KR100373776B1 - 화장료 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 피부 노화의 주요 원인이 되는 생체 내적/외적 유해 환경(열, 자외선, 중금속, 활성산소종 등)에 대한 스트레스로부터 피부 세포를 보호하고 피부 세포의 기능을 정상적으로 회복시켜 주는 보호 단백질의 일종인 열충격 단백질(Heat Shock Protein) 분비를 촉진시키는 화장품에 관한 것이다. 더욱 상세하게는 피부 각질층을 구성하고 있는 케라티노싸이트에 대하여 자외선 등의 스트레스로부터 세포를 보호하고 세포의 기능을 회복시켜 주어 피부 세포의 노화 억제 기능이 우수하고, 피부 진피층을 구성하고 있는 섬유아세포에 대하여 생체 대사과정에서 생성되는 프리라디칼 등의 활성산소종에 의한 단백질의 변성, 막 지질의 산화 등으로 인한 세포 괴사를 억제하여 피부 노화를 지연시키는 기능을 가지는 열충격 단백질의 발현을 촉진시키며, 일소 방지 제품(SPF 제품)과 혼용하여 사용시 일광 차단 지수 상승 효과가 있는 겨우살이 추출물, 죽순 추출물 또는 글루쿠론산을 유효 성분으로 함유하는 피부 화장료에 관한 것이다.

Description

화장료 조성물{A Composition for Cosmetics}

본 발명은 피부 미용 작용이 우수한 천연물 함유 화장료에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 피부 노화의 주요 원인이 되는 생체 내적/외적 유해 환경(열, 자외선, 중금속, 활성산소 등)에 대한 스트레스로부터 피부 세포를 보호하고 피부 세포의 기능을 정상적으로 회복시켜 주는 보호 단백질의 일종인 열 충격 단백질(Heat Shock Protein) 분비를 촉진시키는 화장료 조성물에 관한 것이다. 더욱 상세하게는 피부 각질층을 구성하고 있는 케라티노싸이트에 대하여 자외선 등의 스트레스로부터 세포를 보호하고 세포의 기능을 회복시켜 주어 피부 세포의 광노화 억제 기능이 우수하고, 피부 진피층을 구성하고 있는 섬유아세포에 대하여 생체 대사과정에서 생성되는 프리라디칼 등의 활성산소종에 의한 단백질의 변성, 막 지질의 산화 등으로 인한 세포 괴사(apoptosis)를 억제하여 피부 노화를 지연시키는 기능을 가지는 열충격 단백질(Heat Shock Protein)의 발현을 촉진시키며, 일소 방지 제품(SPF 제품)과 혼용하여 사용시 일광 차단 지수 상승 효과가 있는 겨우살이 추출물, 죽순 추출물 및/또는 글루쿠론산을 유효 성분으로 함유하는 화장료 조성물에 관한 것이다.

HSP70Kda와 HSC70Kda을 포함하는 일련의 열충격 단백질(이하 "HSP"와 혼용함)은 생명체들이 정상적인 범위 이상의 온도 상승에 반응하여 주로 세포질에서 광범위하게 발현하는 일군의 단백질들이다(Bienz and Pelham, 1987; Bond and Schlesinger, 1987; Lindquist, 1986; Ashburner and onner, 1979). 또한 HSP는 환경적 스트레스와 병리적 스트레스 상황에서도 발현된다. 예를 들면 열 충격과 아미노산 유사체, 중금속, 독소, 산화물과 같은 환경 스트레스에 세포가 노출되었을 경우와 바이러스나 박테리아가 세포에 침입할 경우와 같은 병리적 스트레스와 노화나 염증이 세포에 유발되었을 경우 발현된다(Morimoto 등, 1992).

HSP에 대한 연구는 다양한 분야에서 많은 연구들이 이루어지고 있으며, 특히 암, 면역계, 감염성 질환, 자가면역 질환, 백신과 면역치료, 독물학(toxicology) 등에서 활발히 진행 중이다. Li 등(1999)은 골모세포(osteoblast)에 42℃, 45℃, 48℃의 온도로 10분간 열 충격을 가한 결과, 45℃에서 치료한 세포에서 HSP70Kda이 가장 많은 증가를 보였고 세포 방어 기전이 가장 활발함을 보였다. 이러한 방어 기전은 45℃에서 치료한 세포에서 아폽토시스(apoptosis)를 방지할 수 있지만 48℃에서 치료한 세포에서는 그렇지 못함을 의미한다. 또한 초음파 치료시 관절 연골세포 내의 HSP 생성을 증가 시키며, 연골세포를 보호하고 관절 연골을 회복시키는 초음파의 치료적 효과와 밀접한 관계가 있다(Huang 등, 1999). Yoo 등(1999)은 알츠하이머 환자와 다운증후군 환자에 대한 연구에서 알츠하이머 환자의 측두 대뇌피질에서 HSP70Kda의 유의한 증가를 확인하였으며 이는 HSP70Kda이 신경퇴행성 질환에밀접한 영향을 미친다는 것을 의미한다. 최근 연구에서, 뇌졸중이나 간질에 의해 손상 받은 뇌에서 HSP70Kda의 발현이 증가되며, 이는 국소빈혈(ischemia)이나 간질에 의한 손상에 대해 HSP70Kda가 뇌손상을 방어한다는 것을 의미한다(Yenari 등, 1998).

HSP의 종류를 분자량과 서열 상동성(sequence homology)에 따라 분류하면 104(HSP100 패밀리), 90(HSP90 패밀리), 70(HSP70 패밀리), 60(HSP60 패밀리), 20(HSP27/28 패밀리)로 나뉜다.

HSP100 패밀리에 속하는 단백질은 최근에 그 기능이 알려지고 있는 군으로 드로소필라(Drosophila)를 제외하고는 박테리아부터 진핵세포에 이르기까지 광범위하게 확인되고 있으며 고온에서의 열 저항성에 필요한 단백질로서 효모에서는 HSP70Kda의 기능을 보완하는 것으로 알려져 있다(Snachez 등, 1992).

HSP90 패밀리는 세포질(cytosol)과 내형질 세망(reticulum)에서 발견되며 생체 내 기능은 아직 잘 알려져 있지 않지만 인산화 효소나 글루코코르티코이드 수용체와 같은 전사인자(transcription factor)와 결합되어 있는 것이 밝혀졌다. 이러한 단백질과 결합함으로서 HSP90은 이들의 작용을 조절하며, 또한 이러한 단백질들이 적절한 구조를 가질 수 있도록 하여 이들의 기능을 보조한다(Bohn 등, 1995).

HSP60 패밀리는 미토콘드리아에서 제한적으로 발현되고 있으며 몇몇 질병에서 그 발현 정도가 증가하여 질병의 진단 기준으로서의 역할에 관심을 모으고 있다 (Ellis 등, 1991).

HSP27/28 패밀리는 정상세포와 암세포 모두에서 발현되는 단백질로서 최근에세포의 분화단계에서 중요한 작용을 한다는 사실이 밝혀지고 있으며 약제 내성(drug resistance)에도 중요한 역할을 할 것임이 제시되고 있다(Ciocca 등, 1993).

HSP70 패밀리는 다른 HSP 패밀리에 비해 유전학적으로나 생화학적인 면으로 가장 잘 밝혀진 단백질이다. HSP70 패밀리는 여러 개의 HSP으로 나누어지며 세포 내 분포 또한 다르다. 항상 발현되고 주로 세포질에 존재하는 열충격 코그네이트(Heat Shock Cognate; HSC70), 미토콘드리아에 존재하는 p75, 관강(lumen)에 분포하고 포도당(glucose)에 반응하는 grp78/BiP, 열충격에 의해 세포질에서 합성되는 유도성 HSP70Kda이 그것들이다(Kiang and Tsokos, 1998). 그 중 급격하게 자극에 반응하여 그 존재 여부가 좌우되는 것은 HSP72(유도성 HSP70Kda)이다(Beckmann 등, 1990). HSP70Kda은 진핵세포와 원핵세포에서 모두 발현되며 보존성이 높은 단백질로 진핵세포 사이에서는 60-78%의 동일성을 보이며 대장균과 진핵세포 사이에서는 40-60%의 동일성을 보이고 있다(Craig, 1985; Lindquist, 1986; Caplan 등, 1993). 또한 HSP70Kda은 자극을 받았을 때에만 급격하고 민감하게 반응하여 상당한 양의 증가를 보이고 회복시기에는 가장 먼저 감소한다(Welch 등, 1986).

HSP70Kda의 주요 기능을 살펴 보면 최근 몇 년 동안 HSP의 증가된 발현은 국소빈혈, 고열과 염증, 대사성 질환, 세포와 조직 손상, 노화, 감염과 암을 포함한 다양한 질병과 관련하여 연구되어 왔다. HSP 발현은 단지 세포 손상의 상태를 반영하거나 특별한 병태생리적 상태에서 생존을 위한 적응이 아니라 생리적 스트레스의탐지를 위한 신호로 판단되어 왔으며, 최근에 HSP이 비천연(non-native) 단백질들의 축적(accumulation)과 응집으로 인해 초래되는 세포 손상을 방지하고 세포의 회복 과정에 관여한다는 것이 밝혀졌다.

HSP70Kda의 기능 중 가장 중요한 기능은 분자 쉐퍼론(molecular chaperone)으로 변성된 다른 효소 단백질과 결합하여 그 적절한 폴딩(folding)을 유지시켜 세포의 손상을 최소화하는 것이다(Morimoto, 1993; Kiang and Tsokos, 1998). 또한 세포막을 통한 단백질 수송이나 단백질 합성과 같은 세포 내 항성성 유지에 중요한 작용을 한다(Moseley, 1998).

HSP70Kda의 또 다른 기능 중 하나는 세포의 사망이 유전자에 프로그램되어 있는 능동적인 과정으로 프로그램된 세포 사멸(programmed cell death)의 한 형태인 아폽토시스(Steller 등, 1995)를 억제하는 것이다. Samali와 Cotter(1996)는 HSP70Kda이 아폽토시스를 억제하고 세포의 생존을 증가시킨다고 하였으며, 이는 HSP70Kda이 단순한 쉐퍼론(chaperone) 기능에서 벗어나 세포의 운명을 결정해 주는 신호 전달 체계에 관여함을 의미한다(안정혁, 1997). 인간 전단구 세포계(Human premonocytic line) U937 세포에서 열충격을 준 세포는 H₂O₂에 의한 미토콘드리아 막의 변화와 돌기(cristate)의 형성을 감소시키며, 이 효과는 HSP70Kda의 발현과 가장 큰 상관관계가 있다는 보고가 있다(Polla 등, 1996). 그리고 고환(testis)에서 특이적으로 발현하는 HSP70Kda을 결손시킨 생쥐에서 고환의 정모세포 (spermatocyte)에 아폽토시스가 생겼고 또한 수컷 배아세포(germ cell)의 감수분열이 억제되어 불임증이 발생하였다(Dix 등, 1996). 양분의 부족, ATP의 결핍, 열 충격, 그리고 미세소관(microtubule)을 파괴하는 약물인 빈블라스틴(vinblastine)은 EAC(Ehrlich ascites carcinoma) 세포에서 아폽토시스를 유발하는데, HSP70Kda은 이러한 자극에 의한 아폽토시스를 억제한다(Gaba 등, 1995).

HSP70Kda은 고온 이외에도 다양한 자극에 의해 발현이 증가함으로 인해 스트레스 유도성 HSP70Kda이라고도 명명되며, 세포의 차원에서 보면 이들 아폽토시스는 크게 하나의 스트레스로 볼 수 있기 때문에 아폽토시스와 HSP과는 밀접한 관계가 있을 것으로 생각되어, 이에 대한 연구 또한 활발히 진행 중이다.

이와 같은 생체 내부/외부 스트레스에 대해 체내 항상성 유지와 아폽토시스 억제에 관여하는 열충격 단백질 HSP70Kda와 HSC70Kda는 피부 표피층과 진피층에서도 동일한 기능을 수행하여 외부 유해환경(열, 자외선, 중금속, 활성산소 등)으로부터 피부 노화 현상을 억제시켜 준다.

이러한 열 충격 단백질에 관한 선행 기술은 화장품 영역에서는 보고된 바 없으며, 제약업계에서 최근 보고되고 있다. 열 충격 단백질에 관련해서는 종양 및 세포성장억제 목적으로 p53 단백질의 활성화(공개특허번호 1995-703986), 박테리아에 의해 유발된 질병의 진단 및 예방, 처리를 위한 방법으로 스트렙토코커스 속(streptcoccus spec.) 유래의 HSP70Kda 계열의 쇼크 단백질(공개특허 1999-022742), 헬리코박터 감염에 대한 면역원 조성물에 함유되는 폴리펩티드 및 전기 폴리펩티드를 코드화하는 핵산 서열(공개특허 1996-700342)등이 보고되고 있다.

본 발명에서 HSP 생성을 촉진시키는 물질로 사용한 겨우살이 추출물에 관해서는 식품 및 제약에서 적용이 다음과 같이 보고되고 있다. 겨우살이 추출물을 첨가하여 발효시킨 유산균 발효물 및 그 제조 방법(공개특허 1997-064384), 한국산 겨우살이로부터 분리된 렉틴 성분을 함유하는 면역 증강용 의약 조성물(공개특허 1999-034024), 겨우살이 추출물을 함유하는 고지혈증 치료제로서 약학 조성물(공개특허 1999-080547), 경구 투여 면역 증강제로서 겨우살이 추출물의 적용(공개특허 2000-048654) 등이 개시되어 있고, 죽순 추출물의 경우, 화장품에서 죽내피 추출물을 함유하는 미백 화장료(공개특허 2000-007943), 죽염 추출물을 함유한 항여드름 피부 외용제(공개특허 2000-019981)로서 적용이 보고되어 있고, 또한, 화장품에서는 우론산과 관련하여 우론산의 섬유아세포 활성 촉진 효과에 대하여 보고된 바 있다(공개특허 1998-033891). 그러나, 열충격 단백질의 발현을 유도함으로써 세포를 보호하고 회복시키는 기능을 하는 화장료에 대한 연구 보고는 전무하다.

지금까지 화장품 분야에서는 피부 노화 현상을 억제하기 위해 가장 일반적인 방법으로 피부 내,외부에서 레티놀, 아미노산, 기능성 프로테인 컴프렉스 등 섬유아세포의 활성을 촉진하는 일종의 촉진제(promoter)를 이용하여 피부 노화를 억제 하였으나, 이는 결과적으로 강제적인 피부 섬유아세포의 활성 강화로 진피층의 콜라겐 섬유 다발이 증가되어 미세 주름 및 피부탄력을 개선시켜 주는 효과는 있으나 피부 윤곽이 자연스럽지 못하다는 문제점을 가지고 있다.

본 발명자들은 피부 윤곽이 자연스럽고 피부 잔주름 및 탄력 개선에 효과가있는 노화 방지 화장품을 개발하기 위해 기존의 피부 섬유아세포의 활성을 촉진하는 촉진제(promoter)를 이용하여 피부 상태를 개선하는 방법이 아닌 생체 내적/외적 유해 환경(열, 자외선, 중금속, 활성산소 등)에 대한 스트레스로부터 피부 세포를 보호하고 피부 세포의 기능을 정상적으로 회복시켜 주는 기능이 있는 보호 단백질의 일종인 열 충격 단백질 분비를 촉진시키고자 천연 물질을 적용한 피부 방어 및 회복 개념의 노화 방지 화장료를 개발하게 되었으며, 30종의 천연물을 선정하여 저자극성이며 열 충격 단백질의 발현 촉진 기능이 뛰어난 물질로 탐색된 겨우살이 추출물, 죽순 추출물 및 글루쿠론산이 피부 노화 방지 원료로서의 가능성을 가짐을 발견하고 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 생체의 방어 단백질인 열 충격 단백질의 발현을 촉진시키고자 겨우살이 추출물, 죽순 추출물 또는 글루쿠론산을 이용하고, 이 물질을 함유함을 특징으로 하는 저자극성이며 피부 노화 방지 및 주름 개선에 효과가 있는 화장료를 제공하는데 있다.

본 발명은 상기 목적을 달성하기 위하여 생체 내적/외적 유해 환경에 대한 스트레스로부터 생체 보호 및 회복기능이 있는 열 충격 단백질의 발현 촉진 성분을 함유하는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 생체 내·외 유해환경이 열 충격, 활성산소종 또는 자외선인 것을 특징으로 하는 화장료 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 열 충격 단백질이 HSP70Kda 또는 HSC70Kda인 것을 특징으로 하는 화장료 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 열 충격 단백질의 발현 촉진 성분이 겨우살이 추출물, 죽순 추출물, 글루쿠론산 중의 1종 이상인 것을 특징으로 하는 화장료 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 겨우살이 추출물 및 죽순 추출물이 추출 용매로서 정제수, 메탄올, 에탄올, 글리세린, 메틸아세테이트, 에틸아세테이트, 부틸렌글리콜, 프로필렌글리콜, 디에틸에테르, 디클로로메탄, 벤젠 및 헥산 중에서 선택된 1종 이상의 용매를 사용하여 추출한 것임을 특징으로 하는 화장료 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 추출물이 상온에서 냉침, 가열·여과하여 얻어진 액상물, 추가로 용매를 증발 또는 동결건조하여 얻은 추출물인 것을 특징으로 하는 화장료 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 글루쿠론산이 천연물 유래 또는 합성에 의해 제조된 것임을 특징으로 하는 화장료 조성물을 제공한다.

뿐만 아니라, 본 발명은 상기 화장료 조성물이 화장수, 젤, 수용성 리퀴드, 수중유(O/W)형 및 유중수(W/O)형의 제형 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 겨우살이 추출물의 함량이 화장료 조성물 전체에 대하여 0.001 내지 50.0 중량%인 것을 특징으로 하는 화장료 조성물을 제공한다.

나아가, 본 발명은 상기 죽순 추추물의 함량이 화장료 조성물 전체에 대하여0.001 내지 50.0 중량%인 것을 특징으로 하는 화장료 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 글루쿠론산의 함량이 화장료 조성물 전체에 대하여 0.001 내지 10.0 중량%인 것을 특징으로 하는 화장료 조성물을 제공한다.

이하 실시예를 참조로 하여 본 발명의 구성 및 효과를 상세히 설명한다.

겨우살이(Viscum album var.)는 중국, 일본, 한국에 널리 분포하는 상록성 기생관목으로 둥지 모양으로 둥글게 자라며 열매가 붉은색으로 익는 것을 붉은 겨우살이라고 한다. 아미린, 루페올, 렉틴, 글루쿠론산등을 함유하고 있으며 민간에서 고혈압, 요통, 동상, 동맥경화 치료제로서 한방에서 사용해오던 재료로서 체내 섭취에 따른 인체 안정성이 이미 확인되어 있다(약초의 성분과 이용, 일월서각, 1994, 문관심/한국의 자원식물, 서울대학교 출판부, 1996, 김태정).

죽순(BAMBUSAE CAULIS IN TAENIAM)은 솜대 또는 왕대의 겉껍질을 제거한 중간층으로 죽순 높이가 30cm정도 되는 4월경에 채취하며 아미노산, 베타인, 과당, 글루쿠론산, 지베렐린 등이 함유되어 있다. 죽순은 오래전부터 소염, 발한, 진통, 보약 등의 한방 생약 원료 및 식용으로 널리 사용하여 체내 섭취에 따른 인체 안정성이 이미 확인되어 있다(한약규격주해, 한국메디칼인덱스, 1998, 지형준 / 일본후지죽류식물원보고 12호, 1967).

또한, 글루쿠론산(glucuronic acid)은 화학식 C₆H₁₀O₇(분자량194.1)으로 표현되며, 간에서 생성되는 포도당의 산화산물로 콘드로이친황산 등의 뮤코다당의 주요 구성성분이기도 하며 아스코르빅산 생합성의 중간 물질로서도 존재하고 창질경이(Plantage lanceolate), 차전자(Plantaginis semen), 황금, 허브의 일종인 에티나세아(Echinacea) 등의 식물류의 구성당 및 세포의 협막 다당류에 함유되어 있는 천연물이다. 넓게는 우론산에 포함된다. 식물류의 경우 추출, 분리, 여과, 정제 과정을 통해 글루쿠론산 함유 액상 조성물을 얻을 수 있으나 액상물 자체만으로는 글루쿠론산의 함량이 미미하여 본 발명의 목적인 열 충격 단백질 발현 촉진 효과를 얻기 힘들다. 그리고 일반적으로 화장품에 보습제로 널리 적용중인 히아루론산과 같은 무코다당류(분자량 30만∼100만)는 글루쿠론산(분자량 194.1)에 비해 분자량이 너무 커서 피부 세포막 투과가 일어나지 않으므로 세포막 내에서 일어나는 열 충격 단백질의 발현을 기대할 수 없다. 따라서 열충격 단백질의 발현을 촉진시키는 유효성분, 즉 글루쿠론산의 함량을 선택적으로 높인 물질을 사용하여 피부 세포내 열 충격 단백질의 발현을 촉진시켜 생체 내적/외적 유해 환경에 대한 스트레스로부터 피부 세포를 효과적으로 보호함으로서 피부 노화 방지 및 개선 기능을 발휘하고 인체에도 무해하게 사용할 수 있다면 본 발명의 목적에 적합하게 사용할 수 있다.

상기와 같은 천연물 및 글루쿠론산의 세포내 열 충격 단백질의 발현 촉진 여부를 확인하고 피부 노화 예방을 위한 화장료로 혼용하기 위하여 다음의 예를 수행하였다.

본 발명에 사용하는 겨우살이 추출물로는 겨우살이 건물을 10∼200 메쉬 크기로 분쇄한 겨우살이 분말에 추출용매를 바람직하게는 정제수, 에탄올, 부탄올, 메틸아세테이트, 에틸아세테이트, 부틸렌글리콜, 프로필렌글리콜, 글리세린, 디에칠에테르, 디클로로메탄, 벤젠 또는 핵산 중에서 선택된 1종 이상을 첨가하여 24시간 이상 냉침한 후 여과, 농축시켜 제조한 추출물이나, 추출용매에 첨가하여 2시간 이상 가온하여 여과, 농축시켜 제조한 추출물을 사용할 수도 있다.

그러나, 어떤 용매를 이용하여 어떤 방법에 따라 추출물을 얻는가 하는 것은 그리 중요하지 않으며, 추출물 중의 유효성분의 함량을 높여 피부 세포내 열 충격 단백질의 발현을 촉진시킴으로써 생체 내적/외적 유해 환경에 대한 스트레스로부터 피부 세포를 효과적으로 보호하여 피부 노화 방지 및 개선을 효과적으로 발휘할 수 있을 뿐만 아니라 인체에도 무해하게 사용할 수 있다면 본 발명의 목적에 적합하게 사용할 수 있다.

본 발명에서 사용하는 겨우살이 추출물은 각 단계별로 얻어진 추출물을 모두 사용할 수 있지만, 어느 단계의 추출물을 본 발명에 따른 조성물에 적용하는가에 따라 소기의 효과를 달성할 수 있는 데 필요한 함량이 달라진다.

예를 들어, 용매 추출 후 여과하여 바로 수득한 상기 추출물을 사용하는 경우에는 액상을 기준으로 0.05 내지 20.0중량% 함유시키는 것이 바람직하다. 0.05중량% 미만으로 함유시키면 그 효과가 충분치 않아 소기의 목적을 달성할 수 없으며 20.0중량%를 초과하여 함유시키면 함량 증가에 따른 효과의 증가가 없어 비경제적일 뿐 아니라 제품의 안정성이 저하되어 바람직하지 못하기 때문이다. 또한 감압농축장치와 동결건조기를 이용한 농축과정을 통해 추출물 내 유효성분의 함량을 선택적으로 증가시킨 농축 추출물의 경우 그에 바람직한 사용 함량은 0.001 ∼ 2.0중량% 범위이다. 이 범위를 벗어나는 경우에는 상기 추출물에 대해 설명한 것과 동일한 문제점이 발생할 수 있다.

따라서 본 발명에 따른 겨우살이 추출물을 조성물에 적용하여 노화방지 및 주름개선 그리고 일소 방지 제품(SPF 제품)과 혼용하여 사용시 일광 차단 지수 상승 효과를 얻기 위해서는 일반적으로 0.001 내지 20.0중량% 범위의 사용량이 요구된다.

본 발명에 사용하는 죽순 추출물로는 죽순 건물을 10∼ 200 메쉬 크기로 분쇄한 죽순 분말에 추출용매를 바람직하게는 정제수, 엔탄올, 부탄올, 메틸아세테이트, 에틸아세테이트, 부틸렌글리콜, 프로필렌글리콜, 글리세린, 디에틸에테르, 디클로로메탄, 벤젠 및 핵산 중에서 선택된 1종 이상을 첨가하여 24시간 이상 냉침한 후 여과, 농축시켜 제조한 추출물이나, 추출용매에 첨가하여 2시간 이상 가온하여 여과, 농축시켜 제조한 추출물을 사용할 수도 있다.

그러나, 어떤 용매를 어떤 방법에 따라 추출물을 얻는가 하는 것은 그리 중 요하지 않으며, 추출물 중의 유효성분의 함량을 높여 피부 세포내 열 충격 단백질의 발현을 촉진 시킴으로서 생체 내적/ 외적 유해 환경에 대한 스트레스로부터 피부 세포를 효과적으로 보호하여 피부 노화 방지 및 개선을 효과적으로 발휘할 수 있을 뿐만 아니라 인체에도 무해하게 사용할 수 있다면 본 발명의 목적에 적합하게 사용할 수 있다.

본 발명에서 사용하는 죽순 추출물은 각 단계별로 얻어진 추출물을 모두 사 용할 수 있지만, 어느 단계의 추출물을 본 발명에 따른 조성물에 적용하는가에 따 라 소기의 효과를 달성할 수 있는데 필요한 함량이 달라진다. 예를 들어, 용매 추 출 후 여과하여 바로 수득한 상기 추출물을 사용하는 경우에는 액상을 기준으로0.05 내지 20.0중량% 함유시키는 것이 바람직하다. 0.05중량% 미만으로 함유시키면 그 효과가 충분치 않아 소기의 목적을 달성할 수 없으며 20.0중량%를 초과하여 함유시키면 함량 증가에 따른 효과의 증가가 없어 비경제적일 뿐 아니라 제품의 안정성이 저하되어 바람직하지 못하기 때문이다. 또한 감압농축장치, 동결건조기 등을 이용한 농축과정을 통해 추출물 내 유효성분의 함량을 선택적으로 증가시킨 농축 추출물의 경우 바람직한 사용함량은 0.001 내지 2.0중량% 범위이다. 이 범위를 벗어나는 경우에는 상기 추출물에 대해 설명한 것과 동일한 문제점이 발생할 수 있다.

따라서 본 발명에 따른 죽순 추출물을 조성물에 적용하여 노화방지 및 주름개선 그리고 일소 방지 제품(SPF 제품)과 혼용하여 사용 시 일광 차단 지수 상승 효과를 얻기 위해서는 일반적으로 0.001 내지 20.0중량% 범위의 사용량이 요구된다.

본 발명에서 사용하는 글루쿠론산은 단일 성분으로, 글루쿠론산의 함량이 선택적으로 증가되어 있으므로 본 발명의 목적에 바람직한 사용함량은 0.001 내지 10.0중량%의 범위이다. 0.001중량% 미만으로 함유시키면 그 효과가 충분치 않아 소기의 목적을 달성할 수 없으며 10.0중량%를 초과하여 함유시키면 함량 증가에 따른 효과의 증가가 없어 비경제적이다.

본 발명의 화장료 조성물은 크림, 연고, 젤, 로션, 화장수 등으로 제형화되어 사용될 수 있으나, 어떤 제형으로 제조하여 사용하는가는 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자에 의해 극히 용이하게 결정될 수 있는 사항이다.

또한, 본 발명의 겨우살이 추출물과 죽순 추출물, 글루쿠론산은 로션, 젤, 에센스, 크림, 화장수 등은 각각 통상적인 제조방법에 따라 어떤 형태로든 용이하게 제조할 수 있으며 기초화장품 등에 편리하게 첨가하여 피부 노화 방지 및 개선제로서 사용될 수 있다.

일례로서 크림을 제조함에 있어서는 일반적인 수중유형(O/W) 또는 유중수(W/O)의 크림베이스에 겨우살이 추출물 및/또는 죽순 추출물을 함유시키고 여기에 향료, 킬레이트제, 색소, 산화방지제, 방부제 등을 사용하는 한편, 물성개선을 목적으로 단백질, 미네랄, 비타민 등 합성 또는 천연소재를 병용할 수 있다.

예시 1 내지 3 및 비교예 1 :겨우살이 추출물, 죽순 추출물 또는 글루쿠론산 함유 수용성 리퀴드형 화장료의 제조

하기 표 1에 나타낸 바와 같은 조성비로 하기 실시예 1, 2, 3에서 수득한 겨우살이 추출물, 죽순 추출물, 글루쿠론산을 교반기로 혼합, 교반, 탈기시켜 조성물질을 균일하게 혼합시킴으로써 수용성 리퀴드를 조성하였다.

원료명	예시 1	예시 2	예시 3	비교예 1
에칠렌디아민테트라초산디나트륨	0.02	0.02	0.02	0.02
DL-판테놀	0.3	0.3	0.3	0.3
1,3-부틸렌글리콜	5.0	5.0	5.0	5.0
카르복시비닐폴리머	0.2	0.2	0.2	0.2
잔탄검	0.1	0.1	0.1	0.1
폴리옥시에칠렌60 경화피마자유	0.5	0.5	0.5	0.5
트리에탄올아민	0.2	0.2	0.2	0.2
겨우살이추출물	1.6	0	0	0
죽순추출물	0	2.5	0	0
글루쿠론산 분말	0	0	0.16	0
방부제	적량	적량	적량	적량
향료	적량	적량	적량	적량
정제수	잔량	잔량	잔량	잔량

* 글루쿠론산 분말의 함량은 타 천연물에 포함된 글루쿠론산을 제외한 순수 글루쿠론산 분말 함량만을 의미한다.

* 100g중 각 원료 함량을 g단위로 표시함.

예시 4 내지 6 및 비교예 2 :겨우살이 추출물, 죽순 추출물 또는 글루쿠론산 함유 수중유(O/W)형 에센스 화장료의 제조

하기 표 2에 나타낸 바와 같은 조성비로 하기 실시예 1 내지 3에서 수득한 겨우살이 추출물 및/또는 죽순 추출물을 호모 믹서기로 유화하여 얻은 수중유(O/W)형 노화 방지 에센스 베이스에 교반기로 조성물질을 균일하게 혼합 시키고 탈기 시킴 으로써 수중유형 에센스를 조성하였다.

원료명	예시 4	예시 5	예시 6	비교예 2
에칠렌디아민테트라초산디나트륨	적량	적량	적량	적량
DL-판테놀	0.3	0.3	0.3	0.3
1,3-부틸렌글리콜	5.0	5.0	5.0	5.0
폴리아크릴아미드/C13-14이소파라핀/라우레쓰-7	3.0	3.0	3.0	3.0
사이크로메치콘	5.0	5.0	5.0	5.0
폴리솔베이트20	0.7	0.7	0.7	0.7
디메칠실록산/메칠실록산코폴리머	2.0	2.0	2.0	2.0
초산토코페롤	0.3	0.3	0.3	0.3
카프릴 카프레이트	3.0	3.0	3.0	3.0
겨우살이추출물	1.6	0	0	0
죽순추출물	0	2.5	0	0
글루쿠론산 분말	0	0	0.16	0
방부제	적량	적량	적량	적량
향료	적량	적량	적량	적량
정제수	잔량	잔량	잔량	잔량

* 글루쿠론산 분말의 함량은 타 천연물에 포함된 글루쿠론산을 제외한 순수 글루쿠론산 분말 함량만을 의미한다.

* 100g중 각 원료 함량을 g단위로 표시함.

예시 7 내지 9 및 비교예 3 :겨우살이 추출물, 죽순 추출물, 글루쿠론산 함유 유중수(W/O)형 일소 방지 크림 화장료의 제조

하기 표 3에 나타낸 바와 같은 조성비로 하기 실시예 1 내지 3에서 수득한 겨우살이 추출물, 죽순 추출물, 글루쿠론산을 호모 믹서기로 유화하여 얻은 유중수(W/O)형 일소 방지 크림 베이스에 교반기로 조성물질을 균일하게 혼합시키고 탈기시킴으로써 유중수형 일소방지 크림을 제조하였다.

원료명	예시 7	예시 8	예시 9	비교예 3
에칠렌디아민테트라초산디나트륨	적량	적량	적량	적량
DL-판테놀	0.3	0.3	0.3	0.3
1,3-부틸렌글리콜	5.0	5.0	5.0	5.0
옥틸메톡시신나메이트	6.0	6.0	6.0	6.0
사이크로메치콘	25.0	25.0	25.0	25.0
디메치콘	5.0	5.0	5.0	5.0
디메치콘 코폴리올	4.0	4.0	4.0	4.0
초산토코페롤	0.3	0.3	0.3	0.3
염화나트륨	1.0	1.0	1.0	1.0
겨우살이추출물	1.6	0	0	0
이산화티탄	3.0	3.0	3.0	3.0
죽순추출물	0	2.5	0	0
글루쿠론산 분말	0	0	0.16	0
방부제	적량	적량	적량	적량
향료	적량	적량	적량	적량
정제수	잔량	잔량	잔량	잔량

* 글루쿠론산 분말의 함량은 타 천연물에 포함된 글루쿠론산을 제외한 순수 글루쿠론산 분말 함량만을 의미한다.

* 100g중 각 원료 함량을 g단위로 표시함.

아래에서는 실시예 및 비교예를 통하여 본 발명의 구성을 상세히 설명한다. 그러나, 본 발명의 범위가 아래의 실시예에만 한정되는 것이 아님은 분명하다.

실시예 1: 겨우살이 추출물의 제조

건조시킨 겨우살이 100g을 생약분쇄기로 분쇄하여 10∼200메쉬 크기의 분말로 만들었다. 분말에 40%(V/V) 부틸렌글리콜 수용액 1ℓ를 가하여 상온에서 72시간 냉침한 후, 와트만(Watman) #2 여과지와 진공여과장치를 이용하여 여과하여 수득하였다. 또한, 기계적인 장치를 이용한 농축과정을 통해 추출물 내 유효성분의 함량을 선택적으로 증가시킬 수 있는데 이 경우, 여과된 최종 추출액을 50℃ 이하에서 감압농축한 후 동결건조기를 이용 건조함으로서 겨우살이 추출물 7.80g을 수득하였다. 본 발명의 실시예 및 실험예에서 사용된 추출물은 농축과정을 거치지 않은 액상물 상태의 여과된 최종 추출물이다.

실시예 2: 죽순 추출물의 제조

건조시킨 죽순 100g을 생약분쇄기로 분쇄하여 10∼200메쉬 크기의 분말로 만들었다. 분말에 40%(V/V) 에탄올 수용액 1ℓ를 가하여 상온에서 72시간 냉침한 후,와트만(Watman) #2 여과지와 진공여과장치를 이용하여 여과하였다. 다만 기계적인 장치를 이용한 농축과정을 통해 추출물 내 유효성분의 함량을 선택적으로 증가시킬 경우, 여과된 최종 추출액을 50℃ 이하에서 감압농축한 후 동결건조기를 이용, 건조함으로서 겨우살이 추출물 5.5g을 수득하였다. 본 발명의 실시예 및 실험예에서 사용된 추출물은 농축과정을 거치지 않은 액상물 상태의 여과된 최종 추출물이다.

실시예 3: 글루쿠론산 수용액의 제조

글루쿠론산 단일 성분으로 상품화되어 있는 건조물 형태의 분말(제조사 : 시그마, 미국)을 0.001 내지 10.0중량% 내에서 순수에 용해하여 이용하였다.

실시예 4: 각종 천연 활성 성분의 열 충격 단백질(Heat Shock Protein) 발현 비교 실험

본 실시예는 본 발명의 목적을 확인하기 위하여 기존에 항산화제 또는 섬유 세포 활성화제 그리고 보습제로서 화장품에 널리 적용중이며 시중에 상품으로 판매중인 천연활성성분들과 실시예 3의 글루쿠론산의 세포 내에서 열 충격 단백질의 발현 여부를 비교 평가한 것이다.

그리고 일반적으로 글루쿠론산이 함유되어 있다고 문헌에 공개되어 있는 대표적인 천연물 2종(히알루론산 1% 수용액, 황금 추출물) 및 아스코르빅산과 글루쿠론산의 세포 내에서 열 충격 단백질의 발현 여부도 비교 평가하였다.

대상 천연활성성분으로 마늘 추출물(一丸製藥, 일본), 콩 추출물(一丸製藥,일본), 버드나무 추출물(브룩스, 프랑스), 토마토 추출물(가테포사, 프랑스), 아스코르빅산 분말(로슈, 스위스), 인삼 추출물(바이오랜드, 한국), 히알루론산 1% 수용액(바이오랜드, 한국), 황금 추출물(一丸製藥, 일본)과 본 발명의 글루쿠론산 분말(시그마, 미국)을 선정하였다.

실험 방법은 SRB 어세이를 이용하여 농도별, 배양시간 등을 달리하여 세포 생존여부를 측정하고 각기 천연활성성분에 대한 웨스턴 분석의 방법으로 열 충격 단백질의 발현 및 SDS-PAGE와 오토래디오그래피로 단백질 합성 패턴을 측정하였다. 또한 플로우 사이토미터(flow cytometer)를 이용하여 세포 사멸양상을 측정하였다. 상세 실험 방법은 이하 실시예들에 나타내었다.

열 충격 단백질의 발현을 촉진하는 시료(활성 성분)의 농도가 지나치게 낮을 경우 열 충격 단백질의 발현을 유도하지 못하며, 반대로 시료의 농도가 너무 높을 경우 급격한 세포독성을 유발하여 열 충격 단백질의 발현 유도하지 못한다.

실험 결과, 글루쿠론산 분말은 마늘 추출물, 상황버섯 추출물, 버드나무 추출물, 아스코르빅산 분말, 인삼 추출물, 토마토 추출물보다 높은 농도를 처리해도 단백질 회복(protein recovery)이 나타남으로서 세포 생존율이 높아 세포에 독성을 나타내지 않고 열 충격 단백질을 발현시키는데 유용한 것으로 밝혀졌다. 그리고, 일반적으로 글루쿠론산이 함유되어 있다고 문헌에 소개되어 있는 히알루론산 1% 수용액과 황금 추출물 역시 단백질 회복이 나타나지 않았다. 히알루론산 수용액의 경우 분자량이 너무 커서 세포막 투과가 불가능해 단백질 회복이 일어나지 않은 것으로 보인다.

실시예 5: 세포배양기술을 이용한 피부 안전성 평가 실험

본 실시예는 실시예 1 내지 3에 의해서 얻어진 겨우살이 추출물, 죽순 추출물 및 글루쿠론산의 열 충격 단백질의 발현을 유도하는 농도에서의 피부 안전성을 평가하기 위한 실험으로서 사람의 피부를 구성하고 있는 세포를 이용하여 세포 독성을 평가한 것이다. 비교 대상으로 기존에 항산화제 또는 섬유 세포 활성화제 그리고 보습제로서 화장품에 널리 적용 중이며 시중에 상품으로 판매 중인 것들을 선정하였다.

비교 대상 천연 활성성분으로 버드나무 추출물(제조사:브룩스, 프랑스), 토마토 추출물 (제조사:가테포사, 프랑스), 아스코르빅산 분말(제조사:로슈, 스위스)과 본 발명의 실시예 1 내지 3에 의해서 얻어진 액상물 상태의 여과된 겨우살이 추출물 및 죽순 추출물을 선택하였다.

본 실시예에 사용된 Hs68 섬유아세포는 ATCC(American Type Culture Collection, 기탁번호 : CRL 1635)로부터 분양받아 사용하였다.

Hs68 섬유아세포에 대한 세포 독성 평가는 화장품에 적용하기 위한 전 임상 단계에서 실시하는 피부 안전성 평가 방법으로 겨우살이 추출물, 죽순 추출물, 글루쿠론산의 세포에 대한 독성의 평가는 다음과 같은 방법으로 수행하였다.

Hs68 섬유아세포를 65 mm 배양접시에 1.2 x 10⁶/ml의 농도로 5 ml씩 분주하고 세포를 부착시킨 후 겨우살이 추출물, 죽순 추출물, 글루쿠론산을 각각의 농도로 처리하고 24시간동안 배양시킨 다음 세포의 생존율을 확인하기 위하여 Skehan(1990)의 술포로다민 B 어세이(Sulforhodamine B assay; 이하 "SRB 어세이")를 변형하여 평가하였다.

즉, 24시간 동안 배양된 세포를 회수하여 96웰 플레이트에 2 x 10⁴개의 세포를 넣고 37℃에서 48시간 동안 배양한 후 각 웰에 50 ml의 50% 트리클로로아세트산(TCA)를 넣고 4℃에서 1시간 동안 단백질을 첨전시키고 세척한 다음 24시간 동안 상온에서 건조시켰다. 각각의 웰에 0.4% SRB(1% 아세트산 용액) 용액 200 ml을 넣고 상온에서 30분간 염색시켰다. 염색된 세포의 세척과 건조과정을 거처 각 웰에 10 mM Tris-Cl(pH 10.5)를 200 ml씩 넣고 5분간 잘 흔들어 염색된 단백질을 물에 용해시킨 후 ELISA 측정기(BIO-TEK, USA)로 565nm에서 흡광도를 측정하였다.

열 충격 단백질의 발현을 촉진하는 시료의 농도는 지나치게 낮을 경우 열충격 단백질의 발현을 유도하지 못하며, 반대로 시료의 농도가 너무 높을 경우 급격한 세포독성을 유발하여 열 충격 단백질의 발현 유도하지 못한다.

실험 결과, 겨우살이 추출물과 죽순 추출물 및 글루쿠론산은 버드나무 추출물, 아스코르빅산 분말, 토마토 추출물보다 높은 농도를 처리해도 세포 생존율이 높아 세포에 독성을 나타내지 않고 열충격 단백질을 발현시키는데 유용한 것으로 밝혀졌다.

Hs68 섬유아세포에 대한 겨우살이 추출물과 죽순 추출물의 세포 독성을 평가한 결과는 다음과 같다.

시료	세포사멸을 일으키지 않는 최대 농도(중량%)
겨우살이 추출물	1.6중량%
죽순 추출물	2.5중량%
글루쿠론산 분말	0.16중량%
버드나무 추출물	0.025중량%
아스코르빅산 분말	0.005중량%
토마토 추출물	0.025중량%

실시예 6: 열 충격(Heat shock)을 처리한 세포에 대한 사멸 방어 효과

본 실시예는 실시예 1 내지 3에 의해서 얻어진 겨우살이 추출물과 죽순 추출물, 글루쿠론산이 열 충격에 의한 세포 사멸에 대한 방어 효과를 평가하는 것으로 외부 열 충격으로부터의 생체 보호 효과를 평가한 것이다.

NIH3T3 세포를 65 mm 배양접시에 1.2 x 10⁶/ml의 농도로 5ml씩 분주하고 세포를 부착시킨 후 실시예 5에 의해서 얻어진 세포에 사멸을 일으키지 않는 농도로 겨우살이 추출물, 죽순 추출물, 글루쿠론산을 처리하고 15시간을 기다린 후 이 세포에 열 충격(45℃ 수욕조에 띄워 0, 15, 30, 45, 60분동안 일정 시간 가열)을 다시 가한 후 바로 37℃로 온도를 내리고, 24시간 동안 세포 배양 조건에서 배양하면서 열 충격에 의한 세포사멸 방어 효과를 평가하였다. 이하 세포사멸 방어 효과에대한 평가는 실시예 5의 SRB 어세이법으로 수행하였다.

실험 결과, 겨우살이 추출물 1.6 중량%를 처리하였을 때 열 충격으로 인한 세포의 사멸을 막아 세포의 생존율을 증가시킴으로써 강력한 사멸방어 효과를 나타내었으며, 2.5 중량%의 죽순 추출물을 처리한 세포에서도 동일한 세포 사멸방어 효과를 나타내었다. 또한, 0.16 중량%의 글루쿠론산을 처리하였을 때에도 마찬가지의 사멸방어 효과를 나타내었다.

이상의 결과는 겨우살이 추출물과 죽순 추출물 및 글루쿠론산이 열 충격에 의해 야기될 수 있는 피부 세포의 사멸을 억제시키거나 세포를 회복시킴으로서 우수한 피부 보호작용이 있음을 나타낸다. 표 5는 시료의 열 충격(Heat shock) 스트레스 방어 효과를 나타내는 결과이다.

열충격(45℃)	0분	15분	30분	45분	60분	시료처리농도(중량%)
대조군	100%	44%	26%	0%	0%	무처리군(0)
겨우살이 추출물	100%	58%	38%	14%	10%	1.6
죽순 추출물	100%	64%	60%	24%	15%	2.5
글루쿠론산 분말	100%	55%	36%	13%	10%	0.16
버드나무 추출물	100%	45%	10%	0%	0%	0.025
아스코르빅산 분말	100%	48%	5%	0%	0%	0.005
토마토 추출물	100%	45%	15%	0%	0%	0.025

% : 세포 생존율

실시예 7: 과산화수소(H ₂ O ₂ )를 처리한 세포에 대한 사멸 방어 효과

본 실시예는 H₂O₂를 처리하여 유도되는 세포 사멸에 대한 겨우살이 추출물과 죽순 추출물, 글루쿠론산의 방어 효과를 평가한 것으로 활성산소종에 의한 세포내부 자극에 대한 세포 보호 및 회복효과를 평가한 것이다.

NIH3T3 세포를 65 mm 배양접시에 1.2 x 10⁶/ml의 농도로 5ml씩 분주하고 세포를 부착시킨 후 실시예 1 내지 3에서 얻어진 겨우살이 추출물과 죽순 추출물, 글루쿠론산을 세포에 사멸을 일으키지 않는 농도로 처리하고, 다시 과산화수소(H₂O₂) 0, 1.25, 2.5, 5.0, 10mM로 각각 처리한 후, 24시간 동안 정상조건 하에서 배양하면서 세포 회복을 평가하였다. 이하 세포 생존율 회복에 대한 평가는 실시예 5의 SRB 어세이법으로 수행하였다.

실험 결과, 겨우살이 추출물 1.6 중량%을 처리하였을 때 과산화수소(H₂O₂)로 처리된 세포의 사멸을 막아 세포의 생존율에 대한 회복 효과를 나타내었으며, 2.5 중량%의 죽순 추출물을 처리한 세포에서도 동일한 세포 회복 효과를 나타내었다. 또한, 0.16%의 글루쿠론산을 처리하였을 때에도 역시 우수한 세포 회복 효과를 나타내었다.

이와 같은 결과는 겨우살이 추출물과 죽순 추출물, 글루쿠론산이 피부에서 프리 라디칼 등의 활성산소종에 의한 세포막 산화 작용을 강력하게 억제함으로서 세포사멸에 대한 방어 효과가 우수하다는 것을 증명하는 것이다(표 6).

H2O2(mM)	0	1.25	2.5	5.0	10	시료처리농도(중량%)
대조군	100%	57%	32%	0%	0%	무처리군(0)
겨우살이 추출물	100%	72%	42%	18%	0%	1.6
죽순 추출물	100%	77%	48%	24%	0%	2.5
글루쿠론산 분말	100%	74%	40%	20%	0%	0.16
버드나무 추출물	100%	56%	10%	0%	0%	0.025
아스코르빅산 분말	100%	60%	5%	0%	0%	0.005
토마토 추출물	100%	45%	15%	0%	0%	0.025

% : 세포 생존율

실시예 8: 자외선(UVB)으로 스트레스 처리한 세포에 대한 사멸 방어 효과

실시예 1 내지 3에서 수득한 겨우살이 추출물, 죽순 추출물, 글루쿠론산의 자외선에 대한 광방어 효과와 자외선 스트레스로 야기되는 세포의 사멸 방어 및 회복 효과를 평가하기 위한 실험을 수행하였다.

본 실시예에 사용된 세포는 피부 표피층을 구성하고 있는 케라티노싸이트이다. 케라티노싸이트는 피부의 표피층을 구성하는 주 세포로 기저층(基底細胞)-유극층(有棘細胞)-과립층(顆粒細胞)각질층(角化細胞)으로 분화되면서 생체 체온유지, 피부면역, 항상성 유지 등의 중요한 기능을 하며 특히 자외선, 미생물, 환경오염물질등에 대한 방어작용을 수행한다. 또한 피부 미용학적으로 각질층의 원활한 분화과정(turnover)을 통하여 피부의 매끄러움과 탄력, 미백을 결정하는 인자로 자외선등에 지나치게 노출될 경우 광독성과 광노화를 유발하는 원인이 된다. 따라서 각질층의 자외선에 대한 방어 및 회복 효과는 피부 세포와 단백질의 변성을 막아 피부에 탄력을 부여함으로써 피부 노화를 지연시킬 수 있다.

본 실시예는 실시예 1 내지 3에 의해서 수득된 겨우살이 추출물과 죽순 추출물, 글루쿠론산의 자외선에 대한 방어효과 및 회복 효과를 평가한 실험으로 실험방법은 다음과 같이 수행하였다.

케라티노싸이트를 1x10⁶개의 농도로 24 웰 플레이트에 접종하고 24시간동안 안정화시킨 다음 겨우살이 추출물과 죽순 추출물, 글루쿠론산을 케라티노싸이트에 독성을 유발하지 않는 농도로 처리하고 6시간동안 안정시킨 다음 자외선 B를 20-30 mJ/cm으로 조사하고 24시간동안 배양시킨 후 세포 생존율을 평가하여 각각의 자외선 방어 효과를 평가하였다.

글루쿠론산과 겨우살이 추출물과 죽순 추출물의 자외선 스트레스에 의한 회복 효과는 다음과 같이 수행하였다. 케라티노싸이트를 1x10⁶개의 농도로 24 웰 플레이트에 접종하고 24시간동안 안정화시킨 다음 자외선 B를 20-30 mJ/cm으로 조사하고 겨우살이 추출물, 죽순 추출물, 글루쿠론산을 세포에 독성을 유발하지 않는 농도로 처리하고 24시간동안 배양한 다음 자외선을 조사한 후의 회복효과를 시료를 투여하지 않은 세포군의 생존율과 비교하여 자외선 스트레스에 의한 세포 회복효과를 평가하였다.

세포 생존율의 평가는 실시예 5에 기재된 SRB 어세이로 수행하였다.

실험 결과, 겨우살이 추출물, 죽순 추출물, 글루쿠론산을 각각 처리하고 자외선에 대한 방어 효과를 평가한 결과 유의할 만한 효과를 얻었으며, 자외선을 조사하고 겨우살이 추출물, 죽순 추출물, 글루쿠론산을 처리하여 자외선 스트레스로 인한 세포의 회복효과를 평가한 결과에서는 매우 우수한 결과를 얻었다.

이와 같은 실험의 결과는 겨우살이 추출물과 죽순 추출물이 피부 표피세포에 대한 회복효과가 우수하여 광노화 및 광독성에 대한 강한 저항력을 나타냄으로써 노화을 지연시키는 화장료에 혼용시 우수한 노화방지 기능을 나타낼 수 있을 것으로 판단된다.

구분	세포손상율(%)
자외선(UVB)조사	41.0
열충격(39℃)+ 자외선(UVB)조사	2.7
겨우살이 추출물+ 자외선(UVB)조사	3.3
죽순 추출물+ 자외선(UVB)조사	4.8
글루쿠론산 분말 0.16중량% + 자외선(UVB)조사	3.9

실시예 9: HSP70Kda 생성 유도 효과 평가 실험

본 실시예는 실시예 1 내지 3에 의해서 수득된 겨우살이 추출물, 죽순 추출물, 글루쿠론산 및 버드나무 추출물, 아스코르빅산 분말, 토마토 추출물을 독성을 유발하지 않는 농도로 처리하였을 때 열 충격 방어 단백질의 발현 유무를 평가하기 위하여 실시한 것이다.

NIH3T3 세포를 65 mm 배양접시에 1.2 x 10⁶/ml의 농도로 5 ml 씩 분주하고 세포를 부착시킨 후 겨우살이 추출물 1.6중량%, 죽순 추출물 2.5중량%, 버드나무 추출물 0.025중량%, 아스코르빅산 분말 0.005중량%, 토마토 추출물 0.025중량%를 각각 처리하고 45℃ 수욕조에 띄워 0, 15, 30, 45, 60분 동안 일정시간 가열한 후 바로 37℃로 온도를 내리고, 24시간 배양하는 동안 HSP70Kda의 발현을 SDS-PAGE (sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis)로 평가하였으며, 플로우 사이토미터를 이용하여 세포의 아폽토시스체(apoptotic body)를 DNA의 크기에 따라서 분석하였다.

SDS-PAGE는 Bio-Rad사의 미니프로테인 II(Miniprotein II)를 사용하였으며, Leammil(1970)의 방법을 변형하여 사용하였다. 적층용 젤(Stacking gel)은 분리용 젤(separating gel)의 아크릴 아미드의 농도에 구애받지 않고 4%로 만들어 사용하였다. 그 구성은 2.5ml의 적층용 젤 완충액(0.5M Tris-Cl, pH 6.8, 0.4% SDS) 6.17ml의 증류수, 1.33ml의 30% 아크릴아미드 용액(29.2% 아크릴아미드, 0.8% 비스아크릴아미드)이며, 30ml의 10% 암모늄 퍼설페이트(AP)와 10ml의 TEMED로 구성되어 있고 이를 잘 혼합한 후 상온에서 방치하면서 폴리머화(polymerization)시켜 사용하였다.

실험에 사용된 세포 1x10⁶개에 젤 시료 완충용액(62.5mM tris-HCl, pH 6.8 2.3% SDS, 10% 글리세롤, 5% β-머캡토에탄올) 150ml를 넣고 98℃에서 15분간 가열한 후 로우리 어세이(Lowry assay)로 단백질 정량하고 각 웰에 10mg의 단백질을 로딩하여 분석하였다. 전기이동 완충용액 내에서 35분동안 전개시킨 후 젤을 꺼내어 염색 완충액(staining buffer)에 1시간 이상 담가 염색한 후 단백질의 밴드가 보일 때 세척 완충액(destaining buffer)로 세척하였다.

SDS-PAGE 실시 후 엑스레이 필름에 오토래디오그래피(autoradiography)하여 각 시점에서의 단백질 합성 양상을 관찰하였다.

동시에 SDS-PAGE 상에서 분리된 단백질을 니트로셀룰로스 막(nitrocellulose membrane)에 블랏팅한 후 HSP70Kda에 대한 항체로 웨스턴 분석방법을 통하여 총 HSP70Kda 단백질을 확인하였다.

그 결과 겨우살이 추출물을 처리한 세포군에서 10시간동안 회복시켰을 때 HSP70Kda 단백질의 발현이 나타나기 시작하여 24시간 회복시켰을 때 최대로 합성되는 것이 확인되었다.

플로우 사이토미터 분석은 세포의 DNA에 삽입(intercalation)되는 형광물질인 요오드화 프로피디움(propidium iodide)을 세포에 처리한 후 각각의 세포를 한 개씩 떨어뜨리면서 단색광 레이저(monochrome laser)를 쏘아 세포로부터 나오는 형광을 측정하는 것이다. 이때 형광의 세기를 X축으로 세포수를 Y축으로 히스토그램을 그리면 아폽토시스가 일어난 세포와 정상의 세포를 구분할 수 있다.

플로우 사이토미터 분석은 다음과 같은 방법으로 수행하였다. 세포를 트립신으로 처리하여 수집하고 300 ml의 PBS로 풀어준 후 700ml의 에탄올을 첨가하여 4℃에서 24시간 동안 고정시켰다. 4000rpm으로 5분간 원심분리하여 세포를 수집한 후 150ml의 에탄올과 혼합한 뒤 형광물질인 요오드화 프로피디움 용액(0.04 mg/ml 요오드화 프로피디움, 17.2 unit/ml RNase A를 함유한 PBS) 1ml를 넣어 37℃에서 3시간 30분동안 배양시켰다. 배양후 4000rpm으로 5분간 원심분리하여 형광용액을 분리시키고 PBS로 희석한 후 플로우 사이토미터로 분석하였다.

SDS-PAGE 실험 결과 및 플로우 사이토미터 분석 결과 본 발명의 HSP 발현 촉진성분들인 겨우살이 추출물, 죽순 추출물, 글루쿠론산에 의하여 HSP70Kda 단백질의 발현과 함께 세포의 아폽토시스가 현저하게 감소하고 있음을 확인하였다.

죽순 추출물을 2.5중량% 처리한 세포군 및 글루쿠론산을 0.16중량% 처리한 세포군은 모두 3시간 회복시켰을 때부터 HSP70Kda 단백질이 서서히 합성되기 시작하여 24시간 회복시켰을 때 최대의 합성량을 나타내었다. 또한, 겨우살이 추출물을 1.6 중량% 처리한 세포군은 3시간 회복시켰을 때 HSP70Kda 단백질이 서서히 합성되기 시작하여 10시간 회복시켰을 때 최대의 합성량을 나타내었다.

또, 플로우 사이토미터 분석 결과 상기 본 발명의 HSP 발현 촉진성분들에 의한 Hsp70Kda 단백질의 발현과 함께 세포의 아폽토시스가 유의성 있게 감소하고 있음을 확인하였다.

이와 같은 결과는 겨우살이 추출물, 죽순 추출물, 글루쿠론산이 세포에서 HSP70Kda의 발현을 촉진시킴으로서 다음에 오는 스트레스에 의한 세포의 아폽토시스를 억제하여 세포 사멸에 의한 노화 촉진 작용을 효과적으로 억제할 수 있음을 시사하는 것이다.

시료	농도(중량%)	HSP발현
겨우살이 추출물	1.6	+++++
죽순 추출물	2.5	++++
글루쿠론산 분말	0.16	+++++
버드나무 추출물	0.025	+
아스코르빅산 분말	0.005	+
토마토 추출물	0.005	+

* +∼++: 약함, +++: 보통, ++++: 우수, +++++: 매우 우수

실시예 10: 자외선(UVB)에 의해 유도된 스트레스로부터 화장료 조성물에 의한 세포 회복 효과 평가 시험

본 실시예는 예시 1 내지 6과 같이 겨우살이 추출물, 죽순 추출물, 글루쿠론산을 혼용하여 사용하였을 경우와 일반 화장료 조성물 비교예 1, 2에 대하여 자외선에 의해 유발되는 광노화 억제 효과를 평가한 실험이다.

실시예 9와 동일한 방법으로 예시 1 내지 6의 화장료 조성물을 처리한 세포들은 SRB 어세이법에 의한 평가 결과, 39℃에서 열 충격후 자외선을 조사한 세포와 유사한 세포 손상 방어 결과가 나타났으며, 비교예 1, 2의 조성물로 처리한 세포에 비해 자외선(UVB) 조사시 세포 손상이 현저히 감소하였다.

결국, 하기 표 9 및 10의 결과로부터, 본 발명에 따라 화장료 조성물의 유효 성분으로 사용된 겨우살이 추출물, 죽순 추출물, 글루쿠론산이 자외선(UVB)에 의한 광독성 방어 효과 즉 광노화 억제 효과가 우수함을 확인할 수 있다.

시료	세포손상율(%)
비교예 1 + 자외선(UVB)조사	40.0
비교예 1 + 열충격(39℃) + 자외선(UVB)조사	4.2
예시 1 + 자외선(UVB)조사	6.9
예시 2 + 자외선(UVB)조사	9.0
예시 3 + 자외선(UVB)조사	6.0

시료	세포손상율(%)
비교예 2 + 자외선(UVB)조사	39.0
비교예 2 + 열충격(39℃)+ 자외선(UVB)조사	8.0
예시 4 + 자외선(UVB)조사	11.3
예시 5 + 자외선(UVB)조사	13.5
예시 6 + 자외선(UVB)조사	10.5

실시예 11: 자외선 방어 효과에 대한 상승 작용 평가 실험

본 실시예는 겨우살이 추출물, 죽순 추출물, 글루쿠론산을 함유한 예시 7 내지 9(표 3)의 일소방지크림(자외선 차단제품, SPF 28)과 상기 유효성분이 없는 일반 화장료 조성물 비교예 3에 대하여 자외선 차단지수의 상승 효과를 평가한 실험이다.

200 - 250g의 백색 기니픽 15마리를 제모기를 이용하여 등과 옆구리를 제모한 다음 한쪽 부위에는 수중유(W/O)형 에멀젼 타입의 일소방지 크림(비교예 3)을 도포하고 다른 한쪽에는 동일한 일소방지 크림에 겨우살이 추출물과 죽순 추출물을 각각 혼용한 제품(예시 5, 6)을 도포한 후 멀티포트 태양자외선 시뮬레이터 (Multiport solar UV simulator; Solar light CO, USA)를 이용하여 동일한 조건으로 자외선을 조사한 후 공시험 일소방지 크림 도포 부위와 겨우살이 추출물과 죽순 추출물을 각각 혼용한 일소방지 크림을 도포한 부위에 대한 최소 홍반양을 측정하여 일광차단지수(SPF 수치)에 대한 상승효과를 평가하였다.

평가 결과, 본 발명에 따라 화장료 조성물의 유효 성분으로 사용된 겨우살이 추출물, 죽순 추출물, 글루쿠론산을 자외선 차단제품(일소방지제품, SPF 제품)과 혼용하여 사용할 경우 자외선에 대한 차단효과를 각각 10%이상 상승시키는 것으로 밝혀졌다.

시료	일광차단지수(SPF)
비교예 3	28
예시 7	31
예시 8	31
예시 9	31

실시예 12: 노화 방지 및 주름 개선 화장료의 피부 미용 효과

예시 4 내지 6, 그리고 예시 4 내지 6에서 타 화장료 구성 성분은 동일하되 겨우살이 추출물, 죽순 추출물, 글루쿠론산 대신 일반적으로 피부 미용 효과가 널리 알려져 있는 천연 활성 성분을 함유하는 비교예 4(마늘 추출물 3%, 一丸製藥, 일본)와 비교예 5(인삼 추출물 3%, 바이오랜드, 한국)의 피부 미용 효과를 비교, 측정하기 위해 잘 훈련 받은 20 ∼ 40세 여성 패널 20명을 대상으로 1일 2회, 60일 동안 아침 및 저녁에 세안 후 안면에 골고루 사용하게 한 후 5점 평가법에 의해 피부 미용 효과를 평가하였다. 결과를 표 9에 나타내었다. 숫자가 높을수록 긍정적인 효과를 나타낸다.

	예시 4(겨우살이 추출물 3.0%)	예시 5(죽순 추출물 3.0%)	예시 6(글루쿠론산 분말 0.16%)	비교예 4(마늘 추출물 3.0%)	비교예 5(인삼 추출물 3.0%)
피부의 잔주름	4.1	3.8	4.5	3.7	3.0
피부의 매끄러움	4.0	3.8	4.0	3.0	2.8
피부의 보습감	3.2	3.2	3.0	3.3	3.7
만족도	4.1	3.8	4.0	3.4	3.3

상기 표 12의 결과로부터, 본 발명에 따른 화장료를 피부에 도포하여 사용했을 때 우수한 피부 미용 효과를 발휘함을 확인할 수 있었다.

상기와 같이, 본 발명의 겨우살이 추출물, 죽순 추출물, 글루쿠론산 등을 포함하는 열 충격 단백질 발현 촉진 성분은 피부 각질층을 구성하고 있는 케라티노싸이트에 대하여 자외선 등의 스트레스로부터 세포를 보호하고 세포의 기능을 회복시켜 주어 피부 세포의 노화 억제 기능이 우수하고, 피부 진피층을 구성하고 있는 섬유아세포에 대하여 생체 대사과정에서 생성되는 프리라디칼 등의 활성산소종에 의한 단백질의 변성, 막 지질의 산화 등으로 인한 세포 괴사를 억제하여 피부 노화를 지연시키며, 일소 방지 제품(SPF 제품)과 혼용하여 사용시 일광 차단 지수를 상승시키는 효과가 있다.

또한, 상기 본 발명의 겨우살이 추출물, 죽순 추출물, 글루쿠론산 등을 포함하는 열 충격 단백질 발현 촉진 성분을 포함하는 화장료 조성물은 피부의 매끄러움, 보습효과 및 만족도, 잔주름 개선효과가 현저하였다.

Claims (21)

1. 삭제
2. 열 충격, 활성산소종 또는 자외선 등의 생체 내·외 유해환경에 대한 스트레스로부터 생체를 보호하고 회복시키는 기능을 수행하는 열 충격 단백질(heat shock protein)의 발현 촉진 성분으로서 겨우살이 추출물, 죽순 추출물 또는 글루쿠론산을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
3. 제2항에 있어서, 상기 열 충격 단백질은 HSP70Kda 또는 HSC70Kda인 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
4. 삭제
5. 삭제
6. 삭제
7. 제2항에 있어서, 겨우살이 추출물은 추출 용매로서 정제수, 메탄올, 에탄올, 글리세린, 메틸아세테이트, 에틸아세테이트, 부틸렌글리콜, 프로필렌글리콜, 디에틸에테르, 디클로로메탄, 벤젠 및 헥산 중에서 선택된 1종 이상의 용매를 사용하여 추출한 것임을 특징으로 하는 화장료 조성물.
8. 제7항에 있어서, 추출물은 상온에서 냉침, 가열·여과하여 얻어진 액상물, 추가로 용매를 증발 또는 동결건조하여 얻은 추출물인 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
9. 제2항에 있어서, 죽순 추출물은 추출 용매로서 정제수, 메탄올, 에탄올, 글리세린, 메틸아세테이트, 에틸아세테이트, 부틸렌글리콜, 프로필렌글리콜, 디에틸에테르, 디클로로메탄, 벤젠 및 헥산 중에서 선택된 1종 이상의 용매를 사용하여 추출한 것임을 특징으로 하는 화장료 조성물.
10. 제9항에 있어서, 추출물은 상온에서 냉침, 가열·여과하여 얻어진 액상물, 추가로 용매를 증발 또는 동결건조하여 얻은 추출물인 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
11. 제2항에 있어서, 글루쿠론산은 천연물 유래 또는 합성에 의해 제조된 것임을 특징으로 하는 화장료 조성물.
12. 제2항, 제7항 내지 제11항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 화장료 조성물은 화장수, 젤, 수용성 리퀴드, 수중유(O/W)형 및 유중수(W/O)형의 제형 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
13. 삭제
14. 삭제
15. 삭제
16. 제2항, 제7항 또는 제8항에 있어서, 상기 겨우살이 추출물의 함량은 화장료 조성물 전체에 대하여 0.001 내지 50.0 중량%인 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
17. 삭제
18. 제2항, 제9항 또는 제10항에 있어서, 상기 죽순 추추물의 함량은 화장료 조성물 전체에 대하여 0.001 내지 50.0 중량%인 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
19. 삭제
20. 제2항 또는 제11항에 있어서, 상기 글루쿠론산의 함량은 화장료 조성물 전체에 대하여 0.001 내지 10.0 중량%인 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
21. 삭제