KR101324212B1 - 쌀 단백질을 포함하는 세피아프테린 생산용 배지 및 이를 이용한 세피아프테린의 생산방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 쌀 단백질 또는 쌀 단백질의 가수분해물을 포함하는 세피아프테린 생산용 배지 및 이를 이용한 세피아프테린의 생산방법에 관한 것으로, 본 발명의 쌀 단백질 가수분해물을 미생물 배지에 질소원으로 첨가할 경우, 기존의 다른 질소원에 비해 세피아프테린(sepiapterin)을 고 수율 및 고 생산성으로 생산할 수 있다.
Description
본 발명은 세프아프테린 생산용 배지 및 이를 이용한 세피아프테린의 생산방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 쌀 단백질 또는 쌀 단백질의 가수분해물을 포함하는 세피아프테린 생산용 배지 및 이를 이용한 세피아프테린의 생산방법에 관한 것이다.
테트라하이드로바이오프테린(Tetrahydrobiopterin, BH4)은 고등생물의 페닐알라닌 하이드록시라제(phenylalanine hydroxylase), 티로신 하이드록시라제(tyrosine hydroxylase) 및 트립토판 하이드록시라제(tryptophan hydroxylase)와 같은 방향족 아미노산의 수산화효소와 니트로 옥사이드 신타제(nitro oxide synthase)의 활성에 필수적인 조효소이다 (정재훈, "Sepiapterin Reductase(SR) 유전자 적중을 통한 BH4의 생체 기능 분석", 대한민국 특허, 10-2006-0108601).
티로신 하이드록시라제(Tyrosine hydroxylase)와 트립토판 하이드록시라제(tryptophan hydroxylase)는 뇌 신경전달물질인 세라토닌, 도파민의 생합성에 관여하며, BH4의 결핍은 도파 반응성 근육긴장 이상증과 파킨슨병을 포함한 여러 가지의 신경질환을 유발할 수 있다 (오세정, 홍용희, 이용화, 이승태, 기창석, 이동환, Dihydropteridine Reductase 결핍증 1례, Journal of Genetic Medicine, 6:170-174 [2009]).
한편, 세피아프테린(Sepiapterin)은 BH4의 전구체로서 BH4보다 안정성이 탁월하여 생산비용이 저렴해진다면 현재 동물세포주를 이용하여 생산하고 있는 BH4 보다 경제적으로 생산할 수 있는 장점이 있다.
세피아프테린은 재조합 대장균을 이용하여 생산할 수 있는데, 대장균은 통상적으로 펩톤(peptone), 트립톤(tryptone) 및 카세인 가수분해물(casein hydrolysate) 등이 질소원으로 첨가된 배지에서 배양한다.
하지만, 국내에서 유통되는 카세인 가수분해물의 경우, 대부분 해외에서 수입하여 사용하고 있으며, 고가에 판매되고 있는 실정이기 때문에 새로운 대체제의 개발이 요구된다 할 것이다.
본 발명에서는 미생물을 이용한 세피아프테린의 생산에 사용되는 배지에 질소원으로 첨가될 수 있는 새로운 소재를 국내에서 생산되는 곡물로부터 개발하여 제공하고자 한다.
본 발명은 쌀 단백질 또는 쌀 단백질의 가수분해물을 포함하는 것을 특징으로 하는 세피아프테린 생산용 배지를 제공한다. 이때, 본 발명의 쌀 단백질 또는 쌀 단백질의 가수분해물은 배지 중 질소원으로서 첨가될 수 있다.
한편, 바람직하게 본 발명의 쌀 단백질은, 쌀을 분쇄하는 단계; 분쇄한 쌀에 지용성 물질 추출 용매를 첨가하여 현탁시킨 후, 지질을 추출하여 제거하는 단계; 지질을 제거한 쌀에 알칼리성 용액을 첨가하여 pH가 9.0~9.5가 되도록 조정한 후, 원심분리를 통해 불용성 물질을 제거함으로써, 1차 상등액을 회수하는 단계; 회수한 1차 상등액에 산성 용액을 첨가하여 pH가 4.0~4.5가 되도록 조정한 후, 원심분리를 통해 상등액을 제거함으로써, 1차 침전물을 수득하는 단계; 수득한 1차 침전물에 증류수를 첨가하여 용해시키고, 1차 동결건조하는 단계;를 수행하여 수득되는 것을 사용하는 것이 좋다. 이와 같은 단계를 거침으로써 쌀 단백질로부터 지질을 제거하고, 쌀 단백질의 수득 수율을 높일 수 있기 때문이다.
이때, 상기의 수득된 1차 침전물은, 바람직하게, 상기의 1차 동결건조 단계중 증류수 첨가 전에, pH 4.0~4.5로 조정된 증류수를 수득된 1차 침전물에 첨가하여 현탁하고 원심분리하여 상등액을 한 번 더 제거하는 단계를 추가로 거치는 것이 좋다.
한편, 본 발명의 쌀 단백질 가수분해물은, 쌀을 분쇄하는 단계; 분쇄한 쌀에 지용성 물질 추출 용매를 첨가하여 현탁시킨 후, 지질을 추출하여 제거하는 단계; 지질을 제거한 쌀에 알칼리성 용액을 첨가하여 pH가 9.0~9.5가 되도록 조정한 후, 원심분리를 통해 불용성 물질을 제거함으로써, 1차 상등액을 회수하는 단계; 회수한 1차 상등액에 산성 용액을 첨가하여 pH가 4.0~4.5가 되도록 조정한 후, 원심분리를 통해 상등액을 제거함으로써, 1차 침전물을 수득하는 단계; 수득한 1차 침전물에 증류수를 첨가하여 용해시키고, 1차 동결건조하는 단계; 상기 1차 동결건조 후 수득된 동걸건조물과 단백질가수분해효소를 효소반응용액에 첨가한 후, 반응시키는 단계; 반응 후, 단백질가수분해효소를 불활성화시키고, 원심분리하여 2차 상등액을 수득하는 단계; 수득한 2차 상등액을 여과하여 분자량 10 kDa 이상의 단백질을 분리하는 단계; 분리된 분자량 10kDa 이상의 단백질을 2차 동결건조하는 단계;를 수행함으로써 수득되는 것이 좋다. 단백질 가수분해 과정을 추가적으로 거침으로써, 쌀 단백질을 저분자화시켜 미생물이 질소원으로서 보다 용이하게 사용할 수 있기 때문이다.
한편, 본 발명은 세피아프테린을 생산할 수 있도록 형질전환된 미생물을 배양하여 세피아프테린을 생산함에 있어서, 미생물 배양용 배지로, 본 발명의 쌀 단백질 또는 쌀 단백질의 가수분해물을 포함하는 배지를 사용하는 것을 특징으로 하는 세피아프테린의 생산방법을 제공한다
이때, 세피아프테린 생산용 미생물은 일 예로 대장균일 수 있다. 세피아프테린을 생산할 수 있도록 형질전환된 형질전환된 대장균은 GTP 사이클로하이드로라제 1 (GTP cyclohydrolase 1, CGH1)와 프로테인 티로신 포스파타제 (protein tyrosine phosphatase, PTPS)를 발현할 수 있도록 형질전환되어야 하는데, 세피아프테린의 생산을 위해서는 상기의 두 가지 효소가 필요하기 때문이다.
GTP 사이클로하이드로라제 1은 일 예로 시네코싸이스티스 속(Synechocystis sp.)에서 유래한 것을 사용할 수 있고, 프로테인 티로신 포스파타제는 사람의 섬유아세포 cDNA 유래의 것을 사용할 수 있다.
형질전환은 상기의 두 효소를 암호화하는 유전자를 대장균 형질전환용 벡터에 삽입한 후, 대장균 내부에 도입시킴으로써 수행될 수 있다.
기타의 형질전환 과정은 공지의 기술을 사용할 수 있으며, 배양도 대장균 배양에 관한 공지의 기술을 사용할 수 있으므로, 이에 관한 구체적 기술은 생략하기로 한다.
본 발명에서 개발한 쌀 단백질 또는 쌀 단백질 가수분해물은 국내에서 대량 생산되는 작물인 쌀로부터 수득하기 때문에 원료 수급성 면에서 경제성이 높다.
또한, 본 발명에서 개발한 쌀 단백질 가수분해물을 미생물 배지에 질소원으로 첨가할 경우, 기존의 다른 질소원에 비해 세피아프테린(sepiapterin)을 고 수율 및 고 생산성으로 생산할 수 있다.
도 1은 본 발명의 쌀 단백질 추출 과정을 보여주는 흐름도이다.
도 2는 세피아프테린 생산용 배지에서의 재조합 대장균의 비성장속도(specific growth rate)를 보여준다.
도 3은 재조합 대장균의 세피아프테린 생성 농도(sepiapterin concentration)를 보여준다.
도 4는 재조합 대장균의 세피아프테린 생산성(sepiapterin productivity)을 보여준다.
도 2는 세피아프테린 생산용 배지에서의 재조합 대장균의 비성장속도(specific growth rate)를 보여준다.
도 3은 재조합 대장균의 세피아프테린 생성 농도(sepiapterin concentration)를 보여준다.
도 4는 재조합 대장균의 세피아프테린 생산성(sepiapterin productivity)을 보여준다.
이하, 본 발명의 내용을 하기 실시예를 통해 더욱 상세히 설명하고자 한다. 다만, 본 발명의 권리범위가 하기 실시예에만 한정되는 것은 아니고, 그와 등가의 기술적 사상의 변형까지를 포함한다.
[
실시예
1: 쌀 단백질의 제조]
시중에서 구매한 쌀을 120 mesh(TOP30P, 한국기계엔지니어링, 군포, 대한민국) 입자 크기로 분쇄한 후 n-헥산을 이용하여 지질을 추출하였다.
지질을 제거한 쌀을 상온에서 12시간 건조시킨 후, 불용성 물질의 제거를 위해 2M NaOH를 첨가하여 pH 9.0~9.5로 조정한 후, 12,000 rpm에서 10분 동안 원심분리(SUPRA21K, 한일과학, 강릉, 대한민국)하여 상등액을 회수하였다.
회수한 상등액은 2N HCl을 이용하여 pH 4.0~4.5로 조정하고, 12,000 rpm에서 10분 동안 원심분리하여 상등액을 제거하였다.
상등액을 제거하고 남은 침전물은 추가적으로 pH 4.5로 조정된 증류수를 이용하여 현탁하고 한 번 더 원심분리한 후, 상등액을 제거하였다.
상등액을 제거한 침전물은 증류수로 용해시키고 24시간 동결건조(RD5508, 일신랩, 양주, 대한민국)하여 분말형태의 단백질로 수득하였다(도 1).
[
실시예
2: 가수분해된 쌀 단백질의 제조]
실시예 1에서 수득한 쌀 단백질 가수분해를 위해, 121℃에서 15분간 멸균하여 준비한 pH 7.0으로 조정된 0.05M 소디움 포스페이트(sodium phosphate) 완충액에 실시예 1에서 수득한 쌀 단백질 20 g과 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)에서 유래된 단백질가수분해효소(Maxazyme NNP DS, 비젼바이오켐, 성남, 대한민국) 180 unit을 혼합하여 45℃에서 8시간 동안 반응시킨 후, 95℃에서 20분간 처리하여 효소를 불활성화하였다.
여과지(Advantec, Tokyo, Japan)로 반응물을 여과한 후, 12,000 rpm에서 10분 동안 원심분리하였고, 상등액은 여과지(Cat#7182004, Whatman, Maidstone, England)로 여과하였다.
분자량 10 kDa 크기 이상의 단백질 가수분해물을 획득하기 위하여 여과지(PLGC06210, Millipore, Billerica, USA)로 재여과하였다.
위의 방법으로 얻은 분자량 10 kDa 크기 이상의 단백질 가수분해물은 24시간 동안 동결건조하여 분말상태로 확보하였다.
[
실시예
3: 본 발명의 가수분해된 쌀 단백질을 이용한
세피아프테린의
제조]
본 실시예에서는 상기 실시예 2에서 수득한 분자량 10 kDa 크기 이상 쌀 단백질 가수분해물의 질소원 대체 효과를 확인하고자 하였다. 대조구는 질소원으로써 카세인 가수분해물을 이용하였고, 실험구는 카세인 가수분해물 대신 본 발명의 10 kDa 크기 이상의 쌀단백질 가수분해물을 이용하였다.
세피아프테린 생산을 위해 시네코싸이스티스 속(Synechocystis sp.)에서 유래한 GTP 사이클로하이드로라제 1과 사람의 섬유아세포 cDNA 유래의 프로테인 티로신 포스파타제(PTPS)를 pET-28a(Merck, Darmstadt, Germany) 벡터에 삽입하여 재조합 벡터를 구축한 후, 이 벡터로 대장균 BL21(DE3)를 형질전환시켜 세피아프테린 생산용 호스트 균주로 사용하였다.
미생물 배양용 플라스크에 하기 표 1에 제시된 배지 100 ml를 주입하고 상기의 세피아프테린 생산용 재조합 균주를 접종하여, 진탕배양기(한백과학, 부천, 대한민국)을 이용하여 24시간 동안 37℃, 200 rpm 조건에서 배양함으로써, 세피아프테린의 생산성을 비교하였다.
생산된 세피아프테린은 HPLC(High performance liquid chromatography)를 이용하여 분석하였다. ODS-3 컬럼(5020-01732, GL Science, Tokyo, Japan)을 사용하여, UV/VIS 검출기(SPD-20A, Shimadzu, Tokyo, Japan)로 420 nm 파장에서 분석하였다. 컬럼 온도는 40℃로 유지하였으며, 이동상으로서 12%(v/v) 메탄올을 1.2 ml/min의 유속으로 설정하여 분석하였다.
성분 | 농도 (g/L) | |
대조구 | 실험구 | |
글리세롤 | 20 | 20 |
효모 추출액(Yeast extract) | 4 | 4 |
KH2PO4 | 4 | 4 |
K2HPO4 | 4 | 4 |
Na2HPO4 | 2.8 | 2.8 |
(NH4)2SO4 | 1.2 | 1.2 |
NH4Cl | 0.2 | 0.2 |
카세인 가수분해물 | 10 | - |
쌀단백질 가수분해물 (분자량 10 kDa 이상) |
- | 10 |
MgSO4·H2O | 2 | 2 |
FeSO4·H2O | 0.04 | 0.04 |
CaCl2·H2O | 0.04 | 0.04 |
MnSO4·H2O | 0.01 | 0.01 |
AlCl3·H2O | 0.01 | 0.01 |
CoCl2·H2O | 0.004 | 0.004 |
ZnSO4·H2O | 0.002 | 0.002 |
Na2MoO4·H2O | 0.002 | 0.002 |
CuCl2·H2O | 0.001 | 0.001 |
H3BO3 | 0.0005 | 0.0005 |
배양 후, 세피아프테린 생산 재조합 대장균의 비증식속도와 세피아프테린의 생성 농도 및 생산성을 측정하였다.
비증식속도는 10 kDa 크기 이상의 쌀 단백질 가수분해물을 첨가하였을 때, 0.2±0.0 h-1로 카세인 가수분해물을 첨가하였을 때보다 약 11% 낮은 값을 나타내었다 (도 2).
그러나, 세피아프테린의 생성 농도를 비교한 결과, 카세인 가수분해물을 질소원으로 첨가하여 배양하였을 때, 세피아프테린 생성농도는 56.0±9.5 mg/L 이었으나, 분자량 10 kDa 이상의 쌀단백질 가수분해물을 이용해 질소원을 대체하여 재조합 대장균을 배양하였을 때, 세피아프테린의 생성농도는 120.8±25.8 mg/L 이었다. 이 수치는 대조구에 비하여 2배나 높은 수치이다 (도 3).
정리하자면, 10 kDa 크기 이상의 쌀단백질 가수분해물과 카세인 가수분해물을 사용한 대조구의 성장속도는 동등 수준의 결과를 나타내지만, 세피아프테린의 생산성을 볼 때, 10 kDa 크기 이상의 쌀단백질 가수분해물은 0.81±0.2 mg/L·hr의 생산성을 나타내고, 대조구의 생산성은 0.2±0.0 mg/L·hr을 나타낸 것이다 (도 4). 이와 같은 결과는 10 kDa 크기 이상의 쌀단백질 가수분해물이 대조구에 비해 4배 이상의 월등한 생산성 향상을 나타내는 것을 의미하는 것이다.
Claims (7)
- 쌀 단백질 또는 쌀 단백질의 가수분해물을 포함하며,
상기 쌀 단백질은,
쌀을 분쇄하는 단계;
분쇄한 쌀에 지용성 물질 추출 용매를 첨가하여 현탁시킨 후, 지질을 추출하여 제거하는 단계;
지질을 제거한 쌀에 알칼리성 용액을 첨가하여 pH가 9.0~9.5가 되도록 조정한 후, 원심분리를 통해 불용성 물질을 제거함으로써, 1차 상등액을 회수하는 단계;
회수한 1차 상등액에 산성 용액을 첨가하여 pH가 4.0~4.5가 되도록 조정한 후, 원심분리를 통해 상등액을 제거함으로써, 1차 침전물을 수득하는 단계;
수득한 1차 침전물에 증류수를 첨가하여 용해시키고, 1차 동결건조하는 단계;를 수행하여 수득되는 것을 특징으로 하는 세피아프테린 생산용 배지.
- 제1항에 있어서, 상기 쌀 단백질 또는 쌀 단백질의 가수분해물은,
배지 중 질소원으로서 첨가되는 것을 특징으로 하는 세피아프테린 생산용 배지.
- 삭제
- 제1항에 있어서, 상기 1차 침전물은,
상기의 1차 동결건조 단계 중 증류수 첨가 전에,
pH 4.0~4.5로 조정된 증류수를 상기의 수득된 1차 침전물에 첨가하여 현탁하고 원심분리하여 상등액을 한 번 더 제거하는 단계;를 추가로 거친 것을 특징으로 하는 세피아프테린 생산용 배지.
- 제1항에 있어서, 상기 쌀 단백질의 가수분해물은,
쌀을 분쇄하는 단계;
분쇄한 쌀에 지용성 물질 추출 용매를 첨가하여 현탁시킨 후, 지질을 추출하여 제거하는 단계;
지질을 제거한 쌀에 알칼리성 용액을 첨가하여 pH가 9.0~9.5가 되도록 조정한 후, 원심분리를 통해 불용성 물질을 제거함으로써, 1차 상등액을 회수하는 단계;
회수한 1차 상등액에 산성 용액을 첨가하여 pH가 4.0~4.5가 되도록 조정한 후, 원심분리를 통해 상등액을 제거함으로써, 1차 침전물을 수득하는 단계;
수득한 1차 침전물에 증류수를 첨가하여 용해시키고, 1차 동결건조하는 단계;
상기 1차 동결건조 후 수득된 동걸건조물과 단백질가수분해효소를 효소반응용액에 첨가한 후, 반응시키는 단계;
반응 후, 단백질가수분해효소를 불활성화시키고, 원심분리하여 2차 상등액을 수득하는 단계;
수득한 2차 상등액을 여과하여 분자량 10 kDa 이상의 단백질을 분리하는 단계;
분리된 분자량 10kDa 이상의 단백질을 2차 동결건조하는 단계;를 수행함으로써 수득되는 것을 특징으로 하는 세피아프테린 생산용 배지.
- 세피아프테린을 생산할 수 있도록 형질전환된 미생물을 배양하여 세피아프테린을 생산함에 있어서,
미생물 배양용 배지로,
제1항의 배지를 사용하는 것을 특징으로 하는 세피아프테린의 생산방법.
- 제6항에 있어서,
상기 미생물은,
대장균인 것을 특징으로 하는 세피아프테린의 생산방법.
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US20090104668A1 (en) | 2005-02-09 | 2009-04-23 | Kaneka Corporation | Method for Producing Biopterins Using Tetrahydrobiopterin Biosynthesis Enzyme |
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2011
- 2011-11-02 KR KR1020110113256A patent/KR101324212B1/ko active IP Right Grant
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