KR102339013B1 - 양수 검체 내 mmp-8 정량화가 가능한 체외 진단 키트 - Google Patents

양수 검체 내 mmp-8 정량화가 가능한 체외 진단 키트 Download PDF

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Abstract

본 발명은 양수 검체 내 MMP-8 정량화가 가능한 체외 진단 키트에 관한 것으로, 진단 스트립; 및 상기 진단 스트립을 내부 공간에 수용하는 진단 키트 몸체;를 포함하며, 상기 진단 스트립은, 진단 키트 몸체의 내부 공간에 수용 설치되는 상기 진단 스트립의 기저몸체에 해당하는 지지체; 상기 지지체 상부에 부착되며, 진단대상의 양수에 해당하는 검체 및 버퍼가 주입되는 샘플 패드; 상기 샘플 패드에 순차적으로 연결되는 형태로 상기 지지체 상부에 부착되는 검출막; 상기 검출막에 도포 형성되며, Anti-Mouse MMP-8 항체가 고정된 검출라인; 및 상기 검출막의 상기 검출라인으로부터 이격된 위치에 도포 형성되며, Chicken IgY가 고정된 대조(Control)라인;을 포함한다.

Description

양수 검체 내 MMP-8 정량화가 가능한 체외 진단 키트 {IN-VITRO DIAGNOSTIC KIT CAPABLE OF QUANTITATING MMP-8 IN AMNIOTIC FLUID SPECIMEN}
본 발명은 진단대상의 양수를 검체로 하여 MMP-8(Matrix Metalloproteinase -8)의 정량 분석이 가능하여 산모의 산전 임신과 관련한 각종 질병의 진단에 이용할 수 있는 체외 진단 키트에 관한 것이다.
본 발명은 중소벤처기업부 및 한국산업기술진흥원이 지원하는 지역특화산업육성+(R&D)-지역주력산업육성사업으로 수행된 국내 최초 조기 양막파수 산모의 조산 예측용 Quantum Dot 기반 MMP-8/IL-6 듀얼 정량 진단 키트 개발 과제에 대한 연구결과로서, 구체적으로 본 연구와 관련된 사항은 아래와 같다.
- 과제고유번호 : S2910919
- 부처명 : 중소벤처기업부
- 연구관리전문기관 : 한국산업기술진흥원
- 연구사업명 :지역특화산업육성+(R&D)-지역주력산업육성
- 연구과제명: 국내 최초 조기 양막파수 산모의 조산 예측용 Quantum Dot 기반 MMP-8/IL-6 듀얼 정량 진단 키트 개발
- 주관기관 : ㈜옵티바이오
- 연구기간 : 2020.05.01. ~2020.12.31.
조산(早産)은 임신한 날부터 37주가 되기 전에 이루어지는 분만을 의미하는데, 이에 대한 원인으로는 전치태반, 태반조기박리, 양수 감염, 자궁경부무력증, 자궁 기형, 전자간증, 외상, 수술, 태아 기형 등 다양하게 존재한다.
이러한 조산의 현상은 단순히 조기 분만의 문제에서 그치는 것이 아니라, 조산아 패혈증, 조산아 호흡부전, 폐렴, 기관지폐이형성증, 뇌실질내 출혈 및 괴사성 장염과 같은 신생아 합병증과 뇌성마비 등과 같은 심각한 질병을 유발하며 태아 손상을 일으키게 된다.
특히, 조산을 일으키는 원인 중 많은 부분을 차지하는 원인으로 자궁 내 감염이 다양한 연구를 통해 보고되고 있으며, 이러한 자궁 내 감염으로 인한 조산과 태아 손상이 일어나는 과정에서 모체와 태아의 면역체계가 활성화되어 임파구에서는 사이토카인이, 중성백혈구에서는 MMP(matrix-metalloproteinase)와 같은 염증 매개 물질이 분비된다.
더욱 구체적으로, 임신 중 자궁 내 감염이나 염증이 유발되면 양수 내 태아로부터 유래된 중성백혈구의 수가 증가하게 되어, MMP-8과 같은 기질단백질 분해효소를 통해 조산 및 조산과 관련된 태아손상 등을 이어지는 것으로 판단되는 연구들이 이루어진 바 있다.
이와 관련하여, 양수 내 MMP-8(Matrix Metalloproteinase―8)의 면역학적 측정을 통해 산전에 조산과 태아감염 및 태아손상의 검사를 진행하기 위해 마련된 종래기술에 대한 선행문헌에는 대한민국 등록특허공보 제10-0425525호의"조산과 태아감염 및 태아손상을 산전 진단하기 위한진단시약 및 진단키트"(이하, '종래기술'이라고 함)이 있다.
하지만 종래기술을 비롯한 기존의 양수 내 MMP-8(Matrix Metalloproteinase―8)의 면역학적 측정을 통해 산전에 조산과 태아감염 및 태아손상의 검사와 관련한 연구들의 경우, 산모의 양수 내 포함된 MMP-8(Matrix Metalloproteinase―8)의 존재여부에 관한 정성화를 위한 진단기술에 그쳐 MMP-8(Matrix Metalloproteinase―8)의 농도 수준에 따라 산전에 조산과 태아감염 및 태아손상과 관련한 다양한 질병 형태를 구체적으로 구분하여 진단하기 위한 정량화의 기술이 부족한 문제점이 있었다.
본 발명은 상기 문제점을 해결하기 위해 창작된 것으로써, 본 발명의 목적은 산전에 조산과 태아감염 및 태아손상과 관련한 다양한 질병 형태를 구체적으로 구분하여 진단하기 위해 산모의 양수 내 MMP-8(Matrix Metalloproteinase―8)의 정량 분석을 정확하게 수행할 수 있는 기술을 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명의 양수 검체 내 MMP-8 정량화가 가능한 체외 진단 키트는, 진단 스트립; 및 상기 진단 스트립을 내부 공간에 수용하는 진단 키트 몸체;를 포함하며, 상기 진단 스트립은, 진단 키트 몸체의 내부 공간에 수용 설치되는 상기 진단 스트립의 기저몸체에 해당하는 지지체; 상기 지지체 상부에 부착되며, 진단대상의 양수에 해당하는 검체 및 버퍼가 주입되는 샘플 패드; 상기 샘플 패드에 순차적으로 연결되는 형태로 상기 지지체 상부에 부착되는 검출막; 상기 검출막에 도포 형성되며, Anti-Mouse MMP-8 항체가 고정된 검출라인; 및 상기 검출막의 상기 검출라인으로부터 이격된 위치에 도포 형성되며, Chicken IgY가 고정된 대조(Control)라인;을 포함한다.
여기서, 상기 검출막은 상기 샘플 패드 측을 기준으로 상기 검출라인 및 상기 대조라인이 순차적으로 형성될 수 있다.
또한, 상기 샘플 패드에 주입되는 상기 버퍼는 1X PBS(Phosphate-buffered saline), 소혈청 알부민(BSA, Bovine Serum Albumin), 0.1% Triton X-100, 형광 표지물질이 접합된 Anti-Chicken IgY 항체 및 형광 표지물질이 접합된 Anti-Mouse MMP-8 항체를 포함할 수 있다.
여기서, 상기 버퍼 내 포함되는 형광 표지물질이 접합된 Anti-Chicken IgY 항체는 0.5㎍/ml의 농도로 마련되며, 상기 버퍼 내 포함되는 형광 표지물질이 접합된 Anti-Mouse MMP-8 항체는 3.0㎍/ml의 농도로 마련될 수 있다.
또한, 상기 샘플 패드에 주입되는 상기 버퍼는 1X PBS(Phosphate-buffered saline) 1L 내에 소혈청 알부민(BSA, Bovine Serum Albumin) 10g을 첨가한 혼합물 10ml에 형광 표지물질이 접합된 Anti-Chicken IgY 항체 5㎍ 및 형광 표지물질이 접합된 Anti-Mouse MMP-8 항체 25㎍을 추가 첨가하여 10분 이상 교반한 상태로 마련될 수 있다.
아울러, 상기 검출라인에 포함되는 Anti-Mouse MMP-8 항체는 2.5mg/ml의 농도로 마련되며, 상기 대조라인에 포함되는 Chicken IgY는 1.0mg/ml의 농도로 마련될 수 있다.
그리고 상기 진단 스트립은, 상기 검출막에 순차적으로 연결되는 형태로 상기 지지체 상부에 부착되며, 상기 검출막을 거친 잔존 검체 및 버퍼가 흡수되는 흡수 패드;를 더 포함할 수 있다.
본 발명에 의하면 다음과 같은 효과가 있다.
첫째, 산모의 양수로 마련된 검체를 진단 키트에 적용하여 양수 내 MMP-8(Matrix Metalloproteinase―8)의 농도와 관련한 정량 분석이 높은 신뢰도를 갖추어 수행될 수 있다.
둘째, 산모의 양수로 마련된 검체로 하여 해당 검체 내 MMP-8(Matrix Metalloproteinase―8)의 농도에 관한 수치의 진단을 수행하더라도, 검체의 농도에 따른 표지물질의 발현도(Intensity) 검사 및 이를 기반으로 한 표준정량곡선(Calibration curve) 도출 결과가 유사한 양상을 나타내며, 저농도에서 고농도의 검체 모두에 걸친 유의한 정량 분석 결과의 도출이 가능해진다.
도1은 본 발명의 양수 검체 내 MMP-8 정량화가 가능한 체외 진단 키트의 구조를 도시한 분해 사시도이다.
도2는 본 발명의 양수 검체 내 MMP-8 정량화가 가능한 체외 진단 키트의 구조를 도시한 결합 사시도이다.
도3은 본 발명의 양수 검체 내 MMP-8 정량화가 가능한 체외 진단 키트의 진단 스트립 구조를 도시한 단면도이다.
도4는 본 발명의 양수 검체 내 MMP-8 정량화가 가능한 체외 진단 키트를 이용한 진단 수행 시, 검체의 농도에 따른 표지물질의 발현도(Intensity)를 나타낸 결과 그래프이다.
도5는 본 발명의 양수 검체 내 MMP-8 정량화가 가능한 체외 진단 키트를 이용한 진단 수행 시, 도4의 결과 그래프를 이용한 표준정량곡선(Calibration curve) 도출 결과 그래프이다.
도6은 본 발명의 양수 검체 내 MMP-8 정량화가 가능한 체외 진단 키트를 이용한 MMP-8 정량화 결과와 ELISA를 이용한 MMP-8 정량화 결과간의 비교 그래프이다.
본 발명의 바람직한 실시예에 대하여 첨부된 도면을 참조하여 더 구체적으로 설명하되, 이미 주지된 기술적 부분에 대해서는 설명의 간결함을 위해 생략하거나 압축하기로 한다.
1. 체외 진단 키트에 관한 설명
도1을 참조하여 설명하면, 본 발명의 양수 검체 내 MMP-8 정량화가 가능한 체외 진단 키트(100)는 진단 키트 몸체(110)에 해당하는 진단 키트(100)의 전체 하우징 내부에 마련된 별도의 수용 공간 내에 도1에 도시된 바와 같이 마련된 진단 스트립(120)이 수용 설치되도록 형성된다.
다시 말해, 진단 키트 몸체(110)는 도1에 도시된 바와 같이 내부에 마련된 별도의 수용 공간 내에 진단 스트립(120)을 수용하는 하우징 구성이다.
여기서, 진단 키트 몸체(110) 상부 일측에는 진단 스트립(120)의 샘플 패드(121) 내 검체가 주입될 수 있는 개방 공간을 제공하기 위한 검체 주입구(111H)가 형성된다.
아울러, 진단 키트 몸체(110) 상부 일측에는 검출막(124) 내 검출라인(125)을 통한 검출 결과 및 대조라인(126)을 통한 컨트롤 비교 결과를 외부로 노출시키기 위한 결과 관찰구(112H)가 형성된다.
더 나아가, 진단 키트 몸체(110) 상부 일측에는 도1 및 도2에 도시된 바와 같이 해당 체외 진단 키트(100)의 식별을 위한 별도의 바코드와 같은 고유식별코드가 외부로 노출 표시되어 별도의 인식장치를 통해 진단 결과의 분석을 거치게 되는 키트들을 상호 구분하기 위한 바코드 생성부(113)가 구비된다.
여기서, 바코드 생성부(113)는 구비된 체외 진단 키트(100)의 식별에 이용되는 수단으로서, 바코드 형태로 마련됨이 바람직하나 이에 한정되지 않고 상호 구분이 가능한 QR코드 혹은 일련 번호등의 고유식별코드 수단의 다양한 형태로 실시 변형 가능하다.
진단 스트립(120)은 진단 키트 몸체(110) 내에 수용 설치되어 주입되는 검체의 측면 면역 크로마토그래피 분석법(Lateral flow immunochromatographic assay, LFIA)을 이용한 진단이 직접적으로 수행되는 구성으로, 이를 위해 도3에 도시된 바와 같이 지지체(121), 샘플 패드(122), 검출막(123), 흡수 패드(124), 검출라인(125) 및 대조라인(126)을 포함한다.
여기서, 진단 키트 몸체(110) 상부 일측에는 진단 스트립의 샘플 패드(122) 내 검체 및 버퍼가 주입될 수 있는 개방 공간을 제공하기 위한 검체 주입구(111H)가 형성된다.
아울러, 진단 키트 몸체(110) 상부 일측에는 검출막(123) 내 검출라인(125) 및 대조라인(126)을 통한 검출 결과를 외부로 노출시키기 위한 투명한 결과 관찰창이 결과 관찰구(112H)를 덮는 형태로 형성될 수 있다.
우선, 지지체(121)은 도1 및 도3에 도시된 바와 같이 샘플 패드(122), 검출막(123), 흡수 패드(124), 검출라인(125) 및 대조라인(126)이 상부에 부착되어 순차적으로 연결되기 위한 기저 몸체를 제공한다.
구체적으로, 지지체(121)의 상부에는 도1에 도시된 바와 같이 샘플 패드(122)를 시작으로, 검출막(123) 및 흡수 패드(124)가 순서대로 부착되며, 순서상 상호 근접한 샘플 패드(122)와 검출막(123), 검출막(123)과 흡수 패드(124)는 접하여 연결됨으로써, 샘플 패드(122)에 주입되는 검체가 검출막(123)을 거쳐 최종적으로 흡수 패드(124)에 이르기까지 모세관 현상에 따라 이동할 수 있는 경로를 마련한다.
또한, 검출막(123)에는 검출라인(125) 및 대조라인(126)이 순서대로 형성되며, 순서상 검출라인(125)가 샘플 패드(122) 측에 위치하고 대조라인(126)이 흡수 패드(124) 측에 위치하여 순차적 구조를 형성한다.
먼저, 샘플 패드(122)는 지지체(121) 상부에 부착되어 MMP-8(Matrix Metalloproteinase-8)을 포함한 검체 및 버퍼가 주입되는 영역으로, MMP-8(Matrix Metalloproteinase-8)을 포함한 검체 및 버퍼의 모세관 현상에 따른 이동 경로 상 최 선단에 위치한다.
여기서, 샘플 패드(122)에 주입되는 MMP-8(Matrix Metalloproteinase-8)을 포함한 검체는 산모의 양수에 해당하는 시료로 마련될 수 있다.
또한, 샘플 패드(122)에 주입되는 버퍼는 1X PBS(Phosphate-buffered saline, pH7.4), 소혈청 알부민(BSA, Bovine Serum Albumin), Triton X-100, 형광 표지물질이 접합된 Anti-Chicken IgY 항체 및 형광 표지물질이 접합된 Anti-Mouse MMP-8 항체를 포함하는 조성으로 마련된다.
더욱 구체적으로, 샘플 패드(122)에 주입되는 버퍼는 우선적으로 1X PBS(Phosphate-buffered saline) 1L 내에 소혈청 알부민(BSA, Bovine Serum Albumin, Merk사 제품) 10g 및 Triton X-100(JUNSEI, 일본) 1ml을 첨가하여 소혈청 알부민이 중량 기준 1%의 농도를 갖추고 Triton X-100가 부피 기준 0.1%의 농도를 갖추도록 제조한 뒤, 제조된 혼합물 10ml에 형광 표지물질이 접합된 Anti-Chicken IgY 항체 5㎍ 및 형광 표지물질이 접합된 Anti-Mouse MMP-8 항체 25㎍을 추가 첨가하여 10분 이상 교반한 상태로 마련하여 냉장 보관하며 사용하게 된다.
이로 인해, 버퍼 내 포함되는 형광 표지물질이 접합된 Anti-Chicken IgY 항체는 0.5㎍/ml의 농도로 마련되며, 형광 표지물질이 접합된 Anti-Mouse MMP-8 항체는 3.0㎍/ml의 농도로 마련되게 된다.
여기서, 버퍼 내에 포함되는 형광 표지물질이 접합된 Anti-Chicken IgY 항체는 Anti-Chicken IgY(Arista Biologicals Inc., ABGAC-0100) 항체 1mg에 10% Sod. Bicarbonate 용액(pH8.4) 0.1mL을 넣고 1시간 반응시킨 뒤, 형광 물질 FSD647(BioActs, 한국) 0.1mg을 넣고 2시간 암실에서 반응시키고 Sephadex G-25(Merk, US) 컬럼을 이용하여 항체-형광 접합체를 분리하여 마련한다.
또한, 버퍼 내 포함되는 형광 표지물질이 접합된 Anti-Mouse MMP-8 항체는 Anti-Mouse MMP-8(Clone 6-17-6, 서울대학교 의과대학 산부인과학교실 윤보현 교수팀) 항체 1mg에 10% Sod. Bicarbonate 용액(pH8.4) 0.1mL을 넣고 1시간 반응시키고, 형광 물질 FSD647(BioActs, 한국) 0.1mg을 넣고 2시간 암실에서 반응시킨 뒤, Sephadex G-25(Merk, US) 컬럼을 이용하여 항체-형광 접합체를 분리하여 마련한다.
아울러, Anti-Chicken IgY 항체 및 Anti-Mouse MMP-8 항체에 부착되어지는 형광 표지물체는 결합 포화도에 따라 특정 광도의 세기의 형광 발현을 일으킬 수 있어, 진단 결과의 정성적 표지와 진단 수준의 정량적 표지가 가능 물질로 금-나노입자(Gold-nano particle). 형광 비드(Fluorescence bead), FITC(poly L-lysine-fluorescein isothiocyanate)와 같은 형광분자 또는 HRP(horseradish peroxidase)와 같은 발색효소 등의 형태로 특정 표지물질에 한정되지 않고 다양하게 실시 가능하나, 가장 바람직하게는 FSD647(BioActs, 한국)와 같은 제품이 적용될 수 있다.
구체적으로, 샘플 패드(122)에 주입된 산모의 양수에 해당하는 검체 내 MMP-8은 형광 표지물질이 접합된 형광 표지물질이 접합된 Anti-Mouse MMP-8 항체와 항원-항체반응을 일으켜 상호 특이적으로 결합하게 된다.
다음으로, 검출막(123)은 도3에 도시된 바와 같이 지지체(121) 상부에 샘플 패드(122) 다음으로 순차 연결되는 형태로 부착되며, 검출라인(125) 및 대조라인(126)을 포함하는 다공성 막이다.
여기서, 검출막(123)은 NC(nitrocellulose), PVDF(polyvinylidene fluoride), (charge modified)Nylon 또는 PES (Polyethersulfone) 등의 폴리머 재질로 마련 가능한 다공성 막으로, 마련되는 검출막(124)의 폴리머 재질에 따라 항체의 결합 형태를 정전기적 결합(electrostatic) 또는 소수성 결합(hydrophobic) 등으로 대응되어 적용 가능하다.
구체적으로, 샘플 패드(122)에 주입된 산모의 양수에 해당하는 검체 내 MMP-8은 형광 표지물질이 접합된 Anti-Mouse MMP-8 항체와 결합된 형태로 검출막(123)로 이동하게 되고, 나머지 검체 및 버퍼의 조성물은 MMP-8과 결합되지 않은 원상태 그대로 검출막(123)로 이동하게 된다.
이에 따라, 검출막(123) 내로 이동한 산모의 양수에 해당하는 검체 내 MMP-8은 형광 표지물질이 접합된 Anti-Mouse MMP-8 항체에 의해 라벨링되고, 형광 표지물질이 접합된 Anti-Mouse MMP-8 항체가 접합된 MMP-8은 검출막(123) 내 도포된 검출라인(125)에서 Anti-Mouse MMP-8 항체와 결합 반응하게 된다.
여기서, 검출라인(125)은 검출막(123)에 도포 형성되며, 검출막(123) 내로 이동한 산모의 양수에 해당하는 검체 내 MMP-8이 형광 표지물질이 접합된 Anti-Mouse MMP-8 항체에 의해 라벨링된 상태로 항원-항체반응을 일으켜 상호 특이적으로 결합할 수 있는 Anti-Mouse MMP-8 항체(Clone 221-6-1, 서울대학교 의과대학 산부인과학교실 윤보현 교수팀)가 고정 설치된다.
더욱 구체적으로, 검출라인(125)에 포함되는 Anti-Mouse MMP-8 항체는 2.5mg/ml의 농도로 마련될 수 있게 구체화됨이 바람직하다.
아울러, 검출라인(125)(Grade8964, AHLSTROM-MUNKSJㅦ)은 검출막(123) 상에 300mm x 26mm 간격으로 제조됨이 바람직하다.
다음으로, 대조(Control)라인(160)은 검출막(123)의 검출라인(125)부터 이격된 위치에 도포 형성되며, 검출막(123) 내로 이동한 버퍼 내 형광 표지물질이 접합된 Anti-Chicken IgY 항체가 항원-항체반응을 일으켜 상호 특이적으로 결합할 수 있는 Chicken IgY(Arista Biologicals Inc., AGCIG-0100)가 고정 설치된다.
더욱 구체적으로, 대조라인(126)은 Chicken IgY의 농도 조건을 1.0mg/ml의 농도로 마련될 수 있게 구체화함이 바람직하다.
아울러, 대조라인(126)(Grade319, AHLSTROM-MUNKSJㅦ)은 검출막(123) 상에 300mm x 31mm 간격으로 제조됨이 바람직하다.
마지막으로, 흡수 패드(124)는 도3에 도시된 바와 같이 지지체(121) 상부에 검출막(123) 다음으로 순차 연결되는 형태로 부착되며, 검출막(123) 거친 잔존 검체 및 버퍼의 성분들이 흡수된다.
여기서, 흡수 패드(124)는 검체를 비롯한 모세관 현상에 기인한 각종 이동 물질들의 동력을 제공하는 역할을 수행한다.
이와 같은 구성적 특징을 갖춘 본 발명의 MMP-8 진단 키트(100)는 혈청 시료 또는 전혈 시료로 마련된 검체 중 어떤 검체를 진단 키트에 적용하여 MMP-8 수치의 진단을 수행하더라도 해당 검체 내 MMP-8의 정량 분석이 높은 신뢰도를 갖추어 수행될 수 있도록 한다.
2. 체외 진단 키트의 MMP-8 정량분석 성능에 관한 설명
아래에서는, 본 발명에 따른 양수 검체 내 MMP-8 정량화가 가능한 체외 진단 키트(100)는 앞 서 설명한 구성적 특징을 통해 정량분석 성능이 우수한 수준을 갖추고 있음을 검증하기 위해, 검체 별 검체 농도에 따른 표지물질의 발현도(Intensity) 검사 및 이를 기반으로 한 표준정량곡선(Calibration curve) 도출 결과를 비교 설명하고자 한다.
우선, 버퍼 200㎕와 재조합 인간 MMP-8 단백질 0㎕, 1㎕, 10㎕, 50㎕, 100㎕ 및 1000㎕로 각각 구분하여 혼합함으로서, 재조합 인간 MMP-8 단백질의 농도수준을 달리한 혼합물들을 개별 마련한 뒤, 각 혼합물의 100㎕를 앞 서 설명한 구성적 특징을 갖춘 본 발명에 따른 양수 검체 내 MMP-8 정량화가 가능한 체외 진단 키트(100)의 샘플 패드(122)에 각각의 검체 및 버퍼의 혼합물을 주입하여 진단을 수행하였다.
여기서, 진단 스트립(120) 내 검출막(123)의 검출라인(125)에는 Anti-Mouse MMP-8 항체(Clone 221-6-1, 서울대학교 의과대학 산부인과학교실 윤보현 교수팀)가 2.5 mg/ml의 농도 수준을 갖추어 고정되고, 대조라인(126)에는 Chicken IgY(Arista Biologicals Inc., AGCIG-0100)가 1.0 mg/ml의 농도 수준을 갖추어 고정된다.
그 후, 검체 농도별로 구분하여 주입된 각각의 체외 진단 키트(100)의 진단 스트립 내 검출막(123)의 검출라인(130) 상 형광 표지물질의 발현도(Intensity)를 분광광도계를 이용해 280nm 파장에서 라인 별 흡광도를 측정하여 도4와 같은 결과를 도출하였다.
여기서, 도4의 결과 그래프 내 X축은 진단 키트 판독 구간을 step 수로 범위 설정한 값이고, Y축은 라인별로 형광 발색하는 표지물질의 발현도(Intensity)를 나타낸다.
구체적으로, 도4에 도시된 검체의 농도별 결과 그래프에서 상대적으로 오른쪽에 있는 형광신호는 대조라인의 형광신호로서 고정적인 도출이 확인되고, 상대적으로 왼쪽에 있는 형광신호는 검출라인의 형광신호로서 1ng/ml의 저농도에서 1000 ng/ml의 고농도의 검체까지 모두 정량 분석에 이용 가능한 형태로 확인된다.
이와 같은 도4에 도시된 산모의 양수에 해당하는 검체의 농도별 본 발명에 따른 MMP-8 진단 키트(100)의 진단 스트립 내 검출막(123)의 검출라인(125) 상 표지물질의 발현도(Intensity)를 나타낸 결과 그래프를 이용해 표준정량곡선(Calibration curve)을 도출 결과를 도5를 통해 살펴보면 고농도 검체의 정량화가 가능해짐을 더욱 확연히 판단할 수 있다.
여기서, 도5의 결과 그래프 내 X축은 검출막(123) 내 검출라인(125) 상의 표지물질 형광 발현도 수준과 검출막(123) 내 대조라인(126)에서의 표지물질 형광 발현도 수준 간의 비율을 나타내고, Y축은 검체 내 표적물질인 MMP-8의 농도 수준(단위 : ng/mL)을 나타낸다.
도5에 도시된 바와 같이 본 발명에 따른 MMP-8 진단 키트(100)의 경우, 표준 정량 곡선의 직선성이 나타나며 비례관계의 성립이 이루어져 혈청 시료에 해당하는 검체의 농도가 변화하더라도 저농도에서 고농도 모두에 걸쳐 지속적으로 정확한 MMP-8의 정량 분석이 가능하다.
이와 관련해 도5를 통해 산출되는 표준곡선(y=102.69x― 2.875)에 관련한 수식의 x값에 도출되는 표지물질의 발현도(Intensity) 수치를 대입하여 나오는 결과값의 3회 반복 평균치를 AV로 정의하고, 이에 대한 구체적인 평균의 수치는 아래 표1과 같다.
혼합물 내 첨가된 검체 용량 AV CV Recovery
0㎕ 0.00 34.94 -
1㎕ 0.91 6.45 91%
10㎕ 9.80 3.20 98%
50㎕ 50.1 1.41 100%
100㎕ 100.0 1.40 100%
1000㎕ 1000.1 1.70 100%
다음으로, 버퍼 200㎕와 진단 대상이 되는 특정 산모들의 양수에 해당하는 검체 100㎕를 혼합한 혼합물 100㎕를 본 발명에 따른 양수 검체 내 MMP-8 정량화가 가능한 체외 진단 키트(100)의 샘플 패드(122)에 각각에 주입한 후 15분간 대기하고, 해당 시간이 경과하면 별도의 형광물질의 발현 판독 장비를 이용해 판독을 수행한 임상 검체의 정량분석 결과를 ELISA로 정량 분석한 결과와 비교하면 도6과 같은 결과를 도출할 수 있다.
도6의 결과는 총 26 검체를 기준으로 진행되었으며, ELISA의 분석은 R&D Systems(US)의 제품을 이용하여 진행되었다.
구체적으로, X 축은 본 발명의 제품을 사용한 정량분석 결과를 반영하고, Y축은 종래의 ELISA로 정량 분석한 결과를 대입하여 이들에 대한 상관성 평가를 진행한 결과가 도6에 도시된 바와 같으며, 이에 따른 R2값이 0.9 이상으로 본 발명의 진단키트가 양수 검체 내 MMP-8 정량화를 위한 체외 진단 키트로서 유효성을 가지고 있음을 알 수 있다.
본 발명에 개시된 실시예는 본 발명의 기술 사상을 한정하기 위한 것이 아니라 설명하기 위한 것이고, 이러한 실시예에 의해서 본 발명의 기술 사상의 범위가 한정되는 것은 아니다. 보호범위는 아래 청구범위에 의하여 해석되어야 하며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 기술 사상은 본 발명의 권리 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 할 것이다.
100 : 체외 진단 키트
110 : 진단 키트 몸체
111H : 검체 주입구 112H : 결과 관찰구
113 : 바코드 생성부
120 : 진단 스트립
121 : 지지체 122 : 샘플 패드
123 : 검출막 124 : 흡수 패드
125 : 검출라인 126 : 대조라인

Claims (7)

  1. 양수 검체 내 1ng/ml의 저농도에 해당하는 MMP-8에서 1000 ng/ml의 고농도에 해당하는 MMP-8까지에 걸친 모두에서 정량 분석이 가능한 체외 진단 키트에 있어서,
    진단 스트립; 및
    상기 진단 스트립을 내부 공간에 수용하는 진단 키트 몸체;를 포함하며,
    상기 진단 스트립은,
    진단 키트 몸체의 내부 공간에 수용 설치되는 상기 진단 스트립의 기저몸체에 해당하는 지지체;
    상기 지지체 상부에 부착되며, 진단대상의 양수에 해당하는 검체 및 버퍼가 주입되는 샘플 패드;
    상기 샘플 패드에 순차적으로 연결되는 형태로 상기 지지체 상부에 부착되는 검출막;
    상기 검출막에 도포 형성되며, Anti-Mouse MMP-8 항체가 고정된 검출라인; 및
    상기 검출막의 상기 검출라인으로부터 이격된 위치에 도포 형성되며, Chicken IgY가 고정된 대조(Control)라인;을 포함하며,
    상기 검출막은 상기 샘플 패드 측을 기준으로 상기 검출라인 및 상기 대조라인이 순차적으로 형성되며,
    상기 샘플 패드에 주입되는 상기 버퍼는 1X PBS(Phosphate-buffered saline), 소혈청 알부민(BSA, Bovine Serum Albumin), Triton X-100, 형광 표지물질이 접합된 Anti-Chicken IgY 항체 및 형광 표지물질이 접합된 Anti-Mouse MMP-8 항체를 포함하며,
    상기 버퍼 내 포함되는 형광 표지물질이 접합된 Anti-Chicken IgY 항체는 0.5㎍/ml의 농도로 마련되며,
    상기 버퍼 내 포함되는 형광 표지물질이 접합된 Anti-Mouse MMP-8 항체는 3.0㎍/ml의 농도로 마련되며,
    상기 샘플 패드에 주입되는 상기 버퍼는 1X PBS(Phosphate-buffered saline) 1L 내에 소혈청 알부민(BSA, Bovine Serum Albumin) 10g 및 Triton X-100 1ml을 첨가한 혼합물 10ml에 형광 표지물질이 접합된 Anti-Chicken IgY 항체 5㎍ 및 형광 표지물질이 접합된 Anti-Mouse MMP-8 항체 25㎍을 추가 첨가하여 10분 이상 교반한 상태로 마련되며,
    상기 검출라인에 포함되는 Anti-Mouse MMP-8 항체는 2.5mg/ml의 농도로 마련되며,
    상기 대조라인에 포함되는 Chicken IgY는 1.0mg/ml의 농도로 마련되는 것을 특징으로 하는
    양수 검체 내 MMP-8 정량화가 가능한 체외 진단 키트.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 제1항에 있어서,
    상기 진단 스트립은,
    상기 검출막에 순차적으로 연결되는 형태로 상기 지지체 상부에 부착되며, 상기 검출막을 거친 잔존 검체 및 버퍼가 흡수되는 흡수 패드;를 더 포함하는 것을 특징으로 하는
    양수 검체 내 MMP-8 정량화가 가능한 체외 진단 키트.
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