JP2002524044A

JP2002524044A - 植物病耐性シグナル伝達遺伝子：それに関する材料及び方法

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Publication number: JP2002524044A
Application number: JP2000563785A
Authority: JP
Inventors: マリアヨーゼフシュルツェ−レフェレト，パウル; シラス，ケン; ラーイエ，トーマス
Original assignee: プラントバイオサイエンスリミティド
Priority date: 1998-08-06
Filing date: 1999-08-06
Publication date: 2002-08-06
Also published as: WO2000008160A2; CN1322248A; AU760571B2; EP1102849A2; AU5428899A; CA2337861A1; GB9817169D0; WO2000008160A3

Abstract

(57)【要約】オオムギ、イネ、アラビドプシス（Arabidopsis）からの植物疾患耐性シグナル伝達遺伝子Rar1、および多の種からの同族体。核酸およびコードされるポリペプチドは、植物のシグナル伝達経路を調節するのに有用であり、R遺伝子産物と病原体Avrタンパク質との相互作用により植物病原体防御応答および／または死滅、または病原体耐性が得られる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】本発明は、植物の病気耐性シグナル伝達遺伝子、それに関係する物質および方
法に関する。特に、本発明は、オオムギのRar1遺伝子および他の種からのその相
同体に関する。

【０００２】病原体に対する植物の耐性は、1連の防御に関係する応答、例えば、抗菌化合
物の産生、病原関係（PR）遺伝子の活性化、植物細胞壁の架橋、および反応性酸
素種の産生、の誘導に関連することが知られている（DixonおよびLamb 1990；H
ammond−KosackおよびJones 1996）。ほとんどの場合において、耐性は試みら
れた感染部位における宿主細胞死の応答、過敏性応答（HR）と呼ばれる、に関係
付けられる。しかしながら、生化学的および生理学的技術を使用して侵入因子の
成長を阻止することにおいて、特定の応答の意味を示すことは困難であることが
証明された。

【０００３】対照的に、遺伝的研究において、対応する非病原性決定因子を担持する微生物
病原体に対する応答において主要な役割を演ずる遺伝子座、R遺伝子、が定めら
れた（Flor、1971）。したがって、これらの耐性遺伝子産物およびそれらの有意
な経路の知識は、植物の防御メカニズムに対するより深い洞察を促進する。近年
、多数のR遺伝子が単離されてきている（Martin他，1993；Bent他，1994；Jones
他，1994；Mindrinos他，1994；Grant他，1995；Lawrence他，1995；Song他，19
95；Anderson他，1997；Cai他，1997；Ori他，1997；Yoshimura他，1998）。

【０００４】植物から単離された大部分のR遺伝子は、ロイシンに富んだ反復の可変ストレ
ッチおよび推定上のヌクレオチド結合部位をコードするか、あるいはロイシンに
富んだ反復ドメインをコードするが、ヌクレオチド結合部位をコードしない、2
つのクラスに入る。第3および第4クラスの各々はこれまでただ1つの代表的なも
のを有し、ロイシンに富んだ反復およびセリン−スレオニンタンパク質キナーゼ
ドメインを有するタンパク質をコードするか、あるいはタンパク質のみをコード
する。しかしながら、R遺伝子の正確な作用およびそれらが影響を与える下流経
路はほとんど知られていない。

【０００５】植物の防御応答の複雑さは、R遺伝子を除外した他の成分が耐性反応に関係づ
けられることを示唆する。品種特異的耐性における追加の成分についての最初の
遺伝的証拠は、Rar1およびRar2（これらの2つの成分はR遺伝子M1a−12の活性化
に要求される）の同定によりオオムギ−うどんこ病（powdery）の相互作用にお
いて得られた（以前にNar−1およびNar−2と表示された；TorpおよびJorgensen
、1986；Jorgensen，1988；Freialdenhoven他，1994）。他の植物病原体の相互
作用の後の研究において、同様な観測が明らかにされ（Hammond−Kosack他，199
4；Salmeron他，1994；Century他，1995；Parker他，1996）、そしてこれらの成
分のうちの2つは最近簡単な双子葉植物モデルの種アラビドプシス・タリアナ（A
rabidopsis thaliana）において単離された（非公開PCT/GB98/01406；Century
他、1997）。

【０００６】これらのアラビドプシス（Arabidopsis）遺伝子の双方、EDS1およびEDS2、は
、異なる病原体、すなわち、細菌および菌類の病原体に対する多重遺伝子の因子
に要求される。NDR1は未知の生化学的機能を有する推定上の一体的膜タンパク質
をコードするが、EDS1は推定上の新規な植物リパーゼをコードすると予測される
。

【０００７】今日まで、染色体1H上のMla遺伝子座（Mla−6、Mla−9、Mla−12、Mla−13、M
la−14、Mla−22、およびMla−23）にコードされた、大部分の試験したうどんこ
病の品種特異的耐性特異的耐性特異性、ならびに他の遺伝子座（Mlat、Mlh、Mlk
、Mlra、およびMlg）におけるうどんこ病に対する耐性特異性をオオムギRar1中
の突然変異が抑制することは証拠により示される（Jorgensen，1996；Peterhans
el他、1997）。しかしながら、ある場合、Mla−1、Mla−7およびmlo、において
、耐性遺伝子の機能の抑制は観察されなかった（Jorgensen，1996；Peterhansel
他、1997）。

【０００８】 Rar1中の2つの化学的に誘導された対立遺伝子突然変異（rar1−1と表示する）
（突然変異M82）およびrar1−2（突然変異M100）は特性決定された（Freialdenh
oven他、1994）。これらの2つの劣性対立遺伝子の各々は、前述のうどんこ病R遺
伝子の存在下に、うどんこ病の病原体がその寿命を完結できるようにする。表皮
単細胞HR、すなわち、Mla−12特定耐性応答の特徴ある初期事象は、rar1−1また
はrar1−2の存在下に壊滅される。しかしながら、後の段階において、rar1−1ま
たはrar1−2の存在下の罹病性感染表現型は容易に識別可能である。前者の欠陥
対立遺伝子の存在に、低い気中菌糸体および低い胞子形成が観察され、そして感
染部位は壊死性宿主組織により囲まれていることが多い。

【０００９】対照的に、rar1−2の存在下の感染表現型は完全に罹病性のオオムギ遺伝子型
とめったに区別できない。本発明者らは、rar1−1対立遺伝子が残留遺伝子活性
を保持するように、これらの発見を解釈し、rar1−2がもまたそれを保持するこ
とを最近証明した。前述の遺伝的データは、Rar1が多数のうどんこ病R遺伝子により誘発されたう
どんこ病耐性のシグナル伝達において収れん点を表すという、強い証拠を提供す
る。

【００１０】 Rar1タンパク質の普通の精製を可能とする、確実な生化学的試験手順は、文献
に記載されていない。主として遺伝的および物理的距離の不都合な比のために、そして反復非コード
DNA配列の百分率が高いために、高度に複雑なオオムギゲノム（5.3×10⁹bp／一
倍体ゲノム；（BennettおよびSmith 1991））からの地図をベースとする遺伝子
単離は主要な実験的挑戦を付与するという事実にかかわらず、本発明は位置クロ
ーニングを使用してオオムギからRar1遺伝子をクローニングすることに成功した
。今日まで、オオムギ遺伝子の地図をベースとする単離のただ1つの成功例が報
告された（Beschges他、1997）。

【００１１】本発明は、Rar1遺伝子のクローニング、その相同体および突然変異対立遺伝子
に関する。種々の面において、本発明は、Rar1機能を有するポリペプチドをコードする核
酸に関する。「Rar1機能」は、植物病原体防御応答および／またはR遺伝子産物
と病原体Avrタンパク質との直接的または間接的相互作用により実現される細胞
死、好ましくは病原体耐性に導くシグナル伝達経路において機能する、Rar1遺伝
子およびそのポリペプチド発現産物を意味する。

【００１２】用語「Rar1機能」は植物においてRar1表現型を指令する配列を意味するために
使用し、用語「Rar1突然変異機能」または「rar1機能」は植物におけるRar1表現
型を抑制または無効にするRar1配列の形態を意味するために使用できる。rar1突
然変異表現型は、病原体耐性および／または植物病原体防御応答を低下または無
効にすることにより特徴づけられる。

【００１３】 Rar1機能およびrar1機能は、前述したように病原体に対する植物の防御応答お
よび／または感受性のレベルを評価することによって決定することができるか、
あるいはこの分野において知られておりかつ当業者に入手可能な他の適当な別法
により決定することができる。被験植物は単子葉植物または双子葉植物であるこ
とができる。適当な単子葉植物は、オオムギ、イネ、コムギ、トウモロコシまた
はカラスムギの任意のもの、特にオオムギを包含する。適当な双子葉植物は、ア
ラビドプシス（Arabidopsis）、タバコ、トマト、ブラシカ（Brassicas）、ジャ
ガイモおよびブドウを包含する。

【００１４】本発明によるポリヌクレオチドは、第1図に示すアミノ酸配列を包含するポリ
ペプチドをコードすることができる。コード配列は第1図の中に包含されること
が示されている配列であるか、あるいは示されている配列の突然変異、変異型、
誘導体または対立遺伝子であることができる。配列は示されている配列の1また
は2以上のヌクレオチドの1または2以上の付加、挿入、欠失および置換である変
化により示されている配列と異なることができる。

【００１５】ヌクレオチド配列に対する変化は、遺伝暗号により決定して、タンパク質レベ
ルでアミノ酸変化を生ずるか、あるいは生じないことがある。こうして、本発明
による核酸は第1図に示す配列と異なる配列を含むことができ、しかも同一アミ
ノ酸配列を有するポリペプチドをコードすることができる（すなわち、コード配
列は「縮重的に同等」であることができる）。

【００１６】本発明によるポリヌクレオチドは、第4図においてエクソンとして同定される1
または2以上の配列を含むことができる。また、機能的Rar1ポリペプチドに明らかに関係する（例えば、Rar1機能を示す
Rar1ポリペプチドと免疫学的に交差反応性であるか、あるいはRar1ポリペプチド
と共通した特徴的な配列モチーフを有する）がRar1機能をもはやもたないアミノ
酸配列を包含するポリペプチドをコードする、ヌクレオチド配列を包含する核酸
分子は本発明の範囲内に含まれる。こうして、本発明は、植物病原体防御応答ま
たは細胞死、および／または病原体耐性を促進しないRar1の突然変異を提供する
。これらの突然変異を担持する植物および植物細胞は病原体感染に対して感受性
である。

【００１７】こうして、耐性を発生させる型および耐性を低下させる型の双方のRar1突然変
異、変異型、フラグメント、誘導体、対立遺伝子および相同体は、状況に依存し
て実際的値を有することがある。作物栽培学的状況において、主要な興味深いこ
とは病原体に対する植物耐性を発生させることである。

【００１８】特に、本明細書に記載する特定のRar1配列の相同体（例えば、第3図参照）、
ならびにこのような相同体の突然変異、変異型、フラグメントおよび誘導体は本
発明により提供される（そして、このような突然変異およびその他に関する前述
の言及もまた相同体の突然変異およびその他に適用される）。このような相同体
は本明細書に記載する開示により容易に得られる。こうして、本発明は、また、
第1図または第4図から誘導されるか、または第1図または第4図に示す、ヌクレオ
チド配列を使用して得ることができるか、あるいは第1図または第4図に示すアミ
ノ酸配列を使用して得ることができる、Rar1相同体をコードする核酸配列を包含
する核酸分子に拡張される。

【００１９】 Rar1相同体はヌクレオチドレベルにおいて第1図のヌクレオチド配列と相同性
を有するか、あるいは第1図に示されているアミノ酸配列のポリペプチドと相同
性を有する、好ましくは少なくとも約50％、または少なくとも約55％、または少
なくとも約60％、または少なくとも約65％、または少なくとも約70％、または少
なくとも約75％、または少なくとも約80％、または少なくとも約90％相同性であ
るポリペプチドをコードすることができる。より好ましくは、少なくとも約95％
相同性である。（アミノ酸レベルにおける相同体の決定は下記においてさらに説
明される）。

【００２０】ある態様において、特定の配列のポリペプチドの対立遺伝子、変異型、誘導体
、突然変異誘導体、突然変異または相同体は、第1図の特定のアミノ酸配列に対
してわずかの全体の相同性を示す、すなわち、約20％、または約25％、約30％、
または約35％、約40％、または約45％の相同性を示す。しかしながら、機能的に
有意なドメインまたは領域において、アミノ酸の相同性は非常に高いことがある
。推定上の機能的に有意なドメインまたは領域は、相同体の配列の比較を包含す
る、生物情報科学のプロセスを使用して同定することができる。

【００２１】融合タンパク質としてコード核酸からの発現のために、異なるポリペプチドの
機能的に有意なドメインまたは領域を組合わせることができる。例えば、異なる
相同体の特定の有利なまたは望ましい性質をハイブリッドタンパク質において組
合わせることができ、こうして、生ずる発現産物は、Rar1またはRar1機能を有し
、種々の親タンパク質のフラグメントを含むことができる。本発明の他の面に従うフラグメントは第5A図および第5C図に示されており、コ
ードヌクレオチド配列は、それぞれ、第5B図および第5D図に示されている。

【００２２】本発明の他のドメインおよびフラグメントは第6図に示されており、コードヌ
クレオチド配列第7図に示されている。これらのドメインおよびフラグメントは
、本明細書に開示する本発明の種々の面および態様において使用することができ
る。第7図の各ヌクレオチド配列は本発明の他の面を表し、そして示すような配列
を含んでなるポリヌクレオチドは本明細書に開示する種々の面および態様におい
て使用することができる。

【００２３】 Rar1由来オリゴヌクレオチドプライマー（真性または縮重配列として）を使用
して、単子葉植物および双子葉植物、例えば、オオムギ、コムギ、トウモロコシ
、カラスムギ、イネ、トマト、メロン、ウリ科植物（cucurbitaceae）、アブラ
ナ科（Brassicaceae）、トウガラシ、レタス、ブドウ、観賞植物を包含する、多
数の異なる植物からRar1相同体を単離することができる。

【００２４】いったん対応する遺伝子がクローニングされると、それをアンチセンス構築物
として発現させて、作物栽培学的に重要な病気、例えば、下記の病気に対する耐
性におけるその重要性を評価することができる：プッシニア・ホルデイ（Puccin
ia hordei）（葉サビ病）、リンコスポロイム・セカリス（Rhynchosproium se
calis）（うれ腐れ）、ピレノフェラ・テレス（Pyrenophera teres）（ネット
・ブロッチ（net bloch））、ヘテロデラ・アベネ（Heterodera avenae）（オ
オムギ穀物シスト線虫）、ドレキスレラ・テレス（Drechslera teres）、うど
んこ病および黄色萎縮ウイルス（例えば、オオムギ黄色萎縮ウイルス）。

【００２５】相同体を得ることは下に記載するが、ここに記載するヌクレオチド配列の情報
、またはその一部分をデータベースの検索において使用して相同配列を見出すこ
とができ、その発現産物をRar1（またはrar1）機能について試験することができ
ることを簡単に指摘すべきである。これらは植物におけるRar1（またはrar1）表
現型を補足する能力を有するか、あるいは植物において発現されたとき、このよ
うな表現型を付与することができる。こうして、Rar1 cDNAまたはその一部分を
相互作用トラップアッセイ、例えば、酵母2ハイブリッド系においてベイトとし
て使用して、従来知られていない他の病気耐性シグナル伝達成分を単離すること
ができる。これらは、改良された病気耐性向かう経路の操作についての他の目標
を表す。

【００２６】相同体を配列決定し、それらの発現パターンを研究しかつそれらの発現を変更
する効果を検査することによって、Rar1に類似する機能を実行する遺伝子を得る
ことができる。もちろん、これらの配列の突然変異、変異型および対立遺伝子は
、オオムギRar1遺伝子について前述したのと同一の用語において、本発明の範囲
内に入る。しかしながら、データベース上に前もって存在する相同配列、例えば
、第3図に含まれる同定された配列は、本発明の1または2以上の面または態様か
ら排除することができるが、1または2以上の他の面に含めることができることに
注意すべきである。

【００２７】本明細書において開示する相同体間の相同性は、例えば、配列の保存に基づい
て設計されたオリゴヌクレオチド（例えば、縮重プール）またはPCRプライマー
を使用して、それ以上の相同体の同定において利用可能である。本発明の面において有用なプライマーは、「AtRar1 5'」および「AtRar1 3'
」を包含し、それらの配列は下に記載される。

【００２８】他の面によれば、本発明は、例えば、オオムギ以外の種から、Rar1相同体を同
定する方法またはクローニングする方法を提供し、この方法において、第1図ま
たは第4図に示す配列に由来するヌクレオチド配列を使用する。例えば、このよ
うな方法は、植物細胞の核酸の調製物を準備し、実質的にここにおいて示すヌク
レオチド配列または実質的にここにおいて示すヌクレオチド配列に対して相補的
なヌクレオチド配列、好ましくはコード配列（例えば、第1図に示すアミノ酸配
列をコードする配列）内からのヌクレオチド配列を有する核酸分子を準備し、前
記核酸分子を前記調製物中の前記遺伝子または相同体にハイブリダイゼーション
させる条件下に、前記調製物中の核酸を前記核酸分子と接触させ、そして存在す
る場合、前記遺伝子または相同体を、前記核酸分子とのそのハイブリダイゼーシ
ョンにより、同定することを包含することができる。

【００２９】ターゲットまたは候補の核酸は、例えば、このような核酸を含有することが知
られているか、あるいは含有することが推測される生物、単子葉植物または双子
葉植物から得ることができるゲノムDNA、cDNAまたはRNA（またはこれらの任意の
ものの混合物、好ましくはライブラリーとして）を包含することができる。実施
すべきPCRの前に、例えば、RT−PCRを使用してcDNAライブラリーをつくるか、あ
るいはゲノムライブラリーについてフェノールエマルジョンリアソシエーション
技術（Clarke他（1992）NAR 20，1289−1292）を使用することによって、核酸
ライブラリーの複雑さを減少することができる。有望なハイブリダイゼーション
を同定し、そしてターゲット／候補の核酸をそれ以上の研究および／または使用
のために単離することができる。

【００３０】 Rar1遺伝子または相同体に対する核酸分子のハイブリダイゼーションは、例え
ば、核酸増幅反応、特にポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を使用して、間接的に測
定または同定することができる。PCRにおいて、ターゲット核酸を特異的に増幅
するために2つのプライマーの使用を必要とするので、好ましくはRar1の特徴を
示す配列を有する2つの核酸分子を使用する。しかしながら、RACEを使用する場
合、ただ1つのこのようなプライマーを必要とするだけである。

【００３１】また、核酸でプロービングし、そして適当にストリンジェントな条件下に陽性
ハイブリダイゼーションを同定する（既知の技術に従い）ことによって、ハイブ
リダイゼーションを測定することができる（必要に応じて増幅技術、例えば、PC
Rと組み合わせて）。プロービングのために、好ましい条件は、さらに研究する
ことができる、陽性として同定される小さい数のハイブリダイゼーションととも
に、簡単なパターンが存在するために十分にストリンジェントである条件である
。わずかの陽性クローンが残留するまで、ハイブリダイゼーションのストリンジ
ェンシイを徐々に増加することは、この分野においてよく知られている。

【００３２】ターゲット核酸（例えば、DNA）に対するプローブの結合は、この分野におい
て知られている種々の技術により測定することができる。例えば、プローブを放
射線、蛍光または酵素で標識化することができる。プローブを標識化しない他の
方法は、制限フラグメント長さの多形性の検査、PCRを使用する増幅、RNアーゼ
切断、および対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドのプロービングを包含する。

【００３３】プロービングにおいて、標準的サザンブロッティング技術を使用することがで
きる。例えば、DNAを細胞から抽出し、異なる制限酵素で消化することができる
。次いで制限フラグメントをアガロースゲル上の電気泳動により分離した後、変
性し、ニトロセルロースフィルターに移す。標識化プローブをフィルター上でDN
Aフラグメントにハイブリダイゼーションさせ、そして結合を測定することがで
きる。逆転写酵素−PCRのような技術により、細胞からのDNA調製物からプロービ
ングのためのDNAを調製することができる。

【００３４】制限酵素で消化したDNAのサザンブロットに対して低いストリンジェント条件
下に種々のプローブをハイブリダイゼーションさせることによって、予備実験を
実行することができる。プロービングのために、好ましい条件は、さらに研究す
ることができる、陽性として同定される小さい数のハイブリダイゼーションとと
もに、簡単なパターンが存在するために十分にストリンジェントである条件であ
る。わずかの陽性クローンが残留するまで、ハイブリダイゼーションのストリン
ジェンシイを徐々に増加することは、この分野においてよく知られている。

【００３５】多数のハイブリダイゼーションするフラグメントが得られるが、バックグラウ
ンドのハイブリダイゼーションが低かったとき、適当な条件が達成されるであろ
う。これらの条件下に、発現された配列を代表する核酸ライブラリー、例えば、
cDNAライブラリーを検索することができる。当業者は、オリゴヌクレオチドの長
さおよび塩基組成、温度およびその他のような因子を考慮して、選択的ハイブリ
ダイゼーションについて所望のストリンジェンシイの適当な条件をよく使用する
ことができる。

【００３６】例えば、約37℃またはそれより高い温度、約50％より低いホルムアミド濃度、
および中〜低い塩（例えば、標準的食塩−クエン酸緩衝液（「SSC」）＝0.15Mの
塩化ナトリウム；0.15Mのクエン酸ナトリウム；pH7）濃度を含んでなる条件下に
、スクリーニングを最初に実施することができる。

【００３７】あるいは、約50℃またはそれより高い温度および高い塩（例えば、「SSPE」＝
0.180mMの塩化ナトリウム；9mMのリン酸水素二ナトリウム；9mMのリン酸二水素
ナトリウム；1mMのナトリウムEDTA；pH7.4）。好ましくはスクリーニングは、約
37℃、約20％のホルムアミド濃度、および約5×SSCの塩濃度、または約50℃の温
度および約2×SSPEの塩濃度において実施される。これらの条件において、安定
なハイブリッドの同定のために完全な相同性を必要としないで、プローブ配列と
実質的な程度の相同性（類似性、同一性）を有する配列を同定することができる
。

【００３８】適当な条件は、例えば、約80〜90％の同一性を有する配列の検出のために、42
℃における0.25MのNa₂HPO₄，pH7.2，6.5％のSDS，10％の硫酸デキストラン中の
一夜のハイブリダイゼーション、および55℃における0.1×SSC、0.1％のSDS中の
最終洗浄を包含する。約90％より高い同一性を有する配列の検出のために、適当
な条件は、65℃における0.25MのNa₂HPO₄、pH7.2、6.5％のSDS、10％の硫酸デキ
ストラン中の一夜のハイブリダイゼーション、および60℃における0.1×SSC、0.
1％のSDS中の最終洗浄を包含する。

【００３９】一般に、ハイブリダイゼーションは、Sambrook他（下記）の方法に従い、下記
の成分を含んでなるハイブリダイゼーション溶液を使用して実施することができ
る：5×SSC（ここで「SSC」＝0.15Mの塩化ナトリウム；0.15Mのクエン酸ナトリ
ウム；pH7）、5×デンハルト試薬、0.5〜1.0％のSDS、100μg/mlの変性、フラグ
メント化サケ***DNA、0.05％のピロリン酸ナトリウムおよび50％までのホルム
アミド。ハイブリダイゼーションを37〜42℃において少なくとも6時間実施する
。ハイブリダイゼーション後、フィルターを次のように洗浄する：（1）室温に
おいて2×SSCおよび1％のSDS中で5分；（2）室温において2×SSCおよび0.1％のS
DS中で15分；（3）37℃において1×SSCおよび1％のSDS中で30分〜1時間；（4）4
2〜65℃において1×SSCおよび1％のSDS中で2時間、溶液を30分毎に交換する。

【００４０】特定した配列相同性の核酸分子間のハイブリダイゼーションを達成するために
必要なストリンジェンシイ条件を計算する普通の式は次の通りである（Sanger他
、（1989））：Tm＝81.5℃＋16.6Log［Na+］＋0.41（％G＋C）−0.63（％ホルム
アミド）−600／二本鎖中の＃bp。上記式の例示として、［Na⁺］＝［0.368］および50−％ホルムアミド、42％の
GC含量および200塩基の平均プローブサイズ、Tmは57℃である。相同性が1％減少
する毎に、DNA二本鎖のTmは1〜1.5℃だけ減少する。こうして、42℃のハイブリ
ダイゼーション温度を使用して、約75％の配列同一性を有するターゲットを観測
する。このような配列は本発明の核酸配列に対して実質的に相同性であると考え
られる。

【００４１】わずかの陽性クローンのみが残留するまで、ハイブリダイゼーションのストリ
ンジェンシイを徐々に増加させることは、この分野においてよく知られている。
他の適当な条件は、例えば、約80〜90％の同一性を有する配列の検出について、
0.25MのNa₂HPO₄、pH7.2、6.5％のSDS、10％の硫酸デキストラン中の42℃におけ
る一夜のハイブリダイゼーション、および0.1×SSC、0.1％のSDS中の55℃におけ
る最終洗浄を包含する。約90％より高い同一性を有する配列の検出について、適
当な条件は、0.25MのNa₂HPO₄、pH7.2、6.5％のSDS、10％の硫酸デキストラン中
の62℃における一夜のハイブリダイゼーション、および0.1×SSC、0.1％のSDS中
の60℃における最終洗浄を包含する。

【００４２】植物核酸調製物を使用するとき特に適当であることがある別法は、5×SSPE（
最終0.9MのNaCl、0.05Mのリン酸ナトリウム、0.005MのEDTA pH7.7）の溶液、5
×デンハルト溶液、0.5％のSDS、65℃において一夜、（高いストリンジェンシイ
、高度に類似する配列）または50℃（低いストリンジェンシイ、低い類似性の配
列）である。高いストリンジェンシイについて65℃における0.2×SSC／0.1％SDS
中の洗浄、あるいは低いストリンジェンシイについて50〜60℃における1×SSC／
0.1％SDS中の洗浄。本発明は、ここにおいて同定される核酸と高いストリンジェンシイ下に選択的
にハイブリダイゼーション可能な核酸、例えば、第1図のコード配列、第4図の配
列または第5C図または第5D図の配列に拡張される。

【００４３】核酸の増幅のためのPCR技術は、米国特許第4,683,195号およびSaiki他、Scien
ce 239：487−491（1988）に記載されている。PCRは鋳型核酸の変性（二本鎖で
ある場合）、ターゲットへのプライマーのアニーリング、および重合の工程を包
含する。増幅反応において鋳型としてプロービングまたは使用する核酸は、ゲノ
ムDNA、cDNAまたはRNAであることができる。PCRを使用してゲノムDNAからの特定
の配列、特定のRNA配列、およびmRNAから転写されたcDNAを増幅することができ
る。

【００４４】 PCR技術の一般的使用についての参考文献は下記のものを包含する：Mullis他
、Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol.，51：263（1987）；Ehrlich（
編者），PCR Technology，Stockton Press，NY，1989；Ehrlich他、Science
252：1643−1650（1991）；″PCR protocols：A Guide to Methods and A
pplications″，編者：Innis他，Academic Press，New York（1990）。

【００４５】 PCR生成物が病原体に対する植物耐性を変更できる遺伝子に対応するか否かの
評価は、論ずるように、種々の方法で実施することができ、そしてPCRバンドは
生成物の複雑な混合物を含有することがある。個々の生成物をクローニングし、
そしてこのプローブについて多形性を示す子孫において分離する、このような既
知の遺伝子に対する連鎖について各々をスクリーニングする。あるいは、クロー
ニングの前に前もって選択される遺伝子に連鎖される特定の結合を有する、変性
ポリアクリルアミドDNA配列決定遺伝子に対して、PCR生成物が多形性を表示でき
るような方法において、PCR生成物を処理することができる。

【００４６】いったん候補のPCR結合がクローニングされ、既知の耐性遺伝子に連鎖される
ことが示されると、他の特徴およびRar1／Rar1または他の関係する遺伝子に対す
る相同性について検査できるクローンを単離するために、PCR結合を使用するこ
とができる。それを引き続いて形質転換により分析して、問題の植物の病気感受
性変種の中への導入に対するその機能を評価することができる。あるいは、PCR
結合またはそれを分析することによって誘導される配列を使用して、有用な耐性
遺伝子の分離をモニターするとき、植物育種家を補助することができる。

【００４７】これらの技術は、病原体に対する植物耐性を変更できる遺伝子の同定に一般に
適用可能である。プローブまたはPCRプライマーの設計において使用するために適当な、好まし
いアミノ酸配列は、植物における防御応答のシグナル伝達に関係する遺伝子によ
りコードされる少なくとも2つのRar1ペプチドまたはポリペプチドの間に保存さ
れた（完全に、実質的にまたは部分的に）配列である。保存された配列は、ここ
に、例えば、第3図に、記載される情報を使用して同定することが可能である。

【００４８】アミノ酸配列の情報またはヌクレオチド配列の情報に基づいて、オリゴヌクレ
オチドのプローブまたはプライマーを設計することができる（アミノ酸配列の情
報から研究するとき、遺伝暗号の縮重および適当ならば、生物のコドン使用を考
慮する）。

【００４９】前記核酸分子がそれに対してハイブリダイゼーションすると同定された遺伝子
またはそのフラグメントは、増幅されたPCR生成物であることができ、単離およ
び／または精製し、引き続いて病原体に対する植物耐性を変更する能力について
研究することができる。同定された核酸が遺伝子のフラグメントである場合、フ
ラグメントを全長の遺伝子の引き続くクローニングにおいて使用することができ
（例えば、プロービングおよび／またはPCRにより）、ここで遺伝子は全長のコ
ード配列であることができる。

【００５０】インサートを部分的cDNAクローンから調製し、cDNAライブラリーをスクリーニ
ングするために使用できる。単離された全長のクローンを発現ベクターの中にサ
ブクローニングし、そして適当な宿主細胞の中に導入することによって活性をア
ッセイしおよび／または配列決定することができる。1または2以上の遺伝子フラ
グメントを結合して全長のコード配列を発生させることが必要であることがある
。

【００５１】感染に対する植物耐性を変更する能力を有する遺伝子を操作することが見出さ
れた分子をそれ自体使用することができる、すなわち、病原体に対する植物耐性
を変更するために使用することができる。本発明の種々の面において、ここに開
示する方法を使用して得られた核酸および得ることができる核酸が提供される。

【００５２】本発明は、また、ここにおいて提供されるRar1ヌクレオチド配列またはここに
おける開示および示唆に従い得ることができるRar1ヌクレオチド配列をベースと
するオリゴヌクレオチドを提供する。オリゴヌクレオチドは増幅反応においてプ
ライマーとして使用するために適当な長さを有することができるか、あるいはハ
イブリダイゼーションフィッシングプローブとして使用するために適当であるこ
とがある。好ましくは、本発明による、例えば、核酸増幅において使用するため
の、オリゴヌクレオチドは、約10またはそれより少ないコドン（例えば、6、7ま
たは8）を有する、すなわち、約30またはそれより少ない（例えば、18、21また
は24）ヌクレオチド長さである。プローブまたはプライマーは約20〜30ヌクレオ
チド長さであることができる。

【００５３】本発明による核酸分子およびベクターは、それらの自然環境から単離および／
または精製されたの形態で、実質的に純粋なまたは均質な状態で、あるいは問題
の種または関係する配列以外の起源の核酸および／または遺伝子を含有しないか
、あるいは実質的にを含有しない状態で提供することができる。本発明による核
酸は、cDNA、RNA、ゲノムDNAを包含し、完全にまたは部分的に合成であることが
できる。用語「単離物」は、本明細書において使用するとき、任意のこれらの可
能性を包含することができる。

【００５４】ここにおいて提供されるか、あるいはここにおける開示を使用して得ることが
できる核酸は、コードされたアミノ酸配列を変更するか、あるいは変更しないで
（遺伝暗号の縮重により）ヌクレオチドの1または2以上の付加、挿入、欠失また
は置換による変更の主題であることができる。ここにおいて提供されるか、ある
いはここにおける開示を使用して得ることができるRar1ヌクレオチド配列のこの
ような変更された形態は、標準的技術に従いRar1およびRar1機能の両方について
、容易にかつ日常的に試験することができる。このような技術は、基本的には、
突然変異、誘導体または変異型を担持する植物または植物細胞を適当な病原体に
対する変更された防御応答について検査する。

【００５５】核酸分子は、例えば、アグロバクテリウム（Agrobacterium）とともに使用す
るために適当な、組換え、好ましくは複製可能なベクター、例えば、プラスミド
、コスミド、ファージまたはバイナリーベクターの形態であることができる。核
酸は宿主細胞、例えば、微生物、例えば、細菌、または植物細胞における発現の
ために適当なプロモーターおよび調節因子の制御下にあることができる。ゲノム
DNAの場合において、これはそれ自身のプロモーターおよび調節因子を含有する
ことができ、そしてcDNAの場合において、これは宿主細胞における発現のために
適当なプロモーターおよび調節因子の制御下にあることができる。

【００５６】こうして、第1図のヌクレオチド配列（例えば）を、オオムギRar1遺伝子のプ
ロモーター以外のプロモーターの制御下に配置することができる。同様に、他の
種からのRar1相同体配列を自然に関連するプロモーター以外のプロモーターに作
用可能に連鎖することができる。しかしながら、本発明による核酸を包含するベ
クターは、特にゲノムの中への組換えのために細胞の中に核酸を導入するために
ベクターを使用する場合、プロモーターを含むことは不必要である。

【００５７】本発明により提供される核酸は、誘導可能な遺伝子プロモーターの制御下に配
置することができ、こうして発現をユーザーの制御下に配置することができる。それ以上の面において、本発明は、本発明により提供されるヌクレオチド配列
に作用可能に連鎖された誘導可能なプロモーターを包含する遺伝子構築物を提供
する。論ずるように、これは遺伝子の発現のコントロールを可能とする。本発明は、また、遺伝子構築物で形質転換された植物、およびこのような構築
物を植物細胞の中に導入することおよび／または、例えば、適当な刺激因子、例
えば、有効な内因性インデューサーの適用により、植物細胞内の構築物の発現を
誘導することを包含する方法を提供する。

【００５８】用語「誘導可能な」は、プロモーターに適用するとき、当業者によりよく理解
されている。本質的に、誘導可能なプロモーターの制御下の発現は、適用された
刺激因子（これは細胞内で発生させるか、あるいは外因的に提供することができ
る）に応答して「スイッチオン」または増加される。刺激因子の特質はプロモー
ター間で変化する。いくつかの誘導可能なプロモーターは、適当な刺激因子の非
存在下にわずかのまたは検出不可能なレベルの発現を引き起こす（または発現を
引き起こさない）。他の誘導可能なプロモーターは、刺激因子の非存在下に検出
可能な構成的発現を引き起こす。

【００５９】どんなレベルの発現が刺激因子の非存在下にあっても、任意の誘導可能なプロ
モーターからの発現は正しい刺激因子の存在下に増加される。好ましい状況は、
発現レベルが刺激因子に適用時に表現型の特性を変更するために有効な量だけ増
加場合である。こうして刺激因子非存在下に基本的レベルの発現を引き起こす誘
導可能な（または「スイッチ可能な」）プロモーターを使用することができ、そ
のレベルは所望の表現型を発生させるためには低過ぎる（そして事実ゼロである
ことができる）。刺激因子を適用すると、発現を所望の表現型を発生させるレベ
ルに増加（またはスイッチオン）させる。誘導可能なプロモーターの1例は、Cad
dick他，（1998）Nature Biotechnology 16：177−180に開示されている、エ
タノール誘導可能な遺伝子のスイッチである。多数の他の例は当業者に知られて
いる。

【００６０】他の適当なプロモーターは下記のプロモーターを包含することができる：カリ
フラワーモザイクウイルス35S（CaMV 35S）遺伝子のプロモーター、これは事実
上すべての植物組織中の高いレベルで発現される（Benfey他，（1990）EMBO J.
9：1677−1684）；カリフラワーmeri 5プロモーター、これは生長する先端分
裂組織ならびに植物体中のいくつかのよく局在化された位置、例えば、内側師管
部、花原基、根およびシュートにおける分岐点において発現される（Medford，J
.I.（1992）Plant Cell 4：1029−1039；Medford他，（1991）Plant Cell 3
：359−370）およびアラビドプシス・タリアナ（Arabidopsis thaliana）LEAFY
プロモーター、これは花発生において非常に初期に発現される（Weigel他、（19
92）Cell 69：843−859）。

【００６１】当業者は、十分に組換え遺伝子の発現のためのベクターを構築しかつプロトコ
ールを設計することができる。適当な調節配列、例えば、プロモーター配列、タ
ーミネーターフラグメント、ポリアデニル化配列、エンハンサー配列、マーカー
遺伝子および適当ならば他の配列を含有する、適当なベクターを選択するか、あ
るいは構築することができる。それ以上の詳細については、下記の文献を参照の
こと：例えば、Molecular Cloning：A Laboratory Manual：第2版、Sambrook
他、1989、Cold Spring Harbor Laboratory Press。

【００６２】例えば、核酸構築物の製造、突然変異誘発、配列決定、細胞の中へのDNAの導
入および遺伝子の発現、およびタンパク質の分析において、核酸を操作する多数
の既知の技術およびプロトコールは、下記の文献に詳細に記載されている：Curr
ent Protocols in Molecular Biology、第2版、Ausubel他、編、John Wile
y & Sons、1992。Sambrook他およびAusubel他の開示は、引用することによっ
て本明細書の一部とされる。

【００６３】植物について広く首尾よく従来使用されている特定の手順およびベクターは、
下記の文献に記載されている：Bevan、Nucl. Acids Res. 12：8711−8721（1
984）およびGuerineauおよびMullineaux（1993）Plant transformation and
expression vectors。In：Plant Molecular Biology Labfax（Croy RRD e
d）Oxford，BIOS Scientific Publishers、pp.121−148。

【００６４】選択可能な遺伝的マーカーを使用することができる。このようなマーカーは、
選択可能な表現型、例えば、抗生物質、例えば、カナマイシン、ヒグロマイシン
、ホスフィノトリシン、クロルスルフロン、メトトレキセート、ゲンタマイシン
、スペクチノマイシン、イミダゾリノンおよびグリホセートに対する耐性を付与
するキメラ遺伝子から成る。

【００６５】選択した遺伝子構築物を細胞の中に導入するとき、当業者によく知られている
ある種の考察を考慮しなくてはならない。転写を推進する、有効な調節因子を含
有する構築物内で、挿入すべき核酸を組立てるべきである。構築物を細胞の中に
輸送する方法は入手可能である。いったん構築が細胞膜内に配置されると、内因
性染色体材料の中への組込みは起こるか、あるいは起こらないであろう。最後に
、植物に関するかぎり、ターゲット細胞の型は全植物の中に細胞を再生できるよ
うなものでなくてはならない。

【００６６】配列を含有するDNAセグメントで形質転換された植物は、植物の遺伝的操作に
ついて既に知られている標準的技術により産生することができる。任意の適当な
技術、例えば、下記の技術を使用して、DNAを植物細胞の中に形質転換すること
ができる：その自然の遺伝子転移能力を利用するアグロバクテリウム（Agrobact
erium）が担持するジスアームド（disarmed）Ti−プラスミドベクター（EP-A-27
0355、EP−A−0116718、NAR 12（22）8711−87215 1984）、粒子または微小発
射体衝撃（US 5100792、EP−A−444882、EP−A−434616）、

【００６７】マイクロインジェクション（WO 92／09696、WO 94／00583、EP 331083、EP
175966、Green他（1987）Plant Tissue and Cell Culture、Academic Pr
ess）、エレクトロポレーション（EP 290395、WO 8706614）、直接的DNA吸収
の他の形態（DE 4005152、WO 9012096、US 4684611）、リポソーム仲介DNA吸
収（例えば、Freeman他，Plant Cell Physiol. 29：1353（1984）、または渦
形成方法（例えば、Kindle，PNAS U.S.A. 87：1228（1990d）。植物細胞の形
質転換の物理的方法は、Oard，1991，Biotech. Adv. 9：1−11。

【００６８】こうして、いったん遺伝子が同定されると、この分野においてよく知られてい
る技術を使用して、その遺伝子を植物細胞の中に再導入して、適当な表現型のト
ランスジェニック植物を産生することができる。この分野において双子葉植物種を形質転換するために、アグロバクテリウム（
Agrobacterium）の形質転換が広く使用されている。ほとんどすべての経済的に
関係する単子葉植物における安定な、棯性トランスジェニック植物の産生は、ま
た、日常的である：

【００６９】（Toriyama他（1998）Bio／Technology 6：1072−1074；Zhang他（1988）Pla
nt Cell Rep. 7：379−384；Zhang他（1988）Theor. Appl. Genet.76：835
−840；Shimamoto他（1989）Nature 338：274−276；Datta他（1990）Bio／Tec
hnology 8：736−740；Christou他（1991）Bio／Technology 9：957−962；Pe
ng他（1991）International Rice Research Institute、Manila、Philippine
s 563−574；Cao他（1992）Plant Cell Rep. 11：585−591；Li他（1993）P
lant Cell Rep. 12：250−255；Rathore他（1993）Plant Molecular Biology
21：871−884；

【００７０】 Fromm他（1990）Bio／Technology 8：833−839；Gordon−Kamm他（1990）Pla
nt Cell 2：603−618；D'Halluin他（1992）Plant Cell 4：1495−1505；Wa
lters他（1992）Plant Molecular Biology 18：189−200；Koziel他（1993）Bi
otechnology 11：194−200；Vasil、I.K.（1994）Plant Molecular Biology 2
5：925−937；Weeks他（1993）Plant Physiology 102：1077−1084；Somers他
（1992）Bio／Technology 10：1589−1594；WO 92／14828）。特に、アグロバ
クテリウム（Agrobacterium）仲介形質転換は、単子葉植物において、現在高度
に効率よい別の形質転換法である（Hiei他（1994）The Plant Journal 6：27
1−282）。

【００７１】棯性トランスジェニック植物の発生は、穀物、イネ、トウモロコシ、コムギ、
カラスムギ、およびオオムギにおいて達成された（下記の文献において概観され
ている：Shimamoto、K.（1994）Current Opinion in Biotechnology 5，158
−162；Vasil他（1992）Bio／Technology 10：667−674；Vain他，1995，Biote
chnology Advances 13（4）：653−671；Vasil，1996，Nature Biotechnolog
y 14 p.702）。WanおよびLemaux（1994）Plant Physiol. 104：37−48は、
多数の独立に形質転換された棯性オオムギ植物を発生する技術を記載している。

【００７２】アグロバクテリウム（Agrobacterium）が不十分または無効である場合、微小
発射体衝撃、エレクトロポレーションおよび直接的DNA吸収は好ましい。あるい
は、異なる技術の組合わせを使用して、形質転換プロセス、例えば、創傷を誘導
するアグロバクテリウム（Agrobacterium）被覆微小粒子を使用する衝撃（EP−A
−486234）または微小発射体衝撃の効率を増強し、次いでアグロバクテリウム（
Agrobacterium）と同時培養（EP−A−486233）することができる。

【００７３】形質転換後、この分野において標準であるように、植物を、例えば、単細胞、
カルス組織または葉ディスクから再生することができる。植物の細胞、組織およ
び器官から、ほとんど任意の植物を完全に再生することができる。利用可能な技
術は下記の文献において概観されている：Vasil他，Cell Culture and Somat
ic Cell Genetics of Plants，Vol. I、IIおよびIII、Laboratory Proced
ures and Their Applications，Academic Press，1984、およびWeissbachお
よびWeissbach，Methods for Plant Molecular Biology，Academic Press
、1989。

【００７４】形質転換技術の特定の選択は、ある植物種を形質転換するその効率ならびに選
択した特定の方法により本発明を実施する人の経験および好みにより、決定され
るであろう。植物細胞の中に核酸を導入する形質転換系の特定の選択、ならびに
植物再生のための技術の選択は、本発明に対して本質的ではないか、あるいは本
発明の限定ではないことは当業者にとって明らかであろう。さらに、本発明は、前述のベクターで形質転換された宿主細胞、特に植物また
は微生物の細胞を包含する。こうして、ここにおいて示した核酸配列を含む宿主
細胞、例えば、植物細胞が提供される。細胞において、ヌクレオチド配列を染色
体内に組込むことができる。

【００７５】また、本発明によれば、発現をコントロールする調節配列の操作的制御下に本
発明により提供される、ヌクレオチド配列、特に異種ヌクレオチド配列をそのゲ
ノムの中に組込んで有する植物細胞が提供される。コード配列を1または2以上の
調節配列に作用可能に連鎖することができる。調節配列は遺伝子に対して異種ま
たは外来であることができ、例えば、その発現のために遺伝子と自然にアソシエ
ートしないことができる。本発明によるヌクレオチド配列を外部的に誘導可能な
遺伝子プロモーターの制御下に配置して、ユーザーの制御下に発現を配置するこ
とができる。

【００７６】本発明の他の面は、このような植物細胞を産生する方法を提供する。この方法
は、ヌクレオチド配列またはヌクレオチド配列を含む適当なベクターを植物細胞
の中に導入し、ベクターと植物細胞ゲノムとの間の組換えを引き起こすか、ある
いは可能としてヌクレオチド配列をゲノムの中に導入することを包含する。本発
明は、祖先細胞の中にヌクレオチド配列を導入した結果、本発明によるヌクレオ
チド配列を含有する植物細胞に拡張される。

【００７７】用語「異種」（heterologous）は、遺伝子操作を使用して、すなわち、ヒトの
関与により、問題の遺伝子／ヌクレオチド配列が前記植物細胞またはその祖先の
中に導入されていることを示すために使用される。トランスジェニック植物細胞
、すなわち、問題のヌクレオチド配列に対してトランスジェニックである植物細
胞を提供することができる。トランスジーンは余分のゲノムベクター上に存在さ
せるか、あるいは、好ましくは安定に、ゲノムの中に組込むことができる。異種
遺伝子は内因性同等の遺伝子、すなわち、通常同一または類似する機能を実行す
る遺伝子と置換するか、あるいは挿入された配列は内因性遺伝子または他の配列
に対して追加的であることができる。

【００７８】異種遺伝子導入の利点は、選択したプライマーの制御下に配列の発現を配置し
て、好みに従い発現に影響を及ぼすことができることである。さらに、例えば、
野生型よりも高いか、あるいは低い活性を有する、野生型の突然変異、変異型お
よび誘導体を内因性遺伝子の代わりに使用することができる。植物細胞に対して
異種、または外因的または外来のヌクレオチド配列は、その型、変種または種の
細胞の中に天然に存在しないものであることができる。こうして、ヌクレオチド
配列は、植物の異なる型のまたは種または変種の関係内に配置された、植物細胞
の特定の型または植物の種または変種の、またはそれらに由来する、コード配列
を含むことができる。

【００７９】 1つのそれ以上の可能性は、ヌクレオチド配列または相同体が天然に見出され
る細胞内に、ヌクレオチド配列をヌ配置する可能性であり、しかしながら、ここ
でヌクレオチド配列は、植物の細胞、またはその型の複数の細胞または種または
変種内に天然に存在しない核酸に連鎖されているおよび／またはその核酸に隣接
して存在する、例えば、発現のコントロールのための1または2以上の調節配列、
例えば、プロモーター配列に作用可能に連鎖されている。植物または他の宿主細
胞内の配列は同定可能に異種、外因性または外来であることができる。

【００８０】本発明による植物細胞を包含する植物が、また、それらの任意の部分または珠
芽、種子、自殖または雑種の後代または子孫と一緒に提供される。特に、前述し
たように同定された遺伝子を担持するように操作された、トランスジェニック作
物植物が提供される。適当な植物の例は、タバコ、ウリ、ニンジン、野菜アブラ
ナ属、トウガラシ、ブドウ、レタス、イチゴ、アマズナ、テンサイ、コムギ、オ
オムギ、トウモロコシ，イネ、大豆、エンドウ、モロコシ、ヒマワリ、トマト、
ジャガイモ、コショウ、キク、カーネイション、ポプラ、ユーカリおよびマツを
包含する。

【００８１】本発明による植物は、1または2以上の性質において真に繁殖しない植物である
ことができる。植物の変種、特に植物育種家の権利（Plant Breeders' Rights
）に従い登録可能な植物変種を排除することができる。植物はその細胞またはそ
の祖先の中に導入されたトランスジーンをそのゲノム内に安定に含有するので、
植物は単に「植物変種」と必ずしも考えられないことが認められる。

【００８２】植物に加えて、本発明は、このような植物、種子、自殖または雑種の後代また
は子孫のクローン、およびこれらのいずれかの任意の部分、例えば、挿し穗、種
子を提供する。本発明は、任意の植物の珠芽、すなわち、有性または無性の、生
殖または増殖において使用できる任意の部分、例えば、挿木、種子およびその他
を提供する。また、このような植物の有性的または無性的に増殖した子孫、クロ
ーンまたは後代である植物、または前記植物の任意の部分または珠芽、子孫、ク
ローンまたは後代は本発明の範囲内に入る。

【００８３】本発明は、また、ここにおいて開示するまたはここにおける情報および示唆に
従い得ることができる、本発明による核酸分子のペプチド発現産物を包含する。
また、適当な宿主細胞、例えば、大腸菌（E. coli）において適当なの制御下に
、それをコードするヌクレオチド配列からの発現により、このような発現産物を
製造する方法が提供される。当業者は、組換え遺伝子発現の産物の発現および回
収するベクターを構築しかつプロトコールおよび系を設計することが十分に可能
である。

【００８４】好ましいポリペプチドは第1図に示すアミノ酸配列を包含する。本発明による
ペプチドは、第1図に示すポリペプチドの対立遺伝子、変異型、フラグメント、
誘導体、突然変異または相同体であることができる。対立遺伝子、変異型、フラ
グメント、誘導体、突然変異または相同体は、第1図に示すアミノ酸配列のRar1
相同体を実質的に有するか、あるいはRar1突然変異であることができる。

【００８５】また、機能的Rar1ポリペプチドに明らかに関係する（例えば、それらはRar1機
能を示すRar1ポリペプチドと免疫学的に交差反応性であるか、あるいはRar1ポリ
ペプチドと共通の特徴ある配列モチーフを有する）がRar1機能をもはやもたない
ポリペプチドは本発明に包含される。こうして、本発明は、Rar1ポリペプチドの
変異型、例えば、ここにおいて同定されたrar1−1およびrar1−2突然変異から生
ずる変異型を提供する。これらの突然変異型を担持する植物および植物細胞は、
病原体の浸入に対して感受性である。

【００８６】アミノ酸配列に関する「相同性」は、同一性または類似性、好ましくは同一性
を言及するために使用される。既に前述したように、高いレベルのアミノ酸同一
性は、機能的に有意なドメインまたは領域、例えば、ここにおいて同定されたド
メインのいずれかに制限される（例えば、第6図参照）。

【００８７】特に、ここにおいて提供される特定のRar1ポリペプチド配列の相同体、ならび
にこのような相同体の突然変異、変異型、フラグメントおよび誘導体は本発明に
より提供される。このような相同体は、ここにおいてなされる開示を使用するこ
とによって、容易に得ることができる。こうして、本発明は、また、ここにおい
て提供される配列の情報を使用して得ることができるポリペプチドに拡張される
。

【００８８】 Rar1相同体は、第1図のアミノ酸配列との相同性を有する、好ましくは少なく
とも約50％、または少なくとも約55％、または少なくとも約60％、または少なく
とも約65％、または少なくとも約70％、または少なくとも約75％、または少なく
とも約80％、または少なくとも約85％、または少なくとも約88％、または少なく
とも約90％の相同性を有する、最も好ましくは少なくとも約95％またはそれより
高い相同性を有する、アミノ酸レベルであることができる。

【００８９】ある態様において、特定の配列の対立遺伝子、変異型、誘導体、突然変異誘導
体、突然変異または相同体は、特定の配列との、わずかの全体の相同性、例えば
、約20％、または約30％、または約35％、または約40％、または約45％の相同性
を示すことができる。しかしながら、機能的に有意なドメインまたは領域におい
て、アミノ酸の相同性は非常に高いことができる。

【００９０】推定上の機能的に有意なドメインまたは領域は、相同体の配列の比較を包含す
る、生物情報科学のプロセスを使用して同定することができる。コード核酸から
融合タンパク質として発現させるために、異なるポリペプチドの機能的に有意な
ドメインまたは領域を組合わせることができる。例えば、Rar1またはRar1機能を
有する、生ずる発現産物が種々の親タンパク質のフラグメントを含むことができ
るように、異なる相同体の有利なまたは望ましい性質をハイブリッドタンパク質
において組合わせることができる。

【００９１】 Rar1ポリペプチドの個々のドメインおよびフラグメントは第6図に示されてお
り、そして前述したように、これらの、また誘導体、変異型および相同体は、本
発明の種々の面および態様において、例えば、細胞死および／または下流の耐性
応答の活性化において有用である。

【００９２】アミノ酸配列の類似性は定義した通りであり、そして下記の文献に記載されて
いるTBLASTNプログラムにより決定することができる：Altschul他（1990）J. M
ol. Biol. 215：403−10、これはこの分野において標準的使用である。特に、
TBLASTN 2.0をMatrix BLOSUM62およびGAPペナルティー：存在：11、エクステ
ンション：1とともに使用することができる。使用できる他の標準プログラムはB
estFitであり、これはWisconsin Package，バージョン8，1994年9月（Genetics
Computer Group，575 Science Drive，Madison，Wisconsin，USA，Wiscons
in 57311）の一部分である。BestFitは、2つの配列間の類似性の最良のセグメ
ントの最適な整列を作る。

【００９３】 SmithおよびWaterman（Adv. Appl. Math.（1981）2：482−489）の局所相同
性アルゴリズムを使用して、合致数を最大とするようにギャップを挿入すること
によって、最適な整列が見出される。他のアルゴリズムは合致数を増加しかつギ
ャップ数を最小にするGAPを包含し、これは2つの完全な配列を整列するためにNe
edlemanおよびWunschアルゴリズムを使用する。いずれのアルゴリズムを使用し
ても、一般にデフォルトのパラメーターを使用し、これらはGAPについてギャッ
プをつくるペナルティー＝12およびギャップのエクステンション＝4である。あ
るいは、ギャップをつくるペナルティー3およびギャップのエクステンション0.1
を使用することができる。アルゴリズムFASTA（これはPearsonおよびLipman（19
88）PNAS USA 85：2444−2448の方法を使用する）はそれ以上の別法である。

【００９４】ここにおける用語「相同性」および「相同的」の両方の使用は、例えば、2つ
の配列が適当な条件下に組換えるために十分な類似性を有することを単に必要と
する「相同的組換え」のような用語と一致して、比較する配列間の必要な進化的
関係を意味しない。本発明による核酸によりコードすることができる本発明によ
るポリペプチドは、下記においてさらに説明される。

【００９５】この分野において標準的な技術に従い、抗体を発生させるために、例えば、コ
ード核酸からの発現により産生される、精製されたRar1ポリペプチドおよびそれ
らの突然変異、変異型、フラグメント、誘導体、対立遺伝子および相同体を使用
することができる。さらに後述するように、特別にここにおいて提供される配列
の相同体を同定するとき、抗体および抗体の抗原結合性フラグメントを包含する
ポリペプチドを使用することができる。

【００９６】抗体を産生する方法は、タンパク質またはそのフラグメントで哺乳動物（例え
ば、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、ウマ、ヤギ、ヒツジまたはサル）を免疫化
することを包含する。抗体は種々のこの分野において知られている技術を使用し
て免疫化された動物から得ることができ、好ましくは問題の抗原に対する抗体の
結合を使用して、スクリーニングすることができる。例えば、ウェスタンブロッ
ト技術または免疫沈降を使用することができる（Armitage他、1992、Nature 35
7：80−82）。

【００９７】哺乳動物の免疫化に対する別法または補助的方法として、例えば、機能的免疫
グロブリン結合性ドメインをそれらの表面上に表示するラムダバクテリオファー
ジまたはフィラメント状バクテリオファージを使用して、発現された免疫グロブ
リン可変ドメインの組換え的に産生されたライブラリーから、適当な結合特異性
を有する抗体を得ることができる、例えば、WO 92／01047参照。

【００９８】ポリペプチドまたはペプチドに対して発生させた抗体を、相同ポリペプチド、
次いでコード遺伝子、の同定および／または単離において使用することができる
。こうして、本発明は、Rar1機能を有するポリペプチドまたはRar1機能を同定ま
たは単離する方法（ここに開示する態様に従い）を提供する。この方法は、抗体
（全抗体またはそのフラグメント）の抗原結合性ドメインを含むポリペプチドで
候補のポリペプチドまたはポリペプチドをスクリーニングすることを包含し、こ
こで抗体はRar1またはRar1のペプチド、ポリペプチドまたはそれらのフラグメン
ト、変異型または誘導体に結合することができるか、あるいは好ましくはこのよ
うなペプチドまたはポリペプチド、例えば、ここにおいて同定されたアミノ酸配
列を有するものに対する結合特異性を有する。

【００９９】 Rar1またはRar1のペプチド、ポリペプチドまたはそれらの突然変異、変異型ま
たは誘導体に結合するか、あるいは好ましくはそれらに対して特異的である、抗
原結合性ドメインを含む特異的結合性メンバー、例えば、抗体およびポリペプチ
ド、ならびにそれらの使用およびそれらを用いる方法は、本発明の他の面を表す
。スクリーニングのための候補のペプチドまたはポリペプチドは、例えば、問題
の植物に由来する核酸を使用してつくられた発現ライブラリーの産物であるか、
あるいは天然源からの精製プロセスの産物であることができる。

【０１００】抗体に結合することが見出されたペプチドまたはポリペプチドを単離し、次い
でアミノ酸のスクリーニングに付すことができる。任意の適当な技術を使用して
、ペプチドまたはポリペプチドを完全にまたは部分的に配列決定することができ
る（例えば、ポリペプチドのフラグメントを配列決定することができる）。ペプ
チドまたはポリペプチドをコードする核酸を得るとき、アミノ酸配列の情報を使
用することができる。例えば、候補の核酸に対するハイブリダイゼーションにお
いてプローブまたはプライマーとして使用するための1または2以上のオリゴヌク
レオチド（例えば、オリゴヌクレオチドの縮重プール）を設計するか、あるいは
コンピューターの配列データベースを検索する。これらは後述される。

【０１０１】本発明は、さらに、植物において細胞死および／または植物病原体防御応答を
促進する方法を提供する。この方法は、植物細胞内で、前述のRar1機能を有する
異種核酸配列を発現することを包含する。本発明は、さらに、植物細胞内で、前述のRar1機能を有する異種核酸配列を発
現することを包含する、植物において病原体耐性を発生させる方法を提供する。

【０１０２】このような方法は次のようにして達成することができる。植物細胞またはその
祖先の中にヌクレオチド配列を導入する初期の工程を実施した後、Rar1機能を付
与するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列からの発現を植物細胞内で実
施する（これによりコードされたポリペプチドを産生する）。このような方法は
病原体に対する植物耐性を発生させることができる。

【０１０３】 Rar1転写体またはRar1タンパク質の発現を操作して、異なる植物において広い
スペクトルの病原体に対する耐性を増強することができる。これは高度に活性な
植物プロモーター、例えば、CaMV−35Sプロモーターを使用する過剰発現により
達成することができる。あるいは、Rar1を病原体−誘導可能なプロモーターに結
合させ（下記の説明を参照のこと）、チャレンジされた細胞における発現を高く
する。一般的活力および収率に関して植物に対して有害作用を有することがある
過敏性応答（HR）の非存在下に、病気耐性の増加は起こることがある。

【０１０４】植物のゲノムの中に安定に組込まれた遺伝子は世代から世代を通して植物の子
孫に伝達され、子孫の細胞はコードされたポリペプチドを発現することができ、
こうして増強された病原体耐性または病原体感受性を有することができる。前述
したように病原体の適合性を評価することによって、病原体耐性を決定すること
ができる。

【０１０５】本発明は、さらに、植物細胞またはその祖先の中に核酸を導入する初期の工程
を実施した後、第1図のアミノ酸配列またはその配列の突然変異、対立遺伝子ま
たは誘導体（これはRar1機能を有することができる）をコードするヌクレオチド
配列からの発現を植物細胞内で実施する（これによりコードされたポリペプチド
を産生する）ことを包含する方法を提供する。このような方法は1または2以上の
病原体に対する植物耐性を発生させることができる。この方法は、WO 91／1558
5（Mogen）、より好ましくはPCT／GB95／01075（WO 95／31564として公開され
た）に記載されている方法のいずれかに従いavr遺伝子と、または病原体耐性を
付与することに関係する任意の他の遺伝子と組み合わせて使用することができる
。

【０１０６】本発明において、ヌクレオチド配列をセンス方向に導入することによって、耐
性を変更することができる。こうして、本発明は、植物における防御応答をモジ
ュレートする方法を提供する。この方法は、本発明に従い植物細胞内で核酸の発
現を引き起こすか、あるいは可能とすることを包含する。一般に、防御応答を促
進することが望ましいであろう。これはRar1遺伝子が機能できるようにすること
によって達成することができる。 Rar1によりシグナル伝達される耐性をダウンレギュレートするために、アンチ
センス技術または「センス調節」を使用して、内因性Rar1遺伝子の発現を低下さ
せることができる。

【０１０７】遺伝子発現をダウンレギュレートするためにアンチセンス遺伝子または部分的
遺伝子配列を使用することが今回確立された。二本鎖DNAを「逆方向き」にプロ
モーターの制御下に配置し、こうしてDNAの「アンチセンス」鎖の転写により、
ターゲット遺伝子の「センス」鎖から転写された正常mRNAに対して相補的である
RNAが生ずるようにする。次いで相補的アンチセンスRNA配列はmRNAに結合して二
本鎖を形成し、ターゲット遺伝子から内因性mRNAがタンパク質に翻訳されること
を阻害すると考えられる。これが実際の作用モードであるか否かはなお明らかで
ない。

【０１０８】しかしながら、この技術が有効であることは、確立された事実である。例えば
、下記の文献を参照のこと：Rothstein他、1987；Smith他（1988）Nature 334
：724−726；Zhang他（1992）The Plant Cell 4：1575−1588；English他（1
996）The Plant Cell 8：179−188。また、アンチセンス技術は、Bourque，1
995，およびFlavell，1994において概観されている。アンチセンス構築物は，Ra
r1またはRar1相同体の3'末端または5'末端を含むことができる。いくつかのRar1
相同体が植物種の中に存在する場合、アンチセンス構築物中の5'末端および3'末
端の非翻訳配列の包含は、サイレンシング特異性を増強するであろう。

【０１０９】自然プロモーターを使用して、構成的に発現されたプロモーター、例えば、Ca
MV 35Sプロモーターにより、組織特異的または細胞型特異的プロモーターによ
り、または外部のシグナルまたは因子で活性化可能なプロモーターにより、構築
物を発現させることができる。CaMV 35Sプロモーター、しかしまたイネactin1
およびトウモロコシユビキチンのプロモーターは、イネにおいてリポーター遺伝
子を高いレベルで発現させることが示された（Fujimoto他（1993）Bio／Technol
ogy 11：1151−1155；Zhang他（1991）Plant Cell 3：1155−1165；Cornejo
他（1993）Plant Molecular Biology 23：567−581）。

【０１１０】逆向きにコード配列に対応する完全な配列は使用する必要がない。例えば、十
分な長さのフラグメントを使用することができる。種々のサイズのフラグメント
をスクリーニングし、コード配列の種々の部分からアンチセンス阻害を最適化す
ることは、当業者にとって日常的なことである。開始メチオニンATGコドンおよ
び多分初期コドンから上流ｎｉ1または2以上のヌクレオチドを含むことは好都合
であることがある。適当なフラグメントは約14〜23ヌクレオチド、例えば、約15
、16または17ヌクレオチドを有することができる。

【０１１１】こうして、本発明は、植物におけるRar1発現を下方にモジュレートする方法を
提供する。この方法は、本発明に従い植物細胞内で核酸からのアンチセンス転写
を引き起こすか、あるいは可能とすることを包含する。Rar1のダウンレギュレー
ションは防御応答を減少することができる。これはある環境において、例えば、
分析的または実験的アプローチとして、適当であることがある。

【０１１２】アンチセンス調節において使用するために、Rar1遺伝子（すなわち、相同体を
包含する）のコード配列、または発現のアンチセンス調節するとき使用するため
に適当な前記コード配列のフラグメントに対して相補的であるヌクレオチド配列
を包含する核酸が提供される。これはDNAであり、かつ問題の細胞におけるアン
チセンス転写に適当な調節配列の制御下にあることができる。

【０１１３】ターゲット遺伝子の追加のコピーをセンスで、すなわち、ターゲット遺伝子と
同一向きで挿入するとき、ある範囲の表現型が産生され、これらの表現型は過剰
発現が起こる個体、およびターゲット遺伝子からのタンパク質の低い発現が起こ
るいくつかの個体を包含する。挿入された遺伝子が内因性遺伝子の一部分のみで
あるとき、トランスジェニック集団における低い発現をする個体の数は増加する
。

【０１１４】センス調節が起こるメカニズム、特にダウンレギュレーション（または「サイ
レンシング」）はよく理解されていない。しかしながら、この技術はまた科学お
よび特許文献において十分に報告されており、遺伝子制御に日常的に使用されて
いる。例えば、下記の文献を参照のこと：van der Krol他（1990）The Plant
Cell 2：291−299；Napoli他（1990）The Plant Cell 2：279−289；Zhan
g他（1992）The Plant Cell 4：1575−1588。遺伝子のサイレンシングまたは
共抑制技術のそれ以上の改良は下記の文献に記載されている：WO 95／34668（B
iosource）；AngellおよびBaulcombe（1997）The EMBO Journal 16、12：367
5−3684；およびVonnetおよびBaulcombe（1997）Nature 389：p. 553。

【０１１５】適当なフラグメントは、約50、100、150、200、250、300、350、400、450、50
0、550、600、650または700ヌクレオチド長さであることができる。こうして、本発明は、また、植物においてRar1機能を下方にモジュレートする
方法を提供する。この方法は、本発明に従い植物細胞内で核酸からの発現を引き
起こすか、あるいは可能として内因性Rar1発現を抑制することを包含する。 Rar1の修飾されたバージョンを使用する、内因性Rar1機能をダウンレギュレー
トすることができる。例えば、突然変異、変異型、誘導体、およびその他を使用
することができる。

【０１１６】 Rar1の野生型活性は、リボザイム、例えば、複製複製、例えば、ハンマーヘッ
ドクラスのリボザイムを使用することによって、減少させることができる（Hase
loffおよびGerlach、1988、Nature 334：585−591；Feyter他、1996、Mol. Ge
n. Genet. 250：329−338）。

【０１１７】植物におけるRar1機能を減少させる他の方法において、トランスポゾン突然変
異誘発を使用する（Osborne他（1995）Current Opinion in Cell Biology
7：406−413において概観されている）。遺伝子の不活性化は、「ターゲッテッ
ド標識化」アプローチを介して、内因性移動性因子または外来ゲノム中の移動性
を保持する異種クローン化トランスポゾンを使用して証明された。挿入配列およ
びRar1相同体の両方において結合特異性を有するPCRプライマーを使用すること
によって、既知配列の挿入を担持するRar1対立遺伝子を同定することができる。
不活性化細胞内でトランスポゾンを安定化するために、「2因子系」を使用する
ことができる。

【０１１８】 2因子のアプローチにおいて、切除マーカーの中に挿入された選択可能なまた
はスクリーニング可能内マーカー遺伝子を含有する非自律的トランスポゾンを支
持するT−DNAを構築する。トランスポゾン機能を発現する第2T−DNAを支持する
植物に対して、これらのT−DNAを支持する植物を交雑させる。ハイブリッドを切
除およびトランスポゾン内のマーカーについて二重選択して、転移された因子を
有するF₂植物を産生する。

【０１１９】図面を参照して、本発明に関する態様および実施例をここで説明する。本明細書において引用するすべての文献は引用することによって本明細書の一
部とされる。

【０１２０】実施例1．オオムギからのRar1および他の種からの相同体のクローニングおよ
び特性決定 Rar1の高い分解能の遺伝的マッピング以前の低い分解能の間隔マッピング手順により、Rar1は、5cM間隔内のRFLP遺
伝子座cMWG694およびMWG503によりフランクされた、オオムギ染色体2上に見出さ
れた（Freialdenhoven他、1994）。オオムギ中の1cMはほぼ3Mbに対応するので、
Rar1を単離する第1工程として、局所的な高い分解能の遺伝地図を確立すること
を我々は決定した。30kbの平均物理的距離に対応するほぼ0.01cMの分解能を我々
は目標とした。

【０１２１】特に春型におけるDNA多形性の低い頻度のために（Russel他、1997）、交互交
雑の有効性は所定のプローブで多形性を見出す可能性を増加するので、有利であ
ると、我々は理由づけた。したがって、両方の突然変異を3つのMla−12戻し交配
（BC）系統（Mla−12 BC Ingrid，Mla−12 BC Pallas，Mla−12 BC Siri
；（Freialdenhoven他、1994；Kolster他、1986；KolsterおよびStolster 1987
）と交雑させた。これらの系統は、オオムギ春型の異なる遺伝的バックグラウン
ドを表す。

【０１２２】高い分解能のマッピングの段階は、概説すると、次の通りであった： 50の植物に基づく初期RFLP地図（Freialdenhoven他、1994）を使用して、CAPS
マーカーMWG876、MWG892およびMWG2123を遺伝地図の中に組込んだ。Ant2とRar1
との間の組換え事象について1040の植物を分析するために、表現型スクリーンを
使用した。観測された組換え体を使用して、MWG892融点がRar1に関して遠位であ
ることが明らかにされた。マーカー間隔MWG892 − cMWG694において、1063の
追加の植物の引き続くCAPSをベースとする組換えスクリーンを実行した。観測さ
れた組換え体の分析は、Rar1に関して近位にMWG876を位置決定した。

【０１２３】最後に、他の2207植物をマーカー間隔MWG892 − MWG876において研究した。
2つのAFLPs R25／48およびA25／43が同定され、プールの個体のDNAについて試
験した。R25／48が耐性集団セグリガント（segregants）において同定された。P
CR生成物を4.5％の変性ポリアクリルアミドゲル上で分析した。連鎖したAFLPシ
グナルの存在はプールの個体の1つにおいて見出され、AFLP遺伝子座R25／48およ
びRar1の間の組換え事象を示し、これは感受性プール（Bs）において表示されな
かった。R25／48およびA25／43を使用して同定された2つの組換え体はRar1およ
びMWG876の共分離を明らかにし、こうして両方のAFLP遺伝子座はMWG876から遠位
に位置しなくてはならない。遺伝的距離（cM）を2点推定に基づいて計算した。

【０１２４】より詳細において： Rar1を含有するほぼ5cMをRFLPマーカーMWG503およびcMWG694（Freialdenhoven
他、1994）を配列決定し、対応する遺伝子座の増幅のためのオリゴヌクレオチド
が誘導され、そして感受性親（rar1−1、rar1−2）と耐性親（Mla−12 BC Ing
rid、Mla−12 BC Pallas、Mla−12 BC Siri）との間の多形性が決定された
。

【０１２５】これは、鋳型DNAとしてM82、M100、Mla−12 BC Ingrid、Mla−12 BC Pall
asおよびMla−12 BC Siriを使用して、臭化エチジウム染色2.5％アガロースゲ
ル上に、制限酵素消化された増幅産物を表示することを含んだ。表2に関して後
述するように、増幅および消化を実施した。表示されたCAPSマーカーは、RFLP遺
伝子座MWG87、MWG503、MWG876、およびMWG2123に対応した。遺伝子座MWG892につ
いてのPCRプライマーは、引き続く制限消化なしに、PCR生成物の対立遺伝子特異
的識別を可能とした。小さいバンドは、PCRアンプリコンの不完全なBclI消化物
のためのものであった。

【０１２６】 Rar1に隣接するマーカー密度を増加するために、一般的RFLP地図から前述のRF
LP遺伝子座に密接してマッピングされる、3つのそれ以上のRFLPマーカーを我々
は選択した（MWG876、MWG892およびMWG2123［Graner、1991］。これらのRFLPの
各々を切断可能な増幅可能な多形性配列（CAPS）に変換し、50セグリガントの集
団に基づくRar1に関してマッピングした。この集団において、MWG876およびMWG8
92はRar1との共分離を示したが、MWG2123はcMWG694に対して遠位に位置決定され
た。

【０１２７】組換えスクリーニング両方のRar1突然変異（rar1−1およびrar1−2）を誘導した栽培品種Sltan−5（
Mla−12、Rar1）はアントシアニン色素沈着欠陥（ant2）を含有するが、マッピ
ングに使用した3つの耐性Mla−12 BC系統（Mla−12 BC Ingrid，Mla−12 BC
Pallas，Mla−12 BC Siri）はAnt2野生型対立遺伝子を担持する。Ant2遺伝
子座はRar1に対して近位にほぼ0.5cMの距離にマッピングされることが示された
（Freialdenhoven他，1994）。Rar1とAnt2との間の小さい間隔において稀な組換
え体を同定するために、我々は1,040の感受性F₂個体（rar1／rar1）を選択し、
アントシアニン野生型対立遺伝子Ant2の存在についてスクリーニングした。

【０１２８】合計14の組換え体が見出され、これらをMWG87、MWG876、およびMWG892におい
て対立遺伝子について試験した。14組換え体を分析すると、Rar1、MWG87およびM
WG876の共分離が示された。マーカーMWG892はAnt2とRar1との間に位置決定され
、前者から2組換え事象だけ分離されていた。2つの対立遺伝子Rar1突然変異と3
つのMla−12 BC系統との間の異なる交雑は、有意に異なる組換え頻度を明らか
にしなかった。したがって、我々は我々の検索を1つの交雑のみに制限した（M10
0×Mla−12 BC Ingrid）。これにより、後述するターゲッテッドAFLPをベース
とするスクリーニングについてRar1に隣接して同定された組換え体をまた使用す
ることができた。

【０１２９】ターゲット遺伝子座の近傍における遺伝的分解能を増加させるために、CAPSマ
ーカーMWG892およびcMWG694を利用することによって、Rar1をフランキングする
組換え事象について、さらに1,063のF₂植物をスクリーニングした。MWG87および
MWG876を引き続いて研究すると、MWG876とターゲット遺伝子との間の1つの組換
え事象を除いてMWG87およびRar1について完全な連鎖が明らかにされ、このRFLP
をRar1に対して遠位に位置決定した。

【０１３０】さらに2,207のF₂植物をCAPS分析によりマーカー間隔MWG876 − MWG892にお
ける組換え事象について試験することによって、Rar1からMWG87を遺伝的に分離
することを我々は試みた。しかしながら、観測された組換え植物の研究において
、Rar1およびMWG87の共分離がさらに明らかにされた。MWG87、MWG876およびRar1
の緊密な遺伝的連鎖はこれらの遺伝子座間の小さい物理的距離を示すことができ
るが、また、この遺伝的セグメントにおける組換え頻度が低い結果であろう。

【０１３１】これらの可能性を研究しかつ追加のDNAマーカーを使用して間隔を濃厚するた
めに、AFLPをベースとするマーカーの検索を我々は開始した。Rar1、MWG87およ
びMWG876の緊密な遺伝的連鎖が組換えの抑制により引き起こされる場合、大きい
物理的間隔はターゲット領域において多数の連鎖されたAFLPマーカーを明らかに
することが期待されるであろう。

【０１３２】ターゲッテッドAFLPマーカーの検索交雑rar1−2×Mla−12 BC Ingridの選択したF₂後代を使用することによって
、集団化セグリガント分析（Giovannoni，1991；Michelmore他、1991）と組み合
わせて、AFLP技術（Vos他、1995）を使用した。Rar1に堅固に連鎖しないAFLPマ
ーカーの検出を最小するために、前述のCAPSをベースとする組換えスクリーニン
グにおいて我々が同定したDNAプールを構築するために、我々はDNAマーカー選択
組換え体を使用した。

【０１３３】両方のDNAプールは各10のF₂植物を含んでなっていた。AFLPマーカースクリー
ニングを開始するとき、マーカー間隔MWG892−cMWG694において500のF₂個体のみ
を分析し、MWG876とRar1との間の組換え体はまだ同定されなかった。結局、適当
な組換え体を選択するためにMWG876を使用することができなかった。感受性プー
ル（rar1−2／rar1−2）は、cMWG694とRar1との間の組換えを有する3つの個体、
MWG892とRar1との間の組換えを有する4つの個体、および研究したマーカー間隔
において組換えをもたない3つの感受性個体を含有した。

【０１３４】耐性プールについての組換え体の選択はDNAマーカーのみに基づいた。cMWG694
およびMWG892の耐性親の対立遺伝子パターンを示す植物を使用することによって
、対応する遺伝的間隔においてホモ接合性を保証することができた。したがって
、連鎖したAFLPマーカーはトランス型およびシス型であることが期待される。耐
性プールのターゲット間隔を狭くするために、MWG503とMWG892との間（2つの植
物）またはcMWG694とMWG2123との間（2つの植物）の組換え事象を担持する植物
を使用した。組換え個体に加えて、研究したマーカー間隔において検出可能な組
換え事象をもたない植物を使用した。

【０１３５】 M100とMla−12 BC Ingridとの間のAFLP多形性のゲノム幅の頻度は、7％であ
ることが見出された。各AFLPプライマーの組合わせは、平均100のDNAフラグメン
トを表示した。したがって、392の組合わせにおいて7つのPstI＋2プライマーお
よび56のMseI＋3プライマーを使用して、ほぼ40,000遺伝子座を検査した。わず
かに2つのプライマーの組合わせは、DNAプールにおいてRar1に連鎖したAFLPマー
カーを同定した。各プールの個体上のこれらAFLPマーカーを分析すると、それら
はターゲット遺伝子から1つの（R25／45）および2つの（A25／46）組換え事象だ
け分離されており、そしてRar1に関して遠位にマッピングされる。

【０１３６】少量の同定されたRar1連鎖AFLPマーカーは、我々がDNAプールを組立てる方法
により確かに影響を受ける。また、DNAマーカーについて検索した小さい遺伝的
間隔は物理的に過度に大きくないことを示すことができる。遺伝的距離および物
理的距離の関係をいっそう正確に推定するために、レアーカッティング（rare
cutting）制限酵素およびRar1連鎖RFLPプローブと組み合わせてPFGEサザン分析
を実行した。

【０１３７】広範囲物理的マッピング共分離性プローブMWG87およびフランキングプローブMWG892およびMWG876を使
用して、7つの異なるレアーカッティング制限エンドヌクレアーゼで制限後のフ
ラグメントのサイズを測定した。分析により、MWG87およびMWG876にハイブリダ
イゼーションする単一の共移動性MluI制限フラグメントが明らかにされた（表1
）。これはMWG876とMWG87との間の550kbの最大物理的距離を示すことができる。
また、プローブ／制限酵素の組合わせMWG876／NotI、SalIおよびSmaI（90kb）お
よびMWG87／SfiIおよびSmaI（100kb）を使用して、普通サイズのフラグメントが
検出された。1つのプローブおよび異なるエンドヌクレアーゼを使用する普通サ
イズのこれらのフラグメントは、多分、脊椎動物において以前に報告された制限
部位の群化により引き起こされる（Bickmore他、1992；Larsen他、1992）。

【０１３８】オオムギ酵母人工染色体（YACs）上のRar1の物理的限界決定オオムギYACライブラリーのスクリーニングターゲット遺伝子座を包含する遺伝子座MWG892およびMWG876により境界される
0.7cMの間隔の同定は、Rar1の高分解能の遺伝的マッピングにおいて有意であっ
た。8,000より多い減数***に基づいて、遺伝子座MWG87はターゲットと共分離す
ることが見出された。これにより、MWG87を含有する大きいインサートのゲノム
クローンを単離するためにオオムギYACライブラリーのスクリーニングを開始す
ることに対する原理的説明が得られた。

【０１３９】切断され増幅された多形性配列（CAPS）MWG87を使用するPCRをベースとするス
クリーニングを実行すると、各々が期待するPCR生成物を発生する、5つの酵母ク
ローンが同定された。得られたアンプリコンがMWG87遺伝子座を表示することを
確証するために、各PCR生成物を配列決定し、すべてのYAC由来フラグメントにお
いて同一配列を見出した。5つのYACのうちの2つは、Rar1に対して0.015センチモ
ルガン（cM）遠位にマッピングされるCAPSマーカーMWG876をまた含有した。

【０１４０】 PFGEおよび逆PCR（IPCR）によるYACインサートの分析単離されたYACのインサートサイズを測定するために、PFGEサザン分析におい
てプローブMWG87を使用した；それぞれ680kb（Y18）、340kb（Y30）、1,100kb（
Y31）、720kb（Y73）および300kb（Y113）。2回の独立のサザン分析において、Y
AC Y113に対するシグナル強度が有意に減少することが示され、この酵母人工染
色体の遺伝が混乱されたことが証明された。同定されたYACを使用して局所的コ
ンティグを確立するために、IPCRによりYACの左（L）および右（R）末端を単離
し、それらのヌクレオチド配列を決定した。

【０１４１】それらのYAC末端の配列を分析すると、YAC末端Y31LはオオムギBARE−1レトロ
トランスポゾン、すなわち、オオムギゲノムの約6.7％を含んでなる高度に反復
性の配列、に対して約95％の同一性を有することが明らかにされた（Suoniemi他
、1996）。さらに、BARE−1レトロトランスポゾンに対して高い関係を有する配
列ストレッチがY18R、Y18L、およびY73Lの中に見出された。さらに、YACおよびY
31RはトウモロコシレトロトランスポゾンOpie−2（SanMiguel他、1996）に対し
て約64％の配列同一性を明らかにし、オオムギにおいてこれまで記載されてきて
いない新規な因子を示した。

【０１４２】 YACインサートのオーバーラップ分析各酵母クローンからの各プローブをすべてのYACに対して試験して、それらの
関係を決定した。ヌクレオチドブラストの結果に基づいて、重複的非反復性DNA
を表す配列ストレッチにおいて、YAC末端特異的オリゴヌクレオチドを設計した
。マルチコピーDNAのみを含んでなるYAC末端Y31Lについて、これは不可能であっ
た。引き続いて、PCR分析を使用して、それぞれの酵母クローン中のこれらの配
列の存在または非存在を決定した（表2）。なお反復DNAを認識するプライマー対
を露出するために、2つの特徴のないYAC（Y1、Y2）を含めた。

【０１４３】酵母クローンY1およびY2中のYAC末端Y31Lに対応する増幅産物は、このYAC末端
のマルチコピー特性を確証した。YAC末端Y113LはYAC Y73およびY113において増
幅産物を発生した。しかしながら、Y73中のPCR生成物の長さは、Y113において検
出された期待されたサイズと異なっていた。したがって、Y113Lに対応する遺伝
子座はYAC Y73の中に存在しないと我々は結論した。すべての他のYAC末端特異
的プライマーは、異なるYACクローン上の明瞭な非存在／存在を検出し、Y1また
はY2においてフラグメントを増幅せず、YACコンティグの分析のために適当であ
ることを示した。

【０１４４】すべてのYACインサートが源DNAと共直線性である場合、各末端プローブはそれ
が由来する酵母クローンおよびこの領域をカバーするYACを検出するであろう。
コンティグの末端を作る、2つのYAC末端について、それらが由来する酵母クロー
ンが検出されるであろう。ここで、これらの末端プローブはYACコンティグの末
端を定める。それらが由来された1つを除いて、YAC中で増幅されない4つのYAC末
端が決定されたので、4つのYAC末端のうちの少なくとも2つはキメラYACに由来す
る違いない。しかしながら、この情報に基づいて、4つのYAのうちの2つはキメラ
であることはまだ不確実なままであった。YAC末端の遺伝的マッピングはこの明
確さの欠如を解決できるであろうが、末端プローブが単一または低いコピーのマ
ーカーである場合にのみ可能である。

【０１４５】 YAC末端のコピー数 Y31Lを除外して、すべてのYAC末端特異的マーカーはYAC DNAをベースとする
コンティグの確立に適当であることが証明された。次に、YAC末端由来オリゴヌ
クレオチドがオオムギゲノムDNAから単一遺伝子座を増幅するかどうかを決定し
た。これは遺伝的マッピングの前提条件である。栽培品種イングリッド（Ingrid
）のゲノムDNA、YACライブラリーの源DNAを使用し、それぞれのYAC末端特異的プ
ライマー対を用いてPCR分析を実施した。Y113Lに対応するプライマーは、YAC Y
73においてまた観測される非特異的PCR生成物に合致する異なる長さの多アンプ
リコンを明らかにした。

【０１４６】対照的に、YAC末端Y18L、Y18R、Y30L、Y30R、Y31R、Y73RおよびY113Rに対応す
るオリゴヌクレオチド（表3）は、均一なサイズのフラグメントを増幅させた。
しかしながら、PCR生成物（各YAC末端について3つの独立クローン）のクローニ
ングおよび配列決定により、Y30LおよびY73Lは、約5％の配列のダイバージェン
スを示す、少なくとも3つの異なるアンプリコンを発生することが明らかにされ
た。これにより示されるように、Y30LおよびY73Lに対応するプライマーは高度の
配列類似性を有する多遺伝子座を認識する。

【０１４７】 3つの特性決定されたサブクローンとYAC末端由来配列との間の多形性であるヌ
クレオチドストレッチを認識するエンドヌクレアーゼを選択するために、配列分
析を使用した。これらの診断エンドヌクレアーゼを使用するPCR生成物の制限消
化は、既知の配列の単一遺伝子座に由来するアンプリコンについて予測されるよ
りも複雑な結合パターンを生じた。したがって、ゲノムDNAからのPCR生成物のエ
ンドヌクレアーゼをベースとする分析は、Y30LおよびY73Lに対応する増幅産物の
不均質性を確証し、一般に、ある種のマーカーが単一コピーの遺伝子座を検出す
るかどうかを決定する有用な道具である。YAC末端Y18L、Y18R、Y30R、Y31Rおよ
びY113Rに対応するサブクローンの配列分析は、これらのアンプリコンが均質で
あることを示した。

【０１４８】オオムギ染色体に対するYAC末端の帰属単離されたYAC末端の染色***置を決定するために、コムギ／オオムギのジテ
レオソミック付加系統（diteleosomic addition lines）を使用し、各々はオ
オムギ栽培品種ベゼス（Betzes）の既知の染色体アームを含有した（Shepherdお
よびIslam 1981；Islam 1983）。ジテレオソミックコムギ／オオムギ付加系統
は、オオムギ特異的シグナルをコムギ特異的シグナルと区別できる場合、その対
応する染色体に対する所定のオオムギ配列の急速な帰属を促進する。

【０１４９】オオムギ栽培品種イングリッド（Ingrid）に由来するPCRプライマーを使用し
て、Y18RおよびY18Lをオオムギ染色体2HLに帰属させ、Y31Rを染色体5HSに帰属さ
せ、そしてY73Rを染色体6HSに帰属させた。これはYAC Y31、およびY73のキメラ
現象を示した。栽培品種イングリッド（Ingrid）に由来するプライマーは栽培品
種ベゼス（Betzes）、付加系統のオオムギDNAドナー、からのフラグメントを増
幅しなかったので、YAC末端Y113Rはマッピングすることができなかった。同様に
、YAC末端Y30Rは、コムギおよびオオムギにおいて同一サイズのフラグメントを
発生したので、帰属させることができなかった。

【０１５０】 YAC末端の高い分解能の遺伝的マッピングコムギ／オオムギのジテレオソミック付加系統はキメラYACの同定を促進する
が、ターゲット遺伝子座に関してYAC末端の位置を定めるために高い分解能の遺
伝的マッピングは必要である。YAC末端の遺伝的マッピングの前提条件は、マッ
ピング集団の親の遺伝子型間の配列の多形性である。可能な配列の多形性につい
て検索するためにPCRをベースとするアプローチを使用した。Y30Rに対応するオ
リゴヌクレオチドは耐性親（Rar1）および感受性親（rar1）において異なるサイ
ズの増幅産物を発生させたが、Y113Rに対応するプライマー対は耐性親の各々に
おいてのみDNAフラグメントを増幅した。

【０１５１】マーカー遺伝子座Y18LおよびY18Rについての耐性親および感受性親に由来PCR
生成物を、直接的配列決定によりDNA多形性について分析した。比較配列分析はY
18Rの場合において多形性HinfI部位を明らかにしたが、Y18Lにおいて、約2.5kb
にわたってDNA多形性は検出されなかった。Y18L配列内のBARE−1レトロトランス
ポゾンのコピーは、多形性について検索するためにIPCRによりこの配列をさらに
拡張することを不可能とした。多形性YAC末端の遺伝的マッピングは、それぞれ
ターゲット遺伝子座から11および3組換え体だけ分離された、Rar1に対して近位
にY30RおよびY113Rを位置決定した。

【０１５２】 Rar1におけるYACコンティグ（i）YAC上の存在／非存在のマッピング、（ii）コムギ／オオムギの付加系統
を介する染色体の帰属、および（iii）高い分解能の遺伝的マッピングにより得
られた情報に基づいて、YACを推定した。YAC Y18は源DNAに対して共直線性であ
る非キメラインサートを含有する唯一のYACであるようである。なぜなら、両方
の末端は染色体2HLにマッピングされるからである。対照的に、YAC Y30は多分
再配列を行い、マーカーY113Rを含む内部の欠失に導く。

【０１５３】この結論は下記に基づく：（i）MWG87とY30Rとの間のY113Rの遺伝的マッピン
グ、および（ii）YAC Y30中のマーカーの非存在（表2）。サザン分析によるYAC
ライブラリーの以前に詳述された特性決定は、クローンの約30％の不安定性のた
めの、複数のYAC由来フラグメントを明らかにした（Simons他、1997）。しかし
ながら、最長のインサートのみを収容する個々のクローンの回収は通常可能であ
った。Y113Rをまた含有するY30の対応するクローンをライブラリーがなお含有す
る場合、YACクローンの同定に最初に使用した酵母DNAのプールを分析した。YAC
Y30に対応するプールのDNAの中にY113R特異的アンプリコンを見出すことができ
ず、YAC Y30中の内部の欠失がライブラリーの構築の間の初期段階において起こ
ったことが示された。

【０１５４】 YACインサートのキメラ現象が、YAC Y31、Y73およびY113について結論された
。YAC Y31およびY73の場合において、この仮定は染色体それぞれ5HSおよび6HS
に対するY31RおよびY73Rの帰属に基づく。対照的に、YAC Y113におけるキメラ
現象についての証拠は、MWG87から遠位におけるすべてのマーカーの非存在、お
よびY113LがYAC Y113のみにおいて検出されたという事実に基づく（表2）。あ
るいは、YAC末端Y113LはYAC末端Y31Lから遠位に位置することができ、遺伝子座Y
18RおよびY30Lの間の領域がクローン増殖の間にYAC Y113において欠失されたこ
とを意味する。

【０１５５】要約すると、Rar1を含有するゲノム領域は、Y113R（近位）およびMWG876（遠
位）により遺伝的に境界限定される。提示されたYACコンティグは、近位の向き
にYACクローンY18およびY113（2倍の重複性）により、そして遠位の向きにYACク
ローンY30およびy31（2倍の重複性）により、この間隔を物理的にカバーするの
で、Rar1遺伝子座を物理的に境界限定した。

【０１５６】 Rar1におけるBACコンティグの構築次に、YACクローンY18およびYACクローンY30からのベクターpBelo BAC11にお
いて、2つのHindIII BACサブライブラリーを確立した。各サブライブラリーに
ついて50kbの平均インサートサイズおよびほぼ5倍の重複性を目標とした。 YAC Y30およびY18に由来する、5つのBACを、Rar1と共分離する、CAPS MWG87
で最初に単離した（BAC 12、BAC 1J6、BAC 4C20、BAC 1G12、およびBAC 3H
6）。マーカーY113RについてのPCRプライマーを使用して、BAC 1H1を単離した
。

【０１５７】同定されたBACのインサートサイズをPFGEにより測定した。各BACインサートの
末端フラグメントを逆PCRにより単離し、次いで配列決定した。BAC 4C20の末端
配列に基づいて、新しい相互優性を誘導し、EDDAと表示し（表4）、マッピング
集団の親遺伝子型間の配列の多形性を検出した。間隔MWG876 − Y113R内の4つ
の組換え体を分析すると、EDDAはRar1に対して近位に位置決定された。BAC 4C2
0は3つの遺伝子座MWG87、Y18R、およびEDDAの各々を含有するので、単一BACクロ
ーン上のセントロメアの方向にRar1を物理的に境界限定した。

【０１５８】引き続いて、BAC 12、BAC 3H6、およびBAC 1B2の末端配列を使用して、そ
れぞれ、マーカーOK1114、OK3236、およびOK5558を誘導した（表3）。ターゲッ
ト間隔MWG876 − Y113R内の4つの組換え体に由来するゲノムDNAを検査するこ
とによって、相互優性マーカーOK1114はRar1と共分離することが見出された。マ
ーカーOK3236およびOK5558により、親遺伝子型Sultans5／Mla−12 BC Pallas
およびSultans5／Mla−12 BC Ingridの間の多形性が検出されたが、Sultans5
／Mla−12 BC Siriの間でこの遺伝子座を検出することができなかった。

【０１５９】したがって、組換え事象を位置決定するために、ターゲットMWG876 − Y113
R中の4つの組換え体のうちの3つのみを試験することができた。これらの3つの組
換え体のDNAを分析すると、マーカーOK3236およびOK5558とRar1との共分離が明
らかにされた。BACのインサート長さ、前述のマーカーの各々の存在および非存
在、およびRar1に関するそれらの遺伝的向きに基づいて、Rar1遺伝子座における
高い分解能の遺伝地図を推定した。セントロメアの向きのBACレベルおよびマー
カーY18RおよびOK5558により境界される最小の共分離間隔の同定により、Rar1を
物理的に境界限定した。

【０１６０】 Rar1遺伝子座における隣接する66kbのDNAストレッチマーカーMWG87およびOK5558により境界されるDNA間隔の隣接するゲノムDNAを
組立てることを決定した。ベクターpBluescript II Ks+の中への各BACのプラ
スミドのサブライブラリーに由来するランダムに選択されたクローンにより、こ
の領域をカバーするBAC 1B2およびBAC 12のインサートをDNA配列決定した。鋳
型BAC 3H6上で各BACの末端配列に対して特異的なプライマーを使用することに
よって、BAC B2とBAC 12との間の49bpのギャップを閉じた。

【０１６１】候補遺伝子の探索次に我々は、BLASTアルゴリズムとすべての入手できるデータベース（作者不
明のESTsを含む）とゲノム配列ならびに既知の遺伝子とタンパク質配列を使用し
て、Rar1遺伝子座の連続的な66kbのDNAストレッチ中の候補遺伝子の探索を開始
した。我々は、データベース中の種々の登録配列と非常に相同性が高い配列を含
有する3つの別個の領域を同定した（表5）。我々は、これらの3つの区間をI1、I
2、およびI3（66kbの配列コンティグ中の43,500〜45,000位、45,001〜46,500位
、56,000〜61,000位に対応する）と名付けた。

【０１６２】区間I1とI2は、互いに関連する配列（59%のヌクレオチド同一性）であり、デ
ータベース中の同じクラスのESTsにより同定され（表5）、それぞれアクアポリ
ン（aquaporin）遺伝子との類似性を示す［Maurel, 1997］。すなわち区間I1とI
2は、頭（head）から尾（tail）に並べた2つの推定オオムギアクアポリン遺伝子
である。区間I3は、イネのEST C28356と高い配列類似性を示し、66kbストレッチ
中の別のコード領域であるかも知れない。

【０１６３】 Rar1候補遺伝子中の突然変異イベントの同定次に我々は、遺伝子型Rar1 Sultan5、rar1-1 Sultan5、およびrar1-2 Sultan5
（それぞれ、区間I1、I2、およびI3をカバーする）からのゲノムアンプリコンの
DNA配列を比較した。区間I1とI2中の3つの遺伝子型の間で配列の多形性は検出さ
れなかった。しかし、区間I3で56,764と58,562基対の位置に、2つの単一のヌク
レオチド置換が発見された。

【０１６４】 G→A置換は、それぞれ遺伝子型rar1-1とrar1-2中のユニークな配列の変化に対
応する。I3中に突然変異イベントが見つかったため、次に我々は、I3配列から推
定された一連のプライマーを使用して、栽培種イングリッド（Ingrid）から得ら
れる葉の総RNAを用いて、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（RT-PCR）を実施した（Y
ACとBAC組換えクローンの両方とも、栽培種イングリッド（Ingrid）からのゲノ
ムDNAを含有する）。

【０１６５】最も大きいRT-PCR産物の配列決定により、696基対の単一の大きな読みとり枠
が明らかになった（図1）。cDNA末端迅速増幅（RACE）法を使用して、遺伝子転
写体の5'末端と3'末端を同定した。 232アミノ酸のこの推定タンパク質は、約25.5kDaの分子量を有する。種々のデ
ータベース中の他の性状解析されたタンパク質に対して、有意な相同性は見つか
らなかった。ゲノム配列とRT-PCRから得られた配列の比較により、6つのエキソンが明らか
になり、それぞれはコンセンサススプライス部位配列が横に位置していた（図2
と表6）。わずかに3基対のコンセンサススプライス部位配列が横に位置し、グリ
シン残基をコードするエキソン2が目立った。

【０１６６】遺伝子型rar1-1 Sultan5中で同定されたG→A DNA置換は、推定の25.5kDaタン
パク質中でCys²⁴→Tyr置換を引き起こす（Cys²⁴は、Rar1同族タンパク質中の少
ない不変アミノ酸の1つである；下記）。これに対して、遺伝子型rar1-2 Sultan
5中で同定されたG→A DNA置換は、イントロン2の3'スプライス部位コンセンサ
ス配列を破壊する。

【０１６７】スプライス部位コンセンサスのGヌクレオチドは、植物と哺乳動物の両方で、
１次mRNA転写体の有効なスプライシングに必須であることが知られている［Good
all, 1991］。rar1-2遺伝子型のRT-PCR分析は、突然変異により、エキソン3中の
隠れたスプライス部位が使用される（点突然変異により引き起こされるヒトの多
くの遺伝性疾患で記録されている現象）ことを明らかにした［Krawczak, 1992］
［Brown, 1996］。隠れたスプライス部位を使用すると、読みとり枠がシフトし
、新しい停止コドンが形成され、従って推定25.5 kDaタンパク質の末端切断が起
きる。

【０１６８】遺伝子型rar1-1とrar1-2中で単一塩基置換が見つかったことは、アジ化ナトリ
ウム（元々、栽培種Sultan5の突然変異誘発のために使用された突然変異誘発物
質）の提唱された作用モードに一致する。rar1-1とrar1-2を同定するために使用
した化学的に突然変異を誘発した集団から、単一の遺伝子中で、オオムギ中の化
学的突然変異誘発の平均効率に匹敵する0.5×10^-3の頻度で機能的欠陥を有する
突然変異体（TorpとJorgensen 1986）が明らかになった。

【０１６９】従って、2つの独立した突然変異体中でその機能を有する、単一の遺伝子中の2
つの点突然変異を同定する確率は、約0.25×10^-6である。結論として、物理的に
境界を設定した目標区間中で候補遺伝子の不変の単一のアミノ酸の置換またはス
プライス部位の欠陥を引き起こす、遺伝子型rar1-1とrar1-2中に2つの突然変異
イベントが見つかったことは、我々がRar1を単離したことを充分に示している。

【０１７０】オオムギRar1の同族体作者不明のイネEST C28356のDNA配列決定により、233個のアミノ酸の推定Rar1
相同タンパク質をコードする699塩基対の単一の大きい読みとり枠が証明され、
オオムギRar1と75％のDNA類似性と86％のアミノ酸類似性が明らかになった（図3
）（GCGプログラムGAP、gap creation penalty = 3 および gap extension pena
lty = 0.1）。さらにアラビドプシス・タリアーナ（Arabidopsis thaliana）ゲ
ノムのデータベースを探索すると、オオムギとイネのRar1に高い配列関連性を示
す、第5染色体上のゲノムの区間が明らかになった。

【０１７１】配列が相同的なストレッチは、オオムギRar1で同定されたエキソンに限定され
、アラビドプシス（Arabidopsis）ゲノム中のその順序は、オオムギ中で同定さ
れたものと一致する。アラビドプシス（Arabidopsis）中の配列の相同的なスト
レッチのそれぞれは、コンセンサススプライス部位配列が横に位置する。これは
、オオムギPar1と67％の同一性と75％の類似性を有する226アミノ酸の推定の相
同的アラビドプシス（Arabidopsis）Rar1タンパク質を導き出すことを可能にし
た（GCGプログラムGAP、gap creation penalty = 3 および gap extension pena
lty = 0.1）。我々は、対応するイネとアラビドプシス（Arabidopsis）遺伝子を
それぞれOsRarl1-h1とAtRar1-h1と命名する。

【０１７２】プライマーAtRar1 5'-ACTCCTACCTTCTCAATTCGTCCG- およびAtRar1 3'-TATCAG
ACCGCCGGATCAGG- （AtRar1-h1に対応する）は、我々が、同種のcDNAを単離する
ことを可能にし、これは予測されたイントロン−エキソン構造を確認した。最後に我々は、ヒト、マウス、キイロショウジョウバエ（Drosophila）、カエ
ノラブディティス・エレガンス（Caenorabditis elegans）、アスペルギルス（A
spergillus）などから、機能が不明の発現された遺伝子である多くのESTを同定
し、推定アミノ酸レベルでのみ有意な相同性が明らかになった。

【０１７３】これらのESTとオオムギRar1に対応する推定タンパク質の間に見いだされた関
連性を表7に示し、推定配列を並べたものを図3に示す。明らかに、オオムギRar1
は、多細胞生物の間で共有されている新規タンパク質ドメインを示している。興
味深いことに、オオムギRar1のCys²⁴（突然変異体rar1-1では、Tyrに置換されて
いる）は、すべての同定された配列に関連するタンパク質中で厳密に保存されて
いる少ないアミノ酸の1つである。

【０１７４】考察我々はここで、地図ベースのクローニングアプローチにより、オオムギRar1の
分子的単離を説明した。この遺伝子は、新規な22.5kDaの細胞内タンパク質をコ
ードすると予測される。この知見は、Rar1が、異なる人種特異的な耐性遺伝子（
R遺伝子）により開始される多くのうどんこ病菌耐性反応にとって必須であるこ
とを示す、遺伝的データを考慮して解釈すべきである。特定の病原体に対する植
物の耐性は、宿主中の対応するR遺伝子と病原体中の非病原性遺伝子（Avr）によ
り開始される、特異的認識イベントが関与することが、一般に認識されている。

【０１７５】病原体の病原体阻止に多くのエフェクター成分（反応性酸素分子種、フィトア
レキシンの活性化、発病関連タンパク質の蓄積、および植物の細胞壁の架橋を含
む）が関与している。これらの応答の多くはまた、オオムギ／うどんこ病菌相互
作用により活性化されることが証明された。耐性応答で活性化される数種類のR
遺伝子開始耐性反応と多数のエフェクター成分についてRar1が必要であるため、
我々は、Rar1タンパク質は、R遺伝子認識の「下流」で作用するが応答の実行の
「上流」で作用すると考えらている。すなわちRar1は、R遺伝子が開始する耐性
のシグナル伝達の収束点である可能性がある。

【０１７６】 Rar1タンパク質配列をよく調べてイネやアラビドプシス（Arabidopsis）同族
体を比較すると、顕著な3部構造が明らかになる（ドメインI、II、およびIIIと
呼ぶ、図6）。興味深いことにドメインIとIII（各、約60アミノ酸の長さであり
、それぞれRar1のアミノ末端とカルボキシ末端の近くに位置する）は、互いに構
造が関連している。ドメインIとIIIのシステインとヒスチジンの厳密に保存され
たパターンが顕著である。

【０１７７】これは、植物Rar1同族体の間でドメインの特徴が保存されているばかりでなく
、アスペルギルス（Aspergillus）、ショウジョウバエ（Drosophila）、カエノ
ラブディティス（Caenorabditis）、マウスおよびヒトからのタンパク質で同定
された他の関連ペプチドストレッチのそれぞれでも見いだされる。我々は、この
新規タンパク質ドメインを「CHORD」を名付けた（Rar1のドメインIの例では「CH
ORD1」で、ドメインIIIの例では「CHORD2」と読んだ）。特徴的な一連のシステ
インとヒスチジン残基とは別に、CHORDは、わずかな不変のアミノ酸Gly²³、Phe⁴ ⁷ 、およびTrp⁵⁴、ならびに49位の陰性に荷電した残基と52位の陽性に荷電した残
基を有する（番号は、オオムギRar1中のアミノ末端CHORDドメインについて言及
する）。

【０１７８】このような多様な種におけるCHORDの保存は、システインとヒスチジン残基が
主要な役割を果たす同様の3次元構造を維持するようにという選択的圧力を示す
。細胞内タンパク質ドメイン中で保存された一連のシステインとヒスチジン残基
は、亜鉛イオンを結合するのに関与していることがしばしば証明されている。し
かしCHORDにおけるこれらの残基のパターンは、従来の亜鉛結合ドメインとは明
確に区別され、後者では、亜鉛イオンは、小さな自立的に折り畳みかつ機能性タ
ンパク質ドメイン（例えば、TFIIIa亜鉛フィンガー、GAL4亜鉛フィンガー、エス
トロゲン受容体中の亜鉛結合ドメイン、LIMドメイン、RINGフィンガードメイン
、およびGATA-1フィンガードメイン）を安定化させる構造的役割を有する。

【０１７９】 CHORDドメイン（例えば、CHORD1とCHORD2）は、 C-x₄-C-x_10-13-C-x₂-H-x₆-y₁-x_6-7-C₂-x₁₅-Cx_4-5-H として表され、 C-x₄-C-x₁₃-C-x₂-H-x₆-H-x₇-C₂-x₁₅-Cx₄-H でもよい。

【０１８０】特に、本発明のCHORDドメインは、式： C-x₃-G-C-x₃-A₁-x_6-9-C-x₂-H-x₅-F-y₁-A₂-x_1-2-A₃-x₁-W-x₁-C-C-x₁₅-C-x_4-5-H （式中、C、G、FおよびWは、それぞれCys、Gly、PheおよびTrpの一文字コードで
あり、 A₁は、芳香族アミノ酸であり、Phe、TrpおよびTyrから選択され、 A₂は、陰性に荷電した残基であり、GluとAspから選択され、 A₃は、陽性に荷電した残基であり、Arg、HisおよびLysから選択され、 y₁は、Hまたは任意のアミノ酸であり、好ましくはHisまたはArgであり、ｘは
任意のアミノ酸である（数値は、アミノ酸の数を示す）に一致し、亜鉛結合に必要なシステインとヒスチジンの空間的関係の構造制限を受ける。

【０１８１】 Rar1様タンパク質中のドメインIIIは、本発明のドメイン（C-x₂-C-x₅-C-x₂-H
）を提供する別のセットのシステインとヒスチジン残基を含有するようである。これは、酵母SGT1遺伝子（Kitagawaら（1999）Mol Cell 1: 21-34）のアラビ
ドプシス（Arabidopsis）同族体によりコードされるタンパク質に結合する。

【０１８２】オオムギRar1の分子的単離およびイネと双子葉植物アラビドプシス・タリアー
ナ（Arabidopsis thaliana）中に関連遺伝子が見つかったことは、これがすべて
の高等植物ゲノムの成分である可能性がある。植物のRar1同族体中の配列保存の
程度は、これらが関連した機能を共有する可能性を示す。アラビドプシス・タリ
アーナ（Arabidopsis thaliana）NPR1遺伝子（全身性獲得耐性の主要なレギュレ
ーター）のわずかに2〜3倍の過剰発現が、病原体ペロノスポラ・パラシティカ（
Peronospora parasitica）とシュードモナス・シリンジ（Pseudomonas syringae
）に対する完全な耐性を引き起こし［Cao, 1998］，Rar1 mRNAまたはタンパク質
の定常状態レベルを調節することは、耐性応答の速度と病原体スペクトルを変え
るのに使用することができることを示している。

【０１８３】病原性関連遺伝子（PR遺伝子）からのプロモーターにこの遺伝子を融合してRa
r1発現を再指令することは、Rar1介在病原体耐性のスペクトルを広げるのにも使
用することができる。このアプローチは、Rar1タンパク質の誘導体の発現と組合
せると特に魅力的である。例えば、R遺伝子からの活性化を脱共役し下流の応答
の活性化（PR遺伝子活性化、HR）を保持するRar1タンパク質の改変体が同定され
る。植物Rar1タンパク質の同定された3部ドメイン構造は、これらの実験を手引
きするのに有用かも知れない。

【０１８４】高分解遺伝子的および物理的マッピングための追加の材料と方法植物材料倍加半数体オオムギ（ホルデウム・ブルガレ（Hordeum vulgare））株Sultan-
5およびSultan-5由来突然変異体M82（rar1-1）とM100（rar1-2）の種子は、Torp
とJorgensen 1986に記載されたものである。Sultan-5と突然変異体は、肉眼で見
えるマーカー遺伝子ant2（葉鞘中のアントシアニン欠損）を含有する。栽培種シ
リ（Siri）とパラス（Pallas）中のMla-12戻し交配（BC）株は、Kolsterら, 198
6；KolsterとStolenら, 1987に記載されたものである。

【０１８５】栽培種イングリッド（Ingrid）中のMla-12 BC株は、エィチ・ブルガレ（H. vu
lgare）栽培種イングリッド（Ingrid）で７回の戻し交配と次に少なくとも７回
の自殖により作成した。各突然変異体M82とM100に、Mla-12 BC株栽培種からの花
粉を授粉し、各交配からのF₁植物を成熟するまで増殖させて、種々の分離したF₂ 集団を得た。

【０１８６】交配ニッポンバレ（Nipponbare）×カサラス（Kasalath）（Kurataら、1994）
から得られた186個体の分離したF₂集団を、イネのマッピングに使用した。イネ
の遺伝子座MWG876の地図での位置を、交配IR20×63-83（Quarrieら、1997）から
得られた123個体の第2の分離したF₂集団で、独立に試験した。

【０１８７】耐性の試験耐性についての試験は、Freialdenhovenら、1994に記載のように行った。少な
くとも25個体を含むF₃とF₄ファミリー中の自殖と以後の接種実験後に、組み換え
体の表現型を決定した。F₃個体を、切断可能な多型配列解析（CAPS）により試験
して、ホモ接合性組み換え体を同定した。これらの植物を再度自殖し、F₄ファミ
リーで耐性試験を行った。接種の７日後、植物を耐性／感受性についてスコア化
した。

【０１８８】パルスフィールドゲル電気泳動（Pfge）およびサザン解析オオムギの高分子量DNAを、SiedlerとGraner（1990）の方法を使用して、5〜7
日令の実生の葉材料から単離した。GanalとTanksley（1989）のプロトコールを
使用して、6つのレア切断制限酵素（ClaI, MluI, SalI, NotI, SfiI, SgfI, Sma
I）を用いてDNAを消化した。サイズ分画のために、LKB Pulsaphor（登録商標）
装置（ファルマシアバイオテク（Pharmacia Biotech）, ウプサラ（Upsala）,
スエーデン）で180Vで10〜60ｓのパルス時間（直線内挿法）で、25時間、0.5×T
BE（50mMトリス−塩酸、50mMホウ酸、1mM EDTA、pH8.3）中で12℃で1.2％アガロ
ースゲルを流した。Lahayeら(1996)が記載したように、キャピラリー移動と非放
射性サザンハイブリダイゼーションを行った。

【０１８９】 AFLP／CAPS解析 CAPSとAFLP解析のためにゲノムDNAを、StewartとVia(1993)に従って単離した
。CAPSマーカーディスプレイためのプライマーPCR条件と各制限酵素を表1に示す
。CAPS解析は、20μlの容量（100pmoleの各プライマー、200μM dNTP、10mM ト
リス−塩酸、pH8.3、2mM MgCl₂、50mM KCl₂、0.5 U Taqポリメラーゼ（ベーリン
ガー（Boehringer））で、50ngのオオムギゲノム鋳型DNAを使用して行った。

【０１９０】消化したPCR産物を次に、2％アガロースゲルで連続的にサイズ分画した。AFLP
解析（Vosら、1995）は、耐性および感受性植物（Giovannoniら，1991；Michelm
oreら，1991）のバルクDNA試料で、PstIとMseI制限酵素、PstIとMseIアダプター
、および3'末端で2つまたは3つの選択的ヌクレオチドを使用それぞれPstIおよび
MseIアダプターに対応する１セットのプライマーを使用して、行った。7つのPst
I＋2（２つの選択的塩基）−および56のMseI＋3（3つの選択的塩基）−プライマ
ーを使用して、全部で392の組合せを解析した。

【０１９１】 YACSの解析のための追加の材料と方法オオムギYACライブラリースクリーニング CAPSマーカーMWG87を使用して、各96酵母クローン（Simonsら、1997）である4
28のYACプールのDNAをスクリーニングした。MWG87アンプリコンが陽性のYACプー
ルを、単一の酵母クローンの同定のためのコロニーPCRにより、さらに解析した
。観察されたアンプリコンをアガロースゲルでサイズ分離し、切断し、Quiaquic
kゲル抽出キット（キアゲン社（Quiagen GmbH）, デュッセルドルフ、ドイツ）
で精製した。

【０１９２】精製したPCR産物を、色素ターミネーター配列決定（パーキン・エルマー（Per
kin-Elmer）、ノーウォーク（Norwalk）, コネチカット州、米国）を行い、作成
したアンプリコンは、MWG87の単一のコピー遺伝子座に対応することを確認した
。次に、観察された各YACクローンを、CAPSマーカーMWG876で調べた。CAPSマー
カーMWG87とMWG876についてのサイクリング条件および使用したプライマーは、
本明細書に記載されている。コロニーPCR解析のために、最初の変性工程を、2分
から4分に延長した。

【０１９３】植物材料ジテレオソミック（diteleosomic）コムギ／オオムギ添加株の種子は、Shephe
rdとIslam 1981；Islam 1983に記載されたものである。

【０１９４】 CAPS解析 PCRベースの分析のための植物DNAは、StewartとVia 1993に従って抽出した。Y
AC末端特異的マーカーのプライマーとPCR条件は表4に示す。PCRは、20μlの容量
（100pmoleの各プライマー、200μM dNTP、10mM トリス−塩酸、pH8.3、2mM MgC
l₂、50mM KCl₂、0.5 U Taqポリメラーゼ（ベーリンガーマンハイム（Boehringer
Mannheim）、マンハイム、ドイツ）で、200／50ngのコムギ／オオムギゲノム鋳
型DNAを使用して行った。異なるYAC末端に対応するアンプリコンを、pGEM-Tベク
ター（プロメガ（Promega）、サザンプトン、英国）中にクローン化し、各PCR産
物の3つの独立したクローンについて、色素ターミネーター配列決定（パーキン
・エルマー（Perkin-Elmer））を行った。

【０１９５】 YACSのPFGEサザン解析個別のYACクローンを、30℃で、ウラシルとトリプトファンが欠如した100mlの
合成デキストロース（SD）最小培地（Roseら、1990）中で30℃で2日間増殖させ
た。高分子量酵母DNAを、Carleら（1985）が記載したように、低融点アガロース
中で調製した。

【０１９６】酵母染色体の分離は、LKB Pulsaphor（登録商標）装置（ファルマシアバイオ
テク（Pharmacia Biotech）、ウプサラ（Uppsala）、スエーデン）中で180Vで10
〜80ｓのパルス時間（直線内挿法）で、30時間、0.5×TBE（50mMトリス−塩酸、
50mMホウ酸、1mM EDTA、pH8.3）中で12℃で1.2％アガロースゲルにより行った。
Lahayeら(1996)が記載したように、キャピラリー移動と非放射性サザンハイブリ
ダイゼーションを行った。次に、MWG87を、Lahayeら（1996）が記載したように
サザンハイブリダイゼーションのプローブとして使用して、YAC挿入体のサイズ
を決定した。

【０１９７】 YAC末端配列の単離 YAC挿入体の末端配列を、Silvermanら（1989）の逆PCR（IPCR）により単離し
た。観察されたアンプリコンをアガロースゲルでサイズ分離し、切断し、Quiacu
ickゲル抽出キット（キアゲン（Quiagen））で精製し、色素ターミネーター配列
決定（パーキン・エルマー（Perkin-Elmer））を行った。YAC末端を追加のIPCR
によりさらに延長するために、各YAC末端の配列決定情報に基づき、新しいオリ
ゴヌクレオチドを推定した。

【０１９８】データベース探索 YAC末端配列の解析は、ユニックス（Unix）ユーザーのジェネティクスコンピ
ューターグループ（Genetics Computer Groups）(GSG)とSTADENソフトウェアパ
ッケージのプログラムを使用して行った（第４版、1994）。

【０１９９】実施例2．オオムギにおけるR遺伝子誘発に非依存性のRar1依存性宿主細胞の死滅の活性化 Ubi1−イントロン1（WanとLemaux、1994）が横に位置する既知のトウモロコシ
ユビキチンプロモーター（Ubi1プロモーター）の下流の、オオムギの完全長およ
び末端切断型Rar1遺伝子誘導体の過剰発現は、標準的遺伝子クローニング法（Sa
mbrookら、1989）を使用して得られる適当な作製体を供給して行われる。

【０２００】簡単に説明すると、ベクターpUBI-GFP（カールスバーグリサーチラボラトリー
（Carlsberg Research Laboratory）、コペンハーゲン、デンマーク）は、GFPを
除き、そこに目的のRAR-1遺伝子（例えば、全RAR-1遺伝子、またはそのN末端部
分もしくはC末端部分をコードする配列、例えば図5Bと図5Dの配列によりコード
されるそれぞれ図5Aと図5Cに示すもの）を挿入することにより修飾される。作製
体のクローニングの後に、これらを投与して、適当な一過性形質転換プロトコー
ルを使用して、オオムギから7日令の植物の葉を調製する。

【０２０１】一過性形質転換のための植物材料ホルデウム・ブルガレ（Hordeum vulgare）栽培種であるゴールデンプロミス
（Golden Promise）の種子を、70％エタノール中で1分間インキュベートし、Mil
li-Q水で3回洗浄し、次に1.5％塩化ナトリウムで10分間インキュベートし、無菌
Milli-Q水で5回洗浄する。2％ショ糖を補足した30mlの1/2強度のMS基本培地（シ
グマ（Sigma））とともに供給した2cmのバーミキュライトを含有するマゼンタ中
で種をまき（15種子／試料）、22℃で培養する（16時間明所／8時間暗所）。 7日令の実生の第一葉を子葉鞘の上で切断し、2つの3cmの切片に切断する。試
料をシャーレ中で3mlの10％ショ糖で3時間インキュベートすると、これで植物材
料が浮く。次にショ糖溶液を除去し、植物材料を5分間空気乾燥してから粒子衝
撃を行う。

【０２０２】一過性形質転換の方法形質転換法は、粒子流銃（PIG）（Vainら、1992）を使用する。作製体は、１
衝撃当たり1μgのQuiagen精製したプラスミドを導入して、Kleinら（1988）の方
法に従って、金粒子（1μm、バイオラッド（Bio Rad））上に沈着させる。植物
材料を、粒子出口の9cm下に置き、孔径0.4mmのスチールグリットでカバーする。
衝撃条件は：100mbarの空気圧で2735mbarのヘリウムガスを有する粒子を加速。D
NAの供給直後に、4mlの無菌の1/2強度のMS基本培地（3％ショ糖と1mMベンズイミ
ダゾールを補足）を試料に加え、次にこれを24℃で暗所で24時間インキュベート
する。

【０２０３】結果細胞死滅集団の出現を、トリパンブルー染色により確認する。葉の試料を、0.
1mg/mlトリパンブルー（シグマ（Sigma））を含有するアルコール性ラクトフ
ェノール（96％エタノール−ラクトフェノール 1:1[v/v]）中で8分間沸騰させ
て染色し、抱水クローラル溶液（2.5mg/ml）中で一晩脱色させた。一過性測定法で宿主細胞死滅を活性化するRar1作製体を、トランスジェニック
植物中でさらに修飾して選択する。

【０２０４】実施例3．病原性関連遺伝子（Pr遺伝子）からのプロモーターへの融合による
オオムギでのRar-1誘導体を活性化するB細胞死滅の発現 PR遺伝子は、病原体攻撃が試みられた部位の周りで、高レベルで活性化される
ことが知られている。細胞死滅活性化Rar-1誘導体を、オオムギ遺伝子HvPR1-aとHvPR1-bの2kbのプロ
モーター配列に融合させる（Bryngelssonら、1994）。これらの遺伝子は、うど
んこ病菌、ドレクスレラ・テレス（Drechslera teres）やプキニア・ホルデイ（
Puccinia hordei）を含む異なる病原体からの攻撃に応答して、葉の組織中で活
性化されることが知られている（ReissとBryngelsson、1996）。

【０２０５】本明細書記載の細胞死滅活性化Rar-1誘導体へのHvPR1-aとHvPR1-bプロモータ
ー配列の融合体は、uidA受容体遺伝子とトウモロコシユビキチンプロモーターの
両方を置換し、次に標準的クローニング法（Sambrookら、1989）を行うことによ
り、ベクターpAHC25（WanとLemaux、1994）中にクローン化される。栽培種ゴー
ルデンプロミス（Golden Promise）のトランスジェニックオオムギ植物は、pAHC
25中で選択性マーカー遺伝子バーを使用し、次にWanとLemaux（1994）の方法を
使用して、作成される。

【０２０６】うどんこ病菌、プキニア・ホルデイ（Puccinia hordei）、およびドレクスレ
ラ・テレス（Drechslera teres）胞子の異なる単離体を接種後に、トランスジェ
ニック株を広スペクトル耐性について試験する。記載の単離サイトカインに対す
る耐性を示す植物を観察する。

【０２０７】 R遺伝子誘発に非依存性のRar1依存性宿主細胞の死滅の活性化 Ubi1−イントロン1（WanとLemaux、1994）が横に位置する既知のトウモロコシ
ユビキチンプロモーター（Ubi1プロモーター）の下流の、オオムギの完全長およ
び末端切断型Rar1遺伝子誘導体の過剰発現は、標準的遺伝子クローニング法（Sa
mbrookら、1989）を使用して得られる作製体を供給して行われる。

【０２０８】簡単に説明すると、ベクターpU-Mlo（pUBI-GFPを1.8kbのMlo cDNA（Boschges
ら、1997；Shirasu Kら、1999、Plant J., 17(3): 293-299）は、Mloを除き、そ
こに目的のRAR-1遺伝子（例えば、全RAR-1遺伝子、またはそのN末端部分もしく
はC末端部分をコードする配列、例えば図5Bと図5Dの配列によりコードされるそ
れぞれ図5Aと図5Cに示すもの）を挿入することにより修飾される。作製体のクロ
ーニングの後に、これらを投与して、適当な一過性形質転換プロトコールを使用
して、オオムギから7日令の植物の葉を調製する（実施例2を参照されたい）。

【０２０９】結果細胞死滅集団の出現を、トリパンブルー染色により確認する。葉の試料を、0.
1mg/mlトリパンブルー（シグマ（Sigma））を含有するアルコール性ラクトフ
ェノール（96％エタノール−ラクトフェノール 1:1[v/v]）中で8分間沸騰させ
て染色し、抱水クローラル溶液（2.5mg/ml）中で一晩脱色させる。一過性測定法で宿主細胞死滅を活性化するRar1作製体を、トランスジェニック
植物中でさらに修飾して選択する。

【０２１０】実施例4．細胞死滅活性化Rar-1誘導体の双子葉植物中の発現 R遺伝子（オオムギについて実施例2のように）とは非依存性にかつ病原性関連
遺伝子（Pr遺伝子）（オオムギについて実施例3のように）からのプロモーター
への融合により行われる。植物材料の調製は、表面無菌のアラビドプシス（Arabidopsis）（生態型コロ
ンビア（Columbia））とトマト種子（栽培種マネーメーカー（Moneymaker））を
使用して、オオムギについて上記したように行われる。 4週齢の植物の葉に、p35S-Rar1作製体を含有するアグロバクテリウム（Agroba
cterium）株C58（T-DNAベクターpBIN19（Bevan, 1984）中のp35S CaMVプロモー
ターによりRar1が駆動される）を浸透させる。

【０２１１】結果細胞死滅集団の出現を、トリパンブルー染色により確認する。葉の試料を、0.
1mg/mlトリパンブルー（シグマ（Sigma））を含有するアルコール性ラクトフ
ェノール（96％エタノール−ラクトフェノール 1:1[v/v]）中で8分間沸騰させ
て染色し、抱水クローラル溶液（2.5mg/ml）中で一晩脱色させる。一過性測定法で宿主細胞死滅を活性化するRar1作製体を、トランスジェニック
植物中でさらに修飾して選択する。

【０２１２】実施例5．細胞死滅活性化At-Rar1誘導体のアラビドプシス（Arabidopsis）で
の発現糖質コルチコイド介在転写誘導系を、アラビドプシス（Arabidopsis）中の完
全長および末端切断型AtRar1遺伝子誘導体の誘導性過剰発現で使用する。 XhoIとSpeIクローニング部位を使用して、図8A〜8Hに示すものから選択される
目的のAtRar1配列（N末端部分、内部部分、またはC末端部分をコードする配列で
ある全AtRar1遺伝子）を挿入することにより、ベクターpTA231（ロックフェラー
大学、ニューヨーク、米国）を修飾する。AtRar1遺伝子断片を増幅するために使
用されるプライマーは：

【０２１３】全AtRar1について、OK228 5'-CCTCGAGACTCCTACCTTCTCAATTCGTCCG-3' および OK232 5'-AACTAGTATCAGACCGCCGGATCAGG-3'、 N末端部分について、OK228とOK229 5'-AACTAGTCAGGCCAGAACTGGTTTCTCAGTTGT-3'
、内部部分について、OK230 5'-AACTAGTCAAGCCTTTTGTACTGGAGGCGC-3' および OK231 5'-ACTCGAGATGGCCAAATCGGTTCCAAAACATC-3'、および C末端部分について、OK233 5'-ACTCGAGATGGCTGTGATAGACATTAATCAACCGC-3'とOK23
2。

【０２１４】標準的アラビドプシス（Arabidopsis）形質転換プロトコール（CloughとBent
、1998、Plant Journal 16, 735-743）により、アラビドプシス（Arabidopsis）
植物を、上記作製体を含有するアグロバクテリウム（Agrobacterium）株C58で形
質転換する。

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【０２２３】

【表１】

【０２２４】

【表２】

【０２２５】

【表３】

【０２２６】

【表４】

【０２２７】

【表５】

【０２２８】

【表６】

【０２２９】

【表７】

【図面の簡単な説明】

【図１】第1図は、オオムギRar1 cDNAのヌクレオチドおよび推定されたアミノ酸の配
列を示す。ヌクレオチドおよび推定されたアミノ酸の配列は、栽培品種イングリ
ッド（Ingrid）のRar1を使用する実験から得られたRT−PCRおよびRACEの組合わ
せされたデータに基づく。停止コドンは星印でマークされており、そしてRACE産
物の検出された末端は配列の上の矢印で示されている。

【図２】第2図は、Rar1遺伝子の構造を図解する。オオムギRar1遺伝子の構造は概略的
に与えられている。エクソンは黒色ボックスにより強調されている。イントロン
およびエクソンの位置は、RT−PCR産物とゲノム配列との比較により同定された
。突然変異rar1−1およびrar1−2について、突然変異の事象の位置が示されてい
る。

【図３】第3図は、様々の種からの遺伝子中の推定されたペプチド配列の整列を示し、
オオムギRar1に対する関係を示す。相同性の領域は黒色（同一性）、ダークグレ
ー（高度に保存的な交換）または淡いグレー（保存的交換）で強調されている。
配列のデータをジェネティックス・コンピューター・グループ（Genetics Comp
uter Group、Wisconsin Program）バージョン8（GCG；Devereux、1984）で解
析した。拡張されたGCGソフトウェアにおいて「プレッティボックス（prettybox
）」オプションを使用することによって、整列され推定されたアミノ酸配列の表
示を実施した。左の数は、各ペプチド配列の遺伝子バンクの受け入れ番号を示す
。

【図４】第4図は、コードエクソンおよびイントロンを包含する、Rar1ゲノム遺伝子配
列の10,000ヌクレオチドを示す。rar1−1およびrar1−2突然変異（両方G−＞A）
をマークする。下線が引かれている配列はRar1エクソン配列を表し、そしてボー
ルドフェースのヌクレオチドは5'および3'コンセンサススプライス配列を表す。

【図５Ａ】第5A図は、第1図のRar1ポリペプチドのN末端のフラグメントのアミノ酸配列を
示す。

【図５Ｂ】第5B図は、第5A図のRar1ポリペプチドのフラグメントをコードするヌクレオチ
ド配列を示す。

【図５Ｃ】第5C図は、第1図のRar1ポリペプチドのC末端のフラグメントのアミノ酸配列を
示す。

【図５Ｄ】第5D図は、第5C図のRar1ポリペプチドのフラグメントをコードするヌクレオチ
ド配列を示す。

【図６】第6図は、オオムギRar1タンパク質のフラグメントおよびドメインI、IIおよび
IIIのアミノ酸配列を示し、本発明の特定の面を表す。

【図７】第7図は、第6図のフラグメントおよびドメインI、IIおよびIIIをコードするヌ
クレオチド配列、これらの配列を有するポリヌクレオチド、およびこれらの配列
を含んでなるポリヌクレオチドを示し、本発明の他の面を表す。

【図８Ａ】第8A図は、コード配列を含む、AtRar1 cDNA配列を示す。

【図８Ｂ】第8B図は、AtRar1タンパク質配列を示す（また、第3図においてab010074とし
て示されている）。

【図８Ｃ】第8C図は、AtRar1タンパク質のN末端のフラグメントについてのコードヌクレ
オチド配列を示す。

【図８Ｄ】第8D図は、第8C図のヌクレオチド配列によりコードされるAtRar1タンパク質の
N末端のフラグメントを示す。

【図８Ｅ】第8E図は、AtRar1タンパク質の内部のフラグメントについてのコードヌクレオ
チド配列を示す。

【図８Ｆ】第8F図は、第8E図のヌクレオチド配列によりコードされるAtRar1タンパク質の
内部のフラグメントを示す。

【図８Ｇ】第8G図は、AtRar1タンパク質のC末端のフラグメントについてのコードヌクレ
オチド配列を示す。

【図８Ｈ】第8H図は、第8G図のヌクレオチド配列によりコードされるAtRar1タンパク質の
C末端のフラグメントを示す。

【図９】第9図は、種々の「CHORD」（「システインおよびヒスチジンに富んだドメイン
」）配列およびコンセンサス配列の整列を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｃ１２Ｒ 1:91）Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ //(Ｃ１２Ｎ 5/10 5/00 ＣＣ１２Ｒ 1:91） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者シラス，ケンイギリス国，ノーウィッチエヌアール２３ジェイエイチ，グリーブロード 107 (72)発明者ラーイエ，トーマスドイツ連邦共和国，デー−06120 ハレ，バインブルクベーク 22，ハレ，マルティンルテールウニベルシテト，インスティチュトオブジェネティクスＦターム(参考） 2B030 AA02 AB03 CA17 CA19 CD03 CD07 CD09 CD13 CD14 4B024 AA08 BA80 CA03 CA04 DA01 EA04 GA11 HA01 HA20 4B063 QA01 QA07 QA19 QQ04 QQ43 QR32 QR55 QR62 QS05 QS34 4B065 AA88X AA89X AB01 AC15 BA01 CA53 4H045 AA10 AA11 BA10 CA32 DA75 DA86 EA60 FA74

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】植物病原体防御応答シグナル伝達経路で機能するポリペプチ
ドをコードする単離されたポリヌクレオチドであって、該ポリペプチドが、図1
に示すアミノ酸配列と少なくとも70％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配
列を含むことを特徴とする上記ポリヌクレオチド。
【請求項２】前記ポリペプチドが、図1に示すアミノ酸配列を有する、請
求項1に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項３】前記ポリヌクレオチドが、図1に示すコード配列を有する、
請求項2に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項４】植物病原体防御応答シグナル伝達経路で機能するポリペプチ
ドをコードする単離されたポリヌクレオチドであって、該ポリペプチドは、スト
リンジエント条件下で、図1に示すRar1コードヌクレオチド配列の相補体である
プローブと選択的にハイブリダイズすることを特徴とする上記ポリヌクレオチド
。
【請求項５】図5A、図5Cまたは図6に示すオオムギRar1断片をコードする
単離されたポリヌクレオチド。
【請求項６】前記ポリヌクレオチドが、図5Bもしくは図5Dに示すコード配
列または図7に示すコード配列の1つを有する、請求項5に記載の単離されたポリ
ヌクレオチド。
【請求項７】図8D、図8Fまたは図5Hに示すアラビドプシス（Arabidopsis
）Rar1断片をコードする単離されたポリヌクレオチド。
【請求項８】前記ポリヌクレオチドが、図8C、図8Eまたは図8Gに示すコー
ド配列を有する、請求項7に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項９】請求項1〜8までのいずれか１項に記載のポリヌクレオチド、
または (i) 図3に示すOsRar1-h1アミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド； (ii) 図3に示すAtRar1-h1アミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド； (iii) 植物病原体防御応答シグナル伝達経路で機能するポリペプチドをコー
ドするポリヌクレオチドであって、該ポリペプチドが、上記OsRar1-h1またはAtR
ar1-h1アミノ酸配列と少なくとも70％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配
列を含むことを特徴とする上記ポリヌクレオチド； (iv) 植物病原体防御応答シグナル伝達経路で機能するポリペプチドをコード
するポリヌクレオチドであって、該ポリペプチドが、ストリンジエント条件下で
、該OsRar1-h1をコードするジーンバンク受け入れ番号C28356またはAtRar1-h1を
コードするジーンバンク受け入れ番号AB010074のコードヌクレオチド配列の相補
体であるプローブと選択的にハイブリダイズすることを特徴とする上記ポリヌク
レオチド；よりなる群から選択されるポリヌクレオチドが、発現のための制御配列に機能的
に連結している、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１０】そのヌクレオチド配列が、コード配列の発現のアンチセン
スまたはセンス調節（「同時抑制」）での使用に適しており、かつ転写のための
制御配列の支配下にあるコード配列または請求項1〜19のいずれか１項に記載の
核酸のコード配列に相補的な配列の、少なくとも50個の連続ヌクレオチドの配列
に相補的な、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１１】以下の式の1つに一致するCHORDアミノ酸配列からなるペプ
チドをコードする単離されたポリヌクレオチド： (i) C-x₃-G-C-x₃-A₁-x_6-9-C-x₂-H-x₅-F-y₁-A₂-x_1-2-A₃-x₁-W-x₁-C-C-x₁₅-C-x₄ _-5 -H (ii) C-x₂-C-x₆-C-x₂-H （式中、C、G、FおよびWは、それぞれCys、Gly、PheおよびTrpの一文字コードで
あり、 A₁は、芳香族アミノ酸であり、 A₂は、陰性に荷電した残基であり、 A₃は、陽性に荷電した残基であり、 y₁は、Hまたは任意のアミノ酸であり、好ましくはHisまたはArgであり、ｘは任意のアミノ酸であり、数値は、アミノ酸の数を示す）、およびペプチド(i)は亜鉛に結合する。
【請求項１２】植物細胞の形質転換に適し、かつ請求項1〜11のいずれか
１項に記載のポリヌクレオチドを含む、核酸ベクター。
【請求項１３】異種ポリヌクレオチドまたは請求項1〜12のいずれか１項
に記載の核酸ベクターを含有する宿主細胞。
【請求項１４】微生物である請求項13に記載の宿主細胞。
【請求項１５】植物細胞である請求項13に記載の宿主細胞。
【請求項１６】その染色体内に異種ポリヌクレオチドを有する、請求項15
に記載の植物細胞。
【請求項１７】 1つのハプロイドゲノム当たり2つ以上のポリヌクレオチド
を有する請求項16に記載の植物細胞。
【請求項１８】植物、植物の一部もしくは植物の胎芽、または植物の抽出
物もしくは誘導体に含まれる、請求項15〜17のいずれか１項に記載の植物細胞。
【請求項１９】形質転換により、ポリヌクレオチドまたは核酸ベクターを
細胞中に取り込むことを含んでなる、請求項13〜17のいずれか１項に記載の細胞
の産生方法。
【請求項２０】前記ポリヌクレオチドと細胞ゲノム核酸をと、これがその
中で安定に取り込まれるように組換えることを含んでなる、請求項19に記載の方
法。
【請求項２１】１つまたはそれ以上の形質転換細胞から植物を再生するこ
とを含んでなる、請求項19または20に記載の方法。
【請求項２２】請求項15〜17のいずれか１項に記載の植物細胞を含む植物
。
【請求項２３】請求項15〜17のいずれか１項に記載の植物細胞を含む植物
の一部または胎芽。
【請求項２４】請求項1〜12のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドま
たは核酸ベクターを植物細胞中に導入し、該植物細胞から植物を再生することを
含んでなる、植物の産生方法。
【請求項２５】該植物細胞から再生した植物の子孫を有性生殖的または無
性生殖的に繁殖または増殖させることを含んでなる、請求項24に記載の方法。
【請求項２６】植物の細胞内で請求項1〜11のいずれか１項に記載の異種
ポリヌクレオチドから転写を引き起こすかまたは転写を許容することを含んでな
る、植物の特徴に影響を与える方法。
【請求項２７】トランスジェニック植物の産生における、請求項1〜11の
いずれか１項に記載のポリヌクレオチドの使用。
【請求項２８】植物病原体防御応答シグナル伝達経路で機能するポリペプ
チドをコードするポリヌクレオチドを同定するかまたは得るための方法であって
、ストリンジエント条件下で、請求項4に記載のポリヌクレオチドまたはその相
補体に選択的にハイブリダイズする核酸分子を使用して、候補核酸をスクリーニ
ングすることを含んでなる、上記方法。
【請求項２９】図1のコード領域に示す配列またはこれに相補的な配列で
ある、少なくとも約20〜30ヌクレオチドのヌクレオチド配列を有する核酸プロー
ブまたはプライマー。
【請求項３０】請求項1〜9のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドのコ
ード領域の断片の増幅に適した、請求項29に記載の一対のプライマー。
【請求項３１】植物病原体防御応答シグナル伝達経路で機能するポリペプ
チドをコードするポリヌクレオチドを、植物または植物細胞から同定するかまた
は得るための方法であって、請求項29または請求項30に記載の核酸プローブまた
はプライマーを使用することを特徴とする上記方法。
【請求項３２】請求項31に記載の方法であって、 (a) 植物細胞から核酸調製物を提供し、 (b) 請求項29に記載のプローブを提供し、 (c) 核酸調製物とプローブとを、該プローブと該ポリペプチドをコードする
核酸との選択的ハイブリダイゼーションのための条件下で、接触させ、 (d) 該ポリペプチドをコードする該核酸を（もし存在する場合は）、プロー
ブとのハイブリダイゼーションにより同定し、そして所望により (e) 発現系中の発現により核酸にコードされる該ポリペプチドの本体を確認
し、植物病原体防御応答シグナル伝達経路で機能する能力を測定する、ことを含んでなる上記方法。
【請求項３３】請求項31に記載の方法であって、 (a) 植物細胞から核酸の調製物を提供し、 (b) 請求項30に記載の一対のプライマーを提供し、 (c) 該調製物中の核酸と該プライマーとを、PCRを行うための条件下で接触さ
せ、 (d) PCRを行い、増幅されたPCR産物の有無を決定し、そして所望により (e) 発現系中の発現により、増幅されたPCR産物の本体を確認し、植物病原体
防御応答シグナル伝達経路で機能する、産生されたポリペプチドの能力を測定す
る、ことを含んでなる上記方法。
【請求項３４】請求項1〜9のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドにコ
ードされる単離されたポリペプチド。
【請求項３５】請求項34に記載のポリペプチドに対する特異的結合親和性
を有する抗原結合部位を含む単離された抗体。
【請求項３６】請求項35に記載の抗体の抗原結合部位を含むポリペプチド
。
【請求項３７】請求項35または36に記載の抗体またはポリペプチドで候補
ポリペプチドをスクリーニングすることを含む、請求項34に記載のポリペプチド
を同定するかまたは得るための方法。
【請求項３８】請求項11に記載のポリヌクレオチドにコードされる単離さ
れたペプチド。