KR20190142263A - 젓갈로부터 분리된 글루텐 분해능을 가지는 락토바실러스 플란타룸 mb-0601 균주 및 이의 용도 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 젓갈로부터 분리된 글루텐 분해능을 가지는 락토바실러스 플란타룸 MB-0601 균주 및 이의 용도에 관한 것으로, 본 발명에 따른 락토바실러스 플란타룸 MB-0601 균주를 이용하여 국수, 우동, 피자 및 빵 등 대중적인 글루텐 프리 가공식품을 제조할 수 있어 글루텐 불내증으로 인해 발생하는 셀리악 질병(Celiac disease) 또는 글루텐 알레르기 등으로 인해 곡류 가루 가공 식품을 섭취하지 못했던 사람들에게 매우 유용하게 제공될 수 있다.
Description
본 발명은 젓갈로부터 분리된 글루텐 분해능을 가지는 락토바실러스 플란타룸 MB-0601 균주 및 이의 용도에 관한 것이다.
밀가루는 우리나라 식품산업에서 가장 중요한 원료의 하나로서 주용도는 제면·제과·제빵으로 2001년도 밀가루 생산량은 1,779,000 만톤으로, 이 중 제면용이 37.7%, 제과·제빵용이 21.9%를 차지하고 있다. 우리나라에서 생산되는 밀가루는 강력 밀가루, 중력 밀가루, 박력 밀가루로서 1986년부터 생산된 혼합 밀가루와 전립 밀가루가 있는데, 혼합 밀가루는 제면용으로 중력 밀가루에 속한다. 전립 밀가루는 밀 전체를 분쇄한 것으로 특수 제빵·제과용으로 이용되며, 강력 밀가루는 주로 미국의 경질봄 밀(Dark Northern Spring, DNS)로 만들며, 1991년부터 캐나다의 CWRS(Canada Western Red Spring)도 제빵용으로 이용되기 시작하였다.
중력 밀가루는 미국 밀을 원료로 하는 경우 흰 밀(Western White)과 경질 겨울 밀(Hard Red Winter)을 같은 비율로 섞어 제분하여 생산하며 주로 제면용과 가정용 다목적 밀가루로 쓰이고 있다. 최근에는 제면용 밀가루로 호주 밀을 이용하기도 하며, 호주 밀은 크게 호주 표준 흰 밀(Australian Standard White), 호주 흰 밀(Australian White)과 호주 경질 밀(Australian Hard) 등으로 이루어져 있으며, 최근 국수 종류의 다양화와 품질의 고급화에 따라 호주 밀의 주종인 ASW의 선호도가 크게 증가함에 따라 도입량 면에서도 해마다 증가하고 있는 추세이다. 밀가루의 경우, 100여년 동안 체계적인 연구 축적과 산업화가 이뤄져 각각의 음식에 최적화된 수백 가지 제품이 생산되고 있으며, 밀을 주식으로 하는 서구 사회에서는 대부분 밀가공 식품인 빵, 과자, 국수, 튀김, 피자 등으로 발전해 왔으며, 탄수화물을 주로 하는 가공에 있어서 밀 가공식품은 거의 대부분이다. 최근 국내의 경우에서도 음식문화가 점차적으로 서구화되면서 쌀이 주식이기는 하나 매년 1인당 쌀 소비량이 1998년에 992 kg에서 2009년에는 774 kg으로 약 23 % 감소하고 있으며, 쌀 대신 밀가루 음식의 소비는 점차 증가하고 있는 추세이다. 그러나, 보리나 밀 등 곡류에는 불용성 단백질인 글루텐(Gluten)이 함유되어 있어 자체로 소화가 잘 안 되며 글루텐 불내증을 유발하기도 한다.
글루텐은 밀전분 생산 시 발생하는 부산물로 물에 불용성 단백질로서, 주로 글리아딘(gliadin)과 글루테닌(glutenin)으로 구성되어 있으며 글리아딘은 분자량이 30,000∼80,000 Da이고, 글루테닌은 수백만 Da 정도로 큰 분자량을 갖고 있다. 특히, 글루텐의 글리아딘은 알코올에 용해되나 글루테닌은 불용인데, 제빵에서 중요한 역할을 하는 것은 글루테닌이다. 즉, 밀가루를 물과 혼합하면 글리아딘과 글루테닌이 결합하여 글루텐을 형성하며, 글루텐 단백질 중 글리아딘은 점성과 신장성이 있고 글루테닌은 탄력성을 가지고 있다. 이 2개의 단백질이 밀가루 종류에 따라 점유하는 비율이 다르게 되며, 이러한 것은 밀가루만이 가지고 있는 독특한 성질로서, 예를 들면 빵을 만드는데 사용하는 강력분용 밀에는 글리아딘이 65%, 글루테닌이 35%이고 케이크류를 만드는데 사용하는 박력분용 밀에는 글리아딘이 75%, 글루테닌이 25%를 함유하며, 이것의 역할은 빵의 부피와 관계가 있으며 반죽의 골격형성과 발효 중 생성되는 가스를 보유하는 기능을 갖게 된다. 글루텐은 그 자체로 소화가 잘 안되며 글루텐 불내증에 걸리면 피부, 신경계, 면역계, 체력, 관절, 치아를 비롯하여 행동과 기분까지 악영향을 받게 되며, 흔히 글루텐 알레르기라고 알려져 있지만, 실제 병명은 '글루텐 과민성 장 질환'이다.
불내증이란 영양분이 몸 안에 들어왔을 때 우리 몸이 영양분을 흡수하지 못하고 거부하는 반응으로 대표적인 예는 글루텐 불내증 증상으로 설사, 복통, 변비, 복부팽만 등 소화기능 장애를 동반하기도 한다. 글루텐 과민성 장 질환은 글루텐을 소화시키는 효소가 없거나 부족하여 생기는 증상으로, 글루텐을 섭취하면 장을 자극하고 장점막의 돌기가 위축돼 영양소를 흡수할 수 없는 상태가 되며 이러한 글루텐 부작용은 유전적인 요인에 의한 발병으로서 선천적으로 글루텐 소화 효소가 없는 사람에게만 생기는 유전 질병으로 일단 글루텐 과민성 장 질환으로 진단받으면 평생 식사를 통해 조절해야 하는 불편함을 나타낸다.
흔히 알려져 있듯이 글루텐 저항증인 셀리악 질병(Celiac disease)은 소장에서 일어나는 알레르기 질환으로 장내 영양분 흡수를 저해하는 글루텐에 대한 감수성이 일어남으로써 증세가 나타나는 질병으로서 대부분 유아기에 시작하지만 드물게는 성인이 되어서 처음 나타나는 경우도 있다. 미국인들 가운데는 최소한 133명 중 1명의 비율로 셀리악 병를 겪고 있으나 이보다 세 배 이상의 인구가 글루텐에 대한 예민 증상을 갖고 있는 것으로 추정하고 있으며 최근 유럽인(특히 북유럽)에게 급격히 발생하고 있고 라틴아메리카계인, 흑인 그리고 아시아인 또한 질병 발생 인구가 증가하는 추세이다.
한편, 한국공개특허 제2017-0068894호에서는 '젓갈로부터 분리된 글루텐 분해능을 가지는 바이셀라 콘퓨사 CJE-0201 균주 및 이의 용도'가 개시되어 있고, 한국공개특허 제2015-0083899호에서는 '사우어도우 내로의 글루텐 분해를 위한 마이크로캡슐화된 박테리아단 및 그 사우어도우의 제조 방법'이 개시되어 있으나, 본 발명에서와 같이, '젓갈로부터 분리된 글루텐 분해능을 가지는 락토바실러스 플란타룸 MB-0601 균주 및 이의 용도'에 대해서는 밝혀진 바가 전혀 없다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자는 국내 발효식품으로부터 셀리악 병을 유발하는 글루텐을 분해할 수 있는 유산균을 탐색하고 이들 중에 글루텐 분해능을 가지는 유산균을 선별하여 글루텐 분해능을 분석하였다. 그 결과, 본 발명에서 선발한 락토바실러스 플란타룸 MB-0601 균주를 이용하여 글루텐 함유 곡류(밀, 호밀, 보리, 귀리 등) 가루를 발효시키면 곡류 가루에 존재하는 글루텐을 분해할 수 있다는 것을 확인하였고, 락토바실러스 플란타룸 MB-0601 균주가 약 67,000 Da의 분자량을 가지는 글루텐 분해효소를 생산한다는 것을 확인하였다. 따라서 상기와 같이 발효하여 제조된 글루텐 분해 곡류 가루를 이용하여 국수, 우동, 피자 및 빵 등 대중적인 글루텐 프리 가공식품을 제조할 수 있을 것이며, 이를 통해 관련 식품 업계에 매우 유용할 것으로 기대됨으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 젓갈로부터 분리되고, 기탁번호가 KCTC 13532BP인 글루텐(gluten) 분해능을 가지는 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) MB-0601 균주를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 글루텐(gluten) 분해용 미생물제제를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 균주 또는 이의 배양액을 곡류 가루에 처리 후 발효하여 곡류 가루에 존재하는 글루텐(gluten)을 분해하는 단계를 포함하는 글루텐 프리(gluten-free) 곡류 가루 발효물의 제조방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 글루텐 프리(gluten-free) 곡류 가루 발효물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 글루텐 프리(gluten-free) 곡류 가루 발효물로 제조된 글루텐 프리 가공식품을 제공한다.
본 발명에 따른 락토바실러스 플란타룸 MB-0601 균주(KCTC 13532BP)를 이용하여 발효시킨 글루텐이 저감화된 면 제품의 경우 동물 실험을 통해 소화 효소의 증진 및 소화 효소 관련 가스트린 분비 촉진을 통해 위장 소화 개선 효능을 확인하였다. 따라서, 본 발명에서 분리한 락토바실러스 플란타룸 MB-0601 균주는 글루텐 분해능이 우수한 특징이 있으므로, 상기 균주를 이용한 곡류 발효를 통해 밀전분이나 곡류 내 존재하는 글루텐을 분해시켜 글루텐 함유 곡류 섭취시 글루텐 알레르기라고 알려져 있는 글루텐 과민성 장 질환을 개선시킬 수 있다.
따라서, 본 발명에 따른 락토바실러스 플란타룸 MB-0601 균주를 이용하여 국수, 우동, 피자 및 빵 등 대중적인 글루텐 프리 가공식품을 제조할 수 있어 글루텐 불내증으로 인해 발생하는 셀리악 질병(Celiac disease) 또는 글루텐 알레르기 등으로 인해 곡류 가루 가공 식품을 섭취하지 못했던 사람들에게 매우 유용하게 제공될 수 있다.
도 1은 본 발명에서 분리한 락토바실러스 플란타룸 MB-0601 균주의 배양 사진을 나타낸다.
도 2는 본 발명에서 분리한 락토바실러스 플란타룸 MB-0601 균주의 유전학적 동정을 위한 16s rDNA 염기서열(서열번호 1)을 나타낸다.
도 3은 본 발명에서 분리한 락토바실러스 플란타룸 MB-0601 균주의 배양 상등액으로부터 암모늄 설페이트 침전을 통해 수득한 투석물의 단백질 분해효소 활성을 스크리닝한 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명에서 분리한 락토바실러스 플란타룸 MB-0601 균주의 배양 상등액으로부터 암모늄 설페이트 침전을 통해 선별한 단백질 분해효소 활성을 가진 투석물을 DEAE column chromatography 방법을 이용하여 정제한 결과이다.
도 5는 상기 DEAE column chromatography 방법을 이용하여 획득한 활성 분획물을 대상으로 affinity column chromatography 방법을 수행하여 1차(A) 및 2차(B) 정제를 통해 글루텐 분해활성 피크를 확인한 결과이다.
도 6은 본 발명에서 분리한 락토바실러스 플란타룸 MB-0601 균주가 생산하는 글루텐 분해효소의 분자량을 측정한 결과이다.
도 7은 덱스트란 설페이트 소듐에 의한 소화 장애 유발 마우스의 분변을 나타낸 것이다.
도 8은 본 발명에서 분리한 락토바실러스 플란타룸 MB-0601 균주를 이용한 발효면 섭취 시 소화 효소인 아밀라아제 분비 증진에 관한 결과를 확인한 것이다.
도 9는 본 발명에서 분리한 락토바실러스 플란타룸 MB-0601 균주를 이용한 발효면 섭취 시 소화 호르몬인 가스트린 분비 증진에 관한 결과를 확인한 것이다.
도 2는 본 발명에서 분리한 락토바실러스 플란타룸 MB-0601 균주의 유전학적 동정을 위한 16s rDNA 염기서열(서열번호 1)을 나타낸다.
도 3은 본 발명에서 분리한 락토바실러스 플란타룸 MB-0601 균주의 배양 상등액으로부터 암모늄 설페이트 침전을 통해 수득한 투석물의 단백질 분해효소 활성을 스크리닝한 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명에서 분리한 락토바실러스 플란타룸 MB-0601 균주의 배양 상등액으로부터 암모늄 설페이트 침전을 통해 선별한 단백질 분해효소 활성을 가진 투석물을 DEAE column chromatography 방법을 이용하여 정제한 결과이다.
도 5는 상기 DEAE column chromatography 방법을 이용하여 획득한 활성 분획물을 대상으로 affinity column chromatography 방법을 수행하여 1차(A) 및 2차(B) 정제를 통해 글루텐 분해활성 피크를 확인한 결과이다.
도 6은 본 발명에서 분리한 락토바실러스 플란타룸 MB-0601 균주가 생산하는 글루텐 분해효소의 분자량을 측정한 결과이다.
도 7은 덱스트란 설페이트 소듐에 의한 소화 장애 유발 마우스의 분변을 나타낸 것이다.
도 8은 본 발명에서 분리한 락토바실러스 플란타룸 MB-0601 균주를 이용한 발효면 섭취 시 소화 효소인 아밀라아제 분비 증진에 관한 결과를 확인한 것이다.
도 9는 본 발명에서 분리한 락토바실러스 플란타룸 MB-0601 균주를 이용한 발효면 섭취 시 소화 호르몬인 가스트린 분비 증진에 관한 결과를 확인한 것이다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 젓갈로부터 분리되고, 기탁번호가 KCTC 13532BP인 글루텐(gluten) 분해능을 가지는 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) MB-0601 균주를 제공한다.
이에 본 발명자들은 국내 발효식품인 젓갈로부터 글루텐을 분해할 수 있는 유산균을 탐색하고 이들 중에 글루텐 분해능이 우수한 유산균을 선별하여 글루텐 분해능을 분석하였다. 최종 확보된 유산균을 한국생명공학연구원 유전자은행(KCTC, Korean Collection for Type Cultures)에 2018년 05월 28일자로 기탁하여 기탁번호 KCTC 13532BP를 부여받음으로써 본 발명을 완성하였다.
또한, 본 발명의 락토바실러스 플란타 MB-0601 균주는 약 67,000 Da의 분자량을 가지는 글루텐 분해효소를 생산할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서, 글루텐 불내증으로 인해 발생하는 셀리악 질병(Celiac disease)은 몇몇 곡물에 자연적으로 포함되어 있는 "저장" 단백질인 글루텐의 섭취에 의하여 일어나는, 장 질환성의(enterophatic), 만성, 면역 매개형 염증 질병이다. 이러한 음식 불내증은 밀가루 글루텐, 스펠트(밀가루의 일종), 카무트(kamut) 및 스펠라 (밀가루의 일종), 보리, 호밀, 라이밀(밀가루와 호밀의 교잡종) 및 그 파생물의 전형적인 단백질 분획들의 섭취에 비정상적인 방법으로 반응하는 면역 시스템을 갖는 유전학적 소인이 있는(predisposed) 사람들에게 영향을 미친다. 몇몇 개인들은 귀리 단백질에 대해 불내성인 경우도 있다.
본 발명에서, 기술적으로 "글루텐"이라는 용어는 "글리아딘"이라고 불리우는 간단한 프로라미닉(prolaminic)(프롤린이 풍부한) 단백질과 상기에서 언급한 곡물들의 단백질인 "글루테닌"이라고 불리우는 글루테리닉(glutelinic)(글루타민이 풍부한) 단백질의 조합을 말한다. 셀리악병과 관련하여, "글루텐"은 글루텐을 형성하는 다양한 단백질 분획을 비롯하여, 흔히 곡물에 포함되는 단백질들을 통칭하는데 이용되며, 이 중에서 글리아딘이 가장 유해한 것으로 여겨진다. 셀리악병의 발달을 예방하거나 치료할 가능성은 지금까지는 존재하지 않았으므로, 전 생애에 걸쳐 엄격하게 무글루텐 식사를 하는 것이 오직 셀리악병에 걸린 사람들에게 완벽한 건강을 보장해줄 수 있는 유일한 치료법이다.
본 발명은 또한, 본 발명의 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 글루텐(gluten) 분해용 미생물제제를 제공한다. 상기 균주는 바람직하게는 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum)이며, 더욱 바람직하게는 락토바실러스 플란타룸 MB-0601 균주(KCTC 13532BP)이다.
또한, 본 발명은 상기 균주를 배양하는 단계를 포함하는 글루텐(gluten) 분해용 미생물제제의 제조 방법을 제공한다.
상기 균주는 바람직하게는 락토바실러스 플란타룸 MB-0601 균주(KCTC 13532BP)이다. 본 발명의 균주를 배양하는 방법은 당업계에 통상적으로 이용되는 방법을 이용할 수 있다.
또한, 본 발명에서 제공되는 유산균 균주 및 유산균 배양액, 입상, 고상 등 대상 곡류의 종류 및 사용 목적에 따라 제형화하여 공급할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 균주 또는 이의 배양액을 곡류 가루에 처리 후 발효하여 곡류 가루에 존재하는 글루텐(gluten)을 분해하는 단계를 포함하는 글루텐 프리(gluten-free) 곡류 가루 발효물의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에서, 상기 곡류는 밀, 호밀, 보리, 귀리, 스펠트(spelt) 및 카무트(kamut)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 글루텐 프리(gluten-free) 곡류 가루 발효물을 제공한다. 상기 "글루텐 프리 곡류 가루 발효물"은 글루텐이 완전히 제거된 곡류 가루 발효물 외에도 글루텐이 대부분 제거된 곡류 가루 발효물도 포함하는 의미로 해석된다.
또한, 본 발명은 상기 글루텐 프리(gluten-free) 곡류 가루 발효물로 제조된 글루텐 프리 가공식품을 제공한다. 상기 글루텐 프리 가공식품으로는 글루텐 프리 곡류 가루 발효물로 제조된 국수, 우동, 과자, 라면, 피자 또는 빵 등일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예
1. 글루텐 유산균의 확보
각종 젓갈로부터 글루텐 분해능을 갖는 유산균을 분리하기 위하여 각종 젓갈을 무균적으로 잘게 다진 다음, 이 중 1g을 취하여 멸균 생리식염수(0.85% NaCl) 9㎖에 현탁하고 단계적으로 희석하여 글루텐 1%가 함유된 MRS 고체배지에 각각 도말하였다. 30℃에서 48시간 배양한 후 나타난 콜로니(colony) 주변에 글루텐을 분해하면서 발생되는 환(Clear zone)을 형성하는 미생물만을 분리하였다. 이어 상기 젓갈로부터 순수 분리한 미생물을 MRS 고체배지에 도말하여 30℃에서 배양하였으며, 이때 형성된 집락을 20% 글리세롤 용액에 현탁시킨 후 -80℃ 냉동고에 보관하면서 글루텐 분해 유산균의 탐색에 사용하였다.
실시예
2. 젓갈로부터 분리한 유산균의 유전학적 동정
분리 균주의 유전학적 동정을 위해서 MRS 액체배지에 접종한 다음 37℃에서 18시간 2차 계대 배양하여 배양액 2 ㎖을 4,000 rpm에서 10분 동안 원심분리하였다. 원심분리하여 얻은 세포 침전물을 0.85% NaCl로 3회 세척하였다. 세척 후, 리소자임(lysozyme, 10 ㎎/㎖) 0.5 ㎖을 첨가하여 37℃, 1시간 동안 처리하였다. 단백질 분해효소인 프로테아제 K(Protease K) 20㎕와 10% 소듐 도데실 설페이트(sodium dodecyl sulfate, SDS) 25 ㎕를 첨가한 후, 60℃ 워터배스(water bath)에서 30분 처리한 후 RNA 분해효소인 알엔에이즈(RNase) 1㎕ 첨가하여 37℃, 1시간 처리하였다. 동량의 페놀(Phenol)-클로로포름(Chloroform)-이소아밀 알콜(Isoamyl alcohol)을 25:24:1의 비율로 첨가하여 현탁한 후, 14,000 rpm으로 5분 동안 4℃에서 원심분리하여 상층액만 취한 다음, 이와 같은 과정을 2회 반복하였다. 상층액 양의 1/2 양의 3M 암모늄 아세테이트(ammonium acetate, pH 4.8)와 2배 양의 100% 알콜(alcohol)을 첨가하고 -20℃에서 1시간 정치하였다. 3,000 rpm으로 5분 동안 4℃에서 원심분리하여 세포 침전물을 확인하고, 상등액을 완전히 제거한 후에 70% 에탄올(ethanol) 1㎖을 넣고 다시 3,000 rpm으로 5분 동안 4℃에서 원심분리 하였다. 상층액 제거 후에 건조시키고 TE 버퍼나 증류수로 현탁하여 DNA를 분리하였다. 미생물의 16s rRNA를 증폭하기 위해 정방향 프라이머(27f, 5'-AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG -3' : 서열번호 2) 와 역방향 프라이머(1492r, 5'-GGT TAC CTT TGT TAC GAC TT -3' : 서열번호 3)를 사용하였다. PCR 프리믹스(Bioneer, Cat No. K-2012)에 증류수 17㎕, 정방향 프라이머 1㎕, 역방향 프라이머 1㎕, DNA 1㎕를 첨가하여 혼합한 후 PCR을 수행하였다. PCR 조건은 94℃에서 5분간 처리 후, 94℃에서 1분, 62℃에서 40초, 72℃에서 40초로 30회를 반복하였으며, 72℃에서 7분으로 반응을 종료하였다. PCR 반응 산물을 0.8% 아가로스 겔(agarose gel)로 전기영동을 실시하여 확인하였다. 최종 염기서열(서열번호 1, 도 2)을 분석하고 이를 데이터베이스와 비교하여 유산균을 동정하고, 이를 도 2에 나타내었다.
그 결과 도 1 및 도 2에서와 같이, 본 발명에 의해 분리된 균주는 락토바실러스 플란타룸으로 동정되었으며, 상기 유산균을 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) MB-0601로 명명하여 한국생명공학연구원 생물자원센터에 2018년 05월 28일자로 기탁하였다(기탁번호 KCTC 13532BP).
실시예
3.
락토바실러스
플란타룸
MB-0601 균주의 글루텐 분해능
글루텐 발효 유산균인 락토바실러스 플란타룸 MB-0601 균주를 면 생산을 위한 과정에 적용하여 밀가루 내 글루텐 분해력을 평가하였다. 실험방법은 중력분 밀가루 1 kg에 물 500 g을 넣고 반죽함과 동시에 글루텐 발효 유산균(시제품)을 첨가하여 반죽하였다. 이때, 밀가루 반죽에 글루텐 발효 유산균을 1.5 g(0.15%)를 첨가한 군을 실험군 1, 0.6 g(0.06%)를 첨가한 군을 실험군 2, 0.3 g(0.03%)를 첨가한 군을 실험군 3으로 기록하였다. 밀가루를 반죽한 후, 30℃에서 숙성과정을 거쳐 글루텐 분해력을 평가하였다. 글루텐 함량 평가방법은 농촌진흥청 국립식량과학원의 식품단백질의 분리(밀가루로부터 글루텐의 분리) 방법을 이용하여 분석하였다. 유산균 첨가에 따른 글루텐 분해능은 아래의 표 1과 같이 나타났다.
| 유산균 첨가량 | 건부글루텐(g) | 분해율(%) | 평균(%) |
| 대조구 | 1.85 | 0.00 | 0 |
| 실험군 1 | 0.49 | 73.51 | 67.027 |
| 0.73 | 60.54 | ||
| 실험군 2 | 0.69 | 62.70 | 69.730 |
| 0.43 | 76.76 | ||
| 실험군 3 | 0.75 | 59.46 | 58.108 |
| 0.8 | 56.76 |
실시예 4. 락토바실러스 플란타룸 MB-0601 균주가 분비하는 글루텐 분해 효소의 확보
1) 암모늄 설페이트 침전
pH 7.0으로 조정된 MRS 배지 1L에서 락토바실러스 플란타룸 MB-0601 균주를 1% 접종하여 24시간 동안 배양하였다. 배양액을 400mL의 원심분리용 튜브에 넣어 6,000 rpm에서 20분간 원심분리를 통해 균체를 제거하여 얻은 상등액을 실험에 사용하였다. 글루텐 분해 효소의 분리 정제를 위하여 우선적으로 암모늄 설페이트(ammonium sulfate)를 0~20%, 20~40%, 40~60%, 60~80% 및 80~100%로 포화되게 첨가하면서 각각의 농도에서 침전되는 단백질을 10mM CaCl2를 포함하는 20mM Tris-HCl(pH 7.0) 버퍼에 용해시킨 후 동일한 완충액으로 4℃에서 12시간 동안 투석하였다. 투석물을 조효소로 하여 각각 100㎕씩 분취하여 1.5% 스킴 밀크가 함유된 MRS 고체배지에 아가 확산법을 이용하여 활성을 측정하였다. 그 결과, 도 3에 개시한 바와 같이 단백질 분해효소 활성은 암모늄 설페이트 40~60% 포화 구간에서만 측정되었으므로 단백질 분해 효소정제를 위해 위 구간을 선택하였다. 암모늄 설페이트(40~60%)에서 회수된 단백질들은 ion exchange chromatography의 초기 완충액 20mM CaCl2를 포함하는 20mM Tris-HCl(pH 7.0) 버퍼로 투석하였다.
2) DEAE column chromatography
상기 암모늄 설페이트 침전을 통해 얻어진 조효소를 DEAE-sepharose column chromatography 방법을 이용하여 정제 실험을 수행하였다. 이때, NaCl은 0~1M의 농도 구배를 주었다. 각각의 분획별로 각각 100㎕씩 분취하여 1.5% 스킴밀크가 함유된 MRS 고체배지에 아가 확산법을 이용하여 활성을 측정하였으며, 또한 1% 카제인이 함유한 효소 활성과 단백질 함량을 분석하였다. 도 4에 개시한 바와 같이 column 내 NaCl 함량이 높아질수록 용출되는 효소단백질의 양은 점차적으로 증가함을 알 수 있었다. 효소활성 부분은 49-55 분획에서 용출되었으며 효소활성은 단백질 함량이 가장 높은 52 분획에서 최대 활성을 나타내었다. 49-55 분획만을 수집하여 효소액을 증류수에 2시간 간격으로 3번 투석한 후 아미콘 멤브레인(M.W. 1,000)을 사용하여 아미콘 농축기(Amicon)로 농축하였다. 농축된 시료는 20mM Tri-HCl 완충용액으로 용해시켜 다음 실험의 시료로 사용하였다.
3) Affinity column chromatography
상기 DEAE-sepharose column chromatography 실험으로부터 얻어진 활성 분획을 모아 affinity column chromatography 실험을 수행하였다. 각각의 분획별로 각각 100㎕씩 분취하여 1.5% 스킴밀크가 함유된 MRS 고체배지에 아가 확산법을 이용하여 활성을 측정하였으며, 또한 1% 카제인에 대한 효소 활성과 단백질 함량을 분석하였다. 그 결과, 도 5A에 개시한 바와 같이 9-16 분획에서 글루텐 분해 활성을 갖는 피크를 확인할 수 있었다. 다른 종류의 단백질 피크가 있어 얻어진 9-16 분획을 모아 2차 affinity column chromatography 실험을 수행하여 단일 피크의 활성 분획을 수집하였다(도 5B). 이렇게 최종적으로 정제된 효소의 specific activity는 49.4 unit/mg, 수율은 4.9%, 정제도는 17.4 배로 나타났다.
4) 글루텐 분해 효소의 활성 측정
효소 활성 측정은 기질인 카제인의 가수분해 정도를 티로신 정량법(Folin, 1927, J. Biol. Chem., 73, 627-650)을 이용하여 측정하였다. 100㎕의 시료액을 40℃의 진탕배양기에서 5분간 전-배양시킨 다음 1% 기질용액 900㎕를 첨가하여 동일한 온도에서 60분간 가수분해시키고 10% TCA 용액 1,000㎕를 첨가하여 효소 반응을 중지시켰다. 가수분해 되지 않은 단백질은 상온에서 10분간 방치한 후 10,000 rpm에서 10분간 원심분리 하여 제거시켰다. 상등액 200㎕와 0.55M Na2CO3 800㎕를 첨가한 후 혼합하여 15분 동안 방치하였다. 여기에 1.0N Folin Ciocalteu's phenol 용액 200㎕를 첨가하여 혼합하고 30분 동안 방치한 후 660nm에서 흡광도를 측정하였다. 효소 활성 단위는 시료액 1.0mL가 1분당 생성하는 티로신 1μM을 1 unit으로 정의하였으며, 티로신을 사용하여 작성한 표준곡선으로부터 units을 계산하였다.
| 정제 단계 | 총활성(Unit) | 총단백질(mg) | Specific activity(1) ( U/mg) |
Yield(2) (%) |
Purification fold |
| Supernatant | 38,456 | 13,564 | 2.9 | 100 | 1 |
| Ammonium sulfate | 16,877 | 1,856 | 9.1 | 43.9 | 3.2 |
| DEAE-sepharose | 6,587 | 448 | 14.7 | 17.1 | 5.2 |
| 1st Affinity chromatography |
2,566 | 66 | 38.8 | 6.7 | 13.7 |
| 2nd Affinity chromatography |
1,878 | 38 | 49.4 | 4.9 | 17.4 |
1) Specific activity = total activity/total protein.
2) Yield = (total activity)/(total activity of supernatant) × 100.
5) 글루텐 분해효소의 분자량 측정
최종 정제된 글루텐 분해효소의 분자량 측정은 Laemmli의 방법(1970, Nature, 227, 680-685)에 따라 분자량 계산은 void volume에 대한 단백질 분해효소의 용출 부피의 비(Ve/Vo)로 측정하였다. 분자량 측정을 위한 표준곡선은 표준 단백질 cytochrome C(MW 12,400 Da), carbonic anhydrase(MW 29,000 Da), albumin(MW 66,000 Da), alcohol dehydrogenase(MW 150,000 Da), 및 apoferritin(MW 443,000 Da)로 작성하였다. 각각의 표준단백질의 용출 부피의 비를 통해 표준곡선을 작성하였다. 이때 표준곡선은 지수식으로 작성하였고, 표준곡선은 y = 1E+07e-2.932x 이었으며, 신뢰도는 R² = 0.9968로 나타났다. 이렇게 작성한 표준곡선의 지수식에 정제한 글루텐 분해 효소의 용출부피를 도입하여 분자량을 계산하였으며, 락토바실러스 플란타룸 MB-0601 균주가 생산하는 글루텐 분해효소의 분자량 측정을 위한 계산식은 하기와 같다.
1. 
2. 
3. 
Vt = total bed volume, column 내 total volume
Vo = void volume, DEAE column chromatography 내 gel 입자 사이의 공간 volume
Vi = inner volume, 수분을 포함하는 gel 입자들의 volume
Ve = elution volume, 글루텐 분해효소가 용출될 때까지의 volume
Vt = Vo + Vi
K = 분배계수, 단백질이 gel 입자내부를 통해 이동한 부피량/정지상의 부피량
Kav = 평균 분배계수
Vm = 이동상의 부피 = Vo
Vs = 정지상의 부피 = Vi
Vr = 글루텐 분해효소가 머무른 부피 = Ve
따라서 상기식을 통해 락토바실러스 플란타룸 MB-0601 균주가 생산하는 글루텐 분해효소의 분자량을 측정한 결과, 글루텐 분해효소의 용출 부피의 비(Ve/Vo)는 1.8, 분자량은 약 67,000 Da으로 확인되었다(도 6).
실시예
5. 동물 모델을 이용한 글루텐 발효면 제품의 소화 효능 분석
락토바실러스 플란타룸 MB-0601 균주로 발효시킨 면 제품에 대한 동물에서의 소화 효능을 확인하였다. 총 60수의 4주령 C57BL/6 수컷 마우스를 임의적으로 그룹 배치한 후 각각의 시험군은 아래의 표 3와 같이 방식으로 나누어 효능 시험을 수행하였다.
| 그룹 | UT | 대조구 | 글루텐 프리(Gluten-free) | ||
| 저농도 | 중농도 | 고농도 | |||
| % kcal from fat | 18 | 18 | 18 | 18 | 18 |
| % kcal from wheat | - | 60 | 60 | 60 | 60 |
| 글루텐 면 (%, w/w) | - | 30 | 27 | 18 | 0 |
| 글루텐 프리 면 (%. w/w) |
- | 0 | 3 | 12 | 30 |
| 동물(마우스)의 수 | 12 | 12 | 12 | 12 | 12 |
| 성별 | 수컷 | 수컷 | 수컷 | 수컷 | 수컷 |
| 급이 기간(주) | 8 | 8 | 8 | 8 | 8 |
1) 일반사료(UT; untreated)
2) 일반사료 + 일반 밀가루 30%(w/w) (CTL; control, 음성대조군)
3) 일반사료 + 일반 밀가루 27% + 글루텐-프리 밀가루 3%(저농도)
4) 일반사료 + 일반 밀가루 18% + 글루텐-프리 밀가루 12%(중농도)
5) 일반사료 + 글루텐-프리 밀가루 30%(고농도)
일주일 동안 순화기간 종료 후 UT군을 제외한 모든 군에 일주일동안 멸균증류수 중 5% 덱스트란 설페이트 소듐(Dextran Sulfate Sodium, DSS)을 음수로 급여하였다. DSS는 음수 중 2-5%로 소화장애가 유도되며 이는 체중과 배변을 통해 알 수 있었다(도 7).
생체 내 글루텐 관련 소화 효소 중 아밀라아제는 다당류의 글리코시드 결합을 가수분해하는 효소로서 활성이 증가하면 소화에 도움을 줄 수 있다. 췌장 조직을 분해하여 췌장 아밀라아제를 측정한 결과, 음성대조군은 0±0.0005 mU/㎖을 나타냈다. 글루텐-프리 밀가루 저농도 급여군 0.004±0.001 mU/㎖, 중농도 급여군은 0.005±0.002 mU/㎖, 고농도 급여군은 0.008±0.002 mU/㎖을 나타내어 각각 40, 50, 80% 유의적으로 증가하였다. 이는 글루텐-프리 밀가루에 의해 췌장 당분해효소의 활성이 증가되었다(모두 p<0.001)(도 8).
또한, 혈액 내 소화 효소와 관련 호르몬 중 가스트린은 위전정부 G 세포에서 분비되는 호르몬으로서 위액 분비를 촉진시키고, 위장 운동에 도움을 주게 된다. 혈중 가스트린을 상업용 진단 키트를 사용하여 측정하였다. 측정 결과, 음성대조군은 37.33±9.06 pg/㎖, 글루텐-프리 밀가루 고농도는 59.64±18.48 pg/㎖를 나타내어 음성대조군 대비 글루텐-프리 밀가루 고농도에서 60% 증가하였다(p<0.01). 이는 글루텐-프리 밀가루 급여는 가스트린 분비를 촉진하여 위장 소화 개선에 도움을 줄 수 있을 것으로 확인되었다(도 9).
<110> Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology
Microbiome Co., Ltd.
<120> Lactobacillus plantarum MB-0601 strain having gluten degradation
activity from salted seafood and uses thereof
<130> PN19215
<160> 3
<170> KopatentIn 2.0
<210> 1
<211> 1017
<212> DNA
<213> Lactobacillus plantarum MB-0601
<400> 1
tgcagtcgaa cgaactctgg tattgattgg tgcttgcatc atgatttaca tttgagtgag 60
tggcgaactg gtgagtaaca cgtgggaaac ctgcccagaa gcgggggata acacctggaa 120
acagatgcta ataccgcata acaacttgga ccgcatggtc cgagcttgaa agatggcttc 180
ggctatcact tttggatggt cccgcggcgt attagctaga tggtggggta acggctcacc 240
atggcaatga tacgtagccg acctgagagg gtaatcggcc acattgggac tgagacacgg 300
cccaaactcc tacgggaggc agcagtaggg aatcttccac aatggacgaa agtctgatgg 360
agcaacgccg cgtgagtgaa gaagggtttc ggctcgtaaa actctgttgt taaagaagaa 420
catatctgag agtaactgtt caggtattga cggtatttaa ccagaaagcc acggctaact 480
acgtgccagc agccgcggta atacgtaggt ggcaagcgtt gtccggattt attgggcgta 540
aagcgagcgc aggcggtttt ttaagtctga tgtgaaagcc ttcggctcaa ccgaagaagt 600
gcatcggaaa ctgggaaact tgagtgcaga agaggacagt ggaactccat gtgtagcggt 660
gaaatgcgta gatatatgga agaacaccag tggcgaaggc ggctgtctgg tctgtaactg 720
acgctgaggc tcgaaagtat gggtagcaaa caggattaga taccctggta gtccataccg 780
taaacgatga atgctaagtg ttggagggtt tccgcccttc agtgctgcag ctaacgcatt 840
aagcattccg cctggggagt acggccgcaa ggctgaaact caaaggaatt gacgggggcc 900
cgcacaagcg gtggagcatg tggtttaatt cgaagctacg cgaagaacct taccaggtct 960
tgacatacta tgcaaatcta agagattaga cgttcccttc ggggacatgg atacagg 1017
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 2
agagtttgat cmtggctcag 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 3
ggttaccttt gttacgactt 20
Claims (6)
- 젓갈로부터 분리되고, 기탁번호가 KCTC 13532BP인 글루텐(gluten) 분해능을 가지는 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) MB-0601 균주.
- 제1항의 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 글루텐(gluten) 분해용 미생물제제.
- 제1항의 균주 또는 이의 배양액을 곡류 가루에 처리 후 발효하여 곡류 가루에 존재하는 글루텐(gluten)을 분해하는 단계를 포함하는 글루텐 프리(gluten-free) 곡류 가루 발효물의 제조방법.
- 제3항에 있어서, 상기 곡류는 밀, 호밀, 보리, 귀리, 스펠트(spelt) 및 카무트(kamut)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는 글루텐 프리(gluten-free) 곡류 가루 발효물의 제조방법.
- 제3항 또는 제4항의 방법에 의해 제조된 글루텐 프리(gluten-free) 곡류 가루 발효물.
- 제5항의 글루텐 프리(gluten-free) 곡류 가루 발효물로 제조된 글루텐 프리 가공식품.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR20180068686 | 2018-06-15 | ||
| KR1020180068686 | 2018-06-15 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20190142263A true KR20190142263A (ko) | 2019-12-26 |
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|---|---|---|---|
| KR1020190071308A KR102223309B1 (ko) | 2018-06-15 | 2019-06-17 | 젓갈로부터 분리된 글루텐 분해능을 가지는 락토바실러스 플란타룸 mb-0601 균주 및 이의 용도 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| KR (1) | KR102223309B1 (ko) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20220005717A (ko) | 2020-07-07 | 2022-01-14 | 한국식품연구원 | 글루텐 분해활성을 갖는 바실러스 아밀로리쿼파시엔스 플란타럼 아종 kfri-g001 및 이의 용도 |
| KR102466220B1 (ko) * | 2021-09-24 | 2022-11-11 | 롯데제과 주식회사 | 글루텐 분해를 통해 빵의 물리·화학적 소화율을 높여주는 락티플랜티바실러스 플랜타럼 lrcc 5318 균주 및 이의 용도 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2009543576A (ja) * | 2006-07-17 | 2009-12-10 | ジュリアーニ ソシエタ ペル アチオニ | グルテンフリーの焼き製品の調製のための乳酸菌の混合物 |
| JP2012513198A (ja) * | 2008-12-23 | 2012-06-14 | ジュリアーニ・エッセ・ピ・ア | 粉中のグルテンを完全に分解するための微生物バイオ技術のプロセス |
-
2019
- 2019-06-17 KR KR1020190071308A patent/KR102223309B1/ko active IP Right Grant
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2009543576A (ja) * | 2006-07-17 | 2009-12-10 | ジュリアーニ ソシエタ ペル アチオニ | グルテンフリーの焼き製品の調製のための乳酸菌の混合物 |
| JP2012513198A (ja) * | 2008-12-23 | 2012-06-14 | ジュリアーニ・エッセ・ピ・ア | 粉中のグルテンを完全に分解するための微生物バイオ技術のプロセス |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| Eur. Food Res. Technol., Vol. 226, 2008, Pages 1495-1502. * |
| Journal of Food Protection, Vol. 71, No. 7, 2008, Pages 1491-1495.* * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20220005717A (ko) | 2020-07-07 | 2022-01-14 | 한국식품연구원 | 글루텐 분해활성을 갖는 바실러스 아밀로리쿼파시엔스 플란타럼 아종 kfri-g001 및 이의 용도 |
| KR102466220B1 (ko) * | 2021-09-24 | 2022-11-11 | 롯데제과 주식회사 | 글루텐 분해를 통해 빵의 물리·화학적 소화율을 높여주는 락티플랜티바실러스 플랜타럼 lrcc 5318 균주 및 이의 용도 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| KR102223309B1 (ko) | 2021-03-05 |
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