업화된 식품에 대하여 모든 사용되는 성분 및 과정 뿐만 아니라, 각각의 단일 성분들의 모든 생산 고리들도 고려해야하는 것은 필수적이다.
그러므로, 우유 또는 곡물에 기초한 발효 기질의 이용 또는 대안적으로, 비의도적인 또는 교차 오염 때문에 알레르기를 일으키는 물질이 없는 프로바이오틱 박테리아 배양물을 생산할 필요가 있다. 그럼에도 불구하고 실제로, 교차 또는 비의도적인 및 우연한 오염으로 인하여 생산 공정에서 사용되는 몇몇 요소들에 의해 흔적량의 알레르겐이 포함될 수 있다.
그러므로, 발효를 비롯한 생산 공정의 각각의 단계에서, 비알레르기성 물질을 사용하는 프로바이오틱 박테리아 배양물의 제조 방법을 제공할 필요가 있다. 특히, 우유 및 그 파생물과 글루텐 함유 곡물이 아니면서, 우수한 질소원 및 탄소원이 될 수 있는, 발효가능한 기질을 발견 및 선별할 것이 요구되고 있다.
그러므로, 모든 분야의 관계자들은 오늘까지 사용되어온 기질의 대체 기질을 이용할 수 있는 한편, 이와 동시에 교차 오염, 비의도적인, 및 우연한 오염을 줄일 수 있는 프로바이오틱 박테리아 배양체의 생산 방법이 요구된다는 점에 모두 동의한다.
특히, 알레르기를 일으키는 물질의 부재와 관련된 이중 수준의 안전성을 예견하는 프로바이오틱 박테리아 배양물의 제조 방법을 제공할 필요가 있다.
본 발명의 목적은 기술분야의 한계를 극복할 수 있는 배양 배지의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 다른 목적은 모든 집단에 투여하기에 안전한 또한, 알레르기를 일으키는 사람들에게 투여하기에 안전한 프로바이오틱 박테리아 배양물의 생산 방법론을 제공한다.
후술하는 상세한 설명으로부터 명백할 것인, 이러한 또는 다른 목적들은 출원인에 의해 달성될 것이고, 이것은 프로바이오틱 박테리아 배양물의 생산적인 공정에서 알레르겐의 부재와 관련 있는 이중 안전 수준을 함유하는 방법론을 개선시킨다.
특히, 출원인은 선택된 비알레르기성 발효 기질들 (비알레르기성 천연 물질들)이 사용되고, 프로바이오틱 배양물에 적절한 질소원 및 탄소원을 보장할 수 있는 생산 방법론을 설정한다.
비알레르기성 프로바이오틱 박테리아 배양물의 제조방법과, 상기 배양물을 함유하는 조성물 및 소위 "기능적 (fucctional)" 또는 "식품기능적 (nutraceutic)"의 제조를 위한 상기 배양물의 용도는 첨부된 청구항들에서 규정된 특징들을 갖는 본 발명의 실체를 형성한다.
본 발명은 그리고나서 알레르기성 프로바이오틱 종들을 생산하게 하고, 특히 알레르겐, 더욱 좋기로는, 우유 및 글루텐 파생물들의 절대적인 부재에서, 모든 집단 클래스들이 사용하기에 광범위한 안전성을 가진다.
본 발명의 개시 내용에 따라 제조된 비알레르기성 배양물들은 약학적 제형의 제조를 위해 효과적으로 사용될 수 있어 유리하다.
우유에 알레르기를 일으키는 사람들 (2세 이하의 인구 중 3-5%)과 셀리악병 환자(총 인구의 1%)의 수가 많음에 비추어서, 이러한 집단에 투여될 수 있는 프로바이오틱 박테리아 개발을 시도하는 것은 유용하다.
본 발명은 따라서:
·라벨링의 정확성과 명백성을 필요로 하는 소비자들과;
·상기 방식으로 비알레르기성 특성이 전적으로 보장됨으로 해서 전체 구매집단에게 어필할 수 있는 제품을 생산하려는 제조업자에게 모두 유용하다.
본 발명의 구체예에서, 상기 박테리아 배양물의 균주들은 락토바실러스속, 비피도박테리움속, 스트렙토코커스속, 페디오코커스속, 락토코커스속, 프로피오니박테리움속, 바실러스속, 사카로마이세스속, 엔테로코커스속, 류코노스톡속에 속한다.
좋기로는, 락토바실러스속은, 후술하는 균주들이 사용되는 것으로 나타난다: 락토바실러스 펜토서스 (L. pentosus), 락토바실러스 프란타룸 (L. plantarum), 락토바실러스 카제이 (L. casei), 락토바실러스 카제이 아종 파라카제이 (L. casei ssp. paracasei), 락토바실러스 카제이 아종 람노서스 (L. casei ssp . rhamnosus), 락토바실러스 아시도필러스 (L. acidophilus), 락토바실러스 델브루에키 아종 불가리커스 (L. delbrueckii ssp . bulgaricus), 락토바실러스 퍼멘텀 (L. fermentum), 락토바실러스 가세리 (L. gasseri).
상기 종들의 사용된 균주들의 예는 표 1에 기재되어 있다. 좋기로는, 비피도박테리움속의, 후술하는 종들이 사용되는 것으로 나타난다: 비피도박테리움 롱검 (B. longum), 비피도박테리움 브레브 (B. breve), 비피도박테리움 락티스 (B. lactis), 비피도박테리움 아돌레센티스 (B. adolescentis) 및 비피도박테리움 수도카테누라툼 (B. pseudocatenulatum).
상기 종들의 사용된 균주들의 예는 첨부된 표 1에서 기재된 바와 같다. 좋기로는, 락토코커스속의, 후술하는 종들이 사용되는 것으로 나타난다: 락토코커스 락티스 (L. lactis) 및 락토코커스 락티스 아종 락티스 (L. lactis ssp . Lactis).
상기 종들의 사용된 종들의 예는 첨부된 표 1에 기재된 바와 같다. 좋기로는, 스트렙토코커스속의, 후술하는 종들이 사용되는 것으로 나타난다: 스트렙토코커스 써머필러스 (S. thermophilus).
상기 종들의 사용된 균주들의 예는 첨부된 표 1에 기재된 바와 같다.
본 발명의 특히 양호한 구체예에서, 상기 박테리아 배양물의 박테리아는 첨부된 표 1에 기재된 프로바이오틱 박테리아 종들을 함유하는 군으로부터 선택된다.
출원인은 특정한 비알레르기성 원료를 선택 및 사용하는 것이 유용함을 발견하였다. 특히, 출원인은 질소원으로서, 밀크 기원 (mikly origin)의 알레르겐 및 글루텐이 천연적으로 없는 식물기원의 및/또는 동물기원의 펩톤 및/또는 단백질 가수분해물과, 탄소원으로서, 밀크 기원의 알레르겐 및 글루텐이 천연적으로 없는 전형적인 식물종들의 더 복잡한 다당류의 가수분해로부터 유래된 글루코스 및/또는 단당류 또는 이당류를 발견하였다.
식물 기원의 펩톤은 쌀, 감자, 옥수수, 밤, 타피오카, 마니오카, 완두, 잠두 및 그 혼합물을 함유하는 군으로부터 선택되지만, 유액의 (milky) 또는 글루텐 타입이 아닌 알레르겐을 생산하지 않고 발효 박테리아 성장을 촉진할 수 있다.
첫번째 양호한 구체예에서, 본 발명의 방법은 질소원으로 하나 이상의 펩톤들 및/또는 비알레르기성 단백질 가수분해물의 용도 및 탄소원으로 글루코스 및/또는 복합 다당류 (알레르기성 천연 물질들)의 가수분해로부터 유래된 기타 단당류 또는 다당류를 사용한다.
두번째 양호한 구체예에서, 본 발명의 방법은 생산 및/또는 분배 연쇄 공정에 따른 교차-오염으로부터 유도될 수 있는 가능한 흔적량의 알레르겐을 제거하는데 적절한 효소를 이용하여 원료 물질을 전처리하는 것을 포함한다.
본 발명에서, 배양 기질은 상기한 언급한 부칙 III 비스(bis)의 리스트에 속하는 모든 물질들 및 밀크 기원 또는 알레르겐, 글루텐이 없는 식물 및/또는 동물 기원의 비알레르기성 배양 기질 (비알레르기성 천연물질들)이다.
전술한 비알레르기성 원료 물질을 사용함으로써 알레르기를 앓는 사람들에게 사용가능할 것으로 인증된 프로바이오틱스를 얻는 것이 가능한데, 이는, 전술한 유럽공동체 규정의 부칙 III 비스의 목록에 속하는 물질을 사용하지 않는다는 것과, 그러한 물질이 없다는 것이 공급업체에 의해 보증된 성분들만이 사용되었음이 보장되기 때문이다.
또한, 주어진 시료에서 임의의 화학적 물질들이 부재한다는 것을 과학적으로 입증할 수는 없을지 몰라도, 그러한 화학적 물질이 사용된 분석법 (보다 정교하고 민감한 분석법을 이용하는 경우에조차)의 검출 하한의 양으로 존재한다는 것은 간단히 결정할 수 있으며, 이에 더해서, 효소적 전처리 결과를 이용하여 이러한 결론을 부가적으로 뒷받침할 수도 있다.
예의 단순한 방법에 의해, 프로바이오틱 박테리아 배양물의 성장을 위한 배지의 몇몇 비알레르기성 제형들은 하기 기재된 바와 같다.
배양 배지의 성분들은 질소원 (이 경우 펩톤 및/또는 단백질 가수분해물), 탄소원 (이 경우, 글루코스 및/또는 복합 다당류의 가수분해로부터 유래된 기타 단당류 또는 이당류), 성장 생체활성자 및 비타민 (이 경우, 효모 추출물로부터) 및 무기물 염을 가져야 한다.
예컨대, 배양 배지는 다음을 포함할 수 있다:
- 좋기로는 옥수수 녹말, 감자, 비트 당 또는 케인 당으로부터 선택된 글루코스;
- 좋기로는 쌀, 감자, 옥수수, 밤, 타피오카, 마니오카, 완두, 잠두, 콩 또는 일반적으로 협과 및 그 혼합물들로부터 선택된 펩톤;
- 좋기로는 고기로부터 선택된 펩톤;
- 효모 추출물; 무기물 염 (예컨대, 예의 단순한 방식으로, 아세테이트, 탄산염, 인산염, 수소 인산염, 클로라이드, 구연산염, 황산염 및 다른 것들); 증진제 (builder) (필요하다면, 예컨대, 트윈 (Tween), 레시틴 및 다른 것들) 그리고 음료수.
락토바실러스 속 및 비피도박테리움 속의 종들의 성장에 적절한 제형의 하나는 좋기로는 후술하는 성분들을 함유한다:
글루코스 (상기 나열된 소스들로부터) 10-100 g/l
쌀 펩톤 10-50 g/l
고기 펩톤 10-50 g/l
효모 추출물 2-20 g/l
무기물 염 1-10 g/l
증진제 0-5 ml/l
음용수 원하는 부피로 만드는 양
비알레르기성 프로바이오틱 박테리아 배양물을 위한 배지의 좋은 예는 다음일 수 있다:
글루코스 (옥수수 녹말로부터) 20 g/l
쌀 펩톤 10 g/l
고기 펩톤 10 g/l
효모 추출물 5 g/l
아세트산 나트륨 5 g/l
구연산 암모늄 2 g/l
제이인산 칼륨 (dibasic potassium phosphate) 2 g/l
황산 마그네슘 0.1 g/l
황산 망간 0.05 g/l
트윈 (tween) 80 1 ml/l
음용수 원하는 부피로 만드는 양
발효는 종래 사용의 실험적 조건하에 기술분야에 알려진 지식에 따라 수행된다.
출원인은 본 발명에 따른 원료 물질에서 생육되는 프로바이오틱 배양체에 알레르겐 흔적량이 존재하는지 여부를 확인하였다.
예컨대, 밀크 유래의 알레르겐의 경우, 최종 제품에 대하여 베타-락토글로불린 및 락토스를 공인된 특이적이고 민감한 방법에 의하여 연구 조사한 결과 ["소의 베타-락토글로블린 ELISA 정량 키트- 베틸 라보라토리즈(Bethyl Laboratories)" 유형의 베타-락토글로블린에 대한 특이적인 ELISA 키트 분석에 의해 역치 한계가 0.05 ppm으로 밝혀졌고, "락토스/D-글루코스 - 베링거 만하임 (Boehringer Mannheim) cod.10986119"유형의 락토스에 대한 UV-가시광선 검출 및 화학효소 키트에 의한 분석 결과 역치 한계가 7 ppm으로 나타남] 네가티브한 결과를 나타냈으므로, 이러한 물질들은 만일 존재한다 하더라도, 분명히 검출 역치 미만일 것이다.
이와 동시에, 좀더 정교하고 좀더 민감한 방법론 (ELISA RIDASCREEN® 글리아딘 키트-R-Biopharm A, Darmstadt, 독일, 3 ppm과 동등한 민감도를 얻음)에 의하여 글루텐을 조사한 결과, 글루텐이 부재하는 것으로 확인되었다. 나아가, 심지어 글루텐이 존재한다 하더라도, 그 농도는 검출 역치 미만, 즉, 3 ppm 미만임이 명백하다.
원료에 대한 효소적 전처리는, 관련 규정의 요구사항에 따라 수행될 수도, 수행되지 않을 수도 있는데, 수행될 경우 배양 배지에 우연히 존재하는 흔적량의 글루텐 및 파생물들과 우유 및 파생물을 가수분해할 수 있다.
이러한 처리는 알레르기를 일으키는 특히 민감한 사람들에게 또한 적절한 사용을 위한 가장 높은 안전 기준을 준다.
이러한 제조 전략은 DDS - 이중 안전 시스템이라고 불리는 비알레르기성 안전 정도와 함께 프로바이오틱 생산에 적절하다.
효소적 전처리에는 하나 이상의 단백질 분해효소의 용도 및/또는 하나 이상의 글리코시다제 효소를 사용한다.
본 발명에서, 단백질 분해효소는 단백질 분해를 수행할 수 있는 효소이다. 단백질 분해효소는 프로테아제 및/또는 펩티다아제를 함유하는 군으로부터 선택된다. 프로테아제와 펩티다아제는 트립신, 키모트립신, 판크레아틴 (pancreatin), 펩신, 파파인 및 브로멜라인을 함유하는 군으로부터 선택된다. 좋기로는, 프로테아제 및 펩티다아제는 펩신 및/또는 브로멜라인 사이에서 선택된다.
본 발명에서, 글리코시다제 효소는 글리코시드의 가수분해를 수행할 수 있다. 글리코시다제 효소는 알파-글리코시다제 및 베타-글리코시다제, 알파-갈락토시다제 및 베타-갈락토시다제를 함유하는 군으로부터 선택된다.
프로바이오틱을 위한 성장 브로쓰 (broth)를 형성하는 천연 물질의 효소적 처리는 프로테아제 [알카라제(alcalases) 및 브로멜라인]와 글리코시다제를 이용하여 수행되는 것이 좋다.
글리코시다제는 락타제 (또는 베타-갈락토시다제)를 함유하는 군으로부터 선택된다. 좋은 구체예에서, 천연 물질의 전처리는 알카라제, 락타제 및 브로멜라인의 3개의 효소를 차례로 사용한다.
좋은 구체예에서, 효소의 선택 및 그 서열은 다음과 같다:
- 알카라제, 이것은 실질적으로 모든 단백질들 특히 우유의 단백질들을 가수분해한다;
- 락타제, 이것은 락토즈를 가수분해한다;
- 브로멜라인, 이것은 글루텐을 가수분해한다.
상기 순서는 염기에서 산까지의 구배에서 최적 가수분해 pH의 기능이다; 이러한 방식으로, 배지는 영양상의 성질을 보존한다.
설사 우유 파생물과의 의도하지 않은 교차 오염으로부터 유래된 알레르기성 잔류물이 있다 하더라도, 베타-락토글로불린, 알파-락타알부민 및 카제인에 대하여 활성이 있는 알카라제를 사용하여 이를 제거할 수 있다.
이러한 처리는 물에 용해된 원료 물질에, 0.001-0.020 AU/l [리터 당 안손(anson) 유닛]에 상응하는, 0.0025 내지 0.0500 g/l 범위량 효소를 첨가하는 것을 포함한다.
이어서 이 용액을 7 내지 8 사이의 pH, 좋기로는 7.50±0.20의 조절된 pH 범위로, 15-60분 동안, 45 내지 55℃ 사이의 온도로 만든다.
베타-갈락토시다제로도 알려진 락타제는 락토스 이당류에서 갈락토스와 글루코스 간의 글리코시드 결합의 가수분해를 담당한다.
유기산들 (좋기로는 젖산)을 이용하여 배양 브로쓰의 pH를 6 내지 7, 좋기로는 6.50±0.20 범위로 조정한 후, 단백질 알칼라제에 의한 가수분해에 이어서, 5.000 NLU/g으로 적정된 효소 용액 0.05-0.40ml에 상응하는, 좋기로는, 250-2,000 NLU/l (1 리터 당 중성 락타제 단위: Neutral Lactase Units per Liter)의 양으로 를 효소 용액을 첨가함으로써 락타제로 처리한다.
용액은 2 내지 6시간의 다양한 주기 동안에 37±5℃로 유지된다. 마지막으로, 브로멜라인은 파인애플 내에 자연적으로 함유된 단백질 분해효소로, 면역 반응에 의해 인식되지 않는 단편에서 글리아딘을 효과적으로 가수분해할 수 있고 그러므로 알레르기성이 아니다.
처리는 유기산으로 (좋기로는 젖산) 5.0-6.0의 수치로 pH의 교정 후에, [110-220 GDU/l (Gelatin Digesting Units per Liter)과 동등한] 0.005-0.010 g/l의 양으로 발효 배지에 효소를 첨가하는 것에 의해 수행된다. 작용 온도는 1시간 내지 6시간 동안 37℃±5℃에서 유지되어야 한다.
3개의 효소적 처리 뒤에, 단일 균주들의 발효를 위한 최적 수치의 pH를 회복하는 것이 필요하다 (좋기로는, 산성화하기 위해 젖산을, 또는 염기화하기 위해 5N NaOH로).
다음으로, 배지의 정제를 위한 열 처리는 수행되고 (몇초부터 45분까지 변화하는 시간동안 90 내지 145℃ 사이 온도에서 수행된다), 이것은 그러나 최종 제품 및 그것을 사용할 사람들에게 효소가 사용된 잔류물로부터 유래하는 추가적인 위험 없이, 추가된 효소들은 변성시키고 불활성화시킬 것이다.
따라서, 전형적인 공업규모의 생산방법은 다음 단계들을 포함한다:
a. 비알레르기성 원료 물질을 선택하는 단계
b. 물에 원료 물질을 용해시키는 단계
c. 단백질 분해효소, 좋기로는 알카라제를 사용하기에 적합한 pH와 온도로 조정하는 단계.
d. 효소를 첨가하여 필요한 기간 동안 작용시키는 단계
e. 글리콜리틱 효소, 좋기로는 락타제를 이용하는데 적합한 온도 및 pH로 조정하는 단계
f. 효소를 첨가하여 필요한 기간 동안 작용시키는 단계
g. 단백질 분해효소, 좋기로는 브로멜라인을 이용하는데 적합한 온도 및 pH로 조정하는 단계
h. 효소를 첨가하여 필요한 기간 동안 작용시키는 단계
i. 발효시키는데 적합한 pH로 조정하는 단계
j. 배양 배지를 멸균화 (sterilization) 및/또는 저온살균화 (pasteurisation)시켜 정제하는 단계
k. 프로바이오틱 균주들의 생산에 일반적인 접종 온도 (37±2℃)에서 냉각시키는 단계
l. 균주를 접종하는 단계
m. 발효 단계
n. 바이오매스의 분리 및 동결보호 (crioprotection) 단계
o. 동결건조 단계.
[표 1]
Claims (1)
- 비알레르기성 프로바이오틱 박테리아 배양물의 제조 방법으로서, 상기 방법은 상기 프로바이오틱 박테리아가 비알레르기성 배양 기질과 접촉하는 하나 이상의 단계를 포함하고, 상기 비알레르기성 배양 기질은 식물 기원, 동물 기원 또는 식물 및 동물 기원의 비알레르기성 배양 기질로서, 상기 기질은 천연적으로 글루텐, 우유 기원 알레르겐 및 EU 지침 2003/89/EC의 부칙 III 비스의 목록에 속하는 모든 물질을 갖지 않으며, 또한 하나 이상의 펩톤 및/또는 단백질 가수 분해 생성물 및 복합 다당류 가수분해로부터 유래하는 단당류 또는 이당류로부터 선택되는 하나 이상의 물질을 포함하고, 또한 상기 비알레르기성 프로바이오틱 박테리아 배양물은 글루텐에 대해 3 ppm, 락토스에 대해 7 ppm 및 락토글로블린에 대해 0.05 ppm인 검출 한계 미만의 알레르겐 양을 함유하고,
상기 박테리아는 하기의 프로바이오틱 박테리아 균주를 포함하는 군으로부터 선택되는 것인 제조 방법.
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