CN111269292B

CN111269292B - 具有促进组织修复的家蝇多肽及其制备方法与应用

Info

Publication number: CN111269292B
Application number: CN202010142284.3A
Authority: CN
Inventors: 刘睿; 段金廒
Original assignee: Nanjing University of Chinese Medicine
Current assignee: Nanjing University of Chinese Medicine
Priority date: 2020-03-04
Filing date: 2020-03-04
Publication date: 2022-06-10
Anticipated expiration: 2040-03-04
Also published as: CN111269292A

Abstract

本发明公开了具有促进组织修复的家蝇多肽及其制备方法与应用，该多肽的氨基酸序列为：Leu‑Ala‑Asp‑Glu‑Glu‑Ser‑Arg‑Glu‑Arg‑Ala‑Thr‑Leu‑Leu‑Gly。本发明采用现代生化技术手段，对家蝇中促进组织修复的多肽进行跟踪筛选和评价，通过乙醇提取、萃取、离子交换树脂和反相高效液相色谱法等纯化方法制备得到，实验结果表明，该多肽可促进人永生化表皮细胞的增殖与迁移，毒副作用低，能够用于制备美白、祛皱、祛色斑等药物或护肤品，可明显改善皮肤美感，具有很好的应用前景。

Description

具有促进组织修复的家蝇多肽及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及一种活性多肽，具体涉及一种家蝇提取物中分离得到的具有促进组织修复作用的活性多肽及其制备方法，属于生物医药技术领域。

背景技术

皮肤创伤愈合是指由于遭受外力作用，皮肤组织出现离断或缺损后的愈复过程，包括各种组织的修复与再生，如细胞增殖、分化、迁移等过程。表皮及其它组织再生通常发生在创伤后的24小时内，伤口边缘的基底细胞即开始增生，并在凝块下面向伤口中心迁移，形成单层上皮，覆盖于肉芽组织的表面。因此，促进组织细胞增殖、迁移、修复对于创伤愈合非常重要。

多肽类药物在促进创面愈合方面具有独特的优势，效应强，安全性高。如表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子等多肽具有明显的修复创伤的作用；且现代研究发现，动物来源的活性多肽也具有非常好的促进创伤修复的功效。

《本草纲目》有关于金蝇幼虫可用来“治小儿诸疳积、疳疮，热病谵语，毒痢作吐。”金蝇幼虫具有健脾消积，清热除疳的功效。申请人前期研究发现，家蝇提取物具有较好的促进人永生化表皮细胞(HaCat)增殖与迁移的作用，但是其功效成分仍不明确。

发明内容

发明目的：本发明的目的在前期研究基础上，通过大量实验筛选，采用现代生化技术手段，对家蝇提取物中促进组织修复成分进行跟踪评价，通过萃取、强氧离子交换色谱和反相高效液相色谱法等纯化方法制备得到一种促进组织修复的家蝇多肽，实验结果表明，本发明分离得到的多肽具有很好的促进HaCat细胞增殖与迁移的作用，有很好的促进组织修复的功效。

技术方案：为了实现以上目的，本发明采取的技术方案为：

一种促进组织修复的家蝇多肽，该多肽具有下述的氨基酸序列：Leu-Ala-Asp-Glu-Glu-Ser-Arg-Glu-Arg-Ala-Thr-Leu-Leu-Gly。

本发明所述的促进组织修复的家蝇多肽的制备方法，包括以下步骤：

(1)家蝇提取物的制备：取粉碎或未粉碎的家蝇全体，加入乙醇提取，浓缩得到家蝇提取物；

(2)萃取：将步骤(1)的家蝇提取物，用甲醇溶液分散，加入氯仿，充分振摇，静置后，弃去氯仿层，将甲醇溶液部分离心、浓缩干燥，得到家蝇提取物甲醇部位；

(3)强氧离子交换树脂分离：取步骤(2)得到的甲醇部位，用甲酸铵溶液复溶，反复上样强氧离子交换树脂分离小柱，先用5～10mM用甲酸铵溶液冲洗7～8次后，再用甲酸铵溶液洗脱小柱，收集洗脱液，得到家蝇多肽部位；

(4)反相色谱分离纯化：取步骤(3)得到的家蝇多肽部位，以甲酸溶液复溶后，经过反相制备高效液相色谱分离，流动相：A相为体积浓度0.1％甲酸；B相为甲醇，梯度洗脱；流速：5～10mL/min；柱温：30℃，检测波长为220nm，分离收集得到家蝇多肽，该多肽氨基酸序列为：Leu-Ala-Asp-Glu-Glu-Ser-Arg-Glu-Arg-Ala-Thr-Leu-Leu-Gly。

作为优选方案，以上所述的促进组织修复的家蝇多肽的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)家蝇提取物的制备：取粉碎或未粉碎的家蝇全体，加入体积浓度70％乙醇提取，过滤，得提取物，浓缩；

(2)萃取：将步骤(1)的家蝇提取物，用体积浓度70％甲醇溶液分散，加入1/10体积的氯仿，充分振摇，静置后，弃去氯仿层，将甲醇溶液部分离心，浓缩干燥，得到家蝇甲醇提取物部位；

(3)强氧离子交换树脂分离：步骤(2)家蝇甲醇提取物部位，用10mM甲酸铵溶液复溶，甲酸铵溶液含25％乙腈，pH 2.7～3；反复上样强氧离子交换树脂小柱，以保证样品充分吸附，用含25％乙腈，pH 2.7～3的10mM甲酸铵溶液冲洗强氧离子交换树脂小柱7～8次后，用含25％乙腈，pH＝5的0.4M甲酸铵溶液洗脱强氧离子交换树脂小柱，收集洗脱液，得到家蝇多肽部位；

(4)反相色谱分离纯化：取步骤(3)得到的家蝇多肽部位，以体积浓度0.1％甲酸溶液复溶后，经过反相制备高效液相色谱分离，流动相：A相为体积浓度0.1％甲酸；B相为甲醇，梯度洗脱；流速：10mL/min；柱温：30℃，检测波长为220nm，分离收集得到家蝇多肽，该多肽氨基酸序列为：Leu-Ala-Asp-Glu-Glu-Ser-Arg-Glu-Arg-Ala-Thr-Leu-Leu-Gly。

作为优选方案，以上所述的促进组织修复的家蝇多肽的制备方法，梯度洗脱方式为：0～15min，流动相B浓度由2％体积比梯度提高至35％体积比，流速10mL/min。

本发明所述的促进组织修复的家蝇多肽在制备促进组织修复或改善皮肤美感作用的药物、化妆品或日化用品中的应用。所述的药物的形式为片剂、胶囊剂、注射剂、颗粒剂、凝胶软膏剂、软膏剂、搽剂等。

所述的化妆品或日化用品的形式为软膏剂、搽剂、贴剂(如面膜)、霜剂(如面霜)、洗涤剂(如香皂、沐浴液等)、乳剂、凝胶或爽肤水等。

本发明对于现有技术具有如下的有点与效果：

(1)本发明首次从家蝇中分离纯化鉴定了就有促进组织修复作用的多肽，其氨基酸序列为：Leu-Ala-Asp-Glu-Glu-Ser-Arg-Glu-Arg-Ala-Thr-Leu-Leu-Gly。

(2)本发明的多肽在较低浓度(5μM)下即可促进HaCat的增殖和迁移。

(3)本发明的多肽稳定性好，在胃肠道作用下未见水解，可用于组织修复和消化道溃疡。

(4)本发明的多肽具有能够美白、祛皱、祛色斑等作用，可明显改善皮肤美感。

附图说明

图1为本发明提供的多肽的质谱图。

图2为家蝇修复肽对HaCat细胞的增殖作用。

图3为家蝇修复肽对HaCat细胞的促迁移折线图。

具体实施方式

下面结合具体实施例进一步阐明本发明，应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，在阅读了本发明之后，本领域技术人员对本发明的各种等价形式的修改均落于本申请所附权利要求所限定的范围。

实施例1家蝇修复肽的制备方法，其包括以下步骤：

(1)家蝇提取物的制备：用70％乙醇提取粉碎或未粉碎的家蝇全体，提取物浓缩；

(2)萃取：将家蝇提取浓缩物用70％甲醇溶液分散，加入约1/10体积的氯仿，充分振摇，静置后，弃去氯仿层，将甲醇溶液部分离心浓缩干燥，得到家蝇提取物甲醇部位；

(3)强氧离子交换树脂(SCX)分离：步骤(2)得到的家蝇提取物甲醇部位，用10mM甲酸铵溶液(含25％乙腈，pH 2.7～3)复溶，反复上样SCX小柱，以保证样品充分吸附，用10mM甲酸铵溶液(含25％乙腈，pH 2.7～3)冲洗SCX小柱7～8次后，用0.4M甲酸铵溶液(含25％乙腈，pH＝5)洗脱SCX小柱，收集洗脱液，得到家蝇多肽部位；

(4)反相色谱分离纯化：取步骤(3)得到的家蝇多肽部位，以0.1％甲酸溶液复溶后，经过反相制备高效液相色谱分离，流动相：A相为体积浓度0.1％甲酸；B相为甲醇，梯度洗脱；流速：10mL/min；柱温：30℃，检测波长为220nm，分离收集得到家蝇多肽，该多肽氨基酸序列为：Leu-Ala-Asp-Glu-Glu-Ser-Arg-Glu-Arg-Ala-Thr-Leu-Leu-Gly。

实施例2家蝇修复肽的序列分析，其包括以下步骤：

取实施例1制备得到的家蝇修复肽，采用nano-LC-ESI-MS/MS分析多肽的氨基酸序列，质谱条件为：ESI源，扫描方式：正离子模式，质谱一级全扫描范围为m/z 300～2000，分离宽度为3Da；串联质谱分析采用一级质谱数据依赖的二级质谱扫描模式，依次选取一级质谱中离子强度最高的5个离子进行碰撞诱导解离(CID)二级串联质谱。根据获得的MS/MS图谱测定得到家蝇修复肽的氨基酸序列为：Leu-Ala-Asp-Glu-Glu-Ser-Arg-Glu-Arg-Ala-Thr-Leu-Leu-Gly，如图1所示。

实施例3家蝇修复肽的合成

根据实施例2获得的氨基酸序列，采用固相合成的方法，合成二肽基肽酶-4抑制肽Leu-Ala-Asp-Glu-Glu-Ser-Arg-Glu-Arg-Ala-Thr-Leu-Leu-Gly，合成后的多肽通过HPLC分析纯度为98％，质谱测定分子量为1558.79Da,与纯化多肽的保留时间、分子量一致，二级质谱碎片与纯化多肽碎片一致。

实施例4家蝇修复肽促进HaCat细胞增殖作用

HaCat种板：用0.1％胰酶消化细胞，轻轻拍打细胞，加入培养液终止胰酶作用，小心收集细胞于离心管中，离心(1000rpm，5min)，除去上清液，用10ml 10％FBS-DMEM培养基重悬细胞，计数。调整细胞悬液浓度，使细胞浓度为2×10³cells/孔，加入96孔板中(边缘孔用无菌PBS填充)。5％CO₂，37℃孵育，贴壁过夜。

给药：去除上清液，分别加入以10％FBS-DMEM培养基配制的终浓度为20，10，5μg/ml的家蝇修复肽溶液，每孔200μl，每个浓度设3个复孔，空白孔为200μl 10％FBS-DMEM培养基，给药后5％CO₂，37℃孵育24小时。每孔除去上清液，用200μl无菌PBS洗一次，加入150μl培养液，再加入10μl cck-8测定液，设空白对照孔，孔中不含细胞，仅加150μl培养液和10μlcck-8测定液。37℃孵育箱温孵3小时后，于450nm处测定各孔的吸光值，计算细胞存活率。

实验结果如图2所示，与空白组相比，家蝇修复肽在5，10，20μg/ml浓度下对HaCat均有显著的增殖作用(p<0.05；p<0.01)。

实施例5家蝇修复肽促进HaCat细胞迁移作用

HaCat种板：用0.1％胰酶消化细胞，轻轻拍打细胞，加入培养液终止胰酶作用，小心收集细胞于离心管中，离心(1000rpm，5min)，除去上清液，用10ml 10％FBS-DMEM培养基重悬细胞，计数。调整细胞悬液浓度，使细胞浓度为1×10⁵cells/孔，加入12孔板中。5％CO₂，37℃孵育，贴壁过夜。待细胞融合后，用枪头在孔内对细胞进行划痕损伤，形成宽度约为1mm均匀一致的划痕。用无血清DMEM培养液轻轻吹打划痕附近3次，以除去刮掉的细胞。

给药：以5％FBS-DMEM培养基分别将家蝇修复肽配制成浓度为20μg/ml的溶液，在孔中分别加入1ml的家蝇修复肽溶液，每个样品设3个复孔，空白孔为1ml 5％FBS-DMEM培养基。给药后5％CO₂，37℃孵育，分别于0，24，36小时显微镜下观察细胞融合情况。

以Image Pro Plus软件在图中每个时间点的图上选择等距离的6个点，测量划痕宽度，按下式计算迁移率：

迁移率＝[(初始宽度)-(培养后的宽度)]/初始宽度×100％

实验结果如图3所示，根据迁移率绘制折线图，横坐标为时间，纵坐标为迁移率，家蝇修复肽在孵育24h后，可显著促进HaCat划痕的愈合(p<0.05)，家蝇修复肽在孵育36h后可显著促进HaCat划痕的愈合(p<0.01)。

实施例5家蝇修复肽对小鼠皮肤损伤的修复作用

选取40只雄性昆明小鼠，18-20g，分笼饲养，自由取食，实验前12h禁食。用1％戊巴比妥钠0.2ml腹腔注射麻醉小鼠，剪去背部毛，脊柱表皮皮肤上下对称开0.5cm×0.5cm正方形伤口，剪去全层皮肤，伤口止血备用。次日，***麻醉小鼠，伤口分别滴加不同浓度的家蝇修复肽、生理盐水0.1ml，每日换药一次。于3、5、10日观察创面愈合情况。

按下式计算创面愈合率：

创面愈合率＝[(原始创面面积)-(未愈合创面面积)]/原始创面面积×100％；结果如表1，结果表明，家蝇修复肽能够显著促进小鼠皮肤创伤的愈合(p<0.01)。

表1小鼠创面愈合统计结果

与模型组相比，*p<0.05有显著性差异；**p<0.01有极显著性差异。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 南京中医药大学

<120> 具有促进组织修复的家蝇多肽及其制备方法与应用

<141> 2020-03-04

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 1

Leu Ala Asp Glu Glu Ser Arg Glu Arg Ala Thr Leu Leu Gly

1 5 10

Claims

1.一种促进组织修复的家蝇多肽，其特征在于，该多肽的氨基酸序列为：

Leu-Ala-Asp-Glu-Glu-Ser-Arg-Glu-Arg-Ala-Thr-Leu-Leu-Gly。

2.权利要求1所述的促进组织修复的家蝇多肽在制备促进组织修复的药物中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述的药物的剂型为片剂、胶囊剂、注射剂、颗粒剂、软膏剂、搽剂或贴剂。