CN104936574A

CN104936574A - 角豆胚芽提取物与咖啡因的组合作为减肥活性剂的美容用途

Info

Publication number: CN104936574A
Application number: CN201380071291.7A
Authority: CN
Inventors: N·多姆洛格; F·波尔托兰; A·克莱门特; J·M·博托
Original assignee: ISP Investments LLC
Current assignee: ISP Investments LLC
Priority date: 2012-12-11
Filing date: 2013-12-10
Publication date: 2015-09-23
Anticipated expiration: 2033-12-10
Also published as: WO2014091147A3; ES2654621T3; EP2931232B1; FR2999080A1; US20150306023A1; FR2999080B1; CN104936574B; US9962329B2; HK1213787A1; JP2016502976A; EP2931232A2; WO2014091147A2

Abstract

本发明涉及角豆(Ceratonia siliqua L.)胚芽提取物与咖啡因或其任一衍生物的组合作为减肥活性剂以增加水甘油通道蛋白的表达和降低脂肪细胞中所包含的甘油三酯的美容用途。本发明还涉及美容护理方法，其包括将在含有生理学上可接受的介质的组合物中的角豆胚芽提取物与咖啡因或其任一衍生物的组合在身体或者面部的至少一部分皮肤上局部施用，以获得减肥作用，并更具体地以减少局部过量的脂肪。

Description

角豆胚芽提取物与咖啡因的组合作为减肥活性剂的美容用途

发明领域

本发明涉及美容剂的领域，并更具体地涉及美容减肥方法的领域。它涉及角豆(Ceratonia siliqua L.)胚芽提取物与咖啡因或其衍生物的组合作为减肥活性剂的美容用途。本发明还涉及角豆胚芽提取物与咖啡因或其衍生物的组合用于增加水甘油通道蛋白的表达和促进脂肪细胞中所包含的甘油三酯的消除的美容用途。

本发明还涉及美容护理的方法，其包括将在含有生理学上可接受的介质的组合物中的角豆胚芽提取物与咖啡因或其衍生物的组合在身体或者面部的至少一部分皮肤上局部施用，以获得减肥作用，并更具体地以减少局部过量的体脂。

发明背景

皮下脂肪组织位于下皮。它是一种***，其中主要是脂肪细胞，所述***以直径为约5mm的叶(lobe)形式排列，由细小的连接桥(fineconnective bridge)分隔。各脂肪细胞包含基本上含有甘油三酯并且直径可为40-120μm的大量脂质泡。

可认为脂肪组织是不断更新的动态储蓄泡，其平衡饮食摄入与身体的能量需求。因此，脂肪细胞确保脂质的合成、蓄积和释放。该过程依赖于激素，例如胰岛素或瘦素。

脂质合成或脂肪生成源自于葡萄糖和饮食来源的甘油三酯。相反地，在脂解期间，储存在脂肪细胞中的甘油三酯可被水解，以释放脂肪酸、甘油以及甘油单酯和甘油二酯。

由此释放的非酯化脂肪酸可以在血液中循环，然后可用于身体其它细胞的能量需求，或很快被脂肪细胞再使用，以再次通过脂肪生成产生甘油三酯。

如果在体内发生促进脂肪生成的持续失调，则储存在脂肪细胞中的脂质的量增加，导致体脂块的增生，并更具体地导致局部体脂过量的外观。实际上，在成人中，在性激素的作用下，脂肪组织根据性别而不同地分布，并形成轮廓。脂肪组织在女性的胸部、髋部、臀部和大腿蓄积，并在男子的项部和肩部蓄积。另外，局部过量的体脂经常与皮肤的改变相关，其导致微凹(dimpled)或“橙皮”外观。这种局部过量的体脂目前被认为是没有吸引力的，受影响的人们可能想要通过使用美容方法来改善其皮肤的外观和轮廓。

因此，已经鉴定出对脂解或脂肪生成有作用，意图用于减肥作用的多种活性剂。在它们中，可举出以下物质：

-黄嘌呤碱(黄嘌呤衍生物)，例如茶碱、咖啡因、可可碱(在专利FR2609395、FR 267401中描述)，使用它们促进脂肪细胞的脂肪分解活性的作用。

-合成肽，例如序列为Arg-Gly-Ser-NH₂的肽(在专利FR 2 858 769中描述)，或序列为Pro-Leu-Asp-Thr-Ala-Lys-Val-Arg-Leu-Gln的肽(在专利FR 2879 924中描述)，使用它们在线粒体中使辅酶的再氧化与ADP磷酸化成ATP之间解偶联的作用。

-植物提取物，例如掌形藻属(Palmaria)或红皮藻属(Rhodymenia)的海藻提取物(在专利FR 2 887 447中描述)、二叶银杏(gingko biloba)提取物(参见专利FR 2 669 537)，或大豆黄酮或异黄酮(在专利WO 01/64177中描述)。

然而，这些产品随时间通常具有温和的或有限的效能。因此，提供具有作为减肥活性剂的显著效能的新活性美容剂是重要的。

用于解决技术问题的方案在于角豆胚芽提取物与咖啡因或其衍生物的组合的美容用途。发明人的确已证明，角豆胚芽提取物作用于水甘油通道蛋白，从而促进脂解期间从脂肪细胞释放的甘油的转运。该提取物与咖啡因或其衍生物(已知其增加脂解)的组合使得能够获得具有显著特性的减肥活性剂。

水通道蛋白是在细胞和内部环境之间运载水和溶液中的小分子的一类跨膜蛋白质。水通道蛋白可以分为两个不同的亚组：只能够转运水的水通道蛋白，以及除了能够转运水还能够转运甘油的水甘油通道蛋白。

在该第二亚组中，鉴定水甘油通道蛋白7位于人脂肪细胞膜中，并且在储存脂肪的代谢中起到重要作用(Mariko Hara-Chikuma等人，Progressiveadipocyte hypertrophicity in aquaporin-7deficient mice,J.Biol.Chem.,vol.280,no.16,2005年4月22日)。

因此，水甘油通道蛋白的具体特性使它们成为促进包含在脂肪细胞中的脂质的消除的有利的生物目标。

“脂质的消除”是指导致甘油从脂肪细胞排出的脂解的现象。

本发明以及所得的优点会在阅读说明书后更好地理解。

发明内容

首先，本发明涉及角豆胚芽提取物与咖啡因或其衍生物的组合作为减肥活性剂的美容用途。

根据本发明使用的角豆胚芽提取物与咖啡因或其衍生物的组合特别提供以下优点：

-它增加脂解，

-它增加水甘油通道蛋白的表达，

-它促进脂质的消除以及甘油从脂肪细胞的排出，

-它减少局部过量的体脂，

-它减弱皮肤的“橙皮”外观。

因此，在本发明的意义上的“减肥活性剂”是指角豆胚芽提取物与咖啡因或其衍生物的组合，其用于减少过量的局部体脂，所述过量的局部体脂被认为是没有吸引力的，并经常与皮肤的微凹或“橙皮”外观相关。

角豆种子(长角豆属(Ceratonia)植物)，更具体地所述种子的胚乳部分由于其丰富的半乳甘露聚糖含量，以“角豆胶”的名字被广泛用于食品工业。胚芽是种子中蛋白质含量最高的部分，并可被容易地分离。

已记载通过酶法水解获得角豆胚芽蛋白提取物(J.Parrado等人，Bioresource Technology 99,2008)。然而，该提取物具有太高的植物激素(内分泌干扰物)浓度，以至于在美容剂中不可使用。

为了实施本发明，可使用本领域技术人员已知的任何提取或纯化方法，例如在欧洲专利申请EP 0 689771中描述的方法。

“肽提取物”是指主要由肽化合物代表的化合物的混合物，其存在于大量的水或其它溶剂、极性或这些溶剂的混合物的溶液中。

“肽化合物”是指存在于本发明的肽提取物中的蛋白质片段和肽。

“局部施用”是指将本发明的活性剂或包含其的组合物在皮肤或粘膜的表面上施用和涂布。

“生理学上可接受的”是指适合与皮肤或粘膜接触而不引起毒性反应或不耐受的任何化合物。

“局部过量的体脂”是指皮下脂肪组织的肥大部位，其可具有“橙皮”外观。

在下面的描述中，术语“用于减肥作用的活性剂”和“角豆胚芽提取物与咖啡因或其衍生物的组合”会被可互换地使用。

本发明的角豆胚芽提取物可以通过提取植物来源的蛋白质，随后通过释放生物活性的肽化合物的受控水解来获得。

在美容剂中使用肽提取物，特别是低分子量的肽提取物具有许多优点。除了产生之前在起始蛋白质混合物中不存在的肽化合物这一事实之外，水解和纯化使得能够获得具有更高稳定性的混合物，获得更易于再次制备并且在美容剂中不引起***反应的组合物。

为了进行提取，使用角豆(长角豆属的植物)种子胚芽。可使用本领域技术人员已知的任何提取或纯化方法来制备本发明的提取物。例如，受控水解使得能够释放肽化合物。以下是为了实施本发明可以但不是必需的：或者提取有关的蛋白质，然后将其水解，或者对原始提取物进行水解，然后纯化肽化合物。

在第一步骤中，研磨包含在种子中的胚芽以获得粉末或碎粉。可将由此获得的粉末首先通过纤维素酶处理，以促进糖的消除，特别是不溶性多糖。

然后，根据修改的常规方法(Osborne,T.B.,The Vegetable Proteins,2ndEdition.Longmans,Green and Co.,London,1924)进行胚芽蛋白质的提取；将研磨的角豆胚芽在包含不溶性吸附剂聚乙烯聚吡咯烷酮(PVPP)产品(0.01-20％)的碱性溶液中悬浮；事实上，已知随后的水解和纯化通过该方法变得容易。特别是，与蛋白质相互作用的酚类物质的浓度明显降低。然后，可通过改变离子强度或通过酸化介质来使蛋白质沉淀，由此使得能够消除可溶性组分和核酸。然后，用有机溶剂(例如乙醇或甲醇)洗涤沉淀物，然后通过真空干燥来蒸发溶剂。将富含蛋白质的沉淀置于水或其它溶剂的溶液中，由此构成提取物的更纯的形式。

所述提取也可以在中性或酸性介质中进行，仍然是在聚乙烯聚吡咯烷酮的存在下。在过滤步骤之后，然后采用常规的沉淀剂(例如盐(氯化钠、硫酸铵)或有机溶剂(醇、丙酮))来进行沉淀步骤。可将所获得的沉淀物通过放置在水或其它溶剂的溶液中透析来从沉淀剂中分离。

在离心和过滤步骤之后收集包含蛋白质、碳水化合物和可能包含的脂肪的可溶性部分。然后将该原始溶液在受控条件下水解，以生成可溶性肽。水解被定义为涉及通过水来断裂分子的化学反应，所述反应能够在中性、酸性或碱性介质中发生。根据本发明，水解通过化学方法和/或有利地通过蛋白水解酶(其中可以引用基于植物的内切蛋白酶(木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、无花果蛋白酶))进行。

根据本发明的第一实施方案，所述减肥活性剂包括在该步骤中获得的水解角豆胚芽提取物。

由于与上述相同的原因(即消除多酚物质)，在该受控水解的步骤中，可向反应介质中加入一些聚乙烯聚吡咯烷酮。可将所获得的提取物再次纯化，以选择低分子量的肽化合物。有利地，分馏可通过超过滤和/或通过色谱方法进行。

然后，进行在水中或在包含水的溶剂的任意混合物中的稀释阶段。因此，根据本发明的有利的实施方案，将本发明的角豆胚芽提取物有利地在一种或多种生理学上可接受的溶剂中稀释，所述溶剂例如水、甘油、乙醇、丙二醇、丁二醇、二丙二醇、乙氧基化二甘醇或丙氧基化二甘醇、环状多元醇或这些溶剂的任意混合物。然后将稀释的角豆胚芽提取物通过超过滤灭菌。

在如此稀释后得到肽提取物，其特征在于干重为2-5g/kg，肽化合物的浓度是1-10g/l，优选1.5-3.5g/l，糖浓度是0.05-1g/l，优选0.1-0.3g/l，并且相对于干重，多酚浓度小于1％。

因此，根据本发明的有利的实施方案，所述角豆胚芽提取物的干重为2.5g/kg，并且包含1.5-3.5g/l的肽化合物。

根据本领域技术人员熟知的常规技术，对根据本发明获得的提取物的物理化学特性以及蛋白质和肽化合物的含量进行定性和定量分析。

所获得的提取物包含分子量低于5kDa的肽，并且所述提取物的特征在于相对于干重，糖浓度低于15％并且多酚浓度低于1％。

因此，根据本发明的有利的实施方案，所述角豆胚芽提取物是肽提取物，其中所述肽化合物的分子量低于5kDa。

咖啡因是植物来源的杂环分子，其形成嘌呤碱(并更具体地是甲基黄嘌呤)组中的一部分。

咖啡因的脂肪分解作用已被许多体外和体内研究证明。咖啡因促进环AMP的蓄积，环AMP本身激活甘油三酯脂酶，所述酶在脂肪细胞中负责将甘油三酯转化成甘油和游离脂肪酸。

已研发咖啡因衍生物以改善咖啡因的溶解性、透皮给药、生物利用度或效能。咖啡因衍生物可选自咖啡因酸衍生物、咖啡因盐，并更具体地选自咖啡因羧酸金属盐。

本发明还涉及角豆胚芽提取物与咖啡因或其衍生物的组合增加水甘油通道蛋白的表达的用途，并更具体地为增加水甘油通道蛋白7的表达的用途。

本发明的特征分子活性在体外由减肥活性剂增加水甘油通道蛋白表达的能力定义，所述增加水甘油通道蛋白表达通过增加水甘油通道蛋白的蛋白质合成(通过直接或间接调整水甘油通道蛋白的基因表达)实现，或者通过其它生物过程，例如水甘油通道蛋白的稳定化或信使RNA转录物的稳定化实现。

根据本发明，水甘油通道蛋白优选是水甘油通道蛋白7。

本发明还涉及角豆胚芽提取物与咖啡因或其衍生物的组合增加脂解和促进脂质的消除以及甘油从脂肪细胞的排出的用途。

本发明的特征生物活性在体外由减肥活性剂减小脂肪细胞中脂滴的大小和数目的能力定义。

本发明还涉及美容护理方法，其包括将在含有生理学上可接受的介质的组合物中的角豆胚芽提取物与咖啡因或其衍生物的组合在身体或者面部的至少一部分皮肤上局部施用，以获得减肥作用，并更具体地以减少局部过量的体脂。

本发明还涉及美容护理方法，其包括将在含有生理学上可接受的介质的组合物中的角豆胚芽提取物与咖啡因或其衍生物的组合在身体或者面部的至少一部分皮肤上局部施用，以减弱所述皮肤的“橙皮”外观。

有利地，所述角豆胚芽提取物以所述组合物的总重量的0.0001％至20％的浓度存在，并优选以所述组合物的总重量的0.05％至5％的浓度存在于生理学上可接受的介质中。

有利地，咖啡因或其衍生物以所述组合物的总重量的0.0001％至20％的浓度存在，并优选以所述组合物的总重量的0.05％至5％的浓度存在于生理学上可接受的介质中。

根据本发明的另一有利的实施方案，所述角豆胚芽提取物可被包封或包含在美容剂媒介中，所述媒介例如脂质体或在美容剂领域使用的任何其它微胶囊，或者吸附在粉末状有机聚合物、矿物支持物(support)(诸如滑石和膨润土)上。

用于实施本发明的组合物可特别是水性、水醇性(hydro-alcoholic)或油性溶液剂以及水包油乳剂、油包水乳剂或复合型乳剂的形式；它们也可以是适合于在皮肤、粘膜、唇和/或毛发上施用的混悬剂或散剂的形式。

这些组合物可以或多或少地呈流体状，并具有乳膏剂、洗剂、乳液(milk)、精华液(serum)、润发油、凝胶剂、糊剂或泡沫剂的外观。它们也可以是固体形式的，例如棒状剂(stick)，或以气雾剂的形式施用于皮肤。

这些组合物还可以包含在设想的应用领域中常用的任何添加剂，以及对于它们的配制所需的辅料，例如溶剂、增稠剂、稀释剂、抗氧化剂、着色剂、防晒霜、自晒黑剂(self-tanning agent)、色素、填充剂、防腐剂、香料、气味吸收剂、美容剂或药物活性剂、精油、维生素、必需脂肪酸、表面活性剂、成膜聚合物等。

在每种情况下，本领域技术人员会确保选择所述辅料及其比例以便不干扰本发明的组合物的期望的有益特性。例如，这些辅料可相当于所述组合物的总重量的0.01-20％。当本发明的组合物是乳剂时，脂肪相可相当于所述组合物的总重量的5-80重量％，优选5-50重量％。在所述组合物中使用的乳化剂和辅助乳化剂会选自所考虑领域中常规使用的那些。例如，它们可以相当于所述组合物的总重量的0.3-30重量％的比例使用。

有利地，除了本发明的减肥活性剂，能够用于本发明的组合物可包含至少一种具有与本发明的那些相似和/或互补的美容作用的其它活性剂。根据本发明，会将该活性剂定义为“额外的活性剂”。

例如，所述额外的活性剂可选自：抗老化、调色、亮肤(lightening)、保湿、排水(draining)和微循环-促进剂；药剂、表皮脱落剂、擦洗剂、细胞外基质刺激剂、能量代谢活化剂、抗细菌剂、抗真菌剂、镇静剂、抗自由基剂、抗UV剂和抗痤疮剂、抗炎剂、麻醉剂、温热剂、冷却剂和减肥剂。

这样的额外的药剂可以选自：

-维生素A，并特别是视黄酸、视黄醇、视黄醇丙酸酯、视黄醇棕榈酸酯，

-维生素B3，并更特别是烟酰胺、烟酸维生素E，

-维生素B5、维生素B6、维生素B12，

-维生素C，特别是抗坏血酸、抗坏血酸葡糖苷、抗坏血酸四棕榈酸酯、抗坏血酸磷酸酯镁和抗坏血酸磷酸酯钠，

-维生素E、维生素F、维生素H、维生素K、维生素PP、辅酶Q10，

-金属蛋白酶抑制剂、TIMP活化剂，

-DHEA，其前体和衍生物，

-氨基酸，例如精氨酸、鸟氨酸、羟脯氨酸、羟脯氨酸二棕榈酸酯、棕榈酰甘氨酸、羟赖氨酸、甲硫氨酸及其衍生物、N-酰基氨基酸化合物，

-天然肽或合成肽，其包括二肽、三肽、四肽、五肽和六肽及其亲脂性衍生物、异构体，以及与诸如金属离子(例如铜、锌、锰、镁等)的其它物质的络合物。例如，商业上以COLLAXYL^TM、PEPTIDE VINCI 02^TM、CHRONOGEN^TM、LAMINIXYL IS^TM、PEPTIDEQ10^TM等名称已知的肽，

-基于植物的肽提取物，例如大豆、斯佩耳特小麦(spelt)、葡萄藤、油菜籽、亚麻子、水稻、玉米、豌豆的提取物，

-酵母提取物、卤虫(Artemia Salina)提取物，

-脱氢乙酸(DHA)，

-合成或天然来源的植物甾醇，

-水杨酸及其衍生物，α-羟基酸和β-羟基酸，

-氨基糖、葡糖胺、D-葡糖胺、N-乙酰基葡糖胺、N-乙酰基-D-葡糖胺、甘露糖胺、N-乙酰基甘露糖胺、半乳糖胺、N-乙酰半乳糖胺，

-多酚、异黄酮和黄酮类化合物的提取物，例如葡萄提取物、松树提取物和橄榄提取物，

-脂质，例如神经酰胺或磷脂；动物来源的油，例如角鲨烯或角鲨烷；植物油，例如甜杏仁油、椰子油、蓖麻毒蛋白油、希蒙得木油、橄榄油、油菜籽油、花生油、向日葵油、小麦胚芽油、玉米胚芽油、大豆油、棉籽油、紫苜蓿油、罂粟油、笋瓜油、月见草油、粟油、大麦油、黑麦油、红花油、西番莲果油、榛子油、棕榈油、杏仁油、鳄梨油和金盏花油；乙氧基化植物油；以及牛油树脂，

-所有的防紫外线剂(UV screen)和防晒霜。

特别有利地，本发明可包含至少一种已知其减肥作用、抑制脂肪生成或刺激脂解的额外的活性剂，例如：环AMP及其衍生物、腺苷酸环化酶激活剂和磷酸二酯酶抑制剂、积雪草(Centalla asiatica)提取物、积雪草皂苷和亚细亚酸、甲基黄嘌呤、咖啡因(thein)、茶碱、可可碱、福司柯林(forskoline)、七叶苷和七叶灵、ACE抑制剂、肽Val-Trp、神经肽Y抑制剂、脑啡肽、二叶银杏(gingko biloba)提取物、薯蓣提取物、芦丁、马黛茶提取物、瓜拉那提取物、寡糖、多糖、肉碱、常春藤提取物、岩藻提取物、水解夏枯草(Prunella vulgaris)提取物、水解鸡冠花(Celosia cristata)提取物、光滑果榆绿木(Anogeissus leiocarpus)提取物、苦木薯(Manihot utilissima)叶提取物、棕榈酰卡尼丁、肌肽、牛磺酸、接骨木果提取物、藻类提取物(例如掌状红皮藻(Palmaria Palmata)提取物)、以ATPeptide^TM的名称出售且序列为Arg-Gly-Ser-NH₂的合成肽、以ATPeptide^TM的名称出售且序列为Pro-Leu-Asp-Thr-Ala-Lys-Val-Arg-Leu-Gln的合成肽。

能够根据本发明使用的组合物可以通过任何合适的途径施用，特别是口服或局部外用，并且本领域技术人员会对组合物的制剂进行适应性改变。

有利地，本发明的组合物是适合于局部施用的形式。因此，这些组合物必须包含生理学上可接受的介质，即与皮肤和皮肤附件相容的，并涵盖所有的美容剂形式。

本发明明显大体上涉及哺乳动物，并更具体地涉及人。

该美容处理方法的具体实施方案也由上文的描述得到。在阅读为了说明性且非限制性目的而提供的实施例后，本发明的其它优点和特征会是更清楚的。

附图说明

图1：在3T3-L1细胞中的水甘油通道蛋白7的免疫检测。

图2：在3T3-L1细胞中的脂滴的大小的定量。

实施例1：角豆肽提取物的制备

将角豆胚芽以粉末形式置于在70体积的水的溶液中，并将pH调节到4.5-5.5的值。

为了消除不溶性糖，用纤维素酶进行水解。为此，将2％celluclast(Novozymes)与2％10(聚乙烯吡咯烷酮-PVPP-不溶的)加入到反应介质中。然后将反应介质在50℃下加热2小时，然后在80℃下灭活1小时。过滤步骤使得能够分离富含碳水化合物的滤液，以仅保留固体残渣。

后者的特征在于：45-50％的蛋白质含量以及20-30％的糖含量。

将由此获得的干燥残渣置于有2％10存在的100体积的水的溶液中。用2M的苏打水溶液将混合物的pH调节至8.0-8.5。

为了改善蛋白质的提取，用2％(Novozymes)进行第一次水解。在搅拌下，于55℃下，2小时后得到水解。通过在80℃下加热溶液2小时来灭活所述酶。灭活后，过滤反应混合物，并收集滤液。这就是中间体角豆胚芽蛋白提取物。

在制备中的这个阶段，所述滤液的肽和蛋白质化合物通过聚丙烯酰胺凝胶(Bis-Tris预制凝胶，Invitrogen)上的电泳来表征。为此，在LDS样品制备缓冲液的变性还原条件下，将滤液在70℃下加热10分钟。将抗氧化剂溶液加入到内槽(interior vat)(阴极)，以防止还原的蛋白质在电泳期间被再次氧化。在分子量标准(SeeBlue Plus2)的存在下，在MES迁移缓冲液中进行蛋白质的迁移。用BlueR-250进行蛋白质的染色。由此获得的蛋白质图谱显示滤液的肽和蛋白质化合物的分子量为50-10kDa。

然后，将中间体角豆胚芽蛋白提取物置于有2％10存在的100体积的水的溶液中。用1M盐酸水溶液将混合物的pH调节至4-5。

然后用内切蛋白酶进行蛋白质水解的步骤。为此，将2％菠萝蛋白酶加入到反应介质中。在50℃下搅拌2小时后得到水解。通过将溶液在80℃下加热2小时来灭活所述酶。

通过用降低孔隙率(至0.2μm)的Seitz-Orion滤板连续过滤来继续将由此所获得的提取物纯化，以获得清澈明亮的溶液。在该过滤系列之后，角豆胚芽提取物的特征在于干重为20-25g/kg，蛋白质含量为10-15g/l，糖含量为5-6g/l，氨基酸含量为1-2g/l，并且总多酚含量为0.5-1g/l。蛋白质由特定比色法(Lowry法)进行测定。

通过电泳凝胶来分析该提取物的蛋白质谱。在与如上所述相同的条件下，观察到两大家族的蛋白质：占少数的第一家族对应于分子量为25-20kDa的蛋白质；占绝对多数的第二家族对应于分子量低于5kDa的蛋白质。

然后，通过正切流动过滤步骤消除分子量高于5kDa的蛋白质，来纯化该提取物。为此，将角豆胚芽提取物在压力下泵送通过配备有2Biomax盒30kDa的基质。回收得到第一滤液，以便通过另一个2Biomax 5kDa盒再次过滤。

在纯化结束时，获得清澈、明亮、橙黄色的角豆胚芽提取物。它特征在于干重为8-9g/kg，蛋白质含量为6-7g/l，糖含量为0.3-0.5g/l，并且总多酚含量低于0.1g/l。

然后在水-甘油混合物中实施稀释的阶段以获得肽提取物，其特征在于干重为2-5g/kg，优选为2.5g/kg，肽化合物的浓度是1.5-3.5g/l，糖浓度是0.1-0.3g/l(低于15％)，并且多酚浓度低于1％。

该纯化和稀释的提取物对应于本发明的角豆胚芽肽提取物。它的特征在于肽化合物的分子量低于5kDa并且多酚含量低于1％的事实。

然后，采用通过ChemStation软件控制的HP1100设备，将该溶液通过高压液相色谱法进行分析。在角豆提取物的洗脱期间所使用的柱是300-5C4MPN(125x 4mn)。该柱使得能够进行分子量为0.2-25kDa的蛋白质的色谱分析(根据适当的溶剂梯度)。在这些色谱条件下，分离到多个肽流分。通过质谱法分析这些不同的流分，以便确定它们的分子峰。还测定了氨基酸组成。其在酸水解和通过采用PICT(苯异硫氰酸酯)预分化的高压液相色谱法鉴定后获得。

实施例2：评估水甘油通道蛋白7的表达

该研究的目的是测定实施例1的角豆提取物与咖啡因的组合对于分化的3T3-L1脂肪细胞中的水甘油通道蛋白7的表达的影响。

方法：

3T3-L1细胞的培养和分化：

将3T3-L1脂肪细胞在DMEM培养基(包含4.5g/l的葡萄糖、2mM的谷氨酰胺和10％的胎牛血清)中培养。

在细胞融合阶段之后两天时，通过持续3天在培养基中添加0.5mM的IBMX、1μM的***和10μg/ml的胰岛素(Sigma,St.Louis,MO,USA)的溶液，诱导3T3-L1细胞分化成脂肪细胞。然后，仅保留胰岛素额外培养3-4天。然后将细胞保留在标准培养基中持续另外3天。

处理：

从分化诱导阶段的起点开始，通过每日施用以下物质持续12天来进行处理：对未处理的对照，用1X PBS(Lonza,Rockland,ME,USA)；如实施例1中所得的干重为2.5g/kg的角豆胚芽提取物(在PBS中稀释至1％)，或如实施例1中所得的角豆胚芽提取物(在PBS中稀释至1％)，并在处理的最后5小时向其中加入2mM的咖啡因。还用2mM的咖啡因进行了5小时处理。

水甘油通道蛋白7的免疫标记：

用1X PBS(Lonza,Rockland,ME,USA)将细胞洗涤3次，并在环境温度下用3.7％的甲醛(Sigma Aldrich，USA)固定10分钟。将细胞膜用丙酮在-20℃下进行4分钟的可渗透化处理。用3％的牛血清白蛋白(Sigma-Aldrich，Steihheim，德国)对非特异性位点饱和15分钟。施用一级抗体(兔抗水甘油通道蛋白7多克隆抗体(Santa Cruz Biotechnology)，稀释至1/100)持续1.5小时。多次润洗后，施用与Alexa Fluor 488探针偶联的第二抗体(Alexa Fluor488驴抗兔(Invitrogen,Fisher)，稀释至1/1000)持续1小时。然后将载玻片安装在Fluoromount G(Electron Microscopy Science,Hatfield,UK)上。

将细胞用具有40X物镜的Nikon Eclipse 80i显微镜检查，并用NikonDigital DXM1200C照相机拍摄照片。

将各条件下的三幅图像使用Image-Pro Analyzer 6.3软件进行分析。将光强之和相对于培养表面调整(McMullen等人，2010)。

对于不成对的数据，使用t-Student检验进行统计分析，其中P<0.05被认为是显著的；P<0.1被认为是非常显著的，并且P<0.005被认为是高度显著的。

结果：

显微观察表明：相对于未经处理的对照，用咖啡因处理的分化的3T3-L1细胞的荧光不显著地增加了12.6％。相对于未经处理的对照，用实施例1的1％的角豆提取物处理的细胞中观察到荧光显著地增加了18.7％。相对于未经处理的对照，定量分析最终标明非常显著的49.5％的细胞荧光增加，如图1所示。

结论：

实施例1的角豆提取物与咖啡因的组合导致分化的3T3-L1脂肪细胞中水甘油通道蛋白7的表达非常显著的增加。咖啡因非常大幅度地增强实施例1的1％的角豆提取物的作用。

实施例3：评估脂肪细胞中所包含的脂滴

该研究的目的是测量实施例1的角豆提取物与咖啡因的组合对分化的3T3-L1脂肪细胞中所包含的脂滴的大小和数目的影响。

方法：

如实施例2中进行3T3-L1细胞的培养、分化，然后进行用待测化合物的处理。

通过尼罗红(Nile Red)进行脂质检测：

使用尼罗红荧光染料(其为强烈标记细胞内脂质的吩噁嗪酮(phenoxazone))进行脂质检测。

观察到的荧光的颜色直接取决于周围介质的疏水性。尼罗红的这种特性使得它可以区分中性脂质(其标记为金黄色)与磷脂(其标记为红色)。

将细胞用3.7％的甲醛溶液固定10分钟，然后通过100nM的尼罗红在PBS中的溶液标记10分钟，最后用PBS润洗。

用荧光显微镜检测细胞。如实施例2中进行定量和统计分析。

结果：

相对于未经处理的细胞，用实施例1的1％的角豆提取物、2mM的咖啡因以及实施例1的角豆提取物与咖啡因的组合处理的分化的3T3-L1细胞中的尼罗红标记的强度、微滴的大小和数目减少。

对于实施例1的角豆提取物与咖啡因的组合，相对于未经处理的细胞，定量分析表明标记强度显著降低42.78％，微滴大小减小27.7％，并且微滴数目显著减少33％。染色强度、脂滴的大小和体积的定量在表1、2和3中说明。脂滴大小的定量在图2中说明。

结论：

实施例1的角豆提取物与咖啡因的组合导致分化的3T3-L1脂肪细胞中脂滴的大小和数目的显著降低。

实施例4：实施例1的角豆提取物与咖啡因的组合的减肥作用的1号临床评价

该研究的目的是评估实施例1的角豆提取物与咖啡因的组合在人中的减肥作用(以厘米测得量(measurement)计)。

方法：

对39名年龄为34-63岁(平均年龄：52岁)的志愿者进行持续28天的临床研究，其中每日两次施用在不同的待测部位(腰部、腹部、髋部、臀部、大腿)。

所测试的产品是包含2％咖啡因与实施例1的2％角豆提取物的标准美容组合物。

通过比较在T0天和在T28天的测得量来评估效能，各志愿者为其自己的对照。

结果：

在实验条件下，施用28天后，观察到在大腿(平均-0.8cm)、腰部(平均-0.6cm)以及腹部(平均-0.9cm)的厘米测得量的显著的平均值减少。

数据系列具有正态分布。成对数据使用t-Student检验进行统计分析，其中P<0.05被认为是显著的，并注释*。

结论：

每日两次施用实施例1的角豆提取物和2％的咖啡因的组合持续1个月，使得大腿、腰部和腹部显著减肥。

实施例5：实施例1的角豆提取物与咖啡因的组合的减肥作用的2号临床评价

该研究的目的是评估实施例1的角豆提取物与咖啡因的组合在人中的减肥作用(以厘米测得量计)。

方法：

对26名年龄为30-65岁(平均年龄：43.7岁)的志愿者进行持续28天的临床研究，其中每日两次施用在不同的待测部位(腰部、腹部、髋部、臀部、大腿)。

结果：

在实验条件下，施用28天后，观察到在腹部周长上的2.2cm的显著的平均减小，大腿上部周长的1.2cm的显著的平均减小，以及大腿躯干部的体积的显著的平均减小。

数据系列具有正态分布。成对数据使用t-Student检验进行统计分析，其中P<0.05被认为是显著的。

此外，问卷使得能够证实大多数志愿者评估经处理的部位更平滑且更紧实，并且“橙皮”外观减弱。

结论：

实施例1的角豆提取物和2％咖啡因的组合每日两次施用持续1个月，使得大腿和腹部显著变瘦，并且“橙皮”外观减弱。

实施例6：组合物的制备

1减肥乳膏剂1

2减肥乳膏剂2

Claims

1.角豆(Ceratonia siliqua L.)胚芽提取物与咖啡因或其衍生物的组合作为减肥活性剂的美容用途。

2.权利要求1的美容用途，其中所述角豆胚芽提取物包含1.5-3.5g/l的肽化合物。

3.权利要求1或2中任一项的美容用途，其中所述角豆胚芽提取物是肽提取物，其中所述肽化合物的分子量低于5kDa。

4.前述权利要求中任一项的美容用途，其中所述角豆胚芽提取物与咖啡因或其衍生物的组合导致水甘油通道蛋白的表达增加，并更具体为水甘油通道蛋白7的表达增加。

5.前述权利要求中任一项的美容用途，其中所述角豆胚芽提取物与咖啡因或其衍生物的组合增加脂解，并促进脂质的消除以及甘油从脂肪细胞的排出。

6.美容护理方法，其包括将在含有生理学上可接受的介质的组合物中的角豆胚芽提取物与咖啡因或其衍生物在身体或者面部的至少一部分皮肤上局部施用，以获得减肥作用，并更具体地以减少局部过量的体脂。

7.美容护理方法，其包括将在含有生理学上可接受的介质的组合物中的角豆胚芽提取物与咖啡因或其衍生物的组合在身体或者面部的至少一部分皮肤上局部施用，以减弱所述皮肤的“橙皮”外观。

8.权利要求6或7中任一项的美容护理方法，其中如权利要求1-4中任一项所述的角豆胚芽提取物以所述组合物的总重量的0.0001％至20％的浓度存在，并优选以所述组合物的总重量的0.05％至5％的浓度存在。

9.权利要求6-8中任一项的美容护理方法，其中咖啡因或其衍生物以所述组合物的总重量的0.0001％至20％的浓度存在，并优选以所述组合物的总重量的0.05％至5％的浓度存在。

10.权利要求6-9中任一项的美容护理方法，其中所述组合物另外还包含至少一种额外的活性剂，所述活性剂选自：维生素A、视黄酸、视黄醇、维生素B3、维生素B5、维生素B6、维生素B12、维生素C、维生素E、维生素F、维生素H、维生素K、维生素PP、辅酶Q10、金属蛋白酶抑制剂、氨基酸、肉碱、肌肽、牛磺酸、天然肽或合成肽、基于植物的肽、酵母提取物、卤虫(Artemia Salina)提取物、合成或天然来源的植物甾醇、水杨酸、寡糖、多糖、氨基糖、多酚、黄酮类化合物、脂质、磷脂、环AMP及其衍生物、腺苷酸环化酶激活剂、磷酸二酯酶抑制剂、咖啡因、茶碱、可可碱、福司柯林、七叶苷、ACE抑制剂、薯蓣提取物、瓜拉那提取物、常春藤提取物、岩藻提取物、藻类提取物例如掌状红皮藻(PalmataPalmaria)、水解夏枯草(Prunella vulgaris)提取物或接骨木果提取物。