KR100425525B1 - 조산과 태아감염 및 태아손상을 산전 진단하기 위한진단시약 및 진단키트 - Google Patents

조산과 태아감염 및 태아손상을 산전 진단하기 위한진단시약 및 진단키트 Download PDF

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Abstract

본 발명은 조산과 태아감염 및 태아손상을 산전 진단하기 위한 진단시약 및 진단키트에 관한 것으로서, 구체적으로 산모의 양수에서 MMP-8(matrix metalloproteinase-8)의 농도를 측정함으로써 산전에 조산과 태아감염 및 태아손상을 검사하는 방법과 이를 이용하는 진단시약 및 진단키트에 관한 것이다. 본 발명의 진단시약 및 진단키트는 조기 양막파쇄 증상이나 조산의 증상을 나타내는 산모뿐만 아니라 이러한 증상을 전혀 나타내지 않는 무증상 산모에서도 조산과 태아감염 및 태아손상을 산전에 미리 진단할 수 있으며 기존에 태아 혈액내 사이토카인을 측정하는 방법에 비해여 양수내 MMP-8의 농도를 측정함으로써 덜 침습적이면서 높은 민감도와 특이도를 갖으므로 조산과 태아감염 및 태아손상의 산전진단에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

조산과 태아감염 및 태아손상을 산전 진단하기 위한 진단시약 및 진단키트{Diagnostic agents for detecting premature birth, fetal infection and fetal damage and diagnostic kit containing the same}
본 발명은 조산과 태아감염 및 태아손상을 산전 진단하기 위한 진단시약 및 진단키트에 관한 것으로서, 구체적으로 산모의 양수에서 MMP-8(matrix metalloproteinase-8)의 농도를 측정함으로써 산전에 조산과 태아감염 및 태아손상을 검사하는 방법과 이를 이용하는 진단시약 및 진단키트에 관한 것이다.
의학계에서는 조산(조기분만, preterm birth)이나 양막파쇄(rupture of fetal membranes)를 방지하는 것이 그 이후에 치료를 수행하는 것 보다 더 바람직한 것으로 인식되어 왔지만, 여러 가지 다양한 원인에 의해 조산이나 양막파쇄가 유발되기 때문에 그 문제의 해결이 쉽지 않았다. 현재 조산을 방지하기 위한 일반적인 접근방법은 산부인과학적으로, 인구통계학적으로 및 여러 가지 증후군에 따라 특별한 주의를 기울여야하는 여성군을 확인하는 것이었으나(Main et al.,Am. J. Obste. Gynecol., 151:892-898, 1985), 이러한 접근 방법은 그 방식이 민감하거나 특이적이지 않다는 문제점이 지적되어 왔다. 이러한 문제점을 극복하기 위하여, 갑작스런 조산이나 양막파쇄를 예견하기 위한 생화학적인 표지자를 발견하기 위하여 많은 연구가 시행되어 왔는데, 플라즈마 에스트라디올-17 베타(plasma estradiol-17 beta), 프로게스테론(progesterone), C-반응성 단백질(C-reactive protein)과 같은 물질들이 후보로 지명되었으나 이 역시 그 정확도가 떨어지는 것으로 나타났다.
이러한 생화학적인 표지자의 개발 이외에도 조기양막 파쇄의 연구를 통하여 융모막 구조가 결합조직 구조로 이루어져 있고 콜라겐(collagen)의 함량이 섬유성 결합 조직(fibrous connective tissue)의 장력을 결정한다는 사실을 바탕으로 콜라겐의 생화학적 기작을 연구하는 데에도 상당한 관심이 모아졌다. 일부 연구자들은 조기에 파쇄되는 양막을 정상막과 비교하였을 때 파쇄된 막에서 콜라겐 함량이 매우 낮은 것을 발견하였고, 이러한 현상은 파쇄된 양막의 장력이 정상막보다 낮기 때문이라고 보고한 바 있다(Obstet. Gynecol., 57:487-489, 1981). 또 다른 연구에 의하면, 조기 파쇄된 양막과 조산한 여성의 혈청에서 콜라겐 분해효소의 활성이 높게 나타나는 것이 알려져 있으나(Obstet. Gynecol., 75:84-88, 1990), 아직까지 이러한 생화학적인 변화에 대한 정확한 기작은 밝혀지지 않았다(FEBBs Letters, 244(2):315-318, 1989).
한편, 임신 37주 이전에 분만하는 조산의 발생 빈도는 약 8 내지 10%로 우리나라에서는 매년 약 5만명의 신생아가 조산되는 것으로 추산되고 있다. 조산은 조산아 패혈증, 조산아 호흡부전, 폐렴, 기관지폐이형성증, 뇌실질내 출혈 및 괴사성 장염과 같은 신생아 합병증과 뇌성마비 등과 같은 심각한 질병을 유발하는 경우가 많다. 조산의 시기가 빠를수록 이러한 후유증을 남길 가능성이 높고 후유증의 정도도 심하기 때문에 조산을 예방하고 치료할 수 있다면 미숙아와 그로 인한 장애아의 발생률을 현저하게 줄일 수 있을 것으로 추론되고 있다.
최근 밝혀진 바에 의하면 조산의 30 내지 40%가 자궁 내 감염에 의한 것이라고 보고되고 있다(Butler NR., Bonham DG.,Prenatal mortality. The first report of the British perinatal mortality survey, Edinburgh, Churchill Livingstone, 115-145, 1963; Romero R., Avila C., Sepulveda W.,Preterm birth. Cause, prevention, and management.,McGrow-Hill Company, 97-136, 1993; Romero R., Mazor M.,Clin. Obstet. Gynecol.,31:553, 1990; Gibbs RS., Romero R., Hiller SL., et al.,Am. J. Obstet. Gynecol.,166:1515, 1992).
자궁내 감염이 조산과 태아 손상을 유발하는 과정을 살펴보면, 자궁내 감염이 발생하면 모체와 태아의 면역체계가 활성화되어 임파구에서는 사이토카인이, 중성백혈구에서는 MMP(matrix-metalloproteinase)와 같은 염증 매개 물질이 분비된다. 이러한 염증 매개 물질의 농도가 일정수준에 도달하면, 자궁수축을 촉진하는 프로스타글란딘(prostaglandin)이 형성되고 그 결과 분만진통이 유발되어 조산이 일어나게 된다. 또한, 이와 같이 증가된 염증 매개 물질은 태아의 전신에 작용하여 태아 염증반응 증후군(fetal inflammatory response syndrome, FIRS)을 일으키는데, 이는 성인에게서 염증 매개 물질이 패혈증이나 급성 호흡부전 증후군을 유발하거나 자가 면역질환에서 장기 손상을 유발하는 것과 마찬가지로 태아의 전신 장기가 염증 매개 물질에 의해 손상받게 되어 뇌실주위 백질연화증 및 기관지폐이형성증 등이 발생하게 된다. 따라서, 산전에 자궁내 감염을 진단하는 것은 조산과 태아손상을 방지하기 위하여 매우 중요한 일이다.
한편, 현재 일반적으로 사용되고 있는 태아의 자궁내 감염을 진단하는 방법으로는 제대천자(cordocentesis)를 시행하여 태아의 혈액내 사이토카인의 농도를 측정하는 방법이나 분만 후 태아의 제대 조직검사를 통해 제대염(funisitis)을 확인하는 방법이 사용되고 있으나, 제대천자는 침습적인 방법이므로 이용에 제한이 있고 제대염의 진단은 분만 후에만 가능하다는 문제점이 있는 것으로 지적되고 있다(Yoon BH., Romero R., Park JS., Kim CJ., Kim SH., Choi JH., Han TR.,Am. J. Obstet. Gynecol., 182:675-81, 2000; Yoon BH., Romero R., Kim KS., Park JS., Ki SH., Kim BI., Jun JK..Am. J. Obstet. Gynecol., 181:773-9, 1999; Romero R., Gomez R., Ghezzi F., Yoon BH., Mazor M., Edwin SS., Berry SM.,Am. J. Obstet. Gynecol., 179:186-93, 1998).
또한, 임신 중 자궁내 감염이나 염증이 유발되면 양수내 중성백혈구의 수가 증가되는데, 이와 같이 증가된 중성백혈구들이 태아로부터 유래하는 것으로 밝혀져있다(Knauper V., Kramer S., Reinke H., Tschesche H.,Eur. J. Biochem., 189:295-300, 1990; Blaser J., Triebel S., Maasjosthusmann U., Romisch J., Krahl-Mateblowski U., Freudenberg W., Fricke R., Tschesche H.,Clinic.Chim. Acta.,244:17-33, 1996; Segura-Valdez L., Pardo A., Gaxiola M., Uhal BD., Becerril C., Selman M.,Chest.,117:684-94, 2000; Romanelli R., Mancini S., Laschinger C., Overall CM., Sodek J., McCulloch CA.,Infect. Immun., 67:2319-26, 1999; Maymon E., Romero R., Pacora P., Gomez R., Athayde N., Edwin S., Yoon BH.,Am. J. Obstet. Gynecol., 183:94-9, 2000). 이에 본 발명자는 자궁내 감염과 이에 따른 태아로부터의 중성백혈구의 증가가 MMP-8과 같은 기질단백질 분해효소를 통해 조산 및 조산과 관련된 태아손상 등을 유발할 것으로 추론하였다
기질단백질 분해효소인 MMP(matrix metalloproteinase)는 공통된 구조 및 기능을 가지는 일군의 아연을 함유한 기질단백질 분해효소로서 세포외 기질 단백질(extracellular matrix protein)을 분해하는 작용을 한다. MMP는 크게 다섯 군으로 구분되며, MMP-8은 MMP-1, MMP-13과 함께 간질 콜라게나아제(interstitial collagenase)에 속한다. MMP-8은 다른 간질 콜라게나아제들과 크기는 유사하나 훨씬 많이 당화(glycosylation)되어 있어서 완전히 당화된 전효소형(proenzyme form-full glycosylation)은 85 kD이고 이것이 활성화되면 15 내지 25 kD이 소실되어 60 내지 70 kDa의 활성형이 된다. MMP-8의 전형(rpoMMP-8)은 실험적 조건에서 트립신(trypsin), 카이모트립신(chymotrypsin), 카텝신 G(cathepsin G)와 같은 다양한 단백질 분해효소에 의해 활성화되며 유기 수은제(organomercurial compound)와 같은 물질에 의해서도 활성화된다. 생체 내에서 MMP-8의 활성화 기작은 아직까지 완전히 밝혀져 있지 않다.
현재 MMP-8에 대한 선행 기술로는 MMP-8 단클론 항체를 이용하여 민감하고 특이적으로 치주질환을 진단할 수 있는 방법과 키트가 보고되어 있다(미국 특허 출원 제 5,736,341호). 상기에서는 MMP-8이 치주염이 진행되는 동안 일어나는 결합조직의 붕괘와 직접적으로 연결되어 있으며 치육의 틈새 액(gingival crevicular fluid)에 존재하는 치육의 포켓(gingival pocket)을 통하여 구강 공동(cavity)내로 확산되므로 MMP-8의 농도를 측정함으로써 부위 특이적으로 치주질환을 결정할 수있음을 제시하고 있다. 즉, 상기 방법은 진행중인 치주질환을 생화학적으로 특이적이면서도 민감하게 진단하기 위하여 MMP-8의 전형이 치주 감염시 염증반응이 진행되면서 활성형으로 전환되는 점을 이용하여 MMP-8의 전형이 비활성형에서 활성형으로 전환되는 것을 측정하는 방법이다. 그러나, 아직까지 조산과 태아감염 및 손상과 관련하여 MMP-8을 사용한 예는 보고된 바 없다.
한편, 또 다른 기질 단백질 분해 효소로 MMP-8과는 다른 군에 속한 MMP-9를 이용하여 조기 양막파쇄를 예견하는 방법이 보고된 바 있다(미국 특허 출원 제 5,641,636호). MMP-9는 분자량이 92 kDa인 제 4형 콜라게나아제/젤라티나아제 또는 젤라티나아제 B로 MMP중 갖아 분자량이 큰 효소로 알려져 있다. MMP-9의 전형(proMMP-9)은 활성화되어 83 KDa의 중간체를 형성한 후 완전히 활성화되면서 67 KDa의 MMP-9가 형성되기 때문에(J. Biol. Chem., 267(30):21712-21719, 1992), "MMP-9의 활성"은 젤라틴 분해 활성을 가진 83 KDa의 중간체와 67 kDa의 완전 활성형의 활성을 의미한다. 상기 선행기술은 이러한 MMP-9의 활성을 이용하여 변성된 콜라겐, 예를 들면 젤라틴을 가수 분해하는 활성을 측정하므로써 조기 양막파쇄를 진단하는 방법이다. 그러나, MMP-9는 분만 개시전에 이미 양수내에 존재하기 때문에 상기 선행기술의 진단방법을 이용하여 조기 양막파쇄를 예견하는 것에는 한계가 있다.
아울러, 조기 분만 진통 또는 조기 양막파쇄 환자의 약 30 내지 40%가 조산을 경험하게 되는데, 이런 경우 조산을 하는 환자의 양수내에서 농도가 증가한다고알려진 물질로는 인터루킨-6(unterleukin-6),인터루킨-8(interleukin-8), TNF-α, 인터루킨-1β(interleukin-1β), 인터루킨-1α(interleukin-1α), GROα, RANTES, 백혈구(white blood cell), MIP-1α, MCP-1, 글루코오스, PGE2, 안지오제닌(angiogenin) 등이 있다. 그러나, 상기 물질들은 무증상 산모의 양수에서는 별 변화가 없거나, 검출되지 않다가 조기 분만 진통 또는 조기 양막파쇄등의 증상이 나타난 후에 그 농도가 증가하게 되므로 조산의 진단에는 그 유용성이 매우 떨어진다.
이에, 본 발명자들은 기존의 제대천자를 시행하여 태아 혈액 내의 사이토카인을 측정하는 방법의 침습적인 문제점과 분만 후 태아의 제대 조직검사를 통해 제대염을 확인하는 문제점을 해결하고 조기 양막파쇄 또는 조산의 증상을 보이는 산모 뿐 아니라 무증상 산모에서도 조산과 태아감염 및 태아손상을 조기에 진단하기 위하여, 상기 물질들과는 달리 조산하는 환자의 양수에서 뿐 아니라 무증상 산모의 양수에서도 MMP-8의 활성이 검출되는 점에 착안하여 무증상 산모의 양수내 MMP-8의 농도를 측정함으로써 조산과 태아감염 및 태아손상을 산전에 진단할 수 있는 진단시약 및 진단키트를 개발함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 목적은 산전에 조산 증상이나 조기 양막파쇄 증상을 보이는 산모에서 뿐만 아니라 무증상 산모에서도 조산과 태아감염 및 태아손상을 진단하여 조산을 방지하고 신생아의 이환, 뇌성마비와 같은 심각한 합병증 및 후유증을 예방하기 위한 진단시약 및 진단키트를 제공하는 것이다.
도 1은 무증상 산모에서 조산 및 만삭분만에 따른 양수내 MMP-8의 농도 분포도를 IL-6의 농도와 비교하여 나타낸 것이고,
도 2는 조산을 예측할 수 있는 진단지표를 정하기 위하여 양수내 MMP-8의 민감도와 특이도를 리시버-작동 특징 커브(receiver-operating characteristic curve)로 나타낸 것이고,
도 3은 제대염(funitis) 여부에 따른 양수내 MMP-8의 농도 분포도를 나타낸 것이고,
도 4는 제대염을 예측할 수 있는 진단지표를 정하기 위하여 MMP-8의 민감도와 특이도를 리시버-작동 특징 커브로 나타낸 것이고,
도 5는 뇌성마비 발생 여부에 따른 양수내 MMP-8의 농도 분포도를 나타낸 것이고,
도 6은 뇌성마비를 예측할 수 있는 진단지표를 정하기 위하여 MMP-8의 민감도와 특이도를 리시버-작동 특징 커브로 나타낸 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 산모의 양수내 MMP-8의 농도를 측정함으로써 산전에 조산과 태아감염 및 태아손상을 검사하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 산모의 양수내 MMP-8의 농도를 측정함으로써 산전에 조산과 태아감염 및 태아손상을 검사하는 방법을 이용하는 진단시약 및 진단키트를 제공한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 산모의 양수내 MMP-8의 농도를 측정함으로써 산전에 조산과 태아감염 및 태아손상을 검사하는 방법을 제공한다.
MMP-8은 일군의 아연을 함유한 기질 단백질 분해효소로서 세포외 기질 단백질을 분해하는 작용을 한다. MMP-8은 갖리 콜라게나아제로서 단화율이 매우 높은데, 완전히 당화된 전효소형은 85 kDa이고 이것이 활성화되면서 60 내지 70 kDa의 활성형이 된다. 생체내에서 MMP-8은 활성 산소종이나 수화라디칼과 같은 산화제에 의해 활성화되며 이로 인해 아미노산 말단 부위가 제거되고 효소활성부위가 노출되는 것으로 알려져 있다.
MMP-8은 주로 중성백혈구에서 MMP-8의 전형으로 생성되어 과립 내에 저장된상태로 존재하다가 자극을 받으면 과립 외부로 분비된다. 이와 같이 분비된 MMP-8은 세포외 간질에서 활성화되어 제 1형, 2형, 3형의 콜라겐(type Ⅰ, II, Ⅲ의 collagen) 등을 분해하는데, 특히 제 1형 콜라겐(type I collagen)에 대한 특이도가 높다. MMP-8은 염증반응에 의한 조직손상의 주요한 매개물질로서 치주염, 만성폐쇄성 폐질환, 류마티스성 관절염 등의 염증성 질환에서 조직 손상에도 관여하는 한편, 분만과정에서는 자궁경관의 소실과 개대를 유발하여 분만의 진행에 관여하는 것으로 알려져 있다.
본 발명자들은 이러한 MMP-8이 조기 양막파쇄 및 조산의 증상을 보이는 산모들 뿐 아니라 상기 증상이 없는 임신 중기의 무증상 산모에서도 양수내 농도가 기준량 이상인 경우에는 조산하게 됨을 발견하고 이를 이용하여 산전에 조산과 태아감염 및 태아손상을 검사하는 방법을 개발하였다.
본 발명의 양수내 MMP-8의 농도를 측정함으로써 산전에 조산과 태아감염 및 태아손상을 검사하는 방법은
1)임신 중기에 산모로부터 양수를 채취하는 단계; 및
2)채취한 양수내 MMP-8(matrix metalloproteinase)의 농도를 측정하는 단계로 구성된다.
단계 1에서 산모는 조기 분만진통 또는 양막파수 등의 조산 증상을 보이는 산모 뿐 아니라 이러한 증상이 없는 무증상 산모 모두를 대상으로 할 수 있다.
또한, 단계 1의 양수채취는 초음파로 자궁내를 관찰하면서 복부를 통해 천차후 채취하거나 그외 일반적인 양수 분리 방법을 통해 이루어질 수 있다.
단계 2에서 양수내 MMP-8의 농도를 측정하는 방법은 항원-항체 결합을 원리로 하는 모든 분석방법이 사용될 수 있으며, 바람직하게는 ELIZA(enzyme-linked immunosorbant assay) 방법이 사용될 수 있다.
본 발명자들은 상기 MMP-8의 농도를 측정함으로써 산전에 조산과 태아감염 및 태아손상을 검출하는 방법이 상기 목적에 적합하게 사용될 수 있는지 확인하기 위하여 하기와 같은 실험을 수행하였다.
우선, 임신 중기의 조산을 예측하기 위한 진단지표로서 MMP-8의 효율성을 확인하기 위하여 임신 중기에 무증상 상태에서 양수천자를 시행 받고 임신 32주 전에 자연 조산한 경우와 만삭 분만한 경우에서 양수내 MMP-8의 농도를 또 다른 염증 표지자인 IL-6의 농도와 비교하였다. 그 결과, 조산한 경우에 있어서 양수내 MMP-8의 농도와 IL-6의 농도는 모두 통계학적으로 유의성 있게 높게 나타났고, 양수내 MMP-8의 농도가 10 ng/㎖ 보다 큰 경우는 모두 조산하였다(도 1참조). 또한, 조산을 예측하는 민감도와 특이도에 있어서 MMP-8이 IL-6 보다 우수하였고 민감도와 양성률을 모두 고려할 때 조산 예측을 위한 MMP-8의 농도가 10 ng/㎖이 적당함을 확인하였다.
상기 결과로부터, 임신 중기의 양수에서 MMP-8이 상승된 경우는 임신 32주 이내에 조산될 위험성이 높음을 알 수 있었다. 따라서, 염색체 검사를 위해서 임신 중기에 양수검사를 시행하는 경우 조산을 검사하기 위한 진단지표로서 양수내 MMP-8의 농도를 측정하는 것은 조산을 검사하는데 유용하게 사용될 수 있을 것이다.
진단지표로 양수내 MMP-8의 농도를 측정함으로써 태아감염 및 태아손상을 진단하기 위하여, 임신 주수가 36주 미만인 단태아를 조산하였고 조산 전 72시간 이내에 양수검사를 받은 연속적인 산모를 대상으로 하여 양수내 균을 배양하고 MMP-8의 농도를 ELIZA 면역검사법으로 측정하였고 출산 후 태반으로 조직학적 검사를 시행하였다. 양수 배양결과가 양성인 경우는 음성인 경우보다 통계학적으로 유의성 있게 MMP-8의 농도가 상승되어 있었고 태반의 조직학적 융모막염이 있는 경우는 염증이 없는 경우보다 MMP-8의 농도가 유의성 있게 상승되어 있었다(표 1내지표 4참조).
상기 결과들로부터 양수가 균에 감염된 경우에는 양수내 MMP-8이 유의하게 증가되고 양수내 MMP-8의 농도를 측정함으로써 자궁내 감염을 진단할 수 있으며, 조직학적 융모양막염이 있는 경우 역시 양수내 MMP-8의 농도가 유의하게 증가되어 양수내 MMP-8의 농도를 측정하여 자궁내 염증을 진단할 수 있음을 확인하였다. 따라서, 조산을 검사하기 위한 진단지표로서 양수내 MMP-8의 농도 측정은 자궁내 감염과 염증을 모두 효과적으로 진단할 수 있으며, 특히 자궁내 염증의 진단에 더 높은 특이도와 양성예측도를 보이는 것을 알 수 있었다.
또한, 본 발명자들은 보다 직접적으로 태아감염을 진단하기 위하여 제대염 여부에 따른 양수내 MMP-8의 농도를 비교하였다.
태아염증반응 증후군(fetal inflammatory response syndrome, FIRS)은 태아의 전신 여러 기관에 영향을 미치는 질환으로서, 조산이 일어날 가능성이 높고 신생아에서도 여러 합병증이나 후유증이 발병될 가능성이 높은 상태를 말한다. 제대의 염증(제대염, funisitis)은 이런 태아염증반응 증후군의 조직학적 증거로 생각되고 있으며 출생 후 뇌성마비의 발병과도 관련성이 높은 것으로 알려져 있다. 또한, 양수내에서 발견되는 중성백혈구가 태아로부터 유래된다는 사실에 착안하여 본 발명자들은 상기 중성백혈구로부터 분비되는 MMP-8의 농도를 측정하는 것이 태아염증반응 증후군의 지표가 될 수 있을 것으로 생각하고 제대염의 여부와 양수내 MMP-8농도의 상관관계를 조사하였다. 그 결과, 제대염이 있는 경우에는 제대염이 없는 경우보다 MMP-8의 농도가 통계학적으로 유의성 있게 상승되어 있었고 MMP-8의 제대염에 대한 진단 수행능력 역시 매우 높은 특이도, 민감도 및 음성예측도를 나타내었다(표 5및표 6, 도 3및도 4참조).
이러한 결과들로부터 양수내 MMP-8의 농도가 태아감염(제대염)과 밀접한 관련이 있음을 확인하였고, 따라서 태아감염을 진단하기 위해 기존의 침습적인 방법인 태아 혈액 검사를 하지 않고도 간단히 양수내 MMP-8의 농도를 측정함으로써 태아감염 여부를 용이하게 진단할 수 있을 것이다.
상기에서 MMP-8의 농도를 측정하는 것이 태아감염의 진단에 효과적인 검사가 될 수 있음을 확인한 본 발명자들은 패혈증, 신생아 호흡부전, 폐렴, 기관지폐이형성증, 괴사성 장염, 뇌실질내 출혈 등의 신생아 이환을 예측하기 위하여 MMP-8의농도를 측정하였다. 그 결과, 신생아 이환이 있는 경우에 신생아 이환이 없는 경우보다 MMP-8의 농도가 통계학적으로 유의성 있게 상승되어 있었고(표 7), MMP-8의 신생아 이환에 대한 진단 수행능력 역시 특이도, 양성 및 음성예측도에서 높은 확률을 나타냄을 확인하였다(표 7및표 8). 또한, 신생아 혈액에서 균이 검출된 패혈증의 경우에 양수내 MMP-8의 농도가 그렇지 않은 경우보다 유의성 있게 상승되어 있었다(p<0.05)(표 9).
이러한 결과들로부터 양수내 MMP-8의 농도가 신생아 패혈증 및 주산기 이환의 위험성을 진단할 수 있는 진단지표로 유용하게 사용될 수 있음을 확인하였다.
자궁내 감염/염증은 뇌성마비의 주요 원인으로 알려져 있으며, 태아염증반응 증후군은 만삭아와 조산아에서 태아의 뇌손상을 유발하는 것으로 여겨지고 있다. 또한, 자궁내 염증의 대표적 표식자인 양수내 중성백혈구가 태아로부터 유래하며 상기 실시예 2 및 3을 통하여 여기서 분비되는 MMP-8의 농도가 자궁내 감염/염증때 양수내에서 상당히 증가하는 것이 입증되었다. 이에 본 발명자들은 양수내 MMP-8의 농도와 생후 3세에 뇌성마비로 진단받은 경우와의 관련성을 확인하고자 하였다.
그 결과, 뇌성마비를 일으킨 태아의 경우에 MMP-8의 통계학적으로 유의성 있게 상승되어 있었고(도 5), MMP-8의 뇌성마비에 대한 진단 수행능력이 매우 우수함을 확인하였다(도 5및도 6,표 11참조).
이러한 결과로부터 양수내 MMP-8의 농도가 증가된 경우에 뇌성마비로 진행될 가능성이 6배 이상 증가된 것을 알 수 있었다. 따라서, 양수내 MMP-8의 농도는 산전에 뇌성마비의 위험성을 예측할 수 있는 진단지표로 유용하게 사용될 수 있다.
상기 결과들을 통하여 본 발명에서는 MMP-8의 조산과 태아감염 및 태아손상을 예측하기 위한 진단지표로서의 진단 수행능력을 위한 바람직한 기준량을 제시하였다. 우선, 조산의 예측을 위한 양수내 MMP-8의 농도 기준량은 10 ng/㎖ 이상으로 정하는 것이 바람직하고, 주산기 위험성을 예측하기 위해서는 15 ng/㎖ 이상으로, 태아감염(제대염)의 진단을 위해서는 26 ng/㎖ 이상으로, 뇌성마비의 진단을 위해서는 53 ng/㎖ 이상으로 정하는 것이 바람직하다.
또한, 본 발명은 산모의 양수내 MMP-8의 농도를 측정함으로써 산전에 조산과 태아감염 및 태아손상을 검사하는 방법을 이용하는 진단시약 및 진단키트를 제공한다.
본 발명의 양수내 MMP-8의 농도를 측정하는 진단시약 및 진단키트는 일예로서 기질에 MMP-8 항체를 흡착시킨 후 양수내 MMP-8의 농도를 측정하는 방법으로 하기와 같이 구성될 수 있다.
상기 진단시약 및 진단키트의 기질에 MMP-8 항체를 흡착시켜 양수내 MMP-8을 측정하는 방법은
1) 기질에 MMP-8 항체를 흡착시키는 단계;
2) MMP-8 항체가 흡착된 기질에 양수를 첨가하여 반응시킨 후 세척하는 단계;
3) 상기 막에 발색효소 또는 형광물질이 결합된 항체를 첨가하여 반응시키는 단계;및
4)상기 기질에 발색제를 첨가하여 발색을 유도한 후 항체반응의 특이도를 관찰하는 단계로 구성된다.
단계 1의 기질은 니트로셀룰로오즈 막, 폴리비닐(polyvinyl) 수지로 합성된 96-웰 플레이트, 포리스티렌(polystyrene) 수지로 합성된 96-웰 플레이트 및 유리로 된 슬라이드글라스 등이 사용될 수 있다.
단계 3에서 항체에 결합된 발색효소는 퍼옥시다아제(peroxidase), 알칼라인 포스파타아제(alkaline phosphatase), 바이오틴(biotin)등이 사용될 수 있고, 형광물질은 FITC 및 TRITC 등이 사용될 수 있다.
단계 4에서 발색제는 4CN(4-chloro-1-naphtol), DAB(diaminobenzidine), AEC(aminoethyl carbazol), ABTS[2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfo-
nic acid)], OPD(o-phenylenediamine) 또는 TMB(tetramethyl benzidine)가 사용될 수 있다.
상기 진단시약 및 진단키트의 MMP-8 분석원리는 MMP-8에 특이적인 단일클론성 항체를 키트내 고정화시킨 후 시료를 가하여 시료 중의 MMP-8이 항체와 결합하는 것을 이용한다. 우선, 결합하지 않은 항체를 여러 번 세척한 후 효소가 결합된 MMP-8 단일클론성 항체나 다클론성 항체를 가하고 세척하여 다시 결합되지 않은 효소결합 MMP-8 단일클론성 항체 또는 다클론성 항체를 제거한다. 여기에 과산화물과 발색제를 기질로 가하면 MMP-8의 양에 비례하여 발색 반응이 나타나게 되고, 산성용액을 가하여 반응을 정지시킨 후 450 nm에서 흡광도를 측정한다. 이때, 항체로는 호스라디쉬 다클론성 항체(horseradish multiclonal antibody), 비오틸화된 토끼 다클론성 항체(biotinylated rabbit multiclonal antibody) 또는 단일클론성 항체(monoclona antibody)들이 사용될 수 있다.
상기 MMP-8의 분석원리를 이용한 진단키트는 양수내 MMP-8의 항원을 정량분석 또는 정성분석함으로써 조산 또는 조기 양막파쇄를 진단할 수 있으며, 상기 항원의 분석을 위해 MMP-8 항체에 결합금 콜로이드 입자 등을 결합시켜 표식항체를 제조할 수 있다. 시료중에 MMP-8이 존재하면 표식항체액의 MMP-8 항체와 결합하여 면역복합체를 형성하게 되고, 상기 반응액을 다시 MMP-8 항체와 반응시키고 요소 등으로 만든 과잉 표식항체 세정액을 반응시키면 MMP-8의 농도가 어느 수준 이상인 경우에는 양성임을 육안으로 알 수 있다. 이러한 진단키트에는 MMP-8 항체, 표준 MMP-8, 기질, 분석용 완충용액, 발색 효소 또는 형광 물질로 표지된 2차 항체, 점착성 플레이트 커버등이 포함될 수 도 있다.
또한, 상기 진단키트는 조산 또는 조기 양막파쇄를 진단하기 위하여 생물학적 마이크로칩(biological microchip)을 이용한 자동화된 분석 방법을 이용할 수 있다. 예를 들어, 상기 MMP-8 항체를 코팅시킨 글래스 슬라이드 등의 칩을 이용하여 면역블랏을 수행하도록 상기 진단키트를 구성할 수 있다. 이와 같은 진단키트는 MMP-8 항체가 표면에 고정된 생물학적 마이크로칩, 적당한 완충용액, 표준 MMP-8 및 2차 항체 등을 포함한다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> 조산 검사을 위한 진단지표의 선정
임신 중기의 무증상 산모에서 조산의 원인으로 그 중요성이 대두되고 있는 만성적인 자궁내 감염을 검사하기 위하여, 염증의 표지자인 MMP-8과 인터루킨-6(interleukin-6, IL-6)가 이러한 목적으로 사용될 수 있는지 조사하였다.
이를 위하여, 실험 대상으로는 염색체 검사를 위해 임신 중기에 양수검사를 시행한 산모들 중 양수가 보관된 경우를 대상으로 환자대조군 연구를 시행하였다. 즉, 32주 이전에 자연 조산한 23례의 실험군과 만삭 분만한 46례의 대조군에서 양수내 MMP-8과 IL-6의 농도를 ELISA 면역검사법으로 측정하여 비교하였다. 이때, 염색체 검사 결과가 비정상이거나 태아에서 주요 기형이 발견된 경우는 연구 대상에서 제외하였다.
그 결과, 실험군에서의 MMP-8의 농도는 평균적으로 7.0 [0.3-108.1] ng/㎖인 반면 대조군에서는 1.1 [<0.3-9.8] ng/㎖이었다. 또한, 실험군에서의 IL-6의 농도는 평균적으로 0.45 [0.02-8.94] ng/㎖인 반면 대조군에서는 0.10 [0.002-1.70] ng/㎖)으로 나타나 임신 중기의 양수내 MMP-8과 IL-6의 농도는 조산한 경우에 만삭 분만한 경우보다 모두 통계적으로 유의성 있는 증가를 보였다(p<0.0001)(도 1).
또한, 실험군과 대조군의 MMP-8의 농도를 모두 비교한 결과, 임신 중기 양수내 MMP-8의 농도가 10 ng/㎖ 보다 큰 경우에는 모두 조산한 것으로 확인되었다.
조산을 검사하는 민감도와 특이도를 조사한 결과, MMP-8의 경우 임신 중기 양수내 MMP-8의 기준량을 10 ng/㎖로 하였을 때 조산을 검사하는 민감도는 48%(11/23), 특이도는 100%(46/46)로 나타났고, IL-6의 기준량을 0.6 ng/㎖로 하였을 때 민감도는 44%(10/23), 특이도는 98%(45/46)이었다(도 2). 따라서, MMP-8이IL-6보다 조산을 검사하는 민감도와 특이도가 우수하며 민감도와 양성률을 모두 고려할 때 조산 검사을 위한 MMP-8의 농도는 10 ng/㎖임을 확인하였다.
조기분만진통의 경우와 조기양막파수의 경우에서 양수내 MMP-8과 IL-6의 농도는 조산한 경우와 만삭분만한 경우에 모두 서로 유사하였다.
<실시예 2> MMP-8의 농도와 자궁내 감염 및 염증의 상호관계 조사
진단지표로 양수내 MMP-8의 농도를 측정함므로써 태아감염 및 태아손상을 진단하기 위하여, 양수내 MMP-8의 농도와 자궁내 감염 및 염증의 상호관계를 조사하였다.
이를 위하여, 서울대학교병원에서 단태아를 조산하였으며(임신 주수 < 36주), 조산 전 72시간 내에 양수검사를 받은 연속적인 산모 246명을 실험대상으로 선정하여 양수내 균배양, 양수내 MMP-8 농도 측정 및 출산 후 태반의 조직학적 검사를 시행하였다. 이때, 양수 채취는 초음파로 자궁내를 관찰하면서 복부를 통해 천자 후 채취하였다.
<2-1> 양수내 균배양
경복부 양수 천자로 채취된 양수를 즉시 마개가 있는 플라스틱 용기에 넣은 후 혐기성 및 호기성 균배양을 위한 배지에 도말하였다. 사용한 배지는 혈액 한천(blood agar), 맥콩키 한천(McConkey's agar), 박텍 6A 바이알(Bactec 6A vial), 띠오글라이콜레이트(thioglycollate) 육즙, 브루셀라 혈액 한천(brucellar blood agar), 신선한 육추출물 및 말혈청 페니실린 폴리믹신 B(horse serum penincillin polymixin B) 및 암포테리신 B(ampotericin B) 등이 보충된 플레우로뉴모니-유사 생체(pleuropneumoni-like organism) 육즙 등이다. 또한, 마이코트림(Mycotrim) GU 등을 사용하여 마이코플라즈마(Mycoplasma)를 배양하였다.
<2-2> 양수내 MMP-8 농도 측정
채취한 양수를 700g에서 10분간 원심분리하여 침전된 물질을 제거하고 상층액만을 사용하였다. MMP-8의 농도 측정은 MMP-8의 비중첩 에피토프에 결합하는 두 개의 단일클론항체를 이용한 ELISA 방법으로 측정하였다(Amersham pharmacia biotech, UK).
<2-3> 태반의 조직학적 검사
분만 후 태반이 만출된 뒤, 제대, 융모판(chorionic plate), 태반막 등에서 적출한 조직을 10% 포르말린(formalin)에 고정시키고 파라핀(paraffin)을 입혀 슬라이드(slide)를 제작한 후 조직절편을 헤마톡실린(hematoxylin)과 에오신(eosin)으로 염색하여 현미경으로 관찰하였다. 급성 자궁내 염증은 양막, 융모막, 탈락막, 융모판 중 어느 한 조직에서라도 염증성 변화가 관찰되는 경우로 정의하였다.
양수내 균배양 결과 실험대상 235명 중 45명에서 양성으로 나와 자궁내 감염 빈도가 19%로 나타났고, 태반의 조직학적 검사결과 융모양막염은 실험대상 246명 중 115명이 양성으로 나와 자궁내 염증 빈도가 47%로 측정되었다. 양수내 균배양 결과 양성인 경우의 양수내 MMP-8의 평균 농도는 191.4 ng/㎖인 반면 음성인 겨우는 4.6 ng/㎖로 나타나 균배양 결과 양성의 경우에서 MMP-8의 농도가 현저하게 증가되어 있음을 알 수 있었다(p<0.0001)(표 1).
조산 검사을 위한 진단지표로서 진단 수행능력을 확인하기 위하여 양수내 MMP-8의 기준량을 15 ng/㎖로 하였을 때 양수내 균감염에 대한 진단에 높은 민감도(75.6%)와 음성검사도(91.7%)를 보였다(표 2).
태반의 조직학적 검사 결과 융모양막염이 있는 경우는 MMP-8의 농도가 평균적으로 160.9 ng/㎖ 이었는데 그렇지 않은 경우에는 1.0 ng/㎖로 나타나 융모막염이 관찰된 경우에서 MMP-의 농도가 유의성있게 농도가 상승되어 있었다(p<0.0001)(표 3).
이에 대해, MMP-8의 기준량을 15 ng/㎖로 하여 자궁내 염증에 대한 MMP-8의 진단 수행능력을 조사한 결과 민감도(73.9%), 특이도(87.0%), 양성예측도(83.3%) 및 음성예측도(79.2%) 모두 높은 값을 나타내었다(표 4).
<표 1> 양수내 균 감염에 따른 MMP-8의 농도 측정
양수배양검사 중간값(ng/mL) 범위(ng/mL)
양성 191.4 0-4202.7
음성 4.6 0-3929.0
<표 2> MMP-8의 양수내 균 감염에 대한 진단 수행능력 측정
민감도 75.6%
특이도 64.2%
양성예측도 33.3%
음성예측도 91.7%
<표 3> 자궁내 염증에 따른 MMP-8의 농도 측정
조직학적 융모양막염 median(ng/mL) range(ng/mL)
유 160.9 0.1-4202.7
무 1.0 0-766.2
<표 4> MMP-8의 자궁내 염증에 따른 진단 수행능력 측정
민감도 73.9%
특이도 87.0%
양성예측도 83.3%
음성예측도 79.2%
<실시예 3> 양수내 MMP-8의 농도 측정을 이용한 제대염 진단
상기 실시예 2에서 양수내 MMP-8의 농도를 측정함으로써 자궁내 감염 및 염증을 진단할수 있음을 확인한 본 발명자들은 보다 직접적으로 태아감염을 진단하기 위하여 제대염 여부에 따른 양수내 MMP-8의 농도를 비교하였다.
서울대학교병원에서 단태아를 조산하였으며(임신 주수 < 36주), 조산 전 72시간 내에 양수검사를 받은 연속적인 산모 246명을 실험대상으로 하였으며, 제대염은 제대 혈관벽과 와톤 젤리(Wharton jelly)에 중성백혈구가 침윤된 경우를 제대염으로 진단하였고 상기 실시예 2와 동일한 방법으로 MMP-8의 농도를 측정하였다.
그 결과 실험대상 245명 중 57명에서 제대염이 진단되어 제대염의 빈도는 23%를 나타내었다. 이들의 양수내 MMP-8의 농도를 측정한 결과 제대염이 있는 경우에는 MMP-8의 농도가 평균적으로 433.7 ng/㎖인 반면 제대염이 없는 경우에는 2.4 ng/㎖로 측정되어 제대염이 있는 경우에서 그렇지 않은 경우보다 통계적으로 유의성 있는 양수내 MMP-8의 증가가 관찰되었다(p<0.0001)(표 5및도 3).
양수내 MMP-8의 농도로 제대염의 진단지표를 정하기 위한 리시버-작동 특성 커브(receiver-operating characteristic curve)에서 양수내 MMP-8의 농도 기준량이 26 ng/㎖일때 제대염 진단의 민감도와 양성률을 모두 고려할 수 있음을 알 수 있었으며(도 4), 이를 기준으로 MMP-8의 제대염에 대한 진단 수행능력을 확인한 결과 민감도(89%)와 특이도(78%) 및 음성예측도(96%)에서 높은 확률을 나타내었다(표 6).
<표 5> 양수내 제대염 유무에 따른 MMP-8의 농도 측정.
제대염 중간값(ng/mL) 범위(ng/mL)
유 433.7 1.5-3836.8
무 2.4 0-4202.7
<표 6> MMP-8의 양수내 제대염 유무에 대한 진단 수행능력 측정
민감도 89% (51/57)
특이도 78% (148/189)
양성예측도 55% (51/92)
음성예측도 96% (148/154)
<실시예 4> 양수내 MMP-8의 농도 측정을 이용한 신생아 이환 진단
상기 실시예 3에서 양수내 MMP-8의 농도를 측정하는 것이 태아감염의 진단에 효과적인 검사가 될 수 있음을 확인한 본 발명자들은 양수내 MMP-8이 증가된 경우 출산한 신생아에서 패혈증, 신생아 호흡부전, 폐렴, 기관지폐이형성증, 괴사성 장염, 뇌실내 출혈 등의 합병증이 증가될 것으로 추정하고 상기의 신생아 이환이 있는 경우의 양수내 MMP-8의 농도와 그렇지 않은 경우의 양수내 MMP-8의 농도를 비교하였다.
서울대학교병원에서 단태아를 조산하였으며(임신 주수 < 36주), 조산 전 72시간 내에 양수검사를 받은 연속적인 산모 214명을 실험대상으로 하였다. 중요한 신생아 이환은 패혈증, 신생아 호흡곤란 증후군, 폐렴, 기관지폐이형성증, 괴사성장염, 뇌실내 출혈 중 하나라도 관찰되는 경우로 정의하였다. 신생아 패혈증은 분만 후 72 시간내 혈액배양에서 균이 자라는 것으로 증명된 경우나 혈액배양에서 균이 자라지 않더라도 혈액내 백혈구수가 ≤5000 cell/mm3혹은 ≥24000 cell/mm3, 다형백혈구수가 ≤1800 cell/mm3, 총백혈구 중에서 밴드형 백혈구 비가 0.2 이상, 위 흡인액에서 다형백혈구수가 고배율에서 5 셀(cell) 이상, 적혈구 침전 속도가15 mm/min 이상, C-반응성 단백질의 양성, 혈소판이 ≤80000 cell/mm3, 배양에 의해 뇌막염, 요로감염, 폐렴이 진단되는 것과 같은 임상적 증거에 의해 의심이 되는 경우에 상기 기술한 조건 중 2가지 이상을 만족할 때 패혈증으로 진단하였다. 신생아 호흡곤란 증후군은 호흡시 잡음 및 흉곽수축이 있고, 흡기 산소 분율 0.4 이상을 요구할 만큼 산소요구가 증가되며, 다른 폐질환의 증거없이 임상병리검사상 혹은 방사선 검사상에 특징적인 소견이 있는 경우를 신생아 호흡곤란 증후군으로 진단하였다. 폐렴은 생후 7일내 임상적으로나 방사선학적으로 명백한 소견이 있을 때 이를 폐렴으로 진단하였다. 기관지폐이형성증은 반칼라리(Bancalari) 등이 정의한 바와 같이 생후 첫주 동안 3일 이상 간헐적 양압환기가 요구되고 생후 28일 이상 빈호흡, 늑간 혹은 늑하 수축, 청진상 호흡시 잡음이 들리는 임상적 증상이 있으며, 생후 28일 이상 혈액내 산소분압이 50 mmHg 이상을 유지하기 위해 산소의 공급이 필요하고 흉부 방사선 소견에서 양측 폐에 선상의 증가된 음영이 있으면서 정상과 투명부위가 교대로 나타나는 경우를 기관지폐이형성증으로 진단하거나 부검시 소견을 통해 진단하였다. 뇌실내 출혈은 맥네나민(McNenamin) 등이 정의한 바에 따라 진단하였다. 괴사성 장염은 최소한 24시간 이상 복부 팽만과 급양 곤란(feeding intolerance)이 있고, 방사선학적으로 장벽내 공기, 장파열, 태변 폐쇄 증후군이 있거나 수술 혹은 부검소견에서 괴사성 장파열이 있는 경우에 이를 괴사성 장염으로 진단하였다. 양수내 MMP-8의 농도 측정은 상기 실시예 2와 동일한 방법으로 측정하였다.
그 결과, 실험대상 214명 중 102명에서 중요한 신생아 이환이 진단되어 48%의 빈도를 나타내었다. 이들의 양수내 MMP-8의 농도를 측정한 결과, 중요한 신새아 이환이 있는 경우에는 MMP-8의 농도가 평균적으로 36.8 ng/㎖인 반면 그렇지 않은 경우에는 2.7 ng/㎖로 측정되어 신생아 이환이 있는 경우에서 그렇지 않은 경우보다 통계적으로 유의성있게 양수내 MMP-8 농도가 상승되어 있었다(p<0.0001)(표 7).
양수내 MMP-8의 농도로 신생아 이환의 진단지표를 정하기 위한 리시버-작동 특성 커브에서 양수내 MMP-8의 농도 기준량이 15 ng/㎖일 때 신생아 이환 진단의 민감도와 양성률을 모두 고려할 수 있음을 알 수 있었으며, 이를 기준으로 신생아 이환에 대한 MMP-8의 진단 수행능력을 조사한 결과 특이도(72.1%), 양성예측도(63.5%), 음성예측도(62.5%)에서 높은 확률을 나타내었다(표 8).
또한, 신생아 혈액에서 균이 검출된 패혈증의 경우에 양수내 MMP-8의 농도는 평균적으로 208.9 ng/㎖인 반면 그렇지 않은 경우에는 6.5 ng/㎖로 나타나 신생아 패혈증인 경우에 양수내 MMP-8의 농도가 그렇지 않은 경우보다 유의성 있게 상승되어 있었다(p<0.05)(표 9).
이때, 양수내 MMP-8의 농도 15 ng/㎖을 진단기준으로 신생아 혈액에서 균이 검출된 패혈증을 검사할 때 MMP-8의 진단 수행능력은 민감도(66.7%), 특이도(60.1%) 및 음성예측도(98.4%)가 매우 높게 측정되었다(표 10).
<표 7> 양수내 신생아 이환의 유무에 따른 MMP-8의 농도 측정
신생아 이환 중간값(ng/mL) 범위(ng/mL)
유 36.8 0.1-4202.7
무 2.7 0-870.8
<표 8> MMP-8의 양수내 신생아 이환의 유무에 대한 진단 수행능력 측정
민감도 52.9%
특이도 72.1%
양성예측도 63.5%
음성예측도 62.5%
<표 9> 신생아 패혈증의 유무에 따른 MMP-8의 농도 측정
신생아 패혈증 중간값(ng/mL) 범위(ng/mL)
유 208.9 2.4-1568.6
무 6.5 0-4202.7
<표 10> MMP-8의 신생아 패혈증의 유무에 대한 진단 수행능력 측정
민감도 66.7%
특이도 60.1%
양성예측도 4.8%
음성예측도 98.4%
<실시예 5> 양수내 MMP-8의 농도 측정을 이용한 뇌성마비의 진단
양수검사를 시행하고 임신 35주 이전에 단태아로 조산된 116명의 신생아를 실험 대상으로 하였으며 이들을 출생 후 3년간 추적·관찰하였다. 양수내 MMP-8의 농도 측정은 상기 실시예 2와 동일한 방법으로 측정하였으며, 뇌성마비는 생후 3세에 신경학적 검사를 시행하여 보즈타(Vojta) 방법에 따라 발달 단계, 자세 혹은 반사 이상, 근긴장도에 지속적인 이상이 있는 경우에 이를 뇌성마비로 진단하였다.
그 결과, 실험군에서 MMP-8의 농도는 평균적으로 153.9 ng/㎖[범위 < 0.3-1535.9]인 반면 대조군에서는 6.4 ng/㎖[범위 < 0.3-3836.8]로 나타나, 임신 중기 양수내 MMP-8의 농도는 뇌성마비에 걸린 태아의 경우에 통계적으로 유의성 있는 증가를 보였다(p<0.01)(도 5). 또한, 뇌성마비가 된 경우에 출생 주수가 더 빨라졌으며 출생 주수와 양수 배양 결과를 보정한 후에도 양수내 MMP-8의 농도는 뇌성마비 발생 가능성을 6배 정도 증가시킴을 확인하였다(odds ratio, 6.0; 95% 신뢰구간, 1.1-33.0; p<0.05).
양수내 MMP-8의 농도로 뇌성마비의 진단지표를 정하기 위한 리시버-작동 특징 커브에서 양수내 MMP-8의 농도 기준량이 53 ng/㎖일 때 민감도와 양성률을 모두 고려할 수 있음을 알 수 있었으며(도 6), 이를 기준으로 MMP-8의 뇌성마비에 대한 진단 수행능력을 조사한 결과 민감도(76.9%), 특이도(74.8%) 및 음성예측도(95.1%)에서 높은 확률을 나타내었다(표 11).
<표 11> MMP-8의 뇌성마비에 대한 진단 수행능력 측정
민감도 76.9%
특이도 74.8%
양성예측도 28.6%
음성예측도 95.1%
상기에서 실펴본 바와 같이, 본 발명은 산모의 양수에서 MMP-8의 농도를 측정함으로써 산전에 조산과 태아감염 및 태아손상을 진단할 수 있도록 MMP-8 항체를하나 또는 그 이상 함유하는 진단시약과 진단키트를 제공한다. 본 발명의 진단시약 및 진단키트는 조기 양막파쇄 증상이나 조산의 증상을 나타내는 산모뿐만 아니라 이러한 증상을 전혀 나타내지 않는 무증상 산모에서도 조산과 태아감염 및 태아손상을 산전에 미리 진단할 수 있으며, 기존에 태아 혈액내 사이토카인을 측정하는 방법에 비하여 양수내 MMP-8의 농도를 측정함으로써 높은 민감도와 특이도를 가지므로 조산과 태아감염 및 태아손상의 산전진단에 유용하게 사용될 수 있다.

Claims (17)

  1. MMP-8(matrix metalloproteinase-8)의 항체를 함유하여 양수내 MMP-8의 농도를 면역학적으로 측정하는 것을 특징으로 하는, 산전에 조산과 태아감염 및 태아손상의 검사용 진단시약.
  2. 삭제
  3. 제 1항에 있어서, 상기 태아손상은 신생아 패혈증, 신생아 호흡부전, 폐렴, 기관지폐이형성증, 뇌실내 출혈 및 괴사성 장염을 증상으로 하는 주산기 이환 또는 뇌성마비인 것을 특징으로 하는 진단시약.
  4. 제 1항에 있어서, 양수내 MMP-8의 농도가 5 ng/㎖ ∼ 100 ng/㎖ 이면 조산과 태아감염 및 태아손상으로 진단되는 것을 특징으로 하는 진단시약.
  5. 제 1항에 있어서, 양수내 MMP-8의 농도가 10 ng/㎖ 이상이면 조산으로 진단되는 것을 특징으로 하는 진단시약.
  6. 제 1항에 있어서, 양수내 MMP-8의 농도가 26 ng/㎖ 이상이면 태아감염으로 진단되는 것을 특징으로 하는 진단시약.
  7. 제 3항에 있어서, 양수내 MMP-8의 농도가 53 ng/㎖ 이상이면 뇌성마비의 발병률이 증가되는 것으로 진단되는 것을 특징으로 하는 진단시약.
  8. 제 3항에 있어서, 양수내 MMP-8의 농도가 15 ng/㎖ 이상이면 주산기 이환의 발병률이 증가되는 것으로 진단되는 것을 특징으로 하는 진단시약.
  9. 삭제
  10. 제 1항에 있어서 진단시약은,
    1) 기질에 MMP-8 항체를 흡착시키는 단계;
    2) MMP-8 항체가 흡착된 기질에 양수를 첨가하여 반응시키는 단계;
    3) 상기 기질에 발색효소 또는 형광물질로 표지되거나 또는 금입자(금콜로이드)로 표지된 MMP-8 항체를 첨가하여 반응시키는 단계; 및 임의로
    4) 상기 기질에 발색효소 또는 형광물질에 반응하는 발색제를 첨가하여 발색을 유도한 후 항체 반응의 특이도를 관찰하는 단계로 구성되는 분석원리를 이용하는 것을 특징으로 하는 진단시약.
  11. 제 10항에 있어서, 단계 1의 MMP-8 항체는 단일클론성 항체이거나 다클론성항체인 것을 특징으로 하는 진단시약.
  12. 제 10항에 있어서, 단계 1의 기질은 니트로셀룰로오스 막, 폴리비닐(polyvinyl) 수지로 합성된 96-웰 플레이트, 포리스티렌(polystyrene) 수지로 합성된 96-웰 플레이트 및 유리로 된 슬라이드글라스 등으로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 진단시약.
  13. 제 10항에 있어서, 단계 3에서 항체에 결합된 발색효소는 퍼옥시다아제(peroxidase), 알칼라인포스파다아제(alkaline phosphatase) 및 바이오틴(biotin)으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 진단시약.
  14. 제 10항에 있어서, 단계 3에서 형광물질은 FITC 및 TRITC로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 진단시약.
  15. 제 10항에 있어서, 단계 4에서 발색제는 4CN(4-chloro-1-naphtol),DAB(dia-
    minobenzidine), AEC(aminoethyl carbazole), ABTS[2,2'-azino-bis(3-ethyl-benzo-
    thiazoline-6-sulfonic acid)], OPD(o-phenylenediamine), TMB(tetramethyl benzidine)로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 진단시약.
  16. 제 1항의 진단시약을 포함하는 진단키트.
  17. 제 16항에 있어서, 진단키트는 MMP-8의 항체, 표준 MMP-8, 기질, 분석용 완충용액, 발색효소 또는 형광물질로 표지되거나 또는 금입자(금콜로이드)로 표지된 2차 항체, 점착성 플레이트 커버를 포함하는 것을 특징으로 하는 진단키트.
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