CN115491430B - 稻瘟病多重抗病基因组合及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于水稻基因工程技术领域，具体涉及稻瘟病多重抗病基因组合及其应用。本发明连续3年对江苏省119个水稻主栽品种叶瘟和穗瘟抗性进行综合评价，明确其对稻瘟病的抗性水平；利用SSR分子标记检测14个抗病基因分布频率。利用基因抗性贡献率和多元逐步回归分析，确定了适合江苏水稻品种的主要抗性基因和基因组合模式，具体为i)Pita+Pikm+Piz‑t、ii)Pita+Pikm+Pi2、iii)Pita+Pi5+Piz‑t、iv)Pikm+Piz‑t+Pi2、v)Pita+Pikm+Pi5+Piz‑t、vi)Pita+Pikm+Pi2+Piz‑t。利用本发明的抗性基因组合可以有效地提高水稻品种的抗性。

Description

稻瘟病多重抗病基因组合及其应用
技术领域
本发明属于水稻基因工程技术领域，具体涉及稻瘟病多重抗病基因组合及其应用。
背景技术
大米(Oryza sativa)是全球最重要的主食之一，占全球50％的人口所消耗热量的23％。水稻的安全生产受到稻瘟病的严重威胁，稻瘟病由子囊真菌(Magnaporthe oryzae)引起，每年造成世界粮食损失的10-30％。由于地处南北气候过渡带，江苏水稻产区为稻瘟病常发区域。每年防控面积约200万公顷，严重威胁水稻安全生产。选用抗病品种是防治该病害最经济、最有效的方法。然而，由于稻瘟病菌生理小种组成的复杂性和无毒基因的易变性，抗病品种在田间栽培3-5年后，其抗性会减弱或丧失。因此，对主栽品种对叶瘟和穗瘟的抗性进行鉴定，分析其抗性基因的分布，是提高水稻抗性的关键。
在水稻/稻瘟病菌互作体系中，水稻中的抗病基因和稻瘟病菌无毒基因间的遵循“基因对基因”假说，含有抗病基因的水稻品种可以有效抑制含有相应无毒基因的稻瘟病菌的侵染。到目前为止，已鉴定出100多个稻瘟病抗性基因，其中25个主效抗病基因和2个部分抗性基因(Pi21和Pb1)已克隆或鉴定。克隆的所有抗病基因(除Pid2和Pi21外)均属于核苷酸结合位点和富含亮氨酸重复序列(NBS-LRR)类。Pita位于12号染色体上，编码质膜受体蛋白，与稻瘟病菌无毒基因Avr-Pita识别，表达产物相互作用诱导抗性反应。在Pik位点上鉴定出Pik、Pikp、Pikh、Pikm、Piks、Pike和Pi1等7个等位基因，该基因需要两个相邻的NBS-LRR类基因才能发挥全部功能。另一个抗病基因位点是Piz位点，包括Pi9、Pi2、Piz-t、Pigm和Pi50等5个抗病基因。其中Pigm编码两种蛋白质，PigmR和PigmS，共同调控广谱持久抗性和产量。
传统的育种方法是通过杂交、农艺性状选择和抗性鉴定，将抗性基因导入目标品系，形成抗性品种，这种方法是有效的，但工作量大、耗时长。分子标记辅助选择(MAS)是将分子标记应用于水稻育种的一种选择辅助方法。功能标记(Functional markers,FMs)是指代表特定抗性基因的标记位点，可通过筛选分子标记筛选水稻性状。一些针对抗病基因的FMs已经被开发出来，如Pib、Pigm、Pita和Pikm，这将为识别靶基因提供方便的方法。此外，一些基于PCR的紧密链接标记(LMs)与多个抗病基因(包括Pi2、Pi5和Pi9)相关。LMs为基因渐渗和基因聚合中靶基因的筛选提供了一种高效、快速的方法。
稻瘟病根据发病组织可分为叶瘟和穗瘟，穗瘟在产量损失方面的破坏性更大。越来越多的证据表明，叶瘟抗性与穗瘟抗性之间存在不同的调控机制。众所周知，基因聚合可提高水稻品种的抗性谱和抗性水平。Liu等报道了Pita2、Pi5、Pi9和Piz-t在云南56个水稻主要品种中表现出较高频率和抗性。此外，籼型组合中的“Pi9+Pi54”、“Pid3+Pigm”、“Pi5+Pid3+Pigm”、“Pi5+Pi54+Pid3+Pigm”和粳型组合中的“Pi5+Pib”、“Pik+Pita”、“Pik+Pb1”、“Piz-t+Pia”和“Piz-t+Pita”组合模式对水稻品种的抗性至关重要。但是，这些研究都是基于叶瘟抗性，在育种应用中的准确度并不高。选育和利用抗病品种是防控稻瘟病发生和流行最经济有效的措施，因此，急需一种更精准的抗病基因组合来提高抗病品种的选育效率。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明连续3年对江苏省119个水稻主栽品种对叶瘟和穗瘟的抗性进行了综合评价，明确了其对稻瘟病的抗性水平；利用SSR分子标记检测了14个抗病基因的分布频率。利用基因抗性贡献率和多元逐步回归分析，确定了适合江苏水稻品种的主要抗病基因和基因组合模式。利用叶瘟和穗瘟综合抗性指数对江苏省主产区水稻主栽品种的抗病基因分布和抗病水平进行分析，对精准利用抗病基因/组合具有重要意义。
第一方面，本发明提供了一种稻瘟病多重抗病基因组合，所述基因组合选自以下任一组合：i)Pita+Pikm+Piz-t、ii)Pita+Pikm+Pi2、iii)Pita+Pi5+Piz-t、iv)Pikm+Piz-t+Pi2、v)Pita+Pikm+Pi5+Piz-t、vi)Pita+Pikm+Pi2+Piz-t。
第二方面，本发明还提供了所述的稻瘟病多重抗病基因组合在以下任一中的应用，
a)选育或筛选具有广谱持久稻瘟病抗性的水稻品种；
b)比较待测水稻稻瘟病抗性的强弱；
c)选育或筛选具有相对较强稻瘟病抗性的水稻品种。
第三方面，本发明还提供了检测所述的稻瘟病多重抗病基因组合的试剂在制备具有以下任一功能的产品中的应用，
e)选育或筛选具有广谱持久稻瘟病抗性的水稻品种；
f)比较待测水稻稻瘟病抗性的强弱；
g)选育或筛选具有相对较强稻瘟病抗性的水稻品种。
在某些实施例中，所述产品为检测试剂盒。
第四方面，本发明还提供了如下任一方法，
A)选育或筛选具有广谱持久稻瘟病抗性的水稻品种，包括如下步骤：
(A1)提取待测水稻基因组DNA，
(A2)对待测水稻基因组DNA进行PCR扩增，若所述基因组DNA中含有所述的稻瘟病多重抗病基因组合中的至少一种，则所述待测水稻为具有广谱持久稻瘟病抗性的水稻品种；
B)比较待测水稻稻瘟病抗性的强弱，包括如下步骤：
(B1)提取待测水稻基因组DNA，
(B2)对待测水稻基因组DNA进行PCR扩增，所述基因组DNA中含有所述的稻瘟病多重抗性基因组合中的至少一种的水稻品种稻瘟病抗性强于所述基因组DNA中不含有所述的稻瘟病多重抗病基因组合的水稻品种；
C)选育或筛选具有相对较强稻瘟病抗性的水稻品种，包括如下步骤：
(C1)提取待测水稻基因组DNA，
(C2)对待测水稻基因组DNA进行PCR扩增，所述基因组DNA中含有所述的稻瘟病多重抗病基因组合中的至少一种，则所述待测水稻为具有相对较强稻瘟病抗性的水稻品种。
在某些实施例中，所述水稻品种为江苏省水稻品种。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
1、本发明发现水稻品种的抗性水平与抗性基因数量呈弱正相关关系，因此，并不是抗病基因数量越多，水稻品种的抗性水平越高，最好的策略是聚集有效的抗性基因。结合多元逐步回归和抗性贡献率数据，筛选出6个基因组合的抗性贡献率均为100％，分别为i)Pita+Pikm+Piz-t、ii)Pita+Pikm+Pi2、iii)Pita+Pi5+Piz-t、iv)Pikm+Piz-t+Pi2、v)Pita+Pikm+Pi5+Piz-t、vi)Pita+Pikm+Pi2+Piz-t。
2、本发明以具有代表性的119个主栽品种为研究材料，通过田间自然诱发对叶瘟、穗颈瘟、穗损失指数等综合指数进行抗性评价，并且连续3年进行抗性评价，筛选出的抗病基因组合结果更准确严格，更能反映品种田间真实抗性；同时，利用多元逐步回归模型和抗性贡献率等分析方法，更为准确的明确了抗性相关性最大的抗病基因和基因组合，分析结果更精准。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1实施例1中部分品种14个抗病基因标记的凝胶电泳图谱；
图2水稻品种抗性评价及抗病基因分析；
图3实施例4中119个水稻主要品种聚类分析图；
图4实施例5中14个抗病基因抗性贡献率和分布频率分析。
具体实施方式
下面将结合附图对本发明技术方案的实施例进行详细的描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，因此只是作为示例，而不能以此来限制本发明的保护范围。需要注意的是，除非另有说明，本申请使用的技术术语或者科学术语应当为本发明所属领域技术人员所理解的通常意义。
材料与方法
本发明从江苏省所有种植区(苏北、苏中、苏南)采集水稻主要品种119个(粳稻94个、籼稻25个)。
1.水稻侵染分析
本发明采用金坛(31°40′20″N,119°21′34″E)苗圃自然诱发叶瘟和穗瘟。每个品种种植25个(5×5)穴，共1平方米，每排(5穴)，并在各品种之间和品种***种植感病品种Co39，以促进品种的充分发病。在播种40天或易感品种出现病害症状时(85％)，调查叶瘟发病情况。在播种140天或150天(黄熟期)后，对各品种穗瘟发病情况进行了调查。
2.病害的评估
采用标准的0-9级评价叶瘟的严重程度，分为10个级别，定义如下:0级:无病害症状；1级:棕色斑点，直径≤1mm；2级:大棕色斑点，直径1-2毫米；3级:圆形至椭圆形灰色病变，直径1-2cm；4级:纺锤斑，长1-2厘米，局限于两叶脉之间，感染面积不超过叶面积的2％；5级:纺锤斑，侵染面积占叶面积的2％-10％；6级:纺锤斑，侵染面积占叶面积的11％-25％；7级:纺锤斑，侵染面积占叶面积的26％-50％；8级:纺锤斑，侵染面积占叶面积的51％-75％；9级:纺锤斑，侵染面积大于叶面积的75％。
穗瘟发病反应分为0-9级，分为6个级别，定义如下:0级:无病害症状；1级:单个分枝患病，每穗损失小于5％；3级:约1/3的分枝患病，每穗损失6％-20％；5级:水稻穗或穗轴患病，每穗损失21％-50％；7级:水稻穗病，每穗损失51％-70％；9级:每穗损失71％-100％。
穗瘟发病率分级标准:0级:无症状；1级:穗瘟发生率<5.0％；3级:穗瘟发生率5.1％～10.0％；5级:穗瘟发生率10.1％～25.0％；7级:穗瘟病发生率25.1％～50.0％；9级:穗瘟病发生率50.1％～100.0％。穗瘟病发生率＝(病穗数/被调查穗数)×100％。
穗瘟分级损失指数标准:0级:无病害症状；1级:穗丢失<5.0％；3级:穗部脱落5.1％-15.0％；5级:15.1％-30.0％；7级:穗部脱落30.1％-50.0％；9级:50.1％-100％。
稻瘟病分级综合指数标准:0级:<0.1；1级:0.1-2.0；3级:2.1-4.0；5级:4.1-6.0；7级:6.1-7.5；9级:7.6-9.0。综合指数＝叶瘟病水平×25％+穗瘟病发生率×25％+穗瘟病损失指数×50％。
3.稻瘟病抗病基因的分子筛选
分子筛选方面，对14个主要抗稻瘟病基因Pit、Pish、Pib、Pi1、Pia、Pi54、Pita、Pi9、Pi2、Pikm、Pigm、Pi5、Pb1和Piz-t进行基因分型。从已发表的引物序列中筛选出14个分子标记进行分子筛选。引物对的详细信息见表1。
表1分子标记检测引物序列
PCR扩增量为20μl:10μl Green Taq Mix(Vazyme)，1μl(20ng)模板DNA，各引物1μl,ddH2O 7μl。PCR程序设置如下：95℃初始变性5min；35个循环，95℃30s,58℃30s,72℃30s；然后放入72℃10分钟。PCR产物用3％琼脂糖凝胶电泳分离，在80伏下运行60分钟。拍照凝胶图像。PCR扩增片段按存在(1)和不存在(0)进行评分。
4.数据分析
为了进行多样性分析，将14个抗性基因的二进制矩阵作为存在(1)和不存在(0)的二进制数据，用于估计遗传距离和相似系数。采用NTSYS-pc v.2.1对数据矩阵进行进一步分析。采用SIMQUAL程序计算Jaccard相似系数。所得相似矩阵用于基于算术平均(UPGMA)的非加权对组方法构建树状图。
采用SPSS 20统计软件对抗病基因与抗性水平的关系进行多元逐步回归分析。以3年各品种综合指数的平均值作为抗性水平。
实施例1水稻主要品种14个抗病基因的基因型分析
利用SSR分子标记进行抗性基因鉴定。部分品种14个抗病基因标记的凝胶电泳图谱如图1所示。根据分子标记，很容易识别出Pit、Pish、Pib、Pita、Pb1和Pi97个抗病基因。由于Pi54、Pi2、Pi1、Pi5、Pikm、Pia、Piz-t/Pi2和Pigm等7个基因的分子标记可扩增2-3个条带，因此以上基因的鉴定主要基于特异性电泳条带(图1)。
实施例2稻瘟病表型分析
根据对叶瘟和穗瘟的筛选综合指数得分(表2)，籼稻和粳稻分别有23个(92.00％)和28个(29.79％)品种具有抗性和中抗性(1级和3级)，50个(53.19％)品种具有中度易感(图2中A)。上述结果表明，籼稻对稻瘟病的抗性优于粳稻，粳稻抗性退化的风险较大。4个粳稻品种(苏香粳100、金香玉1号、嘉58和沪LPR18)和4个籼稻品种(隆两优1307、和两优332、徽两优882和两优688)抗性较好(表2)。此外，将所有119个水稻品种分为苏北(74个)、苏中(21个)和苏南(24个)3个水稻种植区(表3)，苏南地区50.00％的水稻品种为抗性和中抗性，高于苏北地区的44.60％和苏中地区的28.57％(表3)，说明不同产地水稻品种对稻瘟病的抗性存在显著差异。
表2 119个水稻主栽品种2019-2021年抗性鉴定分析
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表3 119个品种区域抗性评价
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实施例3抗性水平与抗性基因呈正相关
水稻主要品种中检测到的抗病基因数量呈正态分布，119个品种中抗病基因阳性等位基因的频率为3-10个基因。在粳稻中主要是6-9个基因，在籼稻中主要是4-6个基因(图2中B)。相关分析显示，抗性水平与抗病基因数量呈弱正相关(R2＝0.0508,P<0.05)(图2中C)。
利用16个SSR分子标记在119个水稻主要品种中共检测到14个抗病基因，所有抗病基因均存在于籼稻和粳稻亚种基因组中(图2中D)。Pish的分布频率最高(100％)，而Pigm的分布频率最低，仅在金香玉1号和皖稻1532个品种中检测到(表4)。此外,尽管粳米的数量要高得多(94/25)比籼稻,但其他抗病基因的分布频率在粳稻高于籼稻(图2中D和表4)。抗病基因的分布特征表明籼、粳水稻对稻瘟病的抗性可能有所不同。
表4 119个水稻主栽品种中抗病基因分布
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注:“+”表示存在；“-”表示不存在。
实施例4 119个水稻主要品种的聚类分析
在60％的遗传相似系数水平上，将119个水稻主要品种分为两个聚类(I和II)(图3)。主聚类I包含107个品种，分为两个亚聚类IA和IB，亚聚类IA包含78个品种，分为两个亚聚类IA-1和IA-2。IA-1共检出64个品种，其中抗病品种13个(20.31％)。IA-2由14个品种组成，其中7个耐药基因型(50.00％)。IB亚群包含29个品种，分为IB-1和IB-2两个亚群，大部分籼稻品种(21/25)聚在这两个亚群中。b-1亚群由9个品种组成，其中抗病品种均为100％。b-2亚群共检出20个品种，其中15个(75.00％)耐药。有趣的是，IB子集群的水稻品种大多(23/29)生长在苏北，而其他集群的水稻品种生长在苏北、苏中和苏南。II类分为IIA(1)和IIB(11)两个亚群，有7个品种(58.33％)耐药。结果表明，IB亚群中包含了大部分籼稻品种，抗性较好。一些生态环境相似的水稻品种属于同一聚类，且各聚类的遗传相似基因型具有不同生态环境品种的特征。
实施例5抗病基因贡献率及抗病基因组合模式分析
利用16个SSR标记分析了14个抗病基因在119个水稻主要品种中的分布(表4和图4)。Pish基因的分布频率最高(100％)，其次是Pit(95.80％)和Pia(80.67％)，Pigm基因的分布频率最低(1.68％)，其次是Pi2(15.18％)和Pi5,Piz-t(24.37％)。此外，基于抗性综合指数，计算了每个抗病基因的抗性贡献率。有趣的是，Pigm的抗性贡献率最高(100％)，因为只有两个品种(金香玉1号和皖稻153)检出了Pigm，表现出抗和中抗。Pi5、Pi2、Pita、Pikm和Piz-t的抗性贡献率分别为65.52％、61.11％、58.49％、58.23％和51.72％，均大于50％。
为了探究哪些抗病基因影响水稻抗性，利用多元逐步回归分析了抗性水平与抗病基因之间的关系。通过拟合该模型，输入上述14个变量，通过分析发现引入的Pi9、Pib、Pit、Pita、Pi5、Pigm、Pb17个变量并没有被移除(表5)，表明包含7个抗病基因的模型7为最佳模型(R2＝0.434,Sig＝0.000)。
表5影响抗性的7个变量分析
上述结果表明，Pi9、Pib、Pit、Pita、Pi5、Pigm和Pb1对水稻抗性有显著影响。结合上述抗药贡献率数据，我们分析了基因聚合模型的抗药贡献率(表6)。
表6不同基因组合抗性贡献率和分布频率分析
共发现3个基因16个组合，4个基因6个组合，包含8个抗病基因Pita、Pi5、Pi9、Pib、Pb1、Pikm、Piz-t和Pi2(表6)。22个基因组合分布频率较低，从0.84％(Pita+Pikm+Pi5+Piz-t,Pita+Pikm+Pi2+Piz-t)到16.81％(Pi9+Pib+Pb1)不等。相比之下，这些基因组合的抗性贡献率较高，为16.67％-100％。其中，Pita+Pikm+Piz-t、Pita+Pikm+Pi2、Pita+Pi5+Piz-t、Pikm+Pi z-t+Pi2、Pita+Pikm+Pi5+Piz-t、Pita+Pikm+Pi2+Piz-t 6个组合抗性贡献率达到100％。值得注意的是，含有这些基因组合的品种很少，只有组合Pikm+Piz-t+Pi2的品种达到5个，其余5个组合只有1-2个品种。这些结果表明，这些关键的抗病基因或基因组合，在江苏省具有很大的利用潜力。
实施例6在抗性强的水稻品种中检测基因组合
为了进一步验证上述基因组合在水稻抗病中的应用，我们选取了本实验室保存的30份抗性较好的水稻种质资源，上述水稻资源抗性综合指数均为3级以上，同时利用分子标记对30份水稻种质资源的6种基因组合情况进行了分析(按照“材料与方法”部分操作)，结果发现6种基因组合均能够检测到，并且Pita+Pi5+Piz-t和Pikm+Piz-t+Pi2在3个水稻品种中均能检测到，其余基因组合仅在1个水稻品种中被检测到。另外水稻品种SF316可以检测出上述6中基因组合，且其抗病指数为1，抗性最好。
表8 30个抗性强水稻品种中基因聚合组合检测结果
注:“+”表示存在；“-”表示不存在。
综上所述，稻瘟病菌可侵染水稻的整个生育期，主要侵染叶片和穗部，穗瘟对水稻产量危害最大。已有研究报道水稻品种对叶瘟的抗性与穗瘟的抗性之间存在一定的相关性，但也存在抗性不一致的情况。因此，利用叶瘟和穗瘟综合评价稻瘟病抗性是水稻抗病育种和品种抗性评价的重要技术手段。本发明评估了119个主栽水稻品种在2019年、2020年和2021年对叶瘟和穗瘟的综合抗性水平，这些数据更客观、准确地反映了119个品种对稻瘟病的抗性。有效抗性基因的聚合可以有效地提高水稻品种的抗性。此外，通过水稻品种中抗性基因的分布、新抗性基因的发掘利用和稻瘟病菌无毒基因的监测，可以更好地实现水稻的广谱持久抗性。
除非另外具体说明，否则在这些实施例中阐述的数值并不限制本发明的范围。在这里示出和描述的所有示例中，除非另有规定，任何具体值应被解释为仅仅是示例性的，而不是作为限制，因此，示例性实施例的其他示例可以具有不同的值。

Claims (5)

1.一种稻瘟病多重抗病基因组合，其特征在于，所述多重抗病基因组合为Pikm+Piz-t+Pi2。
2.权利要求1所述的稻瘟病多重抗病基因组合在以下任一中的应用，
a)选育或筛选具有广谱持久稻瘟病抗性的水稻品种；
b)比较待测水稻稻瘟病抗性的强弱；
c)选育或筛选具有相对较强稻瘟病抗性的水稻品种。
3.检测权利要求1中所述的稻瘟病多重抗病基因组合的试剂在制备具有以下任一功能的产品中的应用，
d)选育或筛选具有广谱持久稻瘟病抗性的水稻品种；
e)比较待测水稻稻瘟病抗性的强弱；
f)选育或筛选具有相对较强稻瘟病抗性的水稻品种。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述产品为检测试剂盒。
5.如下任一方法，
A)选育或筛选具有广谱持久稻瘟病抗性的水稻品种，包括如下步骤：
(A1)提取待测水稻基因组DNA，
(A2)对待测水稻基因组DNA进行PCR扩增，若所述基因组DNA中含有权利要求1中所述的稻瘟病多重抗病基因组合，则所述待测水稻为具有广谱持久稻瘟病抗性的水稻品种；
B)比较待测水稻稻瘟病抗性的强弱，包括如下步骤：
(B1)提取待测水稻基因组DNA，
(B2)对待测水稻基因组DNA进行PCR扩增，所述基因组DNA中含有权利要求1中所述的稻瘟病多重抗病基因组合的水稻品种稻瘟病抗性强于所述基因组DNA中不含有权利要求1中所述的稻瘟病多重抗性基因组合的水稻品种；
C)选育或筛选具有相对较强稻瘟病抗性的水稻品种，包括如下步骤：
(C1)提取待测水稻基因组DNA，
(C2)对待测水稻基因组DNA进行PCR扩增，所述基因组DNA中含有权利要求1中所述的稻瘟病多重抗病基因组合，则所述待测水稻为具有相对较强稻瘟病抗性的水稻品种。
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