KR100990370B1 - 벼 도열병균에 대한 내성을 증진시키는 유전자 및 이의용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 벼 도열병균에 대한 내성을 증진시키는 Pi5-1 및 Pi5-2 단백질, 상기 단백질을 코딩하는 유전자, 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터, 상기 재조합 벡터로 형질전환된 식물체 및 이의 종자, 상기 유전자를 식물에서 발현하여 식물의 병원균에 대한 내성을 증진시키는 방법, 상기 단백질에 대한 항체 및 상기 유전자를 포함하는 식물의 병원균에 대한 내성 증진용 조성물에 관한 것이다.

이인자 내성, NB-LRR, 벼 도열병균, Pi5, 벼, 항체, 조성물

Description

벼 도열병균에 대한 내성을 증진시키는 유전자 및 이의 용도{Genes enhancing resistance to Magnaporthe oryzae and uses thereof}

본 발명은 벼 도열병균에 대한 내성을 증진시키는 유전자 및 이의 용도에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 벼 도열병균에 대한 내성을 증진시키는 Pi5-1 및 Pi5-2 단백질, 상기 단백질을 코딩하는 유전자, 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터, 상기 재조합 벡터로 형질전환된 식물체 및 이의 종자, 상기 유전자를 식물에서 발현하여 식물의 병원균에 대한 내성을 증진시키는 방법, 상기 단백질에 대한 항체 및 상기 유전자를 포함하는 식물의 병원균에 대한 내성 증진용 조성물에 관한 것이다.

병원균 공격을 방어하기 위해, 식물들은 숙주 질환 내성 (R) 단백질이 병원균의 특이적인 종들에 의해 제공되는 비병원성 (Avr) 인자로 언급되는 그의 동일기원 효과기(effector)들을 검출하는 정교화된 인식 시스템을 발전시켜 왔다. 이어서, 숙주와 기생자 사이의 유전자-대-유전자 분자적 상호작용은 세포예정사의 일종인 과민성 반응 (HR)을 포함한 방어 메카니즘을 활성화시키는 일련의 신호전달 사건을 야기한다.

지난 십년간, 상이한 식물 종에서 박테리아, 진균 및 바이러스 병원균에 대한 내성을 특정하는 70 가지 이상의 R 유전자는 그의 예상된 단백질 산물에서 보존되는 구조적 특징, 예컨대 류신-풍부 반복부 (LRR), 단백질 키나아제 도메인, 뉴클레오티드-결합 부위 (NB), N-말단 류신-지퍼 (LZ) 또는 코일드-코일 (CC) 서열, 및 톨/인터류킨-1 수용체 (Toll/interleukin-1 receptor) (TIR) 영역을 갖는다. 일차적으로 구조 모티프의 조합에 기초한 R 단백질의 클래스들 중에서도 NB-LRR 은 예를 들어, 애기장대 (Arabidopsis thaliana )에서 약 150 개, 벼 (Oryza sativa) 에서 500 개로 가장 큰 R 단백질 클래스를 나타낸다 (Ellis et al. (2000) Current Opinion in Plant Biology 3: 278-284). 이는 병원균 신호의 인식 및 전달에 대한 일반적인 메카니즘이 다양한 식물종에 존재한다는 것을 시사한다.

대부분의 경우, NB-LRR 단백질은 유전자-대-유전자 유형 내성 제공에 관여한다. 대조적으로, 일부 예외적인 예는 질환 내성 경로가 NB-LRR 단백질의 보존된 모티프를 갖는 2 가지 성분을 필요로 한다는 것을 발견했다. 페로노스포라 파라시티카 (Peronospora parasitica)에 대한 RPP2-매개 내성은 아라비돕시스 (Arabidopsis)에서의 근접한 유전자 RPP2a 및 RPP2b 에 의해 코딩되는 2 가지의 이종기원의 TIR-NB-LRR 단백질을 필요로 하는 것으로 발견되었다. N 과 함께, TIR-NB-LRR 단백질, N requirement gene1 (NRG1), CC-NB-LRR 단백질은 담배 모자이크 바이러스에 대한 내성을 매개하는 것으로 나타났다 (Peart et al. (2005) Current Biology 15: 968-973). 각각의 두 단백질이 효과기 인식 또는 신호전달 기능에서 내성을 부여하기 위해 협력한다는 것을 밝혀내는 것이 남아 있다.

진균인 벼 도열병균에 의해 야기된 벼 도열병은 벼에서 가장 지독한 질환들 중 하나이다. 최근, 벼 도열병균에 대한 총 73 가지의 완전 내성 유전자가 동정되었다. 지금까지, 7 가지 도열병 내성 유전자인 Pib, Pi - ta, Pi9, Pi2 / Piz -t, Pi-d2, Pi36 및 Pi37 이 클로닝되고, 벼에서 규명되었다. Pi - d2 가 벌브형(bulb-type) 만노오스 특이적 결합 렉틴 (B-렉틴)의 예상 세포외 도메인 및 세포내 세린-트레오닌 키나아제 도메인을 가진 수용체 유사 키나아제 단백질을 코딩한다는 점을 제외하면, 기타 모든 것들은 중앙에 위치한 NB 및 C 말단에는 일련의 LRR 모티프를 보유한다.

Pi5-보유 라인들은 온실 접종 시험 및 필리핀 및 인도네시아에서의 야외 성능에서 각종 벼 도열병균 분리주에 대해 내성을 나타냈다 (Wang et al. (1994) Genetics 136: 421-1434). 상기 연구는 Pi5 유전자좌 자체가 벼 도열병균 분리주에 대한 광범위한 내성을 부여한다는 것을 시사한다. 상기 유전자는 익명의 기타 공급원으로부터 Moroberekan /CO39 교배 유래의 재조합 동종번식 (RI) 집단으로 유전자이입되었을 가능성이 있다고 보고되었다 (Wang et al. (1994) Genetics 136: 421-1434). Pi3 및 Pi5 을 포함하는 라인들의 게놈 영역이 동일하며 (Jeon et al. (2003) Molecular Genetics and Genomics 269: 280-289), 내성 유전자좌 Pii 는 대립형질이거나 또는 벼의 9 번 염색체 상의 Pi3/Pi5 에 긴밀하게 연관되어 있는 것으로 나타났다. Pi5 내성 유전자의 분리 및 특성규명은 광범위한 내성의 유전학적 근거에 대한 통찰을 제공할 것이며, 또한 동일 유전자좌에서의 벼 도열병 내성 유전자의 대립형질 관계를 명확히 하는 것에 도움이 될 것이다.

RIL260 의 9 번 염색체의 단완(short arm) 상에서 170-kb 간격으로 Pi5 벼 도열병 내성 유전자좌를 맵핑한 바 있다 (Jeon et al. (2003) Molecular Genetics and Genomics 269: 280-289).

한국특허등록 제10-0764563호에는 식물 병저항성 유도 유전자，벡터 및 이로부터 얻어지는 형질전환체가 개시되어 있으며, 한국특허등록 제10-0701302호에는 야생벼로부터 분리한 식물병 저항성 유전자 오지피알1, 그 아미노산 서열 및 이를 이용한 형질전환체 식물이 개시되어 있으나, 본 발명의 유전자와는 상이하다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 안출된 것으로서, 새로운 맵핑 집단을 이용해 Pi5 내성 유전자좌를 더욱 좁히기 위해, 내성 게놈 영역의 서열분석을 통해, Pi5 에 대한 후보 유전자인 2 가지 CC-NB-LRR 유전자를 동정하였으며, 후보 유전자들 중 하나 또는 두가지 모두를 발현하는 트랜스제닉 벼 식물체를 제조하고, 벼 도열병균에 대한 그의 내성 표현형을 규명하고자 하였다.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 벼 도열병균에 대한 내성을 증진시키는 Pi5-1 및 Pi5-2 단백질을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 단백질을 코딩하는 유전자를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터로 형질전환된 식물체 및 이의 종자를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 유전자를 식물에서 발현하여 식물의 병원균에 대한 내성을 증진시키는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 단백질에 대한 항체를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 유전자를 포함하는 식물의 병원균에 대한 내성 증진용 조성물을 제공한다.

본 발명에 따르면, 본 발명의 Pi5 -1 및 Pi5 -2 유전자의 공동작용에 의해 식물의 병원균, 특히 벼 도열병균에 대한 식물의 내성을 증진시킬 수 있다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 벼 도열병균에 대한 내성을 증진시키는 Pi5-1 및 Pi5-2 단백질을 제공한다. 본 발명의 Pi5-1 및 Pi5-2 단백질은 독립적으로는 벼 도열병균에 대한 내성을 증진시키지 못하며, Pi5-1 및 Pi5-2 단백질의 공동작용(coordination)에 의해 벼 도열병균에 대한 내성을 증진시킨다.

본 발명에 따른 Pi5-1 및 Pi5-2 단백질의 범위는 각각 벼로부터 분리된 서열번호 1 및 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 단백질 및 상기 단백질의 기능적 동등물을 포함한다. "기능적 동등물"이란 아미노산의 부가, 치환 또는 결실의 결과, 상기 서열번호 1 및 2로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더 더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로, 서열번호 1 및 2로 표시되는 단백질과 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 단백질을 말한다. "실질적으로 동질의 생리활성"이란 식물체 내에서 벼 도열병균에 대한 내성을 증진시키는 활성을 의미한다.

또한, 본 발명은 상기 Pi5-1 및 Pi5-2 단백질을 코딩하는 유전자를 제공한다. 본 발명의 Pi5 -1 및 Pi5 -2 유전자는 각각 코일드-코일 (CC), 뉴클레오티드-결합 부위 (NB) 및 류신-풍부 반복부 (LRR) 도메인을 포함할 수 있다 (도 3b 및 3c 참고). 본 발명의 유전자는 Pi5-1 및 Pi5-2 단백질을 코딩하는 게놈 DNA와 cDNA를 모두 포함한다. Pi51 cDNA 서열은 각각 70 bp 및 202 bp 의 5' 및 3' 비번역 영역 을 포함하고 1,025 개의 아미노산을 코딩하며, Pi5 -2 cDNA 서열은 각각 72 bp 및 164 bp의 5' 및 3' 비번역 영역을 포함하고 1,063 개의 아미노산을 코딩한다.

바람직하게는, 본 발명의 Pi5 -1 및 Pi5 -2 게놈 DNA는 각각 서열번호 3 및 4로 표시되는 염기서열을 포함할 수 있으며, Pi5 -1 및 Pi5 -2 cDNA는 각각 서열번호 5 및 6으로 표시되는 염기서열을 포함할 수 있다. 또한, 상기 염기 서열의 변이체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 구체적으로, 상기 유전자는 서열번호 3 내지 6의 염기 서열과 각각 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기 서열을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.

또한, 본 발명은 본 발명에 따른 Pi5 -1 및 Pi5 -2 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.

용어 "재조합"은 세포가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 코딩된 단백질을 발현하는 세포를 지칭하는 것이다. 재조합 세포는 상기 세포의 천연 형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 절편을, 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다. 또한 재조합 세포는 천연 상태의 세포에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으며, 그러나 상기 유전자는 변형된 것으로써 인위적인 수단에 의해 세포 내 재도입 된 것이다.

용어 "벡터"는 세포 내로 전달하는 DNA 단편(들), 핵산 분자를 지칭할 때 사용된다. 벡터는 DNA를 복제시키고, 숙주세포에서 독립적으로 재생산될 수 있다. 용어 "전달체"는 흔히 "벡터"와 호환하여 사용된다. 용어 "발현 벡터"는 목적한 코딩 서열과, 특정 숙주 생물에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열을 발현하는데 필수적인 적정 핵산 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자를 의미한다.

상기 재조합 벡터는 바람직하게는 재조합 식물 발현 벡터이다.

식물 발현 벡터의 바람직한 예는 아그로박테리움 투머파시엔스와 같은 적당한 숙주에 존재할 때 그 자체의 일부, 소위 T-영역을 식물 세포로 전이시킬 수 있는 Ti-플라스미드 벡터이다. 다른 유형의 Ti-플라스미드 벡터(EP 0 116 718 B1호 참조)는 현재 식물 세포, 또는 잡종 DNA를 식물의 게놈 내에 적당하게 삽입시키는 새로운 식물이 생산될 수 있는 원형질체로 잡종 DNA 서열을 전이시키는데 이용되고 있다. Ti-플라스미드 벡터의 특히 바람직한 형태는 EP 0 120 516 B1호 및 미국 특허 제4,940,838호에 청구된 바와 같은 소위 바이너리(binary) 벡터이다. 본 발명에 따른 DNA를 식물 숙주에 도입시키는데 이용될 수 있는 다른 적합한 벡터는 이중 가닥 식물 바이러스(예를 들면, CaMV) 및 단일 가닥 바이러스, 게미니 바이러스 등으로부터 유래될 수 있는 것과 같은 바이러스 벡터, 예를 들면 비완전성 식물 바이러스 벡터로부터 선택될 수 있다. 그러한 벡터의 사용은 특히 식물 숙주를 적당하게 형질전환 하는 것이 어려울 때 유리할 수 있다.

발현 벡터는 바람직하게는 하나 이상의 선택성 마커를 포함한다. 상기 마커 는 통상적으로 화학적인 방법으로 선택될 수 있는 특성을 갖는 핵산 서열로, 형질전환된 세포를 비형질전환 세포로부터 구별할 수 있는 모든 유전자가 이에 해당된다. 그 예로는 글리포세이트(glyphosate) 또는 포스피노트리신(phosphinotricin)과 같은 제초제 저항성 유전자, 카나마이신, G418, 블레오마이신(Bleomycin), 하이그로마이신(hygromycin), 클로람페니콜(chloramphenicol)과 같은 항생제 내성 유전자가 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 식물 발현 벡터에서, 프로모터는 CaMV 35S, 액틴, 유비퀴틴, pEMU, MAS 또는 히스톤 프로모터일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. "프로모터"란 용어는 구조 유전자로부터의 DNA 업스트림의 영역을 의미하며 전사를 개시하기 위하여 RNA 폴리머라아제가 결합하는 DNA 분자를 말한다. "식물 프로모터"는 식물 세포에서 전사를 개시할 수 있는 프로모터이다. "구성적(constitutive) 프로모터"는 대부분의 환경 조건 및 발달 상태 또는 세포 분화하에서 활성이 있는 프로모터이다. 형질전환체의 선택이 각종 단계에서 각종 조직에 의해서 이루어질 수 있기 때문에 구성적 프로모터가 본 발명에서 바람직할 수 있다. 따라서, 구성적 프로모터는 선택 가능성을 제한하지 않는다.

상기 터미네이터는, 통상의 터미네이터를 사용할 수 있으며, 그 예로는 노팔린 신타아제(NOS), 벼 α-아밀라아제 RAmy1 A 터미네이터, 파세올린(phaseoline) 터미네이터, 아그로박테리움 투메파시엔스(agrobacterium tumefaciens)의 옥토파인(Octopine) 유전자의 터미네이터 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 터미네이터의 필요성에 관하여, 그러한 영역이 식물 세포에서의 전사의 확실성 및 효 율을 증가시키는 것으로 일반적으로 알고 있다. 그러므로, 터미네이터의 사용은 본 발명의 내용에서 매우 바람직하다.

본 발명은 또한, 본 발명의 재조합 벡터로 형질전환된 식물체를 제공한다.

본 발명에 따른 상기 식물체는 바람직하게는 벼, 보리, 옥수수, 밀, 호밀, 귀리, 잔디, 마초, 기장, 사탕수수, 라이그래스, 오차드그래스 등의 단자엽 식물이며, 가장 바람직하게는 벼이다.

본 발명은 또한, 상기 식물체의 종자를 제공한다. 바람직하게는, 상기 종자는 벼의 종자이다.

본 발명은 또한, 본 발명의 Pi5 -1 및 Pi5 -2 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 식물에 형질전환하여 Pi5 -1 및 Pi5 -2 유전자를 발현하는 단계를 포함하는 식물의 병원균에 대한 내성을 증진시키는 방법을 제공한다. 상기 병원균은 바람직하게는 벼 도열병균 (Magnaporthe oryzae)이다. 상기 식물은 바람직하게는 벼, 보리, 옥수수, 밀, 호밀, 귀리, 잔디, 마초, 기장, 사탕수수, 라이그래스, 오차드그래스 등의 단자엽 식물이며, 가장 바람직하게는 벼이다.

식물의 형질전환은 DNA를 식물에 전이시키는 임의의 방법을 의미한다. 그러한 형질전환 방법은 반드시 재생 및(또는) 조직 배양 기간을 가질 필요는 없다. 식물 종의 형질전환은 이제는 쌍자엽 식물뿐만 아니라 단자엽 식물 양자를 포함한 식물 종에 대해 일반적이다. 원칙적으로, 임의의 형질전환 방법은 본 발명에 따른 잡종 DNA를 적당한 선조 세포로 도입시키는데 이용될 수 있다. 방법은 원형질체에 대한 칼슘/폴리에틸렌 글리콜 방법(Krens, F.A. et al., 1982, Nature 296, 72-74), 원형질체의 전기천공법(Shillito R.D. et al., 1985 Bio/Technol. 3, 1099-1102), 식물 요소로의 현미주사법(Crossway A. et al., 1986, Mol. Gen. Genet. 202, 179-185), 각종 식물 요소의 (DNA 또는 RNA-코팅된) 입자 충격법(Klein T.M. et al., 1987, Nature 327, 70), 식물의 침윤 또는 성숙 화분 또는 소포자의 형질전환에 의한 아그로박테리움 투머파시엔스 매개된 유전자 전이에서 (비완전성) 바이러스에 의한 감염 등으로부터 적당하게 선택될 수 있다. 본 발명에 따른 바람직한 방법은 아그로박테리움 매개된 DNA 전달을 포함한다. 특히 바람직한 것은 EP A 120 516호 및 미국 특허 제4,940,838호에 기재된 바와 같은 소위 이원 벡터 기술을 이용하는 것이다.

식물의 형질전환에 이용되는 "식물 세포"는 어떤 식물 세포도 된다. 식물 세포는 배양 세포, 배양 조직, 배양 기관 또는 전체 식물, 바람직하게는 배양 세포, 배양 조직 또는 배양 기관 및 더욱 바람직하게는 배양 세포의 어떤 형태도 된다. 바람직하게는, 상기 식물체는 벼이다.

"식물 조직"은 분화된 또는 미분화된 식물의 조직, 예를 들면 이에 한정되진 않으나, 뿌리, 줄기, 잎, 꽃가루, 종자, 암 조직 및 배양에 이용되는 다양한 형태의 세포들, 즉 단일 세포, 원형질체(protoplast), 싹 및 캘러스 조직을 포함한다. 식물 조직은 인 플란타(in planta)이거나 기관 배양, 조직 배양 또는 세포 배양 상태일 수 있다.

본 발명은 또한, 본 발명의 Pi5-1 및 Pi5-2 단백질에 대한 항체를 제공한다. 본 명세서에 사용된 용어 "항체"는 모노클로날 항체, 다중특이적(multispecific) 항체, 인간 항체, 인간화 항체, 카멜화 항체(camelised antibody), 키메라 항체, 단일 체인 Fvs(scFv), 단일 체인 항체, 단일 도메인 항체, Fab 프래그먼트, F(ab) 프래그먼트, 디설피드-결합 Fvs(sdFv), 및 항이디오타입(항-Id) 항체, 및 상기 임의의 에피토프 결합 단편을 말한다. 특히, 항체는 면역 글로불린 분자 및 면역학적으로 활성이 있는 면역글로불린 분자 단편, 즉 항원결합부위를 함유하는 분자를 포함한다. 면역글로불린 분자는 임의의 종류(예: IgG, IgE, IgM, IgD, IgA, 및 IgY), 클래스(예: IgG₁, IgG₂, IgG₃, IgG₄, IgA₁, 및 IgA₂) 또는 서브클래스일 수 있다.

본 발명의 항체는 본 발명의 유전자를 통상적인 방법에 따라 발현벡터에 클로닝하여 단백질을 얻고, 얻어진 단백질로부터 통상적인 방법에 의해 제조될 수 있다. 여기에는 상기 단백질에서 만들어질 수 있는 부분 펩티드도 포함되며, 본 발명의 부분 펩티드로는, 최소한 7개 아미노산, 바람직하게는 9개 아미노산, 더욱 바람직하게는 12개 이상의 아미노산을 포함한다. 본 발명의 항체의 형태는 특별히 제한되지 않으며 다클론 항체, 단클론 항체 또는 항원 결합성을 갖는 것이면 그것의 일부도 본 발명의 항체에 포함되고 모든 면역 글로불린 항체가 포함된다. 나아가, 본 발명의 항체에는 인간화 항체 등의 특수 항체도 포함된다.

본 발명은 또한, 본 발명의 Pi5 -1 및 Pi5 -2 유전자를 포함하는 식물의 병원균에 대한 내성 증진용 조성물을 제공한다. 본 발명의 Pi5-1 및 Pi5-2 단백질은 공동작용(coordination)에 의해 벼 도열병균에 대한 내성을 증진시키므로, 상기 Pi5- 1 및 Pi5 -2 유전자를 포함하는 조성물은 식물의 병원균에 대한 내성을 증진시킬 수 있는 것이다. 상기 식물의 병원균은 바람직하게는 벼 도열병균이다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예

재료 및 방법

식물 재료

Pi5 를 보유한 RIL260 및 민감성 재배종인 IR50 을 Pi5 맵핑 집단에 대한 부모 주로서 이용했다. RIL260 및 IR50 을 교배하여, 유전학적 연관 분석을 위한 분리 집단을 수득했다. RIL260/IR50 F₁ 개체의 자가수분 종자 (F₂)를 큰 분리 집단으로 수집했다. 자포니카 (japonica) 벼 재배종인 동진 (Dongjin)을 벼 도열병균 접종 실험에서 감수성 대조군으로서 주로 이용했고, 벼 형질전환에 이용했다. 벼 유묘 식물체는 일반적으로 14/10 시간의 명/암 사이클로, 낮 동안은 30℃ 온도로 하고, 밤 동안은 20℃ 로 하여 온실에서 재배했다.

병원균 접종 및 질환 평가

벼 도열병균 분리주 PO6-6 는 모든 표현형 분석에 이용했다. 벼 도열병균 분리주는 RIL260에는 병증을 나타내지 않는 안정한 필리핀 분리주이며, Pi5 유전자좌 의 검출에 이용되었다 (Jeon et al. (2003) Molecular Genetics and Genomics 269: 280-289). 모든 접종 및 질환 평가는 Chen 등 (Chen et al. (1996) Plant Disease 80: 52-56)이 기재한 바와 같이 경희대학교의 온실에서 수행했다. 4 주령의 잎을 접종 실험에 사용했다. 벼 도열병균 PO6-6 은 귀리 아가 배지에서 2 주 동안 24℃ 암실에서 배양했고, 채집 4 일 전에 코니디아(conidia)를 유도했다. 접종된 식물체는 24℃의 암실로 24 시간 동안 배양 챔버에서 유지한 후, 95% 습도에서 빛을 제공하며 14 시간 동안 유지했다. 질환 평가는 접종 7일 후 수행했다.

RIL260 / IR50 맵핑 집단의 유전자형 분석

C1454 (Jeon et al. (2003) Molecular Genetics and Genomics 269: 280-289) 및 JJ817 (Kwon et al. (2008) Molecules and Cells 25: 407-416)에 대한 CAPS (cleaved amplified polymorphic sequence) 마커 및 우성 마커 JJ80-T3 를 대체할 SCAR (sequence characterized amplified region) 마커 JJ803 (Yi and Lee (2004) Theoretical and Applied Genetics 109: 978-985)를 RIL260 및 IR50 게놈 DNA 서열의 비교로 개발했다. 우성 마커 JJ113-T3 및 S04G03 을 추가로 이용했다. 분자 마커의 PCR 분석을 위해 프라이머를 이용했다: C1454 에 대해서는, 5'-GTATTACCTGAAATCCTAGTGGTG-3'(서열번호 7) 및 5'-AGGAACTACGGTATTACAAGGATC-3'(서열번호 8); JJ817 에 대해서는, 5'-GATATGGTTGAAAAGCTAATCTCA-3'(서열번호 9) 및 5'-ATCATTGTCCTTCATATTCAGAGT-3'(서열번호 10); JJ803 에 대해서는, 5'-AAGTGAGCATCCAGTGCCTAATGA-3'(서열번호 11) 및 5'-AGCCGGTGCTCATAACACGTATTA-3'(서 열번호 12).

벼 게놈 DNA 는 RIL260/IR50 맵핑 집단의 어린 잎으로부터 단순한 미니프렙 방법 (Chen et al. (1999) Plant Molecular Biology Reporter 17: 53-57) 으로 분리했다. PCR 분석은 50 ng 의 게놈 DNA 를 주형으로 이용하여 30 ㎕ 의 부피로 수행되었다 (100 pM 의 각 프라이머, 200 ㎕ 각각의 dNTP, 10 mM Tris-HCl pH 9.0, 2 mM MgCl₂, 50 mM KCl, 0.1% Triton X-100 및 0.5 U Taq 중합효소). CAPS 마커 C1454 및 JJ817 에 대한 각각의 PCR 산물은 MluI 또는 AseI 를 이용하여 절단한 후, 1.5% 아가로스 겔 상에서 크기별로 분획화했다.

DNA 서열결정 및 유전자 예측

RIL260 의 중복되는 BIBAC 클론을 게놈 서열결정을 위해 선별했다. 미니프렙으로 분리정제된 플라스미드를 Sau3AI 로 부분적으로 절단하고, 아가로스 겔 전기영동으로 분리했다. 0.5-3.0 kb 게놈 DNA 절편들을 Gel Extraction Kit (Qiagen)을 이용하여 분리하고, pBluescriptII SK(-) (Clontech) 의 BamHI 부위에 서브클로닝하고, 전기천공으로 대장균 (E. coli) DH10B 에 형질전환했다.

평균 25 kb의 인서트 크기를 가진 각각의 BIBAC 클론을 DNA 서열결정하기 위해, 약 50 개의 클론을 선별하고, T3 및 T7 프라이머 및 BigDye Terminator Cycle Sequencing v2.0 (Applied Biosystems, Foster city, CA) 을 이용하여 단일방향 또는 양방향으로 서열결정했다.

NCBI 데이터베이스 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) 에 대해 Blast를 이용하여 유사성 검색을 수행했다. 단백질 코딩 유전자 영역을 예측하기 위해, 벼 게놈 자동화 표지 시스템인 RiceGASS (http://RiceGAAS.dna.affrc.go.jp/; Sakata 등, 2002) 를 이용했다.

유전자 상보성 실험을 위한 벡터 구축

Pi5 -1 및 Pi5 -2 에 대한 게놈 DNA 절편을, BIBAC 클론 (Jeon et al. (2003) Molecular Genetics and Genomics 269: 280-289)을 클로닝함으로써 재구축하였다. 완전한 Pi5 -1 게놈 절편을 구축하기 위해, 0.5 kb 프로모터를 포함하는 JJ80 의 6.4 kb BamHI-SacI 를 먼저 벼 형질전환 벡터 pC1300intC 에 서브클로닝했다 (GenBank accession no. AF294978). BamHI 및 BstEII 로 절단한 생성된 플라스미드 JJ104 를 JJ106 의 4.1 kb BglII-BstEII 에 융합시켜 2.1 kb 네이티브 프로모터를 갖는 JJ105 를 구축했다. 프라이머 Pi5-1 ter1 (5'-GTCCAAAGAGAAATGCGACAACAC-3'(서열번호 13)) 및 Pi5-1 ter2 (5'-CGCTCGAGGTGGCATTTCATCCAATAGGCAAC-3'(서열번호 14)) 를 이용한 PCR로 증폭한 0.5 kb SacI-XhoI 절편은 JJ105 에 삽입하여 터미네이터 영역을 연장시켜, 8,365-bp Pi5 -1 게놈 영역을 보유한 JJ204 를 생성했다.

Pi5 -2 유전자는 4 개 절편의 라이게이션으로 구축했다: EcoRI 및 ClaI 으로 절단한 JJ113 의 4.5-kb 절편, JJ113-T32 (5'-GATGATGTGATCTGCAGAGAAAC-3'(서열번호 15)) 및 JJ719-I41 (5'-AGCCTCACTGAAATTGCGAAGCA-3'(서열번호 16)) 을 이용한 ClaI 및 BglII-절단된 PCR 산물 200 bp, JJ120 의 6.3-kb BglII-XbaI 절편, 및 EcoRI 및 XbaI 으로 절단한 pC1300intC. 구축된 플라스미드 JJ117 에서, 프로모터 영역은 JJ120 의 2.9-kb KpnI-NsiI 절편을 클로닝하여 연장시켰다. 최종적으로, JJ212 에서의 Pi5 - 2 의 완전한 게놈 서열 (13,250 bp) 은 2.1 kb-연장된 터미네이터 서열을 구축된 플라스미드 JJ142 의 Eco065I 에 삽입하여 구축했다.

벼 형질전환

Pi5 -1 및 Pi5 - 2 의 게놈 클론 및 BIBAC 클론을 전기천공으로 아그로박테리움 투메파시엔스 (Agrobacterium tumefaciens) EHA105 또는 LBA4404 에 안정하게 형질전환하고, 이전 절차 (Jeon et al. (1999) Plant Molecular Biology 39: 35-44)에 따라 아그로박테리움-매개를 통해 벼 도열병균 PO6-6 에 감수성인 벼 재배종인 동진에 도입했다.

Pi5 -1 및 Pi5 -2 cDNA 의 분리

2 세트의 전체 RNA를 PO6-6 처리 후 24 및 48 시간째에 수집한 벼 잎으로부터 트리졸(Trizol)을 이용하여 제조했다. PolyATtract mRNA 분리 시스템 (Promega) 을 이용하여 각 세트의 전체 RNA 로부터 정제된 mRNA 를 1:1 로 혼합하고, cDNA 합성에 이용했다. 0.5 kb 보다 큰 cDNA 는 겔여과를 통해 크기 분획으로 선별하고, Uni-ZAP XR 벡터 (Stratagene) 를 이용하여 초기 pfu 를 5x10⁶ 로 하여 라이브러리를 구축했다. 구축된 라이브러리는 Pi5 -1 및 Pi5 -2 코딩 영역, JJ204 의 570-bp HindIII-KpnI 및 JJ212 의 589-bp EcoRV-SpeI 절편을 각각 프로브로 이용한 콜로니 블랏 혼성화로 스크리닝했다.

실시예 1: Pi5 의 고해상도 맵의 구축

이전에, 본 출원인의 유전자 맵핑 실험은 Pi5 을 보유한 RIL260 및 감수성 재배종인 CO39 사이, 및 RIL260 및 또 다른 감수성 재배종인 M202 사이의 교배로부터의 집단 분석 (Jeon et al. (2003) Molecular Genetics and Genomics 269: 280-289)으로, 벼의 9 번 염색체 상에서 2 가지 플랭킹 (flanking) 마커인 S04G03 및 C1454 사이에 170 kb 간격으로 Pi5 내성 유전자의 경계를 정했다. Pi5 내성 유전자를 더욱 좁히기 위해, RIL260 및 감수성 재배종인 IR50 사이의 교배로 유도되는 신규한 맵핑 집단을 생성했는데, 이는 IR50 가 또다른 두 감수성 재배종 CO39 및 M202 보다도 Pi5 내성 유전자좌에 대해 비교적 더 높은 유사성을 공유하는 감수성 재배종으로 (데이터 미제시), 내성 게놈과 감수성 게놈 사이의 재조합 사건을 초래할 수도 있기 때문이다. 170-kb Pi5 유전자좌 내에서의 드문 재조합을 찾아내기 위해, CAPS 마커인 JJ817 및 C1454 및 SCAR 마커인 JJ803 를 먼저 RIL260/IR50 F₂ 집단 분석에 이용했다. 마커들을 이용한 예비스크리닝 전략은 Pi5 게놈 영역에서의 재조합 사건이 있는 식물체의 동정에도 이용했다 (Jeon et al. (2003) Molecular Genetics and Genomics 269: 280-289).

2,014 개의 F₂ 개체들 중, 상기 실험은 JJ817 및 JJ803 사이에서는 8 가지의 재조합체를 동정했으나, JJ803 및 C1454 사이에서는 아무것도 동정하지 못했다 (도 1). 이어서, 우성 마커 JJ113-T3 및 S04G03 (Jeon et al. (2003) Molecular Genetics and Genomics 269: 280-289)을 이용하여, 동질접합성 유전자형을 이질접합성 유전자형으로부터 구분하기 위해 그의 자손 (F₃) 식물체에서 선별된 8 가지의 재조합체의 breakage point를 결정했다. 그 결과, 모든 8 가지의 라인은 JJ113-T3 및 JJ817 사이에서의 재조합 사건을 이용하는 것을 발견했다. 8 가지의 동정된 라인의 벼 도열병균 P06-6 에 대한 질환 표현형은 각 라인의 F₃ 식물체에서 결정되었다. 결과는 마커 JJ817 및 C1454 사이의 130-kb 간격에서 Pi5 유전자를 정확히 찾아냈다 (도 1). 본 출원인의 선행 결과 및 이번 결과는 마커 JJ803 및 JJ113-T3 가 내성 유전자와 함께 공동분리된다는 것을 나타낸다 (도 1). 더 작은 물리적인 영역에서 유전자를 좁힐 수는 없었는데, 이는 빗나간 재조합 사건이 새로 개발된 맵핑 집단의 Pi5 유전자좌에서 여전히 관찰되었기 때문이다.

실시예 2: Pi5 에 대한 후보 유전자의 동정

R 유전자 후보들을 동정하기 위해, 130-kb Pi5 내성 게놈 영역을 포괄하는 선별된 BIBAC 클론들, JJ80, JJ106, JJ123, JJ120, JJ113, JJ110 및 JJ98 (Jeon 등, 2003) 의 샘플 서열결정 분석을 수행했다. 공개된 데이터베이스에서의 DNA 서열에 대한 상기 생성된 서열을 이용한 Blast 검색으로 이후 Pi5 -1 및 Pi5 - 2 으로 각각 명명되는 2 가지의 Pi5 후보 유전자를 밝혔으며, 이는 보존된 NB-LRR 모티프 와 상당한 유사성을 보여준다. 특히, 두 후보 Pi5 -1 및 Pi5 - 2 의 게놈 영역은 벼 도열병 내성을 갖는 공동 분리 마커 JJ803 및 JJ113-T3 에 각각 해당하는 것으로 밝혀졌다 (도 1). 서열 분석은 Pi5 내성 유전자좌가 전위인자 (transposable element)와 유사성을 보이는 서열이 매우 풍부하다는 것을 밝혀냈다. 두 후보 유전자는 서로 현저한 서열 상동성은 나타내지 않아, 이들이 진화적으로 중복되는 유전자는 아니라는 점을 시사한다.

BIBAC 서열 분석은 RIL260 에서의 Pi5 유전자좌가 이미 서열결정된 자포니카 벼 니폰바레 (Nipponbare) 게놈의 것과는 DNA 서열 상동성이 없거나 또는 거의 없다는 것을 나타냈다. 대조적으로, 130-kb 내성 유전자좌 밖의 게놈 영역들은 모두 서로 거의 일치했다. 그 결과, Pi5 - 1 의 니폰바레 대립형질 유전자는 JJ803 서열을 포함하는 RIL260 의 5' 상류 서열이 결핍되었음을 발견하여, 이것이 비활성 유전자임을 나타냈다. 특히, Pi5 -2 유전자의 대립형질 영역은 니폰바레 게놈의 상응하는 유전자좌에 없었다. Pi5 - 3 로 명명한 신규한 NB-LRR 유전자는 니폰바레의 Pi5 유전자좌에는 존재했으나, RIL260 의 것에는 부재함을 발견했다. 상기 결과들은, Pi5 내성 유전자좌가 벼 게놈에서 매우 분산되었으며(diverged), Pi5 -2 및 Pi5-3 대립유전자가 벼 재배종에서 존재/부재 (P/A) 다형성을 나타낸다는 것을 시사한다. 유전자좌 내의 큰 갭 때문에, Pi5 내성 유전자좌를 인디카 (indica) 93-11 의 것과 정확하게 비교할 수 없고, 게놈에서 Pi5 -1 및 Pi5 -2 에 대한 대립유전자 서열의 일부를 발견했다. 그러나, 93-11 이 벼 도열병균 PO6-6 에 매우 감수성이며 (데이터 미제시), 이는 93- 11 에서의 Pi5 -1 및 Pi5 -2 대립유전자가 기능성이 아닐 수도 있 음을 시사한다.

실시예 3: Pi5 -1 또는 Pi5 - 2 를 발현하는 트랜스제닉 벼 식물체의 분석

벼 도열병균에 대한 Pi5 내성에 두 후보 유전자 중의 하나가 관련되는지 여부를 결정하기 위해, 아그로박테리움(Agrobacterium)-매개 형질전환 (Jeon et al. (2000) The Plant Journal 22: 561-570)을 이용하여 감수성 자포니카 벼 재배종 동진을 Pi5 -1 또는 Pi5 -2 게놈 클론으로 형질전환했다. 두 후보 유전자의 게놈 절편이 2 가지의 중복 클론 JJ113 및 JJ120 및 JJ80 및 JJ106 으로 각각 나뉘어져, Pi5 -1 및 Pi5 -2 유전자의 완전한 게놈 서열을 재구축했다. 생성된 Pi5 -1 (JJ204) 및 Pi5 -2 (JJ212) 클론은 각각, 약 5- 및 6-kb 네이티브 5' 상류, 5.8- 및 7.9-kb 코딩, 및 0.4- 및 2.1-kb 3' 하류 서열을 포함한다. 바이너리 벡터 pC1300intC 에 클로닝된 각각의 게놈 서열을 자포니카 감수성 재배종 동진에 형질전환했다.

Pi5 -1 및 Pi5 -2 게놈 클론을 각각 갖는 일차 트랜스제닉 벼 식물체에 벼 도열병균 PO6-6 를 접종했다. 트랜스제닉 식물체의 게놈 DNA PCR 분석은 이들이 전부 트랜스진을 포함한다는 것을 나타냈다. RT-PCR 분석은 대부분의 트랜스제닉 식물체가 트랜스진을 발현한다는 것을 보여줬다 (도 2a의 패널 (a)). 예상치 않게, 표현형 분석에서 13 개채의 Pi5 -1 또는 12 개체의 Pi5 -2 트랜스제닉 식물체 어느 것도 도열병균 PO6-6 에 대한 내성을 부여하지 못하였다 (도 2a의 패널 (b)). 다시, Pi5 -1 및 Pi5 -2 트랜스제닉 식물체의 모든 자손이 야생형과 유사하게 벼 도열병균 PO6-6 에 대해 감수성인데, 이는 어느 후보도 벼 도열병균 분리주에 대한 내성을 부여하지 못함을 나타낸다.

Pi5 유전자좌 중의 신규한 유전자가 벼 도열병균 분리주에 대한 내성을 부여하는지 여부를 시험하기 위해, 130-kb 간격을 차지하는 RIL260 라이브러리로부터 분리된 8 가지의 BIBAC 클론, JJ80, JJ81, JJ98, JJ106, JJ110, JJ113, JJ120 및 JJ123 를 감수성 벼 재배종 동진으로 형질전환했다. 벼 도열병균 접종 실험은 각각의 BIBAC 클론 및 그의 자손을 이용해 분화된 트랜스제닉 벼 식물체들 중 어느 것도 양립하지 않는 벼 도열병균 PO6-6 에 대한 내성 표현형을 나타내지 않아 (데이터 미제시), 벼 형질전환에 이용했던 각각의 단독 BIBAC 클론은 벼 도열병균 분리주에 대한 내성을 부여하지 않음을 증명했다.

실시예 4: Pi5 -1 및 Pi5 - 2 를 모두 발현하는 트랜스제닉 식물체의 분석

두 후보가 모두 Pi5-매개 완전 내성에 필요한지 여부를 시험하기 위해, 벼 도열병균 PO6-6 에 대해 매우 감수성인 동형접합성 Pi5 -1 라인 #74 와 매우 감수성인 동형접합성 Pi5 -2 라인 # 63 를 교배함으로써 Pi5 -1 및 Pi5 - 2 를 모두 발현하는 트랜스제닉 식물체를 제작했는데, 이는 RT-PCR 분석에서 Pi5 -1-74 및 Pi5 -2-63 가 모두 RIL260 의 것과 비슷한 수준으로 그의 트랜스진을 발현하는 것으로 나타났기 때문이다. 유전자 발현 분석으로 교배된 F₁ 식물체가 Pi5 -1 및 Pi5 -2 유전자를 모두 발현한다는 것을 확인하였다 (도 2a의 패널 (a)). 흥미롭게도, 상기 F₁ 하이브리드 식물체를 이용한 벼 도열병균 PO6-6 접종 실험은 Pi5 -1-74/ Pi5 -2-63 F₁ 식물체가 모 두, RIL260 와 유사하게 벼 도열병균 PO6-6 에 대한 완전한 내성을 나타낸 반면, 각각의 단독적인 트랜스제닉 및 야생형 대조군 식물체가 감수성 표현형을 반복한다는 것을 밝혔다 (도 2a의 패널 (b)).

상기 결과를 확인하기 위해, Pi5 -1-74/ Pi5 -2-63 식물체 유래의 자손 (F₂) 식물체를 벼 도열병균 분리주로 접종했다. 실험은 50 개체의 식물체 중, 두 트랜스진을 전부 가진 28 개의 식물체에서 모두 벼 도열병균 분리주에 대한 내성을 부여한다는 것을 명확하게 밝혀냈다. 대조적으로, 야생형 또는 단일한 트랜스진을 보유한 대립형질분리 식물체는 벼 도열병균 분리주에 대해 감수성 표현형을 나타냈다 (도 2b의 패널 (c)). 상기 결과는, Pi5 -1 및 Pi5 - 2 의 양쪽 모두의 존재가 벼 도열병균 분리주에 대한 내성과 함께 완벽하게 공동 분리된다는 것을 나타낸다. 따라서, 모든 상기 결과들은 이종기원의 두 NB-LRR 유전자 Pi5 -1 및 Pi5 -2 가 벼 도열병균 분리주에 대한 완전한 내성에 필요하다는 것을 증명한다.

실시예 5: Pi5 -1 및 Pi5 -2 유전자의 특성 규명

두 Pi5 유전자의 cDNA 서열을 분리하기 위해, 내성주 RIL260 의 cDNA 라이브러리를 구축하고, Pi5 -1 및 Pi5 - 2 의 유전자 특이적 영역을 프로브로 이용한 콜로니 혼성화 실험으로 스크리닝했다. 상기 실험은 Pi5 -1 및 Pi5 -2 각각에 대한 7 개 및 9 개의 cDNA 클론을 동정했다. DNA 서열분석을 통해, 7 개의 Pi5 -1 cDNA 클론들 중 3 개는 온전한 오픈 리딩 프레임 (ORF) 을 포함하는 반면, 나머지는 번역 개시 코돈 ATG 를 포함한 N-말단 서열이 결핍되어 있음을 밝혀냈다. 상기 3 가지 중, 가장 긴 클론 #1-7 은 전부 서열결정하였으며, 추가로 규명했다. 그 결과, Pi5-1 은 각각 70 bp 및 202 bp 의 5' 및 3' 비번역 영역에 의해 플랭킹된 1,025 개의 아미노산을 코딩하는 것으로 나타났다 (GenBank accession no. EU869185). Pi5-2 클론의 서열 분석은 9 개의 클론들 중 3 개가 온전한 ORF 를 포함한다는 것을 밝혀냈다. 이들 중, 가장 긴 클론 #2-4 는 추가로 규명했다. 결과는, 가장 긴 클론이 각각 72 bp 및 164 bp의 5' 및 3' 비번역 영역에 의해 플랭킹된 1,063 개의 아미노산을 코딩하는 것으로 나타냈다 (GenBank accession no. EU869186).

추론한 아미노산 서열의 유사성 분석은 Pi5-1 및 Pi5-2 이 모두 N-말단 CC, 중앙에 위치한 NB 및 LRR, 및 C-말단 영역을 코딩한다는 것을 밝혀냈다 (도 3b 및 도 3c). Pfam 및 Smart 데이터베이스 및 NCBI 수집자료를 배치한 GenBank 의 보존된 도메인 검색은 Pi5-1 의 아미노산 109-576 및 Pi5-2 의 109-567이, 식물 내성 유전자 산물 및 동물에서의 세포사 조절자에 의해 공유되는 신규한 신호전달 모티프인 NB 도메인을 코딩한다는 것을 예측했다 (Dangle & Jones, 2001; Martin 등, 2003). NB-포함 R 유전자 산물의 특징인 보존된 내부 도메인들, 예컨대 P 루프, RNBS-A, 키나아제-2, RNBS-B, RNBS-C, GLPL 및 RNBS-D 도메인 (Meyers 등, 2003)은 모두 Pi5-1 및 Pi5-2 에서 동정되었다. Paircoil2 프로그램 (http://groups.csail.mit.edu/cb/paircoil2/)은 Pi5-1 의 아미노산 31-67 및 Pi5-2 의 26-87 사이에 0.1 의 역치로 잠재적인 CC 도메인을 예측하여, 상기 단백질들이 NB-LRR 내성 단백질의 CC 서브세트에 속한다는 것을 나타낸다.

각각 24.3 및 22.8% 류신이 있는 두 단백질의 LRR 영역은 각종 길이의, 일련의 불완전한 10 개의 반복체를 포함한다 (도 3b 및 도 3c). 특히, Pi5-1 및 Pi5-2 단백질의 몇가지 반복체들은 타 세포질 R 단백질에서 관찰되는 일치 서열 LxxLxxLxxLxLxxC/N/Sx(x)LxxLPxx (Jones 및 Jones, (1997) Advances in Botanical Research 24: 89-1671997)과 거의 부합하였다. Pi5-1 의 첫번째 및 세번째, Pi5-2 의 세번째 및 여섯번째 반복체 영역은 다수의 NB-LRR 단백질의 세번째 LRR 에서 보존되는 xLDL 모티프를 포함한다. 특히, Pi5-1 및 Pi5-2 단백질은 LRR 도메인 다음에, CNL (C-말단 비-LRR) 도메인에서 멀리 떨어진, 임의의 공지된 아미노산 모티프와 부합하지 않는 특이한 C 말단을 갖는다.

cDNA 및 게놈 DNA 사이의 서열 비교는 Pi5 -1 및 Pi5 -2 유전자가 각각 코딩 영역에 5 및 6 개의 엑손을 포함한다는 것을 밝혀냈다 (도 3a). 그 결과, 두 Pi5 유전자는 코딩 영역에, 클로닝된 벼 도열병 내성 유전자 (Bryan et al. (2000) The Plant Cell 12: 2033-2045) 보다도 더 많은 수의 인트론을 갖는 것으로 나타났다. 특히, Pi5 -1 및 Pi5 -2 유전자는 모두 또한 GLPL 및 NBSD 도메인에 인트론을 갖는데, 이는 클로닝된 도열병 내성 유전자에는 존재하지 않는다. 이는, Pi5 -1 및 Pi5-2 유전자가 벼 도열병균에 대한 다른 NB-LRR 내성 유전자와 유사하긴 하지만 다른 인트론 위치를 갖는다는 것을 알려준다.

도 1은 RIL260/IR50 집단에서 Pi5 유전자좌의 고해상도 맵을 보여준다. 8가지 드문(rare) 재조합 경우를 모식도로 보여준다. 재조합 라인의 breakage point는 관련 마커 사이에 나타낸다. Pi5 를 포함하는 진한 선은 맵핑 집단의 분석에 의해 경계가 결정된 Pi5 를 보유하는 최소 게놈 영역을 나탄낸다. R, 내성; S, 감수성.

1, 추정의(putative) 원핵생물 번역 개시 인자; 2, 추정의 GTP-결합 단백질; 3, 추정의 알도스 1-에피머라아제; 4, ankyrin-유사 단백질; 점선 화살표, 레트로트랜스포존; 백색 화살표, 가상적인 단백질.

도 2는 트랜스제닉 벼 식물체의 분석을 나타낸다. (a) Pi5 -1, Pi5 -2 및 Pi5-1/Pi5-2 F₁ 트랜스제닉 벼 식물체의 RT-PCR 분석. (b) 벼 도열병균 (M. oryzae) PO6-6로 접종된 Pi5 -1, Pi5 -2, 또는 Pi5 -1/ Pi5 -2 F₁ 트랜스제닉 식물체의 질환 반응. 병증은 병원균 접종 후 7일에 보여준다. Pi5 유전자가 없는 감수성 대조군 동진 및 내성 대조군 RIL260을 이용하였다. (c) Pi5 -1/ Pi5 -2 F₁ 트랜스제닉 식물체로부터 유래된 자손 (F₂) 식물체의 게놈 DNA PCR 분석 및 질환 반응. R, 내성; S, 감수성.

도 3은 Pi5 유전자 및 이의 유전자 산물의 게놈 구조를 보여준다. (a) Pi5-1 및 Pi5 - 2 의 유전자 구조. 엑손은 회색 박스로 나타내고, 인트론은 진한 선으로 나타낸다. 5' 상류 및 3' 하류 영역은 가는 선으로 보여준다. ATG 및 TGA는 각각 번역 개시 및 정지 코돈을 나타낸다. (b) Pi5-1 단백질. (c) Pi5-2 단백질. 2가지 내 성 단백질은 코일드-코일 (CC), 뉴클레오티드-결합 부위 (NB), 류신-풍부 반복부 (LRR), 및 C-말단 영역을 코딩한다. 진하게 표시된 Pi5-1의 아미노산 31-67 및 Pi5-2의 아미노산 26-87은 CC 모티프를 나타낸다. NB 단백질의 특징인 보존된 내부 모티프들인 P 루프, RNBS-A, 키나아제-2, RNBS-B, RNBS-C, GLPL 및 RNBS-D 도메인은 진하게 표시한다. 많은 NB-LRR 단백질의 LRR에서 보존된 xLDL 모티프는 밑줄로 표시한다.

<110> University-Industry Cooperation Group of Kyung Hee University <120> Genes enhancing resistance to Magnaporthe oryzae and uses thereof <130> PN08136 <160> 16 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 1025 <212> PRT <213> Oryza sativa <400> 1 Met Val Gly Ala Glu Met Leu Val Ala Ala Ala Val Ser Gln Val Ala 1 5 10 15 Arg Lys Ile Asn Asp Ile Val Gly Val Ala Gln Gly Glu Val Lys Leu 20 25 30 Cys Cys Asn Phe Ser Asp Asp Leu Glu Gly Ile Lys Asp Thr Leu Val 35 40 45 Tyr Leu Glu Thr Leu Leu Lys Asn Ala Glu Asn Asn Ser Phe Gly Ser 50 55 60 Asp Arg Ala Asn Leu Arg His Trp Leu Gly Gln Ile Lys Ser Leu Ala 65 70 75 80 Tyr Asp Ile Glu Asp Ile Val Asp Gly Tyr Tyr Ser Ser Lys Glu Gln 85 90 95 Phe Asp Gly Gly Ser Tyr Ala Gln Lys Gly Ser Leu Phe Cys Ser Leu 100 105 110 Ser Asn Pro Met Leu Leu Lys Gly Ser Met Val Tyr Lys Met Lys Ser 115 120 125 Lys Arg Glu Met Leu Gln Gln Ser Gln Gln Leu Pro Asn Gln Tyr His 130 135 140 Phe Leu Ser Tyr Ile Asn Ser Ala Val His Tyr Phe Glu Glu Lys Gln 145 150 155 160 Thr Thr Ser Tyr Arg Asn Thr Asp Ile Ala Ile Val Gly Arg Asp Ala 165 170 175 Asp Leu Asp His Leu Met Asp Leu Leu Met Gln Asn Ser Ala Glu Glu 180 185 190 Leu Cys Ile Ile Pro Ile Val Gly Pro Val Gly Phe Gly Lys Thr Ser 195 200 205 Leu Ala Gln Leu Val Phe Asn Asp Thr Arg Thr Glu Val Phe Ser Phe 210 215 220 Arg Ile Trp Val His Val Ser Met Gly Asn Ile Asn Leu Glu Lys Ile 225 230 235 240 Gly Arg Asp Ile Val Ser Gln Thr Thr Glu Lys Ile Glu Gly Asn Met 245 250 255 Gln Leu Gln Ser Ile Lys Asn Ala Val Gln Arg Val Leu Asn Lys Tyr 260 265 270 Ser Cys Leu Ile Ile Ile Asp Ser Leu Trp Gly Lys Asp Glu Glu Val 275 280 285 Asn Glu Leu Lys Gln Met Leu Leu Thr Gly Arg His Thr Glu Ser Lys 290 295 300 Ile Ile Val Thr Thr His Ser Asn Lys Val Ala Lys Leu Ile Ser Thr 305 310 315 320 Val Pro Leu Tyr Lys Leu Ala Ala Leu Ser Glu Asp Asp Cys Leu Lys 325 330 335 Ile Phe Ser Gln Arg Ala Met Thr Gly Pro Gly Asp Pro Leu Phe Arg 340 345 350 Glu Tyr Gly Glu Glu Ile Val Arg Arg Cys Glu Gly Thr Pro Leu Val 355 360 365 Ala Asn Phe Leu Gly Ser Val Val Asn Ala Gln Arg Gln Arg Arg Glu 370 375 380 Ile Trp Gln Ala Ala Lys Asp Glu Glu Met Trp Lys Ile Glu Glu Asp 385 390 395 400 Tyr Pro Gln Asp Lys Ile Ser Pro Leu Phe Pro Ser Phe Lys Ile Ile 405 410 415 Tyr Tyr Asn Met Pro His Glu Leu Arg Leu Cys Phe Val Tyr Cys Ser 420 425 430 Ile Phe Pro Lys Gly Thr Val Ile Glu Lys Lys Lys Leu Ile Gln Gln 435 440 445 Trp Ile Ala Leu Asp Met Ile Glu Ser Lys His Gly Thr Leu Pro Leu 450 455 460 Asp Val Thr Ala Glu Lys Tyr Ile Asp Glu Leu Lys Ala Ile Tyr Phe 465 470 475 480 Leu Gln Val Leu Glu Arg Ser Gln Asn Asp Ala Glu Arg Ser Ser Ala 485 490 495 Ser Glu Glu Met Leu Arg Met His Asn Leu Ala His Asp Leu Ala Arg 500 505 510 Ser Val Ala Gly Glu Asp Ile Leu Val Ile Leu Asp Ala Glu Asn Glu 515 520 525 Arg Asn Ala Arg Tyr Cys Asn Tyr Arg Tyr Ala Gln Val Ser Ala Ser 530 535 540 Ser Leu Glu Ser Ile Asp Arg Lys Ala Trp Pro Ser Lys Ala Arg Ser 545 550 555 560 Leu Ile Phe Lys Asn Ser Gly Val Asp Phe Glu His Val Ser Glu Val 565 570 575 Leu Ser Val 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ttataaaact aattacataa atgaaagcta attcacgaga 4800 caattttttt aagcctaatt aatccataat taaagaatgt ttactgtagc atcacatagg 4860 ctaatcatgg attaattaga cttaatagat tcatctcgtg aattagtcca agattataga 4920 tgggctttat taatagtcta cgtttaatat ttataattaa ttttcaatcc aatatgatag 4980 gacttaaaat ttagtcccat ctacagggtc agaggattcg gtcggtctca gggcagtcct 5040 ctccgtataa cgcagcgccc gatatttttt atgggcataa atagtctgat tgctactgta 5100 gcattttgtt caactaactc cccaatgggc aatggctagt cgtcgagtgt cagtagtcaa 5160 gagtagactc cgcttcgctt cgccgtacct tctctcttct cgttctccta tttcacaaat 5220 cacaaccgga ttgctttctt ccttcctccg gtctggtccc caacctccgc ggcagccatg 5280 gttggcgccg agatgcttgt ggccgcggcg gtgagccagg tcgcccggaa gatcaacgac 5340 atcgtggggg tcgcgcaggg cgaggtgaag ctgtgctgca atttcagcga cgatttggag 5400 ggcatcaagg atacccttgt gtacctggaa accttgctga aaaatgcgga gaataactcc 5460 ttcggaagcg acagggccaa cctgcgccac tggcttggcc agatcaagtc cctggcttac 5520 gatatcgaag atatcgttga tgggtactac tcttccaagg agcagttcga tgggggcagc 5580 tatgcacaga aggtaacaga 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ttggtttccg tatctaacgt 10020 ttgaccgtcc gtcttatttg aaaaaattat gaaaaaaatt aaaaagataa gtcatgcata 10080 aaatattatt catgttttat catctaacaa taataaaaat acaatttata aaaaaatttt 10140 atataagacg gatggtcaaa tgttagacgc agaaatccaa gaattgagtc ttttttggga 10200 tggataatac aagggatttt gactttttag ttgtaatgtt tgaccactcg tcttattcaa 10260 aaaatttgtg caaatataaa aaacgaaaaa ttgtgcttaa agtattttgg ataataaagt 10320 aagccacaaa taaaataaat aatagttcta atttttttta ataagacgaa tggtcaaaca 10380 gtgcaaacaa aaagtcaaaa tccctacatt attttttttg agacaaaaat ccctacatta 10440 taggacggag ggagtagcta gatatacaga gatctatcca tatctagact ttagagtcgt 10500 gcgtacgaac ataccttttt cccgatggta atcgaattcg aatcgtagtc cagtacacta 10560 ctcctacctt tattttccgg tttcgcgggc ttcctttcca gtatcgggca tctacagggt 10620 ggtggtggtc agttactcac tcggtcagat cagggcgtct ctatttgctc cgtcatgaaa 10680 aaaaaattat atttttcttt gtgtgtgttt tctgatcagg tgacactgcg attgtcctct 10740 tgcagagaaa accacggaat gagcgatttg gcgcggtgtg gcatgccgaa ctcctgcaaa 10800 aaagatgaac taactcaacg aaggcagcga taacggcggc ggtcgctcac tctcctcaat 10860 aattgagcaa ccggcttccg ttgttttttt tttctcgtat ttttaataat tttattcttt 10920 tattgaaatg ggggttgggc acagcgcgcg atgtacttgt gcgccacaca cttgaatttg 10980 atcacggtcg atcttctatg tcggtacgag aatccacgga tgaagattaa atacaagcac 11040 gaaaaaaaag agagtattag ctaatgatta attaaatttt aattatttaa aacttgaaag 11100 atgtatttat ttgatatttt aaagcaactc tgtttttgca cgaaatatat cgtttagcag 11160 tttgaaaaac atactaacgg aaactaaggt agaatatgta tcttaatcag aaaaagaata 11220 gattttataa aaccttacat tttatggtgc tttgaaaaac cacacatatt ataactcgtg 11280 atacataact acaagtttat agtctaaatg tttcacaaga gcccaccttt atttaaattt 11340 ccattgattt cagcatatct gaaatgatat tttttataag tagtgaatag ttaaaccgat 11400 aac 11403 <210> 5 <211> 3078 <212> DNA <213> Oryza sativa <400> 5 atggttggcg ccgagatgct tgtggccgcg gcggtgagcc aggtcgcccg gaagatcaac 60 gacatcgtgg gggtcgcgca gggcgaggtg aagctgtgct gcaatttcag cgacgatttg 120 gagggcatca aggataccct tgtgtacctg gaaaccttgc tgaaaaatgc ggagaataac 180 tccttcggaa gcgacagggc caacctgcgc cactggcttg gccagatcaa gtccctggct 240 tacgatatcg aagatatcgt tgatgggtac tactcttcca aggagcagtt cgatgggggc 300 agctatgcac agaaggggtc attattctgc tcgctatcca atccaatgct tctgaaaggt 360 agcatggttt ataagatgaa atccaagaga gagatgctac agcaaagcca acagttgccc 420 aatcagtatc atttcctttc atatatcaat tcagctgtgc attattttga ggagaagcaa 480 acaacatcat acagaaatac tgacattgca attgtcggga gggatgctga tttggatcat 540 ctcatggatc ttttaatgca aaacagcgct gaagagcttt gtattatacc catagttggg 600 cctgtaggtt ttggaaagac aagccttgca cagttagttt tcaatgatac aagaacagag 660 gtattcagct ttaggatatg ggttcatgtt tccatgggta atatcaacct tgaaaaaatt 720 gggagagata tagtttcaca aactacagaa aaaattgagg gaaatatgca gctgcagtca 780 atcaagaatg ctgttcagcg tgtgctaaat aaatatagtt gcttgatcat aatagacagc 840 ctttggggaa aggatgaaga agtgaatgaa ttgaagcaga tgttgcttac aggtagacac 900 acagaaagca agatcatagt gaccactcat agcaataaag tagctaagct gatttccacc 960 gttccactgt acaagttggc agctttatct gaggatgatt gtttaaaaat attctctcaa 1020 agggcaatga caggtccggg tgacccgttg ttcagggaat atggagaaga aatcgttaga 1080 aggtgtgaag gcacaccctt ggtagccaat tttctcggtt ctgtggtgaa tgctcaacga 1140 caaaggcgtg agatttggca agctgcaaag gatgaagaaa tgtggaagat agaggaagat 1200 tatccccaag acaaaatttc accactattt ccatcattca agataatata ttataatatg 1260 ccccatgagc taagattatg ctttgtatat tgttcaatct tccctaaagg aactgttata 1320 gaaaagaaga aacttattca gcaatggatt gcacttgaca tgattgagtc caaacatgga 1380 accttgccac ttgatgtaac tgcggagaaa tatattgatg aacttaaagc aatctatttc 1440 cttcaagttt tagagcggtc tcagaatgat gcagaaagat ccagtgcttc tgaggaaatg 1500 cttcgcatgc ataacttggc tcatgatctt gctagatcgg ttgctggtga agatatcctt 1560 gttattttag atgccgagaa tgagcgcaat gccagatatt gcaattaccg ttatgcacag 1620 gtgtctgctt ctagtttaga gtcaatcgat cgcaaggcat ggccttccaa ggcaaggtca 1680 ctaattttca agaatagtgg tgtggacttt gagcatgtca gtgaagttct ttcagtgaac 1740 aaatacctgc gtgttttgga tctcagtgga tgttgtgttc aagatattcc atctcctatc 1800 tttcagctga aacaattgag atacctcgac gtttcatctt tatctattac agcactccct 1860 ctgcaaatta gtagctttca taagttacaa atgttggatc tttcagaaac tgaactaaca 1920 gagttgccac cctttataag caacttaaaa ggactgaatt atttgaatct ccaaggttgc 1980 cagaaacttc aacgattgaa tagccttcat ttgttgcatg atctacatta cctaaacttg 2040 tcatgctgcc ctgaagttac tagttttcct gaatctattg aaaatctgac caaactccgt 2100 ttcttgaatc tttctggatg ctctaagctt tcaacattac ctatcagatt tttggaatca 2160 tttgctagcc tctgttcttt ggtagatctt aacttaagtg gctttgaatt ccaaatgttg 2220 cccgactttt ttggcaacat atattcactt cagtatttaa atctgtcaaa atgtttgaaa 2280 cttgaggtat taccacaatc ttttggccaa cttgcatatc tgaaaagcct aaatctttca 2340 tattgttctg atcttaaact gctggaatcc tttgaatgcc ttacctctct tcggtttttg 2400 aatctctcga actgctctag gcttgaatat ttgccatcat gctttgacaa gcttaataat 2460 ttagagtctc tgaatttatc acaatgtctt ggacttaaag cactacctga atcacttcaa 2520 aaccttaaaa atcttcagct tgatgtttct gggtgtcagg attgtatagt acaatccttt 2580 tctctaagta ccagaagttc ccagtcctgc caacggtcgg agaaagctga gcaggtcaga 2640 tcaagaaaca gtgaaatttc agagatcact tatgaggaac ctgctgagat tgaactttta 2700 aagaataatc caagtaaaga tttggcctcc atctcacacc taaatgagga tagaattgag 2760 gagcctgaag ttgtcactga gccaagtgca actagaggta tggtacaaca gattccagga 2820 aaccagctct catcgccttc atctcatctt tcttcctttg catcaagctc agcgccattt 2880 gcatcctcct cttcggacac ctcaacaagt gagcatccag tgcctaatga agaggcggca 2940 gctttgacag ttcctcggtc caaagagaaa tgcgacaaca ctcccatgcc ggtaaaagat 3000 ggcctgatat ctgaagatga tgcaccggta catctgcatc agaagcccct gcaggcgaca 3060 gccatggcag ccatatga 3078 <210> 6 <211> 3192 <212> DNA <213> Oryza sativa <400> 6 atggccacag ccggcgctgc cgttgaccgg cttctacgcc gtctggcctc cggtgctggc 60 cgtctggagc tgccctcgag catagacgag gacatggcgc atgtaaagcg aaccctggcg 120 aggttgcaag atgtgctgct aaccgtagaa gggaaatact tcaagatggg cgcggaggtg 180 caggaatgga tgaggaagat caagcagatt gcttacggca ttcaagattt gctggatgag 240 tttgaggaca gtagcggcac cggatcccaa aggaacggct ccaggatttc agagggaacg 300 ctatcgtgtt cgtcagctcc atttttctgc catcttagta gatcacaaag aataagggta 360 ctgaaaagaa agttagatca atcaacaaaa gatacttctg tatttagttt actgcagcac 420 agcttatcca atcttgacaa atccaatgag caagaagttc tgttacatag aactgaaatc 480 attggaaggg atactgacaa agaaaatata aaaaatctat tgttacaaaa tgatgtggat 540 aaattaccca tcattccgat agttggcctt gcggggctgg gaaaaacggc tgtagcaaaa 600 ttgattttcc atgaacaggg agaagggtgg aattttgatc agcgcatatg ggtccatttg 660 gacaagaaat tggatcttaa caaaattgct aacagtatta tctcacaagt taaccaatca 720 gtagatacca caaagaatca aattcagaac aacttacagt ttaaaaggaa ttgtcttcaa 780 gaagttcttt gtgaccaaag cagtttgata gtattggatg acttatttag cacagaggaa 840 aaccagattg cagagttgaa ggaaatgttg aggggtacaa agaagggaac caagatcatt 900 gtgactactt ccagtgaaat atctgcagag ctaatacaca cagttccacc atacaagttg 960 ggccctttat ctgaaggtga ctgttcaaca atattttgtc aaagagcatt tggtgatgga 1020 catgaaaaca gcagcctcac tgaaattgcg aagcaaattg tgaaaaggtg tgaaggcata 1080 ccggctgtag cttattctct tggttcattg gttcgtaaca agaataagga ggcctggtta 1140 tatgcaagag acaaagaaat atgggaatta ccaacattat ttcctaatgg gtttgaatta 1200 cttgcatcgt tcagtgaaat gtatatatgt atgccctcgg ctttaaaatc atgctttgca 1260 tacttatcaa ccatacccaa aggaacaata attgataggg agaaacttat 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tctaaacatg 2160 tcgaaatgct ccaagcttga acaactacca gaatctcttg gtgatctttg ttacctacga 2220 tcctttaacc tatcaggttg ttctgggctt aagatgctgc cagaatctct gaaaaatctt 2280 acaaatttag agtatattaa tttgtcaaat attggggaga gtatcgattt caatcagata 2340 caacaactac ggcacattct caagaaaaca tttttttctg gagatattgg agggagtgaa 2400 ctccaaacat gtgaacacgc tgctgattct gcagacagta agaaggaaat tacaatggat 2460 ttttctgcaa atttgcatgg aaatattact ttgccaccca agtgctcaac tgaagagaaa 2520 tctggtgaaa actctgaacg attcctatca gctgcagtta gggaggattc aagcagcact 2580 gatgtttcta catatgtcaa gccggtggtg tcctcactta ttggagtgct gcgcagaccg 2640 actaggttgg atgtgccagc tggcgcgatg gcttctcagg ttggcctggc ccagatgcca 2700 tctagcaaca atggtaaggc tggaccgcat ccaacaatgg ctgcagctca gaccccggag 2760 attgatcaac ctgtgcataa aagggtccgg tgggatgata taatagacta ctcccgtcct 2820 cccaactcaa aacctgccag gagtgcatct cttgtgcagt cgaccgatct gtcgacacca 2880 aagaaaagtt ataaaaaaat tcactcaatg ccggtggtct attcgtcaat tccaaaaggg 2940 agttccggag gaacatactt gatgccagca aaggctatcg cttcttccta caggaggtat 3000 agcccacaga gatgggaaca gcacattggt tatcaaggaa cggatgaaga tgaactgatg 3060 gtcgtgccac catttggtga gtgggatcag tcccccacat tacgaaaatc tgactttcgg 3120 tatgagaagg tcttcgctaa actcaccgaa gagaagatgt ctggtcaaag gcagaaaccg 3180 caacaggtat ga 3192 <210> 7 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 7 gtattacctg aaatcctagt ggtg 24 <210> 8 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 8 aggaactacg gtattacaag gatc 24 <210> 9 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 9 gatatggttg aaaagctaat ctca 24 <210> 10 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 10 atcattgtcc ttcatattca gagt 24 <210> 11 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 11 aagtgagcat ccagtgccta atga 24 <210> 12 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 12 agccggtgct cataacacgt atta 24 <210> 13 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Pi5-1 ter1 primer <400> 13 gtccaaagag aaatgcgaca acac 24 <210> 14 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Pi5-1 ter2 primer <400> 14 cgctcgaggt ggcatttcat ccaataggca ac 32 <210> 15 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> JJ113-T32 primer <400> 15 gatgatgtga tctgcagaga aac 23 <210> 16 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> JJ719-I41 primer <400> 16 agcctcactg aaattgcgaa gca 23

Claims (16)

1. 벼 도열병균에 대한 내성을 증진시키는 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 Pi5-1 단백질.
2. 벼 도열병균에 대한 내성을 증진시키는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 Pi5-2 단백질.
3. 제1항의 Pi5-1 단백질을 코딩하는 유전자.
4. 제2항의 Pi5-2 단백질을 코딩하는 유전자.
5. 제3항에 있어서, 상기 유전자는 서열번호 3의 염기서열로 이루어진 게놈 DNA인 것을 특징으로 하는 유전자.
6. 제4항에 있어서, 상기 유전자는 서열번호 4의 염기서열로 이루어진 게놈 DNA인 것을 특징으로 하는 유전자.
7. 제3항에 있어서, 상기 유전자는 서열번호 5의 염기서열로 이루어진 cDNA인 것을 특징으로 하는 유전자.
8. 제4항에 있어서, 상기 유전자는 서열번호 6의 염기서열로 이루어진 cDNA인 것을 특징으로 하는 유전자.
9. 제3항의 유전자 및 제4항의 유전자를 포함하는 재조합 벡터.
10. 제9항의 재조합 벡터로 형질전환된 식물체.
11. 제10항에 있어서, 단자엽 식물인 것을 특징으로 하는 식물체.
12. 제10항에 따른 식물체의 종자.
13. 제9항의 재조합 벡터를 식물에 형질전환하여 Pi5-1 및 Pi5-2 유전자를 발현하는 단계를 포함하는 식물의 병원균에 대한 내성을 증진시키는 방법.
14. 제13항에 있어서, 상기 병원균은 벼 도열병균임을 특징으로 하는 방법.
15. 제13항에 있어서, 상기 식물은 단자엽 식물인 것을 특징으로 하는 방법.
16. 제3항의 유전자 및 제4항의 유전자를 포함하는 식물의 병원균에 대한 내성 증진용 조성물.

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