KR101634670B1

KR101634670B1 - 겨우살이의 발효된 추출물을 포함하는 항염증 또는 항알러지용 화장료 조성물

Info

Publication number: KR101634670B1
Application number: KR1020150105914A
Authority: KR
Inventors: 이구연; 이득찬; 박철선; 안세진; 유가은
Original assignee: 강원대학교산학협력단
Priority date: 2015-07-27
Filing date: 2015-07-27
Publication date: 2016-06-30

Abstract

본 발명은 겨우살이의 발효된 추출물을 포함하는 항염증 또는 항알러지용 화장료 조성물을 제공한다.
본 발명의 겨우살이의 발효된 추출물을 포함하는 조성물은 세포 독성이 없으면서 마크로파지 활성 억제 효과를 나타내고, 추출물 처리 농도에 비례하여 우수한 탈과립 억제 효과를 나타내어, 항염증 또는 항알러지용 화장료 조성물로서 유용하게 사용될 수 있다.

Description

겨우살이의 발효된 추출물을 포함하는 항염증 또는 항알러지용 화장료 조성물{Cosmetic composition comprising fermented extract of mistletoe for anti-inflammation or anti-allergy}

본 발명은 항염증 또는 항알러지용 화장료 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 겨우살이의 발효된 추출물을 포함하는 항염증 또는 항알러지용 화장료 조성물에 관한 것이다.

겨우살이(Mistletoe, Viscum album)는 다양한 나무를 숙주로 하여 생장하는 반기생 식물이며, 우리나라를 비롯한 동아시아 및 유럽에서 약용식물로 사용되어 왔다. 겨우살이에는 렉틴(lectin), 비스코톡신(viscotoxin), 플라보노이드(flavonoid), 트리테르펜(triterpene), 다당류(polysaccharide), 알칼로이드(alkaloid) 등의 성분이 함유되어 있으며, 이 중 렉틴은 우수한 항암인자로 알려져있다. 특히, 유럽지역에 서식하는 겨우살이는 항암 활성이 우수한 것으로 알려져 있어 항암치료제/보조제로서 상업적 시판되고 있으며, 우리나라에서는 한방에서 치통, 고혈압, 유산방지 및 요통 등에 대한 약재로 사용되고 있다.

겨우살이의 생리활성과 관련하여서는, 대한민국 공개특허 제2002-0053430호는 겨우살이 추출물의 항염증 및 항산화 활성을 보고한 바 있으며, 대한민국 공개특허 제2002-0080658호는 상기생 추출물의 미백 효과를 개시한 바 있으며, 선행논문지(임산에너지 19(1), 49-60(2000))는 겨우살이 메탄올 추출물의 항균 활성을 개시한 바 있으며, 또다른 선행논문지(한국식품과학회지 41(5), 560-565(2009))는 겨우살이 유산균 발효 추출물의 면역증강 효과를 개시한 바 있다.

한편, 유산균은 탄수화물의 최소 단위인 포도당(C₆H₁₂O₆)을 에너지원으로 하여 다량의 유기산(Lactic acid)과 천연 항생물질(Bacteriocin), 효소(Enzyme) 등을 생성하는 유익한 장내세균을 말한다. 유산균은 동물성 유산균과 식물성 유산균으로 분류되며, 우유 발효나 사람의 분변에서 동정 분리한 동물 유래의 유산균을 동물성 유산균이라고 통칭하며, 된장, 청국장 및 김치 등 식물 유래의 발효 과정에서 동정 분리된 유산균을 식물성 유산균으로 통칭한다. 식물성 유산균은 동물성 유산균에 비하여 온도나 pH에 대하여 안정하다는 특징이 있다.

유산균의 대사 산물인 유기산은 장내의 환경을 산성화하여 부패를 유발하는 유해균의 증식을 억제하고, 천연 항생물질인 박테리오신은 병원성 미생물을 사멸시키는 효능이 있는 것으로 알려져 있다. 또한, 소장 기관의 상피세포를 자극하여 면역물질인 IgA의 분비를 촉진하여 병원성 바이러스와 결합하여 몸 밖으로 배출하며, 숙변을 제거하여 장내에 쌓여 있는 각종 독성 물질을 제거한다.

생약이나 한방에서 사용하는 약재 등의 천연물에는 다양한 유효성분들이 포함되어 있으며, 대부분 플라보놀(flavonol) 골격에 당 구조가 결합되어 있는 형태로 존재한다. 천연물을 유산균이나 효모 등으로 발효시킨 경우에, 가수분해에 의하여 배당체의 당 구조가 분리되어 비배당체로 전환되며, 이러한 비배당체는 혈액 내로 보다 쉽게 흡수될 수 있다는 보고가 있다(동의생리병리학회지 22(3), 569~574(2008)).

그러나, 현재까지 충분한 수준의 항염증 효과 및 항알러지 효과를 가지는 천연물 유래 물질이 보고된 바 없다. 따라서, 기존의 항염증/항알러지 효과를 가지는 천연물의 항염증 효과 및 항알러지 효과 등의 생리적 효능을 증가시켜 우수한 항염증/항알러지 효과를 가지는 천연물 소재의 개발이 요구된다.

대한민국 특허공개공보 제2002-0053430호 대한민국 특허공개공보 제2002-0080658호 대한민국 특허등록공보 제10-1301546호 대한민국 특허공개공보 제2013-0023324호 대한민국 특허공개공보 제2004-0052655호 대한민국 특허공개공보 제2003-0005719호

임산에너지 19(1), 49-60(2000) 한국식품과학회지 41(5), 560-565(2009)

본 발명자들은 피부 항염증 및 항알러지 활성이 우수한 천연소재에 대하여 연구하던 중, 겨우살이 추출물, 특히, 한국산 겨우살이 추출물을 유산균, 특히, 특허받은 식물성 유산균인 페디오코쿠스 아시딜락티시 J9으로 발효시키는 경우에, 발효되지 않은 겨우살이 추출물보다 항염증 효과 및 항알러지 효과가 현저히 증가된다는 것을 확인함으로써, 겨우살이의 발효된 추출물이 항염증 또는 항알러지용 화장료 조성물에 유용하게 사용될 수 있다는 것을 발견하였다.

따라서, 본 발명은 겨우살이의 발효된 추출물을 포함하는 항염증 또는 항알러지용 화장료 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명에서는 겨우살이의 발효된 추출물을 포함하는 항염증 또는 항알러지용 화장료 조성물이 제공된다. 일 구현예에서, 상기 겨우살이는 한국산 겨우살이(Viscum album L. var. coloratum)일 수 있다.

일 구현예에서, 상기 발효는 식물성 유산균에 의한 발효일 수 있으며, 페디오코쿠스 아시딜락티시 J9 균주에 의한 발효일 수 있으며, 12 ∼ 22 시간 및 25 ∼ 40 ℃ 온도 조건에서 수행될 수 있다.

본 발명의 일 태양에 따라, 상기 항염증 또는 항알러지용 화장료 조성물을 포함하는 화장품이 제공된다. 일 구현예에서, 상기 화장품은 스킨, 미스트, 마스크팩 또는 영양크림일 수 있다.

본 발명에 의해, 겨우살이 추출물, 특히, 한국산 겨우살이 추출물을 유산균, 특히, 식물성 유산균으로 발효시키는 경우에, 세포 독성이 현저히 감소하면 마크로파지 활성 억제 효과를 나타내는 것으로 확인되었고, 발효 추출물 처리 농도에 비례하여 우수한 탈과립 억제 효과를 나타내는 것이 확인되어, 항염증 및 항알러지 활성을 나타내는 화장료 조성물로 사용하기에 적합한 것으로 밝혀졌다.

따라서, 본 발명의 겨우살이의 발효된 추출물을 포함하는 조성물은 항염증 또는 항알러지용 화장료 조성물로서 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 페디오코쿠스 아시딜락티시 J9 균주의 배양 시간에 따른 성장 곡선이다.
도 2는 페디오코쿠스 아시딜락티시 J9 균주의 배양 온도에 따른 배양액의 O.D_660nm 값을 나타내는 그래프이다.
도 3은 발효 시간에 따른 겨우살이 추출물의 이화학적 변화를 나타낸 그래프이다.
도 4는 겨우살이의 미발효 추출물과 발효 추출물의 마크로파지 세포에서의 생존율 측정(MTT assay) 결과를 나타낸 그래프이다.
도 5는 겨우살이의 미발효 추출물과 발효 추출물의 마크로파지 활성 억제 측정 결과를 나타낸 그래프이다.
도 6은 겨우살이의 미발효 추출물과 발효 추출물의 비만 세포에서의 생존율 측정 결과를 나타낸 그래프이다.
도 7은 겨우살이의 미발효 추출물과 발효 추출물의 비만 세포 활성 억제 측정 결과를 나타낸 그래프이다.

본 발명은 겨우살이의 발효된 추출물을 포함하는 항염증 또는 항알러지용 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 구현예에서, 상기 겨우살이는 한국산 겨우살이(Viscum album L. var. coloratum)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 한국산 겨우살이에는 다양한 종류의 아미노산으로 구성된 염기성 단백 복합 물질들이 존재하며, 이 중 항암활성의 주된 성분인 렉틴이나, 올레아놀릭산(Oleanolic acid), 비스코톡신(Viscotoxin), 호모플라보야도리닌 B(Homoflavoyadorinin B), 비스쿰네오시드 Ⅲ(Viscumneoside Ⅲ) 등의 활성물질들이 함유되어 있는 것으로 알려져 있다.

일 구현예에서, 상기 발효는 식물성 유산균에 의한 발효일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 예를 들어, 본 발명에서 수행되는 발효는 식물성 유산균인 페디오코쿠스 아시딜락티시 J9(Pediococcus acidilactici J9) 균주에 의해 수행될 수 있다. 페디오코쿠스 아시딜락티시 J9 균주는 대한민국 등록특허공보 제10-1296067호에 개시된 식물성 유산균 균주로서, 전통 청국장으로부터 내열성이 우수한 유산균으로 선발된 균주이다(한국미생물보존센터 수탁번호 KCCM-11320P).

일 구현예에서, 상기 발효는 12 ∼ 22 시간, 바람직하게는 15 ∼ 20시간, 더욱 바람직하게는 17 시간 동안 수행될 수 있다. 상기 페디오코쿠스 아시딜락티시 J9 균주를 상기 시간 범위내에서 배양하는 경우에 높은 O.D_660nm 값을 나타내므로, 발효에 의하여 항염증 또는 항알러지 효과를 바람직하게 상승시킬 수 있다(도 1 참조).

일 구현예에서, 상기 발효는 25 ∼ 40 ℃ 온도, 바람직하게는 30 ∼ 40 ℃, 더욱 바람직하게는 37 ℃ 온도 조건에서 수행될 수 있다. 상기 페디오코쿠스 아시딜락티시 J9 균주를 상기 온도 범위내에서 배양하는 경우에 높은 O.D_660nm 값을 나타내므로, 발효에 의하여 항염증 또는 항알러지 효과를 바람직하게 상승시킬 수 있다(도 2 참조).

본 발명에서는 겨우살이 발효 추출물의 항염증 효과를 평가하기 위하여 마크로파지 활성 억제 효과를 측정하였다.

마크로파지(macrophage)는 선천면역에 관여하는 면역세포 중 한 종류로서, 식세포 작용을 통해 병원체 및 세포 파편 등을 섭취하여 소화시킨 후, 적응면역세포에 항원을 제시하는 기능을 한다. 이 과정을 통해 T 헬퍼세포(T helper cell)가 활성화되어 B 세포(B cell) 활성화를 통한 항체 생산, 기억세포의 형성과 같은 강력한 면역반응이 이루어진다. 마크로파지는 미생물을 비롯한 외래 물질을 인식, 포식하면 이를 분해하기 위하여 식포(phagosome)를 형성한 다음 리소좀(lysosome)을 형성한다. 이 과정에서 여러 가지 효소나 독성 과산화물(reactive oxygen species, ROS) 및 해당 조직으로 여러 면역세포들을 불러들이는 물질 등이 분비되어 외래 물질을 분해시킨다.

NO(nitric oxide)는 활성화된 마크로파지가 분비하는 물질 중 하나로서, 혈관 내피세포에 작용하여 내피세포를 둘러싼 평활근의 이완을 야기한다. 혈관의 이완을 통해 혈액 속 면역세포들이 보다 원활히 감염된 조직으로 침투할 수 있도록 하는 것이 NO의 역할이다. 그러나, 마크로파지의 과도한 면역작용은 염증을 심화시키고 통증을 일으키는 등 좋지 않은 영향을 가져온다. 따라서, 마크로파지가 분비하는 NO 생성량을 통하여, 마크로파지의 염증반응에 대한 효과를 알 수 있으며, 이에 대한 억제 효과를 측정함으로써 염증 억제 여부를 측정하는 지표로 사용하고 있다.

또한, 본 발명에서는 겨우살이의 발효 추출물의 항알러지 효과를 측정하기 위하여 비만 세포 활성 억제 효과를 측정하였다.

비만세포(Mast cell)는 활성화되면 과민 반응(알러지)을 일으키고, 이러한 과민 반응은 아토피, 천식과 같은 질병을 유발한다. 비만세포는 세포 내 수많은 과립(granule)을 보유하고 있으며, 그 과립은 히스타민, TNF-α와 같은 다수의 염증성 물질을 포함하고 있다. 비만세포가 활성화되면 이러한 과립들이 세포막과 융합되고, 과립 속 물질들이 세포 외부로 분비되어 과민성 염증 반응이 유발된다. 이러한 과정을 탈과립(degranulation)이라고 한다. β-헥소사미니다아제(β-hexosaminidase)는 비만세포의 탈과립이 일어날 때 히스타민과 동시에 분비되는 물질로, 비만세포의 탈과립 정도를 알아볼 수 있는 지표로 널리 활용되고 있다.

본 발명의 겨우살이의 발효된 추출물의, 항염증 효능 측정 시험인 마크로파지의 NO 생성량에 대한 영향을 측정한 결과, 겨우살이의 발효 추출물은 세포 독성이 없으면서 마크로파지 활성 억제 효과를 나타내어(도 4 및 5 참조), 항염증용 조성물로 사용하기에 적합한 것으로 확인되었다. 또한, 본 발명의 겨우살이의 발효된 추출물의, 비만 세포의 탈과립 활성에 대한 영향을 측정한 결과, 겨우살이의 미발효 추출물은 탈과립 억제 효과가 거의 없는 것에 반하여, 발효 추출물은 세포 독성이 없으면서 추출물 처리 농도에 비례하여 우수한 탈과립 억제 효과를 나타내어(도 6 및 7 참조), 항알러지 효능이 우수한 것을 확인하였다.

또한, 본 발명은 상기 항염증 또는 항알러지용 화장료 조성물을 포함하는 화장품을 제공한다.

본 발명의 항염증 또는 항알러지용 화장료 조성물은 기초 화장품, 메이크업 화장품 및 바디케어 화장품에 사용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

기초 화장품이란, 세안료·메이크업 리무버·화장수·유액·미용액·페이스 크림·팩·아이케어 및 그 외 얼굴 스킨 케어용 화장품을 가리킨다. 예를 들면, 고형 비누, 세안 폼, 및 세안 파우더 등의 세안료; 클렌징 폼, 클렌징 크림, 클렌징 밀크, 클렌징 로션, 클렌징 젤, 클렌징 오일 및 클렌징 마스크 등의 메이크업 리무버; 리포솜 화장수, 유연 화장수, 수렴 화장수, 세정용 화장수 및 다층식 화장수 등의 화장수; 에몰리언트 로션, 모이스처 로션, 밀키 로션, 너리싱 로션, 너리싱 밀크, 스킨 모이스처, 모이스처 에멀젼, 마사지 로션 및 얼굴용 각질 스무저 등의 유액; 리포솜 화장수, 보습 미용액, 항알러지 미용액, 및 자외선 방지 미용액 등의 미용액; 에몰리언트 크림, 영양 크림, 모이스처 크림, 나이트 크림, 마사지 크림, 클렌징 크림, 메이크업 크림, 베이스 크림, 셰이빙 크림, 및 얼굴용 각질연화 크림 등의 크림; 필오프팩, 분말팩, 워싱팩, 오일팩, 및 클렌징 마스크 등의 팩; 아이세럼, 아이젤, 아이크림 등의 아이케어; 얼굴용 UV 프로텍트 에멀전, 선프로텍트, 선프로텍터, UV케어밀크, 선스크린, 선스크린 크림 및 선탠 크림 등의 UV 케어, 모이스처 젤 등의 젤, 페이스 필링, 페이스 슬리밍제 등의 그 외의 기초 화장품을 들 수 있다.

메이크업 화장품으로서는, 메이크업 베이스, 베이스 크림, 컬러 컨트롤 베이스, UV 차단 베이스 등의 화장 기초; 파우더 컨실러 및 크림·리퀴드 컨실러 등의 컨실러; 파우더 파운데이션, UV 차단 파운데이션, 크림 파운데이션, UV 차단 크림 파운데이션 등의 파운데이션; 루스파우더, 프레스토파우더, 페이스컬러, 백분 등의 페이스파우더 등을 들 수 있다.

바디케어 화장품으로서는, 예를 들면, 바디로션, 바디오일 및 바디미스트 등의 바디로션; 바디크림, 바디밀크, 바디젤 및 바디무스 등의 바디크림; 보습용 립 크림, UV케어용 립 크림 및 컬러 립크림 등의 립크림; 핸드크림 및 핸드젤 등의 핸드크림; 바디용의 UV프로텍트에멀전, 선프로텍트, 선프로텍터, UV케어밀크, 선스크린, 선스크린 크림 및 선탠크림 등의 UV케어; 제모크림, 제모무스, 탈모왁스, 잔털 탈색제 및 체모용 셰이빙크림 등의 잔털처리; 풋마사지제, 풋슬리밍제, 풋필링제, 발뒤꿈치 등의 얼굴 이외의 각질제거제, 및 에몰리언트제 등의 풋케어; 데오도란트 로션, 데오도란트 파우더, 데오도란트 스프레이, 데오도란트 스틱 등의 제한방취제; 제충 스프레이 등의 인섹트 리펠러를 들 수 있다.

일 구현예에서, 상기 화장품은 바람직하게는 스킨, 미스트, 마스크팩 또는 영양크림일 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예 및 시험예를 통하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나, 하기 실시예 및 시험예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이에 제한되는 것은 아니다.

실시예 . 겨우살이 발효 추출물의 제조

(1) 식물성 유산균의 최적 배양 시간 결정 시험

겨우살이 추출물의 발효를 위한 종균(Seed)을 배양하기 위하여, 페디오코쿠스 아시딜락티시 J9(Pediococcus acidilactici J9) 균주를 배양하면서 정해진 시간에 탁도를 측정하여 성장곡선(growth curve)을 얻었다. 분광광도계(Spectrometer, BioTek instruments Inc, USA)를 이용하여 시간대별로 O.D_660nm(Optical Density) 값을 측정하여 그 결과를 하기 표 1 및 도 1에 나타내었다.

시간 (hour)	O.D ( 660 nm )
0	0.1
2	0.2
4	0.3
6	0.5
8	0.6
10	1.3
14	2.4
16	3.0
18	2.8
20	2.5
22	2.4
24	2.2

표 1 및 도 1에 나타난 바와 같이, 0 ∼ 6시간은 유도기(Lag Phase), 6 ∼ 12시간은 대수기(Exponential Phase), 12 ∼ 16시간은 사멸기(ine Phase), 12 ∼ 20시간은 정지기(Stationary Phase), 20 ∼ 48시간은 용해기(Lysis Phase)로 나타났다. 상기 성장곡선으로부터 배양 조건으로서 17시간이 최적임을 결정하였다.

(2) 식물성 유산균의 최적 배양 온도 결정 시험

페디오코쿠스 아시딜락티시 J9 균주를 다양한 온도 조건에서 배양하면서 17시간 배양한 후 O.D_660nm 값을 측정하여 그 결과를 하기 표 2 및 도 2에 나타내었다.

온도 ( ℃ )	20	25	37	45
O.D ( 660 nm )	0.1	2.6	3.4	2.1

표 2 및 도 2에 나타난 바와 같이, 37 ℃가 최적의 배양 온도임을 확인하였다.

(3) 겨우살이 추출물의 유산균 접종에 의한 이화학적 변화 평가

유산균의 접종 농도를 1%와 2%로 달리하여 접종한 결과 유의성있는 차이가 없음을 확인하여 1%를 접종농도로 정하였다.

(4) 겨우살이 추출물의 발효 조건 결정

겨우살이 추출물에 유산균을 접종하여 발효시키면서 정해진 시간(0, 1, 2 및 3일)에 발효액 일정량을 채취하였다. 채취한 시료를 생리식염수에 10진 희석법으로 희석하여 BCP 첨가 평판측정용 배지(BCP PLATE COUNT AGAR, Japan)에서 37 ℃, 24시간 배양하였으며, 이 때 생성된 콜로니(colony)를 계수하여 시료 g당 콜로니 형성 단위(lony forming unit. CFU/g)로 나타내었다. 또한, 발효 시간에 따른 pH 변화를 pH 미터(pH meter, Eutech pH 510 Instruments, Singapore)를 사용하여 측정하였다. 발효 시간에 따른 콜로니 형성 단위 및 pH 변화를 하기 표 3 및 도 3에 나타내었다.

발효 시간 (일)	0	1	2	3
콜로니 형성 단위 (Log CFU /g)	8.17	7.56	6.54	6.23
pH	6.5	3.9	3.9	3.9
Brix	0.8	0.8	0.8	0.8

표 3 및 도 3에 나타난 바와 같이, 겨우살이 추출물의 발효는 37 ℃에서 2일간 배양하여 사용하는 것이 가장 효과적임을 알 수 있다.

(5) 발효된 겨우살이 추출물의 제조

최적화된 조건인 37 ℃에서 2일 동안 발효시킨 겨우살이 발효 추출물을 효능 시험에 사용하기 위하여 동결 건조하여 보관하였다.

시험예 1. 겨우살이 발효 추출물의 항염증 효과 평가

제조된 겨우살이 발효 추출물의, 유산균 발효에 의한 항염증 효능의 증가 여부를 확인하기 위해서 세포 생존율 및 마크로파지 활성 억제 효과를 측정하였다.

(1) 세포 생존율 측정( MTT assay)

겨우살이 발효 추출물의 해당 세포에서의 독성 여부를 확인하기 위하여, 겨우살이의 미발효 추출물과 발효 추출물에 대하여 세포 생존율 측정 시험(MTT assay)을 하기와 같이 수행하였다.

24웰 플레이트에 5×10⁴ cell/ml의 세포(Raw264.7 cell line)를 분주하고 24 시간 동안 배양한 후, 배양한 세포에 0.1, 0.2, 0.5 및 1 mg/mL의 농도로 각 추출물을 처리하고 24 시간 동안 배양하였다. 그 후, 배양된 세포에 MTT용액(Thiazol blue Tetrazolium Bromide)을 1/10로 희석하여 넣은 후, 37 ℃ CO₂ 인큐베이터에서 4 시간 동안 반응시킨 다음, 배지를 제거하였다. 그 후, DMSO 250 ㎕를 넣고 피펫팅(pipetting)하여, 용액 50 ㎕를 96웰 플레이트에 옮긴 다음, 550 nm에서 흡광도를 측정하였다. 측정된 결과를 도 4에 나타내었다.

도 4에 나타난 바와 같이, 겨우살이의 미발효 추출물은 0.5 mg/mL 농도부터 매우 높은 세포 독성을 나타낸 반면에, 유산균 발효 추출물은 1 mg/mL 농도까지 세포 독성을 나타내지 않아, 발효에 의해 세포 독성이 현저히 감소한 것을 확인하였다.

(2) 마크로파지 활성 억제(NO 생성 억제) 측정

항염증 효과를 측정하는 방법으로 마크로파지 활성 억제 시험을 하기와 같이 수행하였다.

24 웰 플레이트에 5×10⁴ cell/ml의 세포(Raw264.7 cell line)를 분주하고 24 시간 동안 배양한 후, 배양한 세포에 각 추출물을 0.1, 0.2, 0.5 및 1 mg/ml의 농도로 1 시간 동안 처리한 후, LPS(lipopolysaccharide)를 1 μg/ml 넣고 24 시간 동안 배양하였다. 플레이트를 흔들어 교반한 후, 상등액 100 ㎕를 새로운 플레이트에 옮긴 다음, 그리스 시약(Griess reagent) 100 ㎕를 넣고 37 ℃에서 15분간 반응시켰다. 540 nm에서 흡광도를 측정하여, 그 결과를 도 5에 나타내었다.

도 5에 나타난 바와 같이, 겨우살이의 미발효 추출물은 높은 마크로파지 활성 억제 효과를 보였으나, 이는 상기 측정된 세포 생존율 시험 결과를 고려할 때, 세포 독성에 의한 결과로 판단되었다. 겨우살이의 발효 추출물은 1 mg/ml 농도에서 마크로파지 활성 억제 효과를 나타냈다. 세포 생존율 시험 결과 및 마크로파지 활성 억제 시험을 종합하여 보면, 세포 독성이 없으면서 마크로파지 활성 억제 효과를 나타내는 겨우살이의 미발효 추출물이 항염증용 조성물로 사용하기에 적합한 것으로 확인되었다.

시험예 2. 겨우살이 발효 추출물의 효소를 이용한 항알러지 효과 평가

겨우살이 추출물을 식물성 유산균인 페디오코쿠스 아시딜락티시 J9로 발효시키면 추출물의 항알러지 효능이 증가되는지 확인하기 위하여, 비만세포에서의 탈과립 억제 활성을 하기와 같은 방법으로 측정하였다.

(1) 세포 생존율 측정(MTT assay)

겨우살이 발효 추출물의 해당 세포에서의 독성 여부를 확인하기 위하여, 겨우살이의 미발효 추출물과 발효 추출물에 대하여 세포 생존율 측정 시험을 하기와 같이 수행하였다.

24웰 플레이트에 5×10⁵ cell/ml의 세포(Mast cell, RBL-2H3 cell line)를 분주하고 24 시간 동안 배양한 후, 배양한 세포에 각 추출물을 0.1, 0.2, 0.5 및 1 mg/mL의 농도로 1 시간 동안 처리하였다. 그 후, 배양된 세포에 MTT용액(Thiazol blue Tetrazolium Bromide)을 1/10로 희석하여 넣은 후, 37 ℃ CO₂ 인큐베이터에서 4 시간 동안 반응시킨 다음, 배지를 제거하였다. 그 후, DMSO 250 ㎕를 넣고 피펫팅하여, 용액 50 ㎕를 96웰 플레이트에 옮긴 다음, 550 nm에서 흡광도를 측정하였다. 측정된 결과를 도 6에 나타내었다.

도 6에 나타난 바와 같이, 상대적으로 겨우살이의 유산균 발효 추출물의 세포 생존율이 미발효 추출물의 경우보다 높게 나타나 세포독성이 없는 것으로 나타났다.

(2) 탈과립 억제 효과(β- hexosaminidase release assay) 측정

항알러지 효과를 측정하는 방법으로 탈과립 억제 시험을 하기와 같이 수행하였다.

24 웰 플레이트에 2×10⁵ cell/ml의 세포를 분주하고 24 시간 동안 배양한 후, 시라가니언 완충액(Siraganian buffer)으로 2번 세척하였다. 여기에 시라가니언 완충액 990 ㎕와, 0.1, 0.2, 0.5 및 1 mg/ml의 농도로 맞춘 각 추출물 10 ㎕를 첨가하여 1 시간 동안 처리한 후, 다시 2회 세척하였다. 시라가니언 완충액 980 ㎕, PMA(phorbol 12-myristate 13-acetate, 50 nM) 10 ㎕, A23187(Ca² ⁺ ionophore, 1 μM) 10 ㎕를 첨가하여 37 ℃에서 30분간 반응시킨 후, 상층액 20 ㎕를 96 웰 플레이트로 옮겨, 기질 완충액(Substrate buffer) 80 ㎕를 처리하여 37 ℃에서 30분 동안 반응시켰다. 정지액(Stop solution) 200 ㎕ 넣고 405 nm에서 흡광도를 측정하여, 그 결과를 도 7에 나타내었다.

도 7에 나타난 바와 같이, 겨우살이의 미발효 추출물은 탈과립 억제 효과가 거의 없는 것에 반하여, 유산균 발효 추출물은 추출물 처리 농도에 비례하여 우수한 탈과립 억제 효과를 나타내어, 항알러지 효능이 우수한 것을 확인하였다.

Claims

페디오코쿠스 아시딜락티시 J9 균주에 의해 발효된 겨우살이의 추출물을 포함하는 항알러지용 화장료 조성물.
제1항에 있어서, 상기 겨우살이가 한국산 겨우살이(Viscum album L. var. coloratum)인 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
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제1항에 있어서, 상기 발효가 12 ∼ 22 시간 및 25 ∼ 40 ℃ 온도 조건에서 수행되는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
제1항, 제2항 및 제5항 중 어느 한 항의 화장료 조성물을 포함하는 화장품.
제6항에 있어서, 스킨, 미스트, 마스크팩 및 영양크림으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 화장품.