JP2016521134A - 母体血から捕捉する胎児細胞を使用する胎児診断 - Google Patents
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- G01N2333/96494—Matrix metalloproteases, e. g. 3.4.24.7
Abstract
Description
本出願は、米国特許法第119条(e)の下で2013年5月16日に出願の米国仮特許出願第61/824,128号の優先権を主張し、その全体を参照により本明細書に明示的に組み込む。
1つまたは複数の有核胎児細胞を含有する母体サンプルは、診断もしくは予後診断が実施されるべき任意の動物からまたは診断もしくは予後診断が実施されるべき胎児を妊娠した動物から得ることができる。一実施形態において、サンプルは、妊娠が疑われる、妊娠している、または妊娠していた雌の動物から得ることができる。動物がヒトである場合、サンプルは、第1のトリメスター(妊娠の最初の約3カ月)、第2のトリメスター(妊娠の約4〜6カ月)または第3のトリメスター(妊娠の約7〜9カ月)中に採取することができる。本発明の動物は、ヒトまたはウシ、ブタ、ウマ、ウサギ、イヌ、ネコ、ヒツジもしくはヤギなどの家畜であることができる。一般に、得られるサンプルは、血液サンプルである。他のサンプルには、膣分泌物、子宮頚部スワブおよび尿があり得る。したがって、例えば、母体血サンプルなどの母体サンプルは、妊娠中の雌性のヒトもしくはヒト以外の哺乳動物から得ることができ、それを使用して妊娠中の雌性のヒトまたはヒト以外の哺乳動物内の胎児の状態を調査することができる。
サンプルは、サンプルの全成分と比較して有核胎児細胞を濃縮するおよび/またはサンプル中の全細胞と比較して有核胎児細胞を濃縮する1つまたは複数のステップに供される。
密度勾配遠心分離は、混合物中にある細胞型の異なる密度に基づいて細胞を分離する方法である。本方法を使用して、使用される勾配物質の特定の密度より軽いかまたは重いかいずれかの細胞を含有する区画に細胞を分離することができる。密度勾配遠心分離は、一連の異なる密度勾配に基づく反復ステップによってまたは親和性分離、細胞パニング、細胞ソートなどのような他の分離法と組み合わせて実行することができる。一部の実施形態において、密度勾配遠心分離は、異なる勾配密度の複数の層を使用して実施することができる。この方法により、遠心分離後に、異なる密度の細胞は、それに対応する密度でゾーンまたはバンドを形成することができる。1つまたは複数の異なるゾーンにある細胞は、適当な位置にピペットを配置することによって採集することができる。密度勾配遠心分離によって特定の細胞型を濃縮する方法は、米国特許第5,840,502号に記述されており、その全体を参照により本明細書に組み込む。
一部の実施形態において、希少な細胞の濃縮は、1つまたは複数のサイズに基づく分離法を使用して生ずる。サイズに基づく分離モジュールの例には、濾過膜、分子ふるいおよびマトリックスがある。本発明によって考えられる、サイズに基づく分離モジュールの例としては、国際公開番号WO 2004/113877に開示されるものがあり、その全体を参照により本明細書に組み込む。他のサイズに基づく分離法が、国際公開番号WO 2004/0144651ならびに米国特許出願公開第20080138809(A1)号および同第20080220422(A1)号に開示され、その全体を参照により本明細書に組み込む。
一部の実施形態において、有核胎児細胞は、結合部分または親和性分子に対してそれらの親和性に基づいて濃縮することができる。そのような実施形態において、結合部分は単離可能に標識されて、母体サンプルの望ましくない成分からの有核胎児細胞の分離を容易にする。例えば、有核胎児細胞に対して親和性を持つ結合部分は、有核胎児細胞を結合することができ、その結合部分を磁気ビーズもしくはクロマトグラフィー物質の固相などの固体支持体に結合させることによりそれを使用して有核胎児細胞を分離することができ、または有核胎児細胞の検出支援濃縮によって有核胎児細胞を他のサンプル成分から区別できるように、結合部分を検出可能に標識することができる。
一部の実施形態において、親和性クロマトグラフィー法を使用することができる。例えば、結合部分または親和性分子を、ビーズ、カラムもしくは粒子などの固定相に結合させることができ、胎児有核細胞は結合部分もしくは親和性分子に特異的に結合できるがサンプルの他の成分は結合部分もしくは親和性分子に特異的に結合しない条件下で、サンプルを親和性分子に結合した固定相と接触させることができる。接触させた固定相は、次いで例えば移動相を使用して処理して、親和性分子を結合した固定相に結合している母体サンプルの成分を親和性分子が結合した固定相に結合していない母体サンプルの成分から分離することができる。次いで、胎児有核細胞を含む親和性分子を結合した固定相に結合しているサンプルの成分を保持または採取して、さらに濃縮もしくは分析することができる。
一部の実施形態において、濃縮された産物でさえ、対象ではない細胞(例えば、母体有核赤血球(nucleated maternal red blood cell))が優勢である場合がある(>50%)。一部の場合に、濃縮サンプルの有核胎児細胞は、濃縮サンプル中の全ての細胞の少なくとも2、3、4、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90または95%を占める。例えば、本明細書に記述される方法およびシステムを使用して、濃縮されたサンプルが合計約500個の細胞を有し、その2%が有核胎児細胞であり、残りの細胞が母体細胞であるように、妊娠したヒト由来の母体血サンプル20mLを有核赤血球など1つまたは複数の有核胎児細胞について濃縮できる。一部の実施形態において、実施した濃縮ステップは、サンプル由来の全ての不要な分析物(例えば、母体細胞、母体赤血球、母体有核赤血球、無核細胞)の少なくとも50、60、70、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、99.5、99.6、99.7、99.8または99.9%を除去した。
一部の実施形態において、胎児バイオマーカーを使用して、1つまたは複数の胎児細胞を検出および/または単離することができる。例えば、これは、胎児の発達の間に差動的(differentially)に発現する遺伝子(例えば、DYS1、DYZ、CD−71、MMP14)の相対的な発現に基づいて胎児と母体有核細胞とを区別することによって実施することができる。提供される本発明の一実施形態において、MMP14、CD71、GPA、HLA−G、EGFR、CD36、CD34、HbF、HAE 9、FB3−2、H3−3、エリスロポエチン受容体、HBE、AFP、APOC3、SERPINC1、AMBP、CPB2、ITIH1、APOH、HPX、β−hCG、AHSG、APOB、J42−4−d、2,3−ビスホスホグリセリン酸(BPG)、炭酸脱水酵素(CA)もしくはチミジンキナーゼ(TK)を含めた1つまたは複数の遺伝子の転写産物もしくはタンパク質発現の検出を使用して、胎児細胞を濃縮、精製、列挙、同定、検出または区別する。発現は、これらの遺伝子から発現される転写産物またはタンパク質を含むことができる。提供される本発明の一実施形態において、MMP14、CD71、GPA、HLA−G、EGFR、CD36、CD34、HbF、HAE 9、FB3−2、H3−3、エリスロポエチン受容体、HBE、AFP、AHSG、J42−4−d、BPG、CAまたはTKを含めた1つまたは複数の遺伝子の発現を使用して、有核胎児赤血球など有核胎児細胞を同定、精製、濃縮または列挙する。
胎児細胞濃縮サンプル由来の細胞を、次いで核酸分子のヌクレオチド配列または遺伝子の発現について評価することができる。
濃縮された有核胎児細胞は、有核胎児細胞の1つまたは複数のヌクレオチド配列または有核胎児細胞の1つまたは複数の遺伝子の発現を同定する1つまたは複数の細胞アッセイによって分析することができる。
一部の実施形態において、本明細書に提供される方法は、個々の細胞について決定した核酸分子のヌクレオチド配列データもしくは遺伝子発現データを分析するステップと、データが母体配列もしくは遺伝子発現または胎児配列もしくは遺伝子発現の指標となるか否かを決定するステップとをさらに含む。一部のそのような実施形態において、母体または胎児情報の指標となるデータの確率が、決定される。濃縮方法が実施された後でさえ、母体細胞は、胎児細胞濃縮サンプル中にまだ存在している可能性が高いと考えられる。したがって、方法を実行して、細胞が胎児もしくは母体起源であると同定する、または細胞が胎児もしくは母体起源である確率を同定することができる。胎児細胞濃縮サンプルの細胞の分析は、単一細胞ずつの原則で実施されるので、本明細書に提供される方法は、細胞が胎児起源であると同定するまたは細胞が胎児起源である見込みを同定する能力を向上させることができる。したがって、本明細書に提供される実施形態による配列もしくは遺伝子発現の決定は、細胞の集合体または多数の細胞の平均シグナルには基づかず、その代わりに複数の単一細胞の配列もしくは遺伝子発現の測定値に基づく。
Claims (48)
- 母体サンプルを準備するステップと;
該母体サンプルを1つまたは複数の糖類に対して親和性を有する第1の固定相と接触させるステップと;
該第1の固定相に結合している、該母体サンプルの成分を該第1の固定相に結合していない該母体サンプルの成分から分離するステップと;
該第1の固定相に結合している、該母体サンプルの該成分を保持するステップと;
該母体サンプルをマトリックスメタロプロテアーゼ14に対して親和性を有する単離可能に標識された親和性分子と接触させるステップと;
該単離可能に標識された親和性分子に結合している、該母体サンプルの成分を該単離可能に標識された親和性分子に結合していない該母体サンプルの成分から分離するステップと;
該単離可能に標識された親和性分子に結合している、該母体サンプルの該成分を保持し、それによって胎児細胞濃縮サンプルを得るステップとを含む、母体サンプルから胎児細胞濃縮サンプルを得る方法。 - 前記母体サンプルを前記第1の固定相および前記第1の固定相と接触させるステップの前に:
サイズおよび/または密度によって該母体サンプルの成分を分離するステップと;
有核胎児赤血球の該サイズおよび/または密度を有する、該母体サンプルの分離された該成分を採取するステップとをさらに含む、請求項1に記載の方法。 - サイズおよび/または密度によって前記母体サンプルの成分を前記分離するステップが、勾配遠心分離を使用して実施される、請求項2に記載の方法。
- 前記1つまたは複数の糖類が、ガラクトースである、請求項1から3のいずれかに記載の方法。
- 前記第1の固定相が、レクチン結合固定相である、請求項1から4のいずれかに記載の方法。
- 前記第1の固定相が、磁気ビーズを含む、請求項1から5のいずれかに記載の方法。
- 前記単離可能に標識された親和性分子が、磁気ビーズに結合している、請求項1から6のいずれかに記載の方法。
- 前記第1の固定相に結合している、前記母体サンプルの前記成分を保持した後に、該第1の固定相に結合している、該母体サンプルの該保持された成分を、マトリックスメタロプロテアーゼ14に対して親和性を有する前記単離可能に標識された親和性分子と接触させる、請求項1から7のいずれかに記載の方法。
- 前記母体サンプルをマトリックスメタロプロテアーゼ14以外の胎児細胞表面マーカーに対して親和性を有する第2の固定相と接触させるステップと;
該第2の固定相に結合している該母体サンプルの成分を該第2の固定相に結合していない該母体サンプルの成分から分離するステップと;
該第2の固定相に結合している該母体サンプルの該成分を保持するステップとをさらに含む、請求項1から8のいずれかに記載の方法。 - 前記胎児細胞表面マーカーが、トランスフェリン受容体(CD71)、グリコホリンA(GPA)、HLA−G、EGFR、トロンボスポンジン受容体(CD36)、CD34、HbF、HAE 9、FB3−2、H3−3、エリスロポエチン受容体、HBE、AFP、APOC3、SERPINC1、AMBP、CPB2、ITIH1、APOH、HPX、β−hCG、AHSG、APOB、J42−4−d、2,3−ビスホスホグリセリン酸(BPG)、炭酸脱水酵素(CA)およびチミジンキナーゼ(TK)からなる群から選択される、請求項9に記載の方法。
- 前記胎児細胞表面マーカーが、トランスフェリン受容体(CD71)である、請求項10に記載の方法。
- 前記母体サンプルが、母体血サンプルである、請求項1から11のいずれかに記載の方法。
- 前記胎児細胞濃縮サンプル中の細胞の少なくとも50%、60%、70%、80%、または90%が、胎児細胞である、請求項1から12のいずれかに記載の方法。
- 前記胎児細胞濃縮サンプルを準備するステップと;
該胎児細胞濃縮サンプル由来の1つまたは複数の細胞における核酸分子のヌクレオチド配列または遺伝子の発現を分析するステップとをさらに含む、請求項1から13のいずれかに記載の方法。 - 核酸分子のヌクレオチド配列を前記分析するステップが、前記胎児細胞濃縮サンプル由来の1つまたは複数の細胞のゲノムDNAをシークエンシングするステップを含む、請求項14に記載の方法。
- 前記ゲノムDNAをシークエンシングするステップが、単一細胞の前記DNAをシークエンシングするステップを含み、単一細胞の該DNAをシークエンシングするステップが、前記胎児細胞濃縮サンプル由来の1つまたは複数の細胞に対して実施される、請求項15に記載の方法。
- 単一細胞の前記DNAをシークエンシングするステップが、前記胎児細胞濃縮サンプル由来の少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9または10個の細胞に対して実施される、請求項16に記載の方法。
- 遺伝子の前記発現が、前記胎児細胞濃縮サンプル由来の1つまたは複数の細胞の表面に検出可能な抗体をハイブリダイズさせるステップを含む、請求項14に記載の方法。
- 核酸分子のヌクレオチド配列を前記分析するステップが、前記胎児細胞濃縮サンプル由来の1つまたは複数の細胞の前記ゲノムDNAに、検出可能なプローブをハイブリダイズさせるステップを含む、請求項14に記載の方法。
- 1つまたは複数の個々の細胞が、分析される各細胞の前記ゲノムDNAへの検出可能なプローブのハイブリダイゼーションについて分析される、請求項19に記載の方法。
- 少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9または10個の個々の細胞が、分析される各細胞の前記ゲノムDNAへの検出可能なプローブのハイブリダイゼーションについて分析される、請求項20に記載の方法。
- 母体サンプルを準備するステップと;
該母体サンプルを1つまたは複数の糖類に対して親和性を有する第1の固定相と接触させるステップと;
該第1の固定相に結合している、該母体サンプルの成分を該第1の固定相に結合していない該母体サンプルの成分から分離するステップと;
該第1の固定相に結合している、該母体サンプルの該成分を保持するステップと;
該母体サンプルを胎児細胞表面マーカーに対して親和性を有する単離可能に標識された親和性分子と接触させるステップと;
該単離可能に標識された親和性分子に結合している、該母体サンプルの成分を該単離可能に標識された親和性分子に結合していない該母体サンプルの成分から分離するステップと;
該単離可能に標識された親和性分子に結合している、該母体サンプルの該成分を保持して、分析用の胎児細胞濃縮サンプルを得るステップと;
該胎児細胞濃縮サンプルの2つ以上の細胞のそれぞれ個々の細胞における核酸分子のヌクレオチド配列または遺伝子の発現を決定するステップと;
該胎児細胞濃縮サンプルの2つ以上の細胞のそれぞれ個々の細胞について決定した核酸分子の該ヌクレオチド配列または遺伝子の発現を評価して、胎児ヌクレオチド配列または遺伝子発現を同定するステップとを含む、胎児ヌクレオチド配列または胎児遺伝子発現について母体サンプルを評価する方法。 - 前記胎児細胞濃縮サンプルの2つ以上の細胞のそれぞれ個々の細胞について決定した前記核酸分子のヌクレオチド配列または遺伝子の発現を評価するステップが、
該決定したヌクレオチド配列または遺伝子発現に基づいて各細胞を細胞の第1の集団もしくは細胞の第2の集団に属するように分類するステップと;
該細胞の第1および第2の集団が、胎児または母体起源のものである確率を同定するステップとを含む、請求項22に記載の方法。 - 前記第1および第2の集団のそれぞれについて前記核酸分子のヌクレオチド配列もしくは遺伝子の発現を公知の母体細胞の公知の核酸分子のヌクレオチド配列もしくは遺伝子の発現と比較することによって、該細胞の第1および第2の集団が、胎児または母体起源のものである前記確率を同定し、該公知の母体細胞に対する類似性がより高いヌクレオチド配列もしくは遺伝子発現を有する細胞の該集団が母体起源のものとして同定される、請求項23に記載の方法。
- 前記細胞の第1および第2の集団が胎児または母体起源のものである前記確率が、該細胞の第1および第2の集団のサイズを評価することによって同定され、より大きな細胞集団が胎児起源のものと同定される、請求項23または24に記載の方法。
- 胎児細胞濃縮サンプルの2つ以上の細胞のそれぞれ個々の細胞における核酸分子のヌクレオチド配列もしくは遺伝子の発現を提供するステップを含む胎児ヌクレオチド配列または胎児遺伝子発現について母体サンプルを評価する方法であって、該胎児細胞濃縮サンプルが、
母体サンプルを準備するステップと;
該母体サンプルを1つまたは複数の糖類に対して親和性を有する第1の固定相と接触させるステップと;
該第1の固定相に結合している、該母体サンプルの成分を該第1の固定相に結合していない該母体サンプルの成分から分離するステップと;
該第1の固定相に結合している、該母体サンプルの該成分を保持するステップと;
該母体サンプルを胎児細胞表面マーカーに対して親和性を有する単離可能に標識された親和性分子と接触させるステップと;
該単離可能に標識された親和性分子に結合している、該母体サンプルの成分を該単離可能に標識された親和性分子に結合していない該母体サンプルの成分から分離するステップと;
該単離可能に標識された親和性分子に結合している、該母体サンプルの該成分を保持して、分析用の胎児細胞濃縮サンプルを得るステップと;
該胎児細胞濃縮サンプルの2つ以上の細胞のそれぞれ個々の細胞について決定した該核酸分子のヌクレオチド配列もしくは遺伝子の発現を評価して、胎児ヌクレオチド配列または遺伝子発現を同定するステップとを含む方法によって調製される方法。 - 前記第1および第2の集団のそれぞれについて前記核酸分子のヌクレオチド配列もしくは遺伝子の発現を公知の母体細胞の公知の核酸分子のヌクレオチド配列もしくは遺伝子の発現と比較することによって、前記細胞の第1および第2の集団が、胎児または母体起源のものである前記確率を同定し、該公知の母体細胞に対する類似性がより高いヌクレオチド配列もしくは遺伝子発現を有する細胞の該集団が母体起源のものとして同定される、請求項26に記載の方法。
- 前記細胞の第1および第2の集団が胎児または母体起源のものである前記確率が、該細胞の第1および第2の集団のサイズを評価することによって同定され、より大きな細胞集団が胎児起源のものと同定される、請求項26または27に記載の方法。
- 前記胎児細胞濃縮サンプルの調製方法が、前記母体サンプルを前記第1の固定相および前記第1の固定相と接触させるステップの前に:
サイズおよび/または密度によって該母体サンプルの成分を分離するステップと;
有核胎児赤血球の該サイズおよび/または密度を有する、該母体サンプルの分離された該成分を採取するステップとをさらに含む、請求項22から28のいずれかに記載の方法。 - サイズおよび/または密度によって前記母体サンプルの成分を前記分離するステップが、勾配遠心分離を使用して実施される、請求項29に記載の方法。
- 前記1つまたは複数の糖類が、ガラクトースである、請求項22から30のいずれかに記載の方法。
- 前記第1の固定相が、レクチン結合固定相である、請求項22から31のいずれかに記載の方法。
- 前記第1の固定相が、磁気ビーズを含む、請求項22から32のいずれかに記載の方法。
- 前記単離可能に標識された親和性分子が、磁気ビーズに結合している、請求項22から33のいずれかに記載の方法。
- 前記第1の固定相に結合している、前記母体サンプルの前記成分を保持した後に、該第1の固定相に結合している、該母体サンプルの該保持された成分を、前記単離可能に標識された親和性分子と接触させる、請求項22から34のいずれかに記載の方法。
- 前記胎児細胞濃縮サンプルの調製方法が、
前記母体サンプルを胎児細胞表面マーカーに対して親和性を有する第2の固定相と接触させるステップと;
該第2の固定相に結合している該母体サンプルの成分を該第2の固定相に結合していない該母体サンプルの成分から分離するステップと;
該第2の固定相に結合している該母体サンプルの該成分を保持するステップとをさらに含む、請求項22から35に記載の方法。 - 前記胎児細胞表面マーカーが、MMP14(マトリックスメタロプロテアーゼ14)、トランスフェリン受容体(CD71)、グリコホリンA(GPA)、HLA−G、EGFR、トロンボスポンジン受容体(CD36)、CD34、HbF、HAE 9、FB3−2、H3−3、エリスロポエチン受容体、HBE、AFP、APOC3、SERPINC1、AMBP、CPB2、ITIH1、APOH、HPX、β−hCG、AHSG、APOB、J42−4−d、2,3−ビスホスホグリセリン酸(BPG)、炭酸脱水酵素(CA)およびチミジンキナーゼ(TK)からなる群から選択される、請求項36に記載の方法。
- 前記胎児細胞表面マーカーが、MMP14(マトリックスメタロプロテアーゼ14)またはトランスフェリン受容体(CD71)である、請求項37に記載の方法。
- 前記母体サンプルが、母体血サンプルである、請求項22から38のいずれかに記載の方法。
- 前記胎児細胞濃縮サンプル中の細胞の少なくとも50%、60%、70%、80%、または90%が、胎児細胞である、請求項22から39のいずれかに記載の方法。
- 前記胎児細胞濃縮サンプルの調製方法が、
該胎児細胞濃縮サンプルを準備するステップと;
該胎児細胞濃縮サンプル由来の2つ以上の細胞における核酸分子のヌクレオチド配列または遺伝子の発現を分析するステップとをさらに含む、請求項22から40のいずれかに記載の方法。 - 核酸分子のヌクレオチド配列を前記分析するステップが、前記胎児細胞濃縮サンプル由来の2つ以上の細胞のゲノムDNAをシークエンシングするステップを含む、請求項41に記載の方法。
- ゲノムDNAを前記シークエンシングするステップが、単一細胞の前記DNAをシークエンシングするステップを含み、単一細胞の該DNAをシークエンシングするステップが、前記胎児細胞濃縮サンプル由来の2つ以上の細胞に対して実施される、請求項42に記載の方法。
- 単一細胞の前記DNAをシークエンシングするステップが、前記胎児細胞濃縮サンプル由来の少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9または10個の細胞に対して実施される、請求項43に記載の方法。
- 遺伝子の前記発現が、前記胎児細胞濃縮サンプル由来の2つ以上の細胞の表面に検出可能な抗体をハイブリダイズさせるステップを含む、請求項41に記載の方法。
- 核酸分子のヌクレオチド配列を前記分析するステップが、前記胎児細胞濃縮サンプル由来の2つ以上の細胞の前記ゲノムDNAに検出可能なプローブをハイブリダイズさせるステップを含む請求項41に記載の方法。
- 1つまたは複数の個々の細胞が、分析される各細胞の前記ゲノムDNAへの検出可能なプローブのハイブリダイゼーションについて分析される、請求項46に記載の方法。
- 少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9または10個の個々の細胞が、分析される各細胞の前記ゲノムDNAへの検出可能なプローブのハイブリダイゼーションについて分析される、請求項46に記載の方法。
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