KR100378904B1 - 천연생약재로부터성장호르몬분비자극인자를추출하는방법및수용성속단추출물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 천연 생약재로부터 성장호르몬 분비자극인자를 효과적으로 추출하는 방법에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 성장호르몬 분비자극인자를 포함하는 속단 (라틴명 : Phlomidis Radix)을 물로 추출하여 저급 알코올로 불순 고용물을 제거하고 n-부탄올 또는 이소부탄올 등으로 다시 분획한 다음 에틸 에테르로 불순물을 제거하는 과정으로 얻은 수용성 속단 추출물에 관한 것으로서, 상기 방법으로 생산한 속단 추출물은 침전이 형성되지 않는 음료 첨가물 등으로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

천연 생약재로부터 성장호르몬 분비자극인자를 추출하는 방법 및 수용성 속단 추출물

본 발명은 천연 생약재로부터 성장호르몬 분비자극인자를 효과적으로 추출하는 방법에 관한 것이다.

보다 상세하게는, 본 발명은 성장호르몬 분비자극인자를 포함하는 속단 (라틴명 : Phlomidis Radix)을 물로 추출하여 저급 알코올로 불순 고용물을 제거하고 n-부탄올 또는 이소부탄올 등으로 다시 분획한 다음 에틸 에테르로 불순물을 제거하는 과정으로 얻은 수용성 속단 추출물에 관한 것으로서, 상기 방법으로 생산한 속단 추출물은 침전이 형성되지 않는 음료 첨가물 등으로 유용하게 사용될 수 있다.

성장호르몬은 동물의 뇌하수체에서 분비되는 단백질로서 191개의 아미노산으로 구성된 펩타이드 호르몬이다. 성장호르몬은 오래 전부터 동물체로부터 분리되어 주로 왜소증 (dwarfism, 난장이병) 환자들의 치료에 사용되어 왔는데, 과거에는 주로 성장호르몬이 사체의 뇌하수체로부터 추출되어 사용됨으로써 분리 과정에서 다른 질병의 원인균까지 환자에게 유입될 수 있는 위험성이 있어 그 사용이 매우 제한되었다. 그러나 최근 유전공학의 발달과 더불어 미생물을 이용한 성장호르몬의 대량 생산 및 공급이 가능해지고 다른 질환의 감염 위험성이 적어짐에 따라, 재조합 성장호르몬을 포함하는 단백질 제제가 왜소증 치료제 시장의 대부분을 차지하게 되었다. 재조합 성장호르몬은 주사기를 이용하여 자가 치료가 가능할 정도로 보편화되어 있는데, 주로 근육주사로 투여된다. 이와 같이 재조합 성장호르몬은 대량 생산될 수 있음에도 불구하고 일정한 치료 기간동안 요구되는 비용이 상당하고 주사를 이용하는 불편함으로 인하여 최근에는 경구 투여용 제제를 개발하려는 시도들이 활발히 진행되고 있다.

경구 투여용 성장호르몬 제제의 기본 요건은 체내에서 흡수율이 높아야 하는동시에, 선택적으로 성장호르몬 분비를 자극할 수 있는 생물학적 활성도를 지니고 있어야 하는 것이다. 경구 투여로 체내에서 높은 흡수율을 갖기 위해서는 분자량이 작을수록 유리하며, 체내에서 생리 활성 작용을 원활하게 수행하려면 구조적으로도 특별한 물리화학적 성질을 가져야 한다.

이와 같은 기본 요건을 갖춘 물질로서 최근에 연구되어 임상시험 단계까지 개발된 대표적인 것들로는 유기합성된 L-692,429 (Horm. Res., 40: 109-115, 1993) 및 L-163,191 (PNAS, 92: 7001-7005, 1995), 그리고 펩타이드성 화합물인 GHRP-2 (Endocrinology, 140: R9-R13, 1994), GHRP-1 (J.Neuroendocrinology, 6: 185, 1994) 및 헥사렐린 (Hexarelin; His-D-2-methyl-Trp-Ala-Trp-D-Phe-Lys-NH2) 등이 있다. 상기 물질들은 공통적으로 1980년대 초에 알려진 펩타이드성 화합물인 GHRP-6 (His-D-Trp-Ala-Trp-D-Phe-Lys-NH2)의 기본 구조를 이용하여 새로이 연구 개발된 것이다.

최근 들어 새로운 물질을 개발하는 접근 방식으로 화학물질 라이브러리 (chemical library)를 이용하여 후보 물질들을 대량 검색하는 방법이 각광을 받고 있다. 이외에도 길이가 짧은 펩타이드들로 구성된 펩타이드 라이브러리 (peptide library)도 이용되고 있으며, 자연계에 존재하는 여러 물질들로 구성된 천연물질 라이브러리 (natural library)도 이러한 새로운 물질을 개발하기 위하여 활용될 수 있다. 이와 같이 다양하고 광범위한 라이브러리를 이용하여 신약을 개발하는 것은 개발에 소요되는 기간 및 비용면에서 기존의 접근 방식보다 상당히 효율적이므로 선진 제약기업에서는 이미 오래전부터 자사의 라이브러리를 이용한 신약 개발에 적극적으로 참여하여 왔다. 구체적으로 상기 L-163,191 및 헥사렐린도 이러한 접근 방식으로 개발된 물질이라 할 수 있다.

원래 체내에는 동물마다 다르지만 사람의 경우 44개의 아미노산으로 구성된 성장호르몬 분비자극 호르몬 (growth hormone releasing hormone, GHRH)이 존재한다. GHRP-6 는 생물학적 활성도에 있어서 상기 GHRH 보다 효과는 저조하지만 분자량 크기 면에서는 상당히 압축되어 있어 유용한 합성 펩타이드이다 (대한내분비학회지, 10(1): 1-9, 1995). GHRP-6 의 자세한 작용 기전에 대해서 많은 연구가 진행되었지만 아직까지 확실한 결론은 내리지 못하고 있다. 그러나 최근에 GHRP 의 수용체가 존재하고 이들이 시상하부와 뇌하수체에서 발견되었다고 보고되었다 (Science, 273 (5277): 974, 1996). 또한, 이 물질의 작용 과정에는 부분적으로 프로테인 키나아제 C 가 관여하거나 신호전달 과정에서 칼슘 이온이 유입되어 성장호르몬 분비가 유도되는 것으로 알려져 있다.

미국 머크 (Merck)사가 개발한 L-692,429 (Science, 260: 1640-1643, 1993)는 선택적으로 성장호르몬을 분비시키는 것으로 알려졌으며, 동물 실험 단계에서도 효과적인 체내 흡수율을 보여주었다. 그러나 인체 실험 결과는 동물의 그것과 다르게 나타났다. 따라서 이러한 문제를 개선한 L-163,191 가 개발되었고 이는 경구투여시 생리 활성이 높은 특징이 있으며 개를 이용한 동물 실험 결과를 바탕으로 현재 임상실험 중에 있다 (PNAS, 92: 7001-7005, 1995). 이들 물질에 관한 연구 결과는 뇌하수체를 자극하여 성장호르몬을 분비시키는 물질들이 성장호르몬 대체제로서 임상적으로 유용하게 사용될 수 있음을 시사하고 있는 반면, 새로운 성장호르몬 분비자극인자를 개발하는 것이 용이하지 않다는 것을 보여준다.

이와 같은 사실을 고려하여 본 발명자는 자연계에 존재하면서 안전성이 확보된 천연물질을 대상으로 새로운 성장호르몬 분비자극인자를 개발하기 위한 연구를 진행하는 과정에서, 실험 재료로 사용했던 복합생약제제가 성장호르몬 분비자극작용이 있음을 확인하여 이를 대한민국 특허출원 제 96-7402호로서 이미 1996년 3월 19일자로 출원한 바 있다. 또한, 본 발명자는 후속연구를 진행하는 과정에서 감초로부터 생리활성물질을 분리하여 그의 구조 및 용도를 밝혀 대한민국 특허출원 제 97-12797로 1997년 4월 26일자로 출원한 바 있다.

또한 본 발명자는 속단으로부터 성장호르몬 분비자극인자를 분리하여 그의 구조를 밝혔고 이의 용도에 관한 내용을 동일자로 출원한 바 있다. 그러나 이전의 발명은 물질의 분리 과정에서 고압 역상 크로마토그래피를 이용함으로 상기 인자를 분석하는데는 적당하나 대량 생산하는데는 많은 제약이 있었다.

한편 성장호르몬 분비자극인자 등을 포함하는 천연 생약재를 이용하여 음료 또는 약품을 제조하는 경우, 생산성의 향상을 위하여 추출 공정을 철저히 분석하고 각 단계에서 용매의 종류에 따라 유효 성분이 분포하는 양상 및 그의 양을 고려하여 전체 추출 공정의 수율을 증가시키는 것이 필요하다. 또한 천연 생약재에서 얻은 수용성 추출물의 경우, 오랜 기간동안 방치하면 자발적으로 침전물이 형성되는 단점이 있다. 이러한 침전 형성은 시간에 따른 연속적인 현상으로 천연 생약재를 이용한 음료 또는 약품 등의 생산을 어렵게 한다.

이에 본 발명자들은 천연 생약재로부터 성장호르몬 분비자극인자를 효과적으로 대량 생산하기 위하여 연구를 계속하던 중, 속단을 증류수로 추출하고 메탄올 또는 에탄올로 침전을 제거한 다음 n-부탄올 또는 이소부탄올 등의 유기 용매로 분획하고 다시 증류수 및 에틸 에테르를 차례로 혼합하여 불순물을 제거하면 성장호르몬 분비자극인자 활성을 가지는 순도를 높은 수용성 형태의 속단 추출물을 간단하게 고수율로 얻을 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 천연 생약재로부터 성장호르몬 분비자극인자를 포함하는 분획을 효과적으로 분리하는 방법 및 성장호르몬 분비자극인자 활성을 가지는 수용성 속단 추출물을 제공함에 그 목적이 있다.

도 1은 속단으로부터 용매 추출을 이용하여 성장호르몬 분비자극인자를 분리하는 최적의 방법을 도식적으로 나타낸 것이고,

도 2a는 속단을 물로 추출하고 50 % 메탄올로 불순 고용물을 제거하여 얻은 상등액을 고압 역상 액체 크로마토그래피 (HPLC)로 분석한 결과를 나타낸 것이고,

도 2b는 속단을 물로 추출하고 66 % 메탄올로 불순 고용물을 제거하여 얻은 상등액을 HPLC 로 분석한 결과를 나타낸 것이고,

도 2c는 속단을 물로 추출하고 75 % 메탄올로 불순 고용물을 제거하여 얻은 상등액을 HPLC 로 분석한 결과를 나타낸 것이고,

도 3a는 속단을 물로 추출하고 50 % 에탄올로 불순 고용물을 제거하여 얻은 상등액을 HPLC 로 분석한 결과를 나타낸 것이고,

도 3b는 속단을 물로 추출하고 66 % 에탄올로 불순 고용물을 제거하여 얻은 상등액을 HPLC 로 분석한 결과를 나타낸 것이고,

도 3c는 속단을 물로 추출하고 75 % 에탄올로 불순 고용물을 제거하여 얻은 상등액을 HPLC 로 분석한 결과를 나타낸 것이고,

도 4는 속단을 물로 추출하고 저급 알코올로 불순 고용물을 제거한 다음 다시 n-부탄올로 분획하여 용매 층을 HPLC 로 분석한 결과를 나타낸 것이고,

도 5는 속단을 물로 추출하고 저급 알코올로 불순 고용물을 제거한 다음 다시 2-부탄올로 분획하여 용매 층을 HPLC 로 분석한 결과를 나타낸 것이고,

도 6는 속단을 물로 추출하고 저급 알코올로 불순 고용물을 제거한 다음 다시 3차 부탄올로 분획하여 용매 층을 HPLC 로 분석한 결과를 나타낸 것이고,

도 7는 속단을 물로 추출하고 저급 알코올로 불순 고용물을 제거한 다음 다시 테트라하이드로퓨란으로 분획하여 용매 층을 HPLC 로 분석한 결과를 나타낸 것이고,

도 8는 속단을 물로 추출하고 저급 알코올로 불순 고용물을 제거한 다음 다시 n-프로필 알코올로 분획하여 용매 층을 HPLC 로 분석한 결과를 나타낸 것이고,

도 9는 속단을 물로 추출하고 저급 알코올로 불순 고용물을 제거한 다음 다시 이소프로필 알코올로 분획하여 용매 층을 HPLC 로 분석한 결과를 나타낸 것이고,

도 10는 속단을 물로 추출하고 저급 알코올로 불순 고용물을 제거한 다음 다시 이소부탄올로 분획하여 용매 층을 HPLC 로 분석한 결과를 나타낸 것이고,

도 11는 속단을 물로 추출하고 저급 알코올로 불순 고용물을 제거한 다음 다시 n-부탄올로 분획하여 수용액 층을 HPLC 로 분석한 결과를 나타낸 것이고,

도 12는 속단을 물로 추출하고 저급 알코올로 불순 고용물을 제거한 다음 다시 이소부탄올로 분획하여 수용액 층을 HPLC 로 분석한 결과를 나타낸 것이고,

도 13a는 속단을 상기 과정으로 n-부탄올로 분획하고 용매 층에 다시 물을가하여 분획시킨 다음 용매 층을 HPLC 로 분석한 결과를 나타낸 것이고,

도 13b는 속단을 n-부탄올로 분획하고 용매 층에 다시 물을 가하여 분획시킨 다음 수용액 층을 HPLC 로 분석한 결과를 나타낸 것이고,

도 14는 속단을 이소부탄올로 분획하고 용매 층에 다시 물을 가하여 분획시킨 다음 용매 층을 HPLC 로 분석한 결과를 나타낸 것이고,

도 15는 속단을 n-부탄올로 분획하고 용매 층을 물을 3번 세척하여 분획한 다음 수용액 층을 HPLC 로 분석한 결과를 나타낸 것이고,

도 16은 속단을 n-부탄올로 분획하고 용매 층을 다시 에틸 에테르와 혼합한 다음 하층액을 HPLC 로 분석한 결과를 나타낸 것이고,

도 17a는 속단을 이소부탄올로 분획하고 용매 층을 다시 물로 3번 세척한 다음 수용액 층을 HPLC 로 분석한 결과를 나타낸 것이고,

도 17b는 속단을 이소부탄올로 분획하고 용매 층을 다시 에틸 에테르와 혼합한 다음 혼합 층 (300 mL 상태)을 HPLC 로 분석한 결과를 나타낸 것이고,

도 18은 상기 과정을 통하여 최종적으로 얻은 수용성 속단 추출물에서 성장호르몬 분비자극인자의 순도를 나타낸 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 천연 생약재를 물로 추출하고 여과한 다음 저급 알코올을 가하여 불순 고용물의 침전을 제거하는 과정을 포함하는 성장호르몬 분비자극인자의 추출 방법을 제공한다.

본 발명은 천연 생약재로 속단 등을 사용하여 성장호르몬 분비자극인자를 추출한다. 이 때 저급 알코올로 35 내지 75 % 인 메탄올 또는 에탄올을 사용하여 불순 고용물을 침전시키는 것이 바람직하고, 66 % 의 메탄올 또는 에탄올을 사용하는 것은 더욱 바람직하다.

또한, 본 발명은 상기 과정에 더하여 다시 유기 용매로 사용하여 분획함으로 성장호르몬 분비자극인자를 추출한다. 이 때 유기 용매로는 n-부탄올, 2차 부탄올, 3차 부탄올, 이소부탄올, 테트라하이드로퓨란, n-프로필 알코올, 이소프로필알코올 중 적어도 하나를 사용하는 것이 바람직하고, n-부탄올 또는 이소부탄올을 사용하는 것은 더욱 바람직하다.

또한, 본 발명의 방법은 상기 과정에 더하여 n-부탄올 또는 이소부탄올을 이용하여 추출한 분획을 다시 물을 이용하여 분획함으로 불순물을 제거하는 단계를 포함한다.

또한, 본 발명의 방법은 상기 과정에 더하여 n-부탄오 또는 이소부탄올로 추출되어 성장호르몬 분비자극인자를 포함하는 분획을 다시 에틸 에테르를 이용하여 분획함으로 불순물을 제거하는 단계를 포함한다.

또한, 본 발명은 속단을 물로 추출 여과하여 메탄올 또는 에탄올로 침전을 제거한 다음 n-부탄올 또는 이소부탄올로 다시 분획하고 이에 물 및 에틸 에테르를 차례로 가하여 불순물을 제거하는 과정으로 얻은 성장호르몬 분비자극인자 활성을 가지는 수용성 속단 추출물을 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명하면 다음과 같다.

본 발명은 천연 생약재로부터 침전이 형성되지 않고 순도가 높은 성장호르몬 분비자극인자를 포함하는 조성물을 간단하게 분리하는 방법을 제공한다.

우선, 본 발명은 천연 생약재를 물로 추출하고 여과한 다음 저급 알코올을 가하여 불순 고용물의 침전을 제거하는 과정으로 성장호르몬 분비자극인자를 추출한다. 본 발명은 천연 생약재료서 속단을 이용하는데, 구체적으로 속단을 물에 넣고 끊인 다음 여과하여 속단 물 추출액을 얻고 다시 저급 알코올을 가하여 침전을 제거한다. 이 때 침전 형성을 위하여 가한 용매를 감압 농축 과정으로 제거함으로수용성 속단 추출물을 얻는다.

본 발명은 상기 과정에서 저급 알코올로 메탄올과 에탄올을 사용하고, 이때 침전을 제거하는 최적의 용매 조건을 다양한 조건을 시도하여 결정한다 (도 2및도 3참조). 구체적으로 메탄올 또는 에탄올은 35 내지 75 % 농도인 것을 사용하는 것이 바람직하고, 66 % 인 것을 사용하는 것은 더욱 바람직하다.

또한, 본 발명은 상기 과정에 더하여 수용성 속단 추출물을 다양한 유기용매를 사용하여 다시 분획한다. 이 때 유기 용매로 n-부탄올, 2차 부탄올, 3차 부탄올, 이소부탄올, 테트라하이드로퓨란, n-프로필 알코올, 이소프로필 알코올 등을 사용하는 것이 바람직한데, 이는 상기 수용성 추출물 내에 존재하는 성장호르몬 분비자극인자의 유효성분을 용매 층으로 이동되게 한다.

본 발명은 상기 용매 층을 고압 역상 액체 크로마토그래피 (HPLC)를 수행하여 그 추출 정도를 분석한다. 그 결과, 유기 용매로 n-부탄올 및 이소부탄올을 처리한 경우 용매 층으로 성장호르몬 분비자극인자가 대부분 추출되고 수용액 층에는 상기 인자가 매우 적게 존재함을 확인한다.

또한, 본 발명은 상기 과정에 더하여 성장호르몬 분비자극인자의 유효성분이 함유된 유기 용매 층을 회수한 다음 순수한 물을 가하여 반복적으로 분획함으로 수용액 층에 용해될 수 있는 수용성 물질을 제거한다. 이러한 과정을 반복하면 유기 용매 층에 존재하는 각종 자연염료 또는 불순물을 제거할 수 있고 용매 층에 존재하는 유효성분의 순도를 높일 수 있다.

또한 본 발명은 상기 과정에 더하여 성장호르몬 분비자극인자의 유효성분이함유된 유기 용매 층의 순도를 더욱 높이기 위하여, 상기 용매 층을 다시 에틸 에테르 (ethyl ether)를 이용하여 분획시킨다. 이 때 에틸 에테르는 1 : 3 이상의 부피 비로 희석시키는 것이 바람직하고 1 : 5 의 부피 비로 희석하는 것은 더욱 바람직하다.

상기에서 유효성분은 대부분이 에테르-부탄올 또는 에테르-이소부탄올 등의 혼합 층으로 전이되고, 이 과정을 거치면 상기 수용성 속단 추출물은 약간의 노란색만을 지닐 정도로 거의 모든 불순물이 제거된다.

따라서, 상기 각 과정을 통하여 침전이 형성되지 않는 맑은 용액 형태의 수용성 속단 추출물을 얻을 수 있다. 이러한 속단 추출물은 침전 형성, 색소 침착 또는 냄새 등의 문제를 해결하여 음료 첨가물 및 화장품의 원료 등으로 유용하게 사용될 수 있다.

또한, 상기 과정을 거친 추출물을 감압 건조시키면 최종적으로 성장호르몬 분비자극인자가 포함된 조성물을 간단히 얻을 수 있어, 이를 이용하면 상기 성장호르몬 분비자극인자를 속단으로부터 고순도로 용이하게 대량 생산할 수 있다.

이하, 실시예에 의하여 본 발명을 상세히 설명하면 다음과 같다.

단 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것으로, 하기 실시예에 의하여 본 발명의 범위가 제한되는 것은 아니다.

＜실시예 1＞ 용매를 이용하여 침전을 제거한 수용성 속단 추출물의 제조

본 발명은 건조된 속단 31.5 g 을 400 mL의 물에 넣고 80-90℃ (생약 추출 온도)에서 약 2시간 동안 물 중탕하여 수용성 추출액을 얻었다. 이를 약 5분 동안방치하여 추출된 용액을 모은 다음 상기 약재에 다시 물 400 mL 을 다시 부어 동일한 방법으로 재추출 하였다.

이렇게 모은 수용성 추출액 800 mL 을 물 중탕으로 끊여 부피를 약 350mL 로 줄였다. 이 용액을 각각 1mL 씩 취하고 메탄올과 에탄올을 처리하여 최적의 용매 처리 효과를 나타내는 조건을 확립하는 다음의 실험을 실시하였다. 이 때 용매를 처리한 방법과 결과는 다음의 표 1 에 나타내었다.

[표 1]

표 1 의 결과로부터 얻은 침전 무게를 분석하여 살펴보면 용매의 양이 증가되면서 침전되는 양이 비례적으로 증가하다가 어떤 임계점 (critical point) 이후로는 침전의 양이 감소하는 경향을 보인다. 상기 실험 결과는 약 66 % 상당의 용매 함량 부근에서 침전 양이 감소하는 양상을 나타내었다. 따라서 본 실험에서 보고자 한 침전 양의 최적점은 75 % 가 아닌 66 % 이며, 75 % 처리에서 침전의 양이66 % 처리 보다 감소하는 경향은 메탄올과 에탄올 모두에서 공통적으로 나타났다. 결론적으로 66 % 를 처리하여 얻어진 침전 중에는 용매의 함량이 증가하면서 침전되었다가 다시 증가된 용매 층에 용해되는 성분이 존재하며 이 물질은 친수성과 소수성의 성질을 동시에 지니는 것으로 추정된다.

상기 용매 처리로 침전이 제거한 다음 원심분리하여 얻은 상등액에 존재하는 성장호르몬 분비자극인자의 함량 내지 분리 경향은 고압 역상 액체 크로마토그래피 (reverse-phase HPLC)로 분석되었다. 상등액에 함유된 성장호르몬 분비자극인자의 경향 차이를 확인하여 그 결과를도 2및도 3에 나타내었다. 성장호르몬 분비자극인자의 피크는 동일자로 출원되는 특허 (" 새로운 성장호르몬 분비촉진인자 ")에서 언급된 소수성 고압 액체 크로마토그래피에서와 동일한 분석 조건에서 얻어진 피크의 보유 시간 (retention time), 뇌하수체 세포의 생체외 (in vitro) 배양 및 그의 실험 결과를 기준으로 확인하였다. 이를 간단히 설명하면 각 용매층을 1 mL씩 주사하여 기본용액 대 용출용액의 비가 40분에 걸쳐 선형구배 방식이 되게 한 다음 7 mL/분의 유속으로 전개하였다. 특히 이 때 기본 완충용액으로는 0.01 % 트리플루오르아세트산 (trifluoroacetic acid, TFA)을 사용하고, 용출 완충 용액으로는 메탄올에 녹인 0.01 % TFA 를 사용하였다. 도면상에서 보면 화살표로 표시된 마지막 피크가 성장호르몬 분비자극인자의 피크로서, 모든 도면에 성장호르몬 분비자극인자를 화살표로 표시하였다.

＜실시예 2＞ 성장호르몬 분비자극인자의 용매 추출 I

상기 실시예 1 에서 얻은 350 mL 의 침전이 제거된 용액을 각각 2 mL씩 취하고 이에 각각의 용매를 처리하여 추출 과정에서 용매의 효과를 비교하였으며 처리한 과정을 정리하여 아래의표 2에 나타내었다. 이 때 얻은 상등액을 실시예 1의 고압 역상 액체 크로마토그래피를 수행하여 분석하고 그 추출 정도를 추정하였다. 각 용매 처리에 따라 분리된 용매 층의 유효성분 함량은 도면 (도 4 - 도 10참조)에 나타내었다.

[표 2]

또한, 각각 n-부탄올 및 이소부탄올을 처리하여 얻은 용매 층을 제거하고 남은 수용액을 300μl씩 주사하여 그 순도를 확인한 결과,도 11및도 12에서 보는 바와 같이 수용액 층에는 성장호르몬 분비자극인자가 매우 적게 존재하며 대부분이상층의 용매 층으로 상기 인자가 추출되었음을 간접적으로 알 수 있었다.

＜실시예 3＞ 성장호르몬 분비자극인자의 용매 추출 II

본 발명은 실시예 2 의 결과를 바탕으로 성장호르몬 분비자극인자의 분리에 바람직하다고 평가된 n-부탄올 및 이소부탄올을 이용하여 실험을 계속 진행하였다. 실시예 1 의 과정을 거쳐 얻은 속단 추출물 250 mL을 약 100 mL씩 나누어 2가지 용매에 처리하였다. 각 시료 100 mL에 150 mL 의 n-부탄올 및 이소부탄올을 각각 처리하고 잘 혼합한 다음 이를 상온에서 10분 동안 방치시켰다. 이 때 얻은 각각의 상등액 (용매 층)을 잘 분리하고 분리된 용매 층에 원래의 시료 부피인 100 mL의 증류수를 추가로 가하여 다시 추출하였다. 이 때 얻은 상등액을 이전과 동일한 조건에서 1 mL씩 주사하고 HPLC 를 수행하여 분석하였다. 그 결과는 다음의도 13 - 도 15에 나타내었다.

도 15을 살펴보면 새로이 증류수를 처리하여 추출하는 경우 성장호르몬 분비자극인자를 제외한 모든 피크가 상대적으로 많이 제거되었고, 실험 과정에서 많은 천연염료 (갈색)가 물 층으로 이전되고 있음을 확인할 수 있었다. 이와 같이 용매 추출 과정에서 증류수를 반복적으로 처리하여 주면 천연염료를 제거하는 동시에 성장호르몬 분비자극인자의 상대적인 순도를 향상시킬 수 있다. 이는 10분 - 25분대의 피크가 수용액 층에 상대적으로 많이 분포하고 있는 현상과 일치한다. n-부탄올 처리 및 이소부탄올 처리 결과를 비교하여 보면 재차 증류수를 처리한 경우 수용액 층으로 이동하는 색의 강도가 매우 달랐다. 즉, n-부탄올의 수용액 층은 짙은 갈색의 염료가 제거되었고 이소부탄올의 수용액 층은 약한 노란 색의 상태를 보여주었다. 이소부탄올을 처리하여 얻은 용매 층의 경향을 분석하여 도 14 에 나타내었다.

이상과 같이, 각각의 용매 층에 물을 100 mL/회당 가하여 수용액 층을 분리하는 과정을 3회 수행하여 수용액 층으로 여러 가지 불순 물질들을 이동시켰다. 또한, 이를 3회 수행하여 얻은 각각의 용매 층을 다시 에틸 에테르 (ethyl ether) 에 1 : 3 이상의 비로 희석시킨 다음 가만히 방치하였다. 구체적으로, n-부탄올 / 이소부탄올의 경우 100 mL 의 부탄올에 에틸 에테르를 가하여 최종 500 mL 이 되게 하였고 이 때 형성된 아래 갈색 층을 따로 모아 (약 5 mL) 분석한 다음 그 결과를도 16에 나타내었다. 에테르와 부탄올 또는 이소부탄올의 혼합 층은 따로 분리하여 용매 층을 후드 내에서 자연 건조시켰다. 최종적으로 얻어진 에테르-부탄올 층과 에테르-이소부탄올 층에 용해된 물질을 분석하기 위하여 상기와 동일한 방법을 수행하였다. 이 결과는도 17에 나타내었다.

이상에서 보는 바와 같이, 속단 유래의 성장호르몬 분비자극인자는 분리 과정 중 제거되는 다른 물질과 함께 일부가 물 층으로 용해되는 경향이 있으나 대부분이 여전히 용매인 n-부탄올 층에 존재하며 이는 특히 에테르를 처리하는 단계에서는 에테르-부탄올 층으로 전이되므로 분리가 용이하다. 또한 이 단계에서 성상은 약간의 노란 색만을 지닐 정도로 맑고 초기의 갈색은 완벽하게 제거되었다. 따라서 분리된 에테르 층을 감압 건조시키면 최종적으로 성장호르몬 분비자극인자가 포함된 조성물을 간단히 얻을 수 있다.도 18은 본 발명의 과정으로 최종적으로 분리한 성장호르몬 분비자극인자의 순도를 나타낸 것이다.

상기에서 살펴 본 바와 같이, 본 발명은 천연 생약재로부터 성장호르몬 분비자극인자를 간단하게 고순도로 대량 추출할 수 있는 방법으로, 이 방법을 이용하여 얻은 수용성 속단 추출물은 불순물이 없고 유효성분의 함량이 높아서 성장호르몬 분비자극 기능과 관련된 다양한 분야에 이용될 수 있다.

구체적으로, 상기 성장호르몬 분비자극인자가 함유된 조성물은 색소 또는 냄새 문제가 없어 화장품의 원료 등으로, 또한 초기에 침전 현상의 원인을 충분히 제거함으로 음료 첨가물 등으로 유용하게 사용될 수 있어 속단을 포함한 천연 생약재로부터 성장호르몬 분비자극인자를 분리하는 최적의 경제적인 방법이다.

Claims (9)

1. 천연 생약재를 물로 추출하고 여과한 다음 메탄올 또는 에탄올을 가하여 불순 고용물의 침전을 제거하는 과정을 포함하는 성장호르몬 분비자극인자의 추출 방법.
2. 제 1항에 있어서, 천연 생약재는 속단인 것을 특징으로 하는 성장호르몬 분비자극인자의 추출 방법.
3. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 불순 고용물은 35 내지 75 % 인 메탄올 또는 에탄올을 사용하여 침전시키는 것을 특징으로 하는 추출 방법.
4. 제 2항에 있어서, 상기 과정에 더하여 n-부탄올, 2차 부탄올, 3차 부탄올, 이소부탄올, 테트라하이드로퓨란, n-프로필 알코올, 이소프로필 알코올 중 적어도 하나를 다시 유기 용매로 사용하여 분획하는 단계를 포함하는 추출 방법.
5. 제 4항에 있어서, 상기 과정에 더하여 n-부탄올 또는 이소부탄올을 이용하여 추출한 분획을 다시 물을 이용하여 분획함으로 불순물을 제거하는 단계를 포함하는 추출 방법.
6. 제 4항 또는 제 5항에 있어서, 상기 과정에 더하여 n-부탄올 또는 이소부탄올로 추출되어 성장호르몬 분비자극인자를 포함하는 분획을 다시 에틸 에테르를 이용하여 분획함으로 불순물을 제거하는 단계를 포함하는 추출 방법.
7. 속단을 물로 추출 여과하여 메탄올 또는 에탄올로 침전을 제거한 다음 n-부탄올 또는 이소부탄올로 다시 분획하고 이에 물 및 에틸 에테르를 차례로 가하여 불순물을 제거하는 과정으로 얻은 성장호르몬 분비자극인자 활성을 가지는 수용성 속단 추출물.
8. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 불순 고용물은 66 % 의 메탄올 또는 에탄올을 사용하는 것을 특징으로 하는 추출 방법.
9. 제 2항에 있어서, 상기 과정에 더하여 n-부탄올 또는 이소부탄올을 유기 용매로 사용하여 분획하는 단계를 포함하는 추출 방법.