CN117947094B - Pi-Pprs42基因提高水稻稻瘟病抗性的方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物技术领域，具体来说是一种Pi‑Pprs42基因提高水稻稻瘟病抗性的方法及应用，通过负调控水稻抗病性的miRNA靶基因的表达研究，克隆了一个新的广谱抗稻瘟病基因Pi‑Pprs42，Pi‑Pprs42基因在水稻植株中受稻瘟病菌侵染诱导表达，过表达Pi‑Pprs42基因的水稻植株通过增强活性氧H2O2积累、防御相关基因PR1a和PBZ1，SA和JA途径关键基因OsNPR1和OsCOI1b的表达赋予水稻广谱稻瘟病抗性。本研究为稻瘟病抗性基因的鉴定提供了新思路和新方法，为水稻品种抗性改良和广谱抗病新品种的选育提供了新的基因资源。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体来说是一种Pi-Pprs42基因提高水稻稻瘟病抗性的方法及应用。
背景技术
稻瘟病是水稻生产上最具毁灭性的病害，稻瘟病的有效防治，对水稻生产的可持续性发展和世界粮食安全至关重要。新的抗稻瘟病基因，尤其是广谱抗稻瘟病基因的鉴定和在水稻育种中的应用，是防控稻瘟病最经济有效的措施。
目前为止，已经鉴定的稻瘟病主效抗性基因位点146个，但克隆研究的只有38个。一些基因在水稻抗病育种中被广泛利用，在稻瘟病防治中发挥了重要作用。例如从籼稻’Modan’中鉴定的编码卷曲的CC-NBS-LRR蛋白Pb1，已被引入日本商业种植的几个优良品种中，并且在近30年内未表现出抗性丧失的迹象。何祖华等人在我国农家品种的育种材料中鉴定了一个广谱持久抗瘟性新位点Pigm，它是一个包含多个NBS-LRR类抗病基因的基因簇。利用Pigm改良选育的品种既有广谱持久抗病性又不影响最终的产量。
我们在水稻中鉴定了一个新的负调控水稻稻瘟病抗性的miRNA，miR9664，其预测的靶基因主要是编码NBS-LRR蛋白的基因，其中预测靶基因LOC_Os12g13550的表达水平在过表达miR9664的转基因水稻中显著下调，而在敲除miR9664的转基因水稻中显著上调，推测其很可能是一个受表观遗传调控的主效抗稻瘟病基因，在水稻稻瘟病防控中具有重要的潜在应用价值。
发明内容
本发明的目的是提供一种Pi-Pprs42基因提高水稻稻瘟病抗性的方法及应用。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：本发明以水稻miR9664预测靶基因LOC_Os12g13550为对象，从水稻子预44中提取总RNA并反转录成cDNA，用PCR技术扩增出LOC_Os12g13550基因的CDS区序列2883bp（如SEQ ID No.1所示），编码包含一个蛋白磷酸激酶1调节亚基42（protein phosphatase 1 regulatory subunit 42）的CC-NBS-LRR抗病蛋白，这是第一个发现的具有磷酸激酶结构域的抗病蛋白（图1），我们将其命名为Pi-Pprs42。
基因序列SQE ID No.1所示，编码的氨基酸序列如SQE ID No.2所示。通过构建Pi-Pprs42基因过表达载体，采用农杆菌介导的遗传转化方法，将过表达载体导入感病水稻TP309中，得到Pi-Pprs42基因过表达植株。过表达Pi-Pprs42基因的水稻株系显著增强了对稻瘟病菌的抗性，T1代阳性转基因株系分蘖期离体叶片伤害接种稻瘟病菌A7203-8、HN2、GUY11和LP11分生孢子悬浮液（1.0×105个/mL），转基因株系平均病斑长度、真菌孢子量均显著低于非转基因TP309对照。表明Pi-Pprs42能显著增强水稻对不同致病稻瘟菌株的抗性。DAB（3,3’Diaminobenzidine-HCl）染色检测水稻叶片细胞H2O2累积表明，过表达Pi-Pprs42基因的水稻植株，受稻瘟病菌侵染后48 h叶片细胞中H2O2的积累显著高于非转基因的TP309对照。qRT-PCR 方法对防御相关基因OsPR1a和OsPBZ1，JA和SA途径信号通路关键基因OsCOI1b和OsNPR1的表达水平检测结果表明，与对照相比，过表达Pi-Pprs42基因的水稻植株中OsPR1a、 OsPBZ1、OsNPR1和 OsCOI1b的表达显著上调。
上述结果表明，Pi-Pprs42通过增强水稻植株体内H2O2的积累，激活防御相关基因表达而赋予水稻的广谱稻瘟病抗性。
因此，本申请请求保护SEQ ID No.1所示Pi-Pprs42基因在提高水稻抗稻瘟病中的应用。
对于本领域技术人员来说，利用如SEQ ID No.1所示Pi-Pprs42基因序列来进行水稻新品种培育也属于本发明的保护范围。
本方法将Pi-Pprs42目的基因在水稻品种TP309中过表达，实现了抗性提高，因此本方法亦可以用于水稻的改良或新品种选育也属于本发明的保护范围。
利用如SEQ ID No.1所示Pi-Pprs42基因或编码的氨基酸在提高水稻抗稻瘟病的方法，步骤包括：
（1）从野生型水稻子预44中提取总RNA，然后反转录为cDNA；
（2）用PCR技术扩增出目的基因Pi-Pprs42，所述目的基因Pi-Pprs42序列如SEQ IDNo.1所示；
（3）将基因Pi-Pprs42片段连接到表达载体上，得到过量表达Pi-Pprs42目的基因的质粒pCAMBIA1300- Pi-Pprs42；
（4）将质粒pCAMBIA1300- Pi-Pprs42导入农杆菌；
（5）含有质粒pCAMBIA1300- Pi-Pprs42的农杆菌与水稻株共培养即可得到抗病性正相关的水稻株系。
进一步的，步骤（2）中，于扩增所述目的基因Pi-Pprs42的引物序列为Pi-Pprs42-F和Pi-Pprs42-R：
Pi-Pprs42-F:5¢- ATTCGAGCTCGGTAATGTCGACGATGGTGGTGAG-3¢
Pi-Pprs42-R:5¢-AGGATCCCCGGGTACTACTTACATGCAACTGTTT-3¢。
本发明的有益技术效果是：本发明提供了一种通过负调控水稻抗病性的miRNA靶基因的表达研究，克隆了一个新的广谱抗稻瘟病基因Pi-Pprs42，Pi-Pprs42基因在水稻植株中受稻瘟病菌侵染诱导表达，过表达Pi-Pprs42基因的水稻植株通过增强活性氧H2O2积累、防御相关基因PR1a和PBZ1，SA和JA途径关键基因OsNPR1和OsCOI1b的表达赋予水稻广谱稻瘟病抗性。本研究为稻瘟病抗性基因的鉴定提供了新思路和新方法，为水稻品种抗性改良和广谱抗病新品种的选育提供了新的基因资源。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1：Pi-Pprs42蛋白结构预测图。
图2：稻瘟病菌侵染水稻时Pi-Pprs42表达水平检测结果图。
图3：T0代过表达Pi-Pprs42转基因水稻株系阳性鉴定结果图。
图4：T1代过表达Pi-Pprs42转基因水稻株系Pi-Pprs42表达水平检测结果图。
图5：T1代过表达Pi-Pprs42转基因水稻株系阳性鉴定结果图：图中A为OX-Pprs42＃14-T1阳性鉴定结果图，B为OX-Pprs42＃16-T1阳性鉴定结果图。
图6：过表达Pi-Pprs42基因的转基因水稻株系苗期抗性鉴结果图：图中 A为接种后的病害症状图，B为平均发病等级统计图。
图7：过表达Pi-Pprs42基因的转基因水稻株系分蘖期接种稻瘟病菌A7203-8抗性鉴定结果图：图中 A为接种后的病害症状图，B为稻瘟病病斑长度统计图，C为病斑真菌孢子量统计图。
图8：过表达Pi-Pprs42基因的转基因水稻株系分蘖期接种稻瘟病菌HN2抗性鉴定结果图：图中 A为接种后的病害症状图，B为稻瘟病病斑长度统计图，C为病斑真菌孢子量统计图。
图9：过表达Pi-Pprs42基因的转基因水稻株系分蘖期接种稻瘟病菌GUY11抗性鉴定结果图：图中 A为接种后的病害症状图，B为稻瘟病病斑长度统计图，C为病斑真菌孢子量统计图。
图10：过表达Pi-Pprs42基因的转基因水稻株系分蘖期接种稻瘟病菌LP11抗性鉴定结果图：图中 A为接种后的病害症状图，B为稻瘟病病斑长度统计图，C为病斑真菌孢子量统计图。
图11：对照TP309及过表达Pi-Pprs42的转基因水稻株系幼苗受稻瘟病菌侵染后叶片中细胞中活性氧积累检测结果图：图中A、B、C为DAB染色情况图，D为相对H2O2含量统计图，E为OsRbohA基因表达水平检测结果图。
图12：对照TP309及过表达Pi-Pprs42的转基因水稻株系幼苗受稻瘟病菌侵染后OsPR1a、OsPBZ1、OsNPR1 和 OsCOI1b的表达水平检测结果图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
过表达Pi-Pprs42基因载体构建，步骤包括：
1、使用 MiniBEST 植物RNA提取试剂盒（TaKaRa，大连，中国）根据试剂盒说明书从子预44四叶期水稻幼苗的叶子中提取总RNA。使用 NanoDrop 2000 紫外可见分光光度计（Thermo Fisher Scientifc，沃尔瑟姆，马萨诸塞州，美国）测定RNA浓度和质量，并通过2%琼脂糖凝胶电泳检查完整性分布。
2、将RNA通过逆转录PCR转录为cDNA。
3、使用扩增引物Pi-Pprs42-F/R通过PCR技术扩增出带有酶切位点的Pi-Pprs42基因的CDS序列（SEQ ID No.1所示，编码的氨基酸系列如SEQ ID No.2）。
4、用1%琼脂糖凝胶电泳，120V电压，23分钟，将2883bp的电泳片段在紫外灯下切取出来，放在一个体系中进行溶胶回收，回收程序见具体厂家的试剂盒说明书，用总体积30μL的水溶解回收DNA。
5、采用T4连接法构建载体。
用于构建Pi-Pprs42过表达载体的质粒为pCAMBIA1300，含有两个35S强启动子，一个用于启动目的基因，另一个用于启动潮霉素基因（用于阳性转基因植物的筛选和鉴定）。该载体还含有抗卡那霉素（kan）基因，用于在载体构建过程中筛选阳性细菌克隆。
6、将pCAMBIA1300质粒转入大肠杆菌（DH5a）（见大肠菌感受态转化标准方法)中37℃，200rpm培养过夜，次日提质粒。然后用限制性内切酶KpnI对质粒pCAMBIA1300进行酶切。
7、将目的基因与质粒进行重组。将连接产物加入大肠杆菌（DH5a）中37℃培养过夜。挑单克隆于含有kan抗性的LB液体培养基置于恒温摇床上（37℃ 200rpm/h）12h后用特异性引物（Pi-Pprs42-F/R）进行菌斑PCR鉴定，将测序正确的阳性菌落进行质粒小提得到纯化的质粒。
8、然后将质粒转至根癌农杆菌EHA105中，然后置于Kan+潮霉素抗生素平板上，置于28℃中倒置过夜培养。次日挑单菌落进行PCR菌落鉴定。
9、水稻愈伤组织诱导
（1）75%酒精洗种子10s，然后用无菌水洗三次。
（2）加入1.5%的次氯酸钠浸泡种子，在超净工作台中震荡摇晃10min，倒掉次氯酸钠，然后用无菌水冲洗至无异味。
（3）用灭菌滤纸将种子表面的液体吸干。用灭菌镊子将吹干的种子均匀地摆放在N6培养基上。用封口膜将平板封好，放入30℃培养箱，暗培养7～10d，至长出嫩黄色的愈伤组织。
10、侵染和共培养
（1）将带转化载体的农杆菌菌株在LB（加了Kan和Rif 抗生素）平板上划线，放28℃培养箱中活化。
（2）挑取单菌落于2mL液体LB（加了Kan和Rif抗生素），28℃，200 rpm摇过夜，次日吸取1mL 菌液至50 mL TY 培养基，28℃，200rpm摇1h后测浓度，调OD600值至0.05～0.1。
（3）在超净工作台中，将提前剥下来的水稻愈伤组织浸泡在菌液中，轻轻摇晃25min（避免污染）。
（4）用灭菌滤纸将愈伤组织表面的菌液吸干，在超净台中吹30min至愈伤组织表面干燥。
（5）将干燥的愈伤组织转移到共培养培养基上，22℃暗培养3天。
11、筛选、分化和生根培养
（1）从共培养培养基上将愈伤组织用灭菌镊子摆放到筛选培养基上，30℃光照培养一个月左右，期间每10天更换一次筛选培养基。
（2）把经筛选存活的愈伤组织转移至初分化培养基，间距要宽松，30℃光照培养约14天。
（3）将经过初分化的愈伤组织转移至再分化培养基，至愈伤组织分化出绿芽。
（4）待绿芽长健壮，将整个组织转移至生根培养基。
12、待生根培养基中的组织长出健壮的根，并且叶长到约10cm 时（此时已成为小苗），将小苗从培养基中 取出，洗去根部的培养基，泡到自来水中3～5d，之后仍健康成活的小苗移栽至土壤中。
实施例2
抗病水稻子预44（ZY44）和感病水稻江南香糯（JNXN）接种稻瘟菌LP11后0、3、12 和24 小时Pi-Pprs42基因的表达水平。
为了明确Pi-Pprs42在抗感材料间的表达模式，对抗病水稻子预44（ZY44）和感病水稻江南香糯（JNXN）三叶一心期幼苗接种稻瘟病菌LP11分生孢子悬浮液（浓度为1.5×105个/mL），分别取接种后0，3，12，24 h的叶片提取RNA，利用qRT-PCR方法检测两个材料中，不同时间点Pi-Pprs42的表达。Pi-Pprs42在抗病水稻ZY44和感病水稻JNXN中的表达模式相似，3hpi显著上调表达，12hpi表达水平最高，24hpi显著下调表达，但其在抗病水稻ZY44中受稻瘟菌诱导表达的水平显著高于感病水稻JNXN（图2）。表明Pi-Pprs42在水稻-稻瘟菌互作早期发挥重要作用。
实施例3
过表达Pi-Pprs42基因的阳性水稻株系鉴定。
首先利用使用潮霉素浸泡法对转基因植株进行初步鉴定。具体方法：1L潮霉素浸泡液中加650 μL 浓度为 50 mg/mL 的潮霉素溶液，加1 mL 1mg/mL的6-BA母液，调pH至7。在待检测的水稻叶片背面标注序号，剪取含序号的2cm长的水稻叶片（另一个相同的序号留在植株上），放到潮霉素浸泡液中，置于人工气候室中3～5天，观察叶片切口处是否有棕褐色印记，若有，说明为阴性植株，若整片叶子为绿色即为阳性植株。
对上述鉴定出的阳性转基因植株进一步用潮霉素特异引物Pprs42-PI进行PCR鉴定。
Pprs42-PI-F: 5¢- TCCTTCGCAAGACCCTTCCTC-3¢
Pprs42-PI-R: 5¢- TACGCCGCTCGTTTATCTCCTG-3¢。
具体方法：用CTAB法提取转基因水稻的DNA，扩增潮霉素基因来鉴定转化苗是否为阳性。最终鉴定出8株阳性T0代转基因植株（图3）。随后使用特异引物Pprs42-RT-F/R对T1代转基因植株的Pi-Pprs42的表达量进行检测（图4）。
Pprs42-RT-F: 5¢-TCAACAGCTGTTGCTTCTGCAGG-3¢
Pprs42-RT-R: 5¢-TCCTTGGGAGCACGGTAAATGC-3¢。
使用特异引物Pprs42-PI-F/R对表达量分别高于对照16.6倍和9.0倍的OX-Pprs42#14和OX-Pprs42#16株系的T1代植株进行了阳性鉴定，分别获得8株（图5A）和15株阳性T1代转基因植株（图5B）。
实施例4
过表达Pi-Pprs42基因的转基因水稻系苗期抗性鉴定。
以非转基因的TP309为对照，对T1代阳性转基因植株三叶一心期幼苗喷雾接种稻瘟病菌LP11分生孢子悬浮液（1.5×105个/mL），7 d后调查发病情况。结果表明，过表达Pi-Pprs42的转基因 T1株系#14和#16稻瘟病抗性显著增强（图6A），其发病等级分别比对照降低了2.2和1.6个级别（图6B）。
实施例5
过表达Pi-Pprs42基因的转基因水稻系分蘖期抗性鉴定。
为了进一步观察Pi-Pprs4对分蘖期水稻的抗性贡献，对分蘖期T1代阳性转基因植株离体接种稻瘟病菌A7203-8（图7）、HN2（图8）、GUY11（图9）和LP11（图10）分生孢子悬浮液（1.0×105个/mL），5～7 d进行抗性鉴定，9 d后对叶片伤口处进行真菌孢子量检测。结果表明，与对照相比，OX-Pprs42转基因植株发病较轻，接种不同稻瘟病菌后OX- Pprs42转基因植株平均病斑长度均显著减小（图7B、8B、9B、10B）。孢子量检测结果表明，与对照相比， OX-Pprs42转基因植株病斑上的真菌孢子量显著减少（图7C、8C、9C、10C），与抗性鉴定结果一致（图7A、8A、9A、10A），表明过表达Pi-Pprs4增强了分蘖期水稻对多个稻瘟病菌株的抗性。综上所述，表明Pi-Pprs4赋予了水稻广谱稻瘟病抗性。
实施例6
Pi-Pprs4过表达转基因苗期水稻叶片中活性氧对稻瘟病菌侵染的响应情况
对接种稻瘟病菌48 h后的三叶一心期水稻叶片进行DAB（3,3’Diaminobenzidine-HCl）染色，检测H2O2爆发情况。结果表明，受稻瘟病菌侵染48 h后，与对照TP309相比（图11A），在Pi-Pprs4过表达转基因植株中棕色面积更大（图11B、C），H2O2的积累显著增加，#14和#16株系分别增加了1.75和1.13倍（图11D）。48 hpi活性氧合成相关基因OSRbohA表达量在OX- Pprs42水稻株系中显著高于TP309（图11E）。表明H2O2的爆发增强是Pi-Pprs4增强水稻植株稻瘟病抗性的途径之一。
实施例7
对照TP309及过表达Pi-Pprs42的转基因水稻株系幼苗受稻瘟病菌侵染后OsPR1a、OsPBZ1、OsNPR1 和 OsCOI1b的表达水平检测
接种稻瘟病菌LP11分生孢子悬浮液（1.0×105个/mL）后0 h及24 h，分别检测了TP309和OX-Pprs42#14中OsPR1a、 OsPBZ1、 OsCOI1b和 OsNPR1的表达情况。结果表明，接菌后OsPR1a（图12A）、 OsPBZ1（图12B）、OsNPR1（图12C）和 OsCOI1b（图12D）均被诱导表达，且24 hpi 在OX- Pprs42植株中表达量显著高于TP309。表明Pi-Pprs42过表达增强了防御相关基因表达，并通过SA和JA信号途径增强水稻植株的稻瘟病抗性。
最后所应说明的是：以上实施例仅用以说明而非限制本发明的技术方案，尽管参照上述实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应该理解：依然可以对本发明进行修改或者等同替换，而不脱离本发明的精神和范围的任何修改或局部替换，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
Claims (2)
1.Pi-Pprs42基因在提高水稻抗稻瘟病中的应用，其特征在于，应用步骤包括：
（1）从野生型水稻子预44中提取总RNA，然后反转录为cDNA；
（2）用PCR技术扩增出目的基因Pi-Pprs42，用于扩增所述目的基因Pi-Pprs42的引物序列为Pi-Pprs42-F和Pi-Pprs42-R：
Pi-Pprs42-F: 5'-ATTCGAGCTCGGTAATGTCGACGATGGTGGTGAG-3'
Pi-Pprs42-R:5'-AGGATCCCCGGGTACTACTTACATGCAACTGTTT-3'；
（3）将基因Pi-Pprs42片段连接到表达载体上，得到过量表达Pi-Pprs42目的基因的质粒pCAMBIA1300- Pi-Pprs42；
（4）将质粒pCAMBIA1300- Pi-Pprs42导入农杆菌；
（5）含有质粒pCAMBIA1300- Pi-Pprs42的农杆菌与水稻株共培养即可得到抗病性正相关的水稻株系。
2.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述Pi-Pprs42基因在水稻选育中的应用。
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