KR100285870B1 - 도코사헥사엔산을 포함하는 식용 가능한 단세포 오일 및 이의 제조방법 - Google Patents

도코사헥사엔산을 포함하는 식용 가능한 단세포 오일 및 이의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 도코사헥사에노산(DHA)을 함유하는 식용 가능한 단세포 오일을 제조하는 방법, 오일, 및 오일의 용도에 관한 것이다. 크립테코디늄 코니(Crypthecodinium Cohnii)와 같은 해수 미생물을 발효기에서 배양하여 단세포 오일을 생성하도록 유도한 다음, 용매로 추출하여 회수한다.

Description

[발명의 명칭]
도코사헥사엔산을 포함하는 식용 가능한 단세포 오일 및 이의 제조방법
[발명의 상세한 설명]
본 발명은 도코사헥사엔산(DHA)을 함유하는 식용 가능한 단세포 오일(edible single cell oil)에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 DHA를 함유하는 오일을 상업적으로 실용적인 수율로 제조하는 방법 및 이러한 오일을 함유하는 제품에 관한 것이다.
DHA는 오메가-3-지방산이며, 뇌의 회백질 중에서 가장 풍부한 장쇄 다중 불포화 지방산(PUFA)이다. 일반적으로, 오메가-3-지방산은 관상동맥 심장병의 발생을 감소시키는데 유리하다고 공지되어 있다[참조: Lands. Fish and Human Health(1986) Academic Press]. 그러나, 오메가-3-지방산의 대사는 잘 알려져 있지 않다. 따라서, 정확한 임상적 투여량 및 효능은 미지로 남아있다.
한류 해수 어류는, DHA를 포함하는 오메가-3-지방산의 공지된 공급원이다. 미합중국 특허 제4,670,285호는 C22오메가-3-지방산의 공급원으로서 청어(menhaden 및 herring)와 같은 어류로부터 어유(fish oil)의 용도에 관해 기술하고 있다. 결국, 어유는 오메가-3-지방산의 1차 상업적 공급원이다. 그러나, 종종 어유는 PCB와 같은 환경 오염물질로 오염되기 때문에 사람이 소비하기에는 바람직하지 않다.
또한, 식품에 사용하기 위한 DHA를 함유하는 어유의 회수와 관련하여 여러 문제점들이 존재한다. 이러한 오일은 종종 지방산의 산화 생성물과 관련된 비린내(fishy odor) 및 불쾌한 맛을 갖는다. 이러한 맛과 과산화물의 독성이 상기 오일을 유아식(baby food) 및 유아용 조제 분유(infant formula)와 같은 식용 가능한 조성물에 사용하기에 만족스럽지 않게 한다.
또한, 해수 미생물은 DHA를 함유하는 것으로 공지되어 있다. 특히, 다양한 와편모충류 종(dinoflagellate species)이 DHA를 함유한다고 공지되어 있다. 문헌[참조: Harrington et al., "The Polyunsaturated Fatty Acids of Marine Dinoflagellates" J. Protozoal, 17: 213-219 (1970)]은 8개의 광합성 해수 와편모충류 및 1개의 종속 영양요구성 해수 와편모충류의 지방산 함유물을 특징지었고, 상기 와편모충류가 도코사헥사엔산의 1차 생산자 그룹이며, 상기 화합물의 상당량이 바다 먹이 사슬에 기여한다고 결론지었다.
DHA를 함유하는 식용 가능한 오일을 생성하는 와편모충류의 성공적 배양은 아직 달성되지 않았다. 일반적으로 와편모충류는 매우 느리게 증식하고 전단 민감성(shear sensitive)이다[참조: Guillard et al., Dinoflagellates, (1984) Academic Press]. 선행 기술은 배양 용기 중에서의 소량의 교반 조차도 배양물의 증식을 저하시킨다고 기술하고 있다. 그러나, 이러한 교반은 적당한 산소 첨가반응을 달성시켜 상업적 제조를 위한 증식을 최대화하기 위해 필요하다.
DHA는 유아의 적당한 두뇌 및 시력 발달에 필수적이라고 생각되는데, 왜냐하면 상기한 바와 같이 DHA는 뇌 및 망막에서 가장 풍부한 장쇄 PUFA이기 때문이다. 리놀렌산 식이로부터의 DHA의 생합성을 위한 대사 경로가 포유동물에 존재함에도 불구하고, 상기 경로는 생체 에너지학적으로 바람직하지 않고[참조: Crawford, P. AOCS, Short Course in Polyunsaturated Fatty Acids and Eicosanoids, pp. 270-295(1987)], 어류와 같은 포유동물은 식품 공급원으로부터 그들의 대부분의 DHA를 획득하는 것으로 생각된다. 유아의 경우에, 가장 유망한 공급원은 모유일 것이다. 결국, DHA는 모유 중 가장 풍부한 C20오메가-3 PUFA이다. 그러나, 일반적으로 DHA는 유아용 조제 분유에 부재한다. 미합중국 특허 제4,670,285호는 오메가-3-지방산을 함유하는 유아용 조제 분유를 기술하고 있다. 그러나, 여기에서 사용된 산은 란(egg)또는 어(Talapia)유로부터 수득된 것이고, 상기에서 기술된 불쾌한 특성에 연관되어 있다. 더우기, 어유는 일반적으로 또다른 오메가-3-지방산인 에이코사펜타엔산(EPA)을 함유하는데 이것은 지연된 항응고 효과 및 유아에서의 아라키돈산 수준의 억압때문에 유아용 조제 분유에서 바람직하지 않은 성분이다. EPA는 유아 체중 증량의 감소율과 상호관련 있다[참조: Carleson et al., INFORM 1:306]. 사실상, EPA 수준은 모유에서 매우 낮다(DHA 수준의 1/4 미만).
따라서, 본 발명의 목적은 DHA를 함유하는 식용 가능한 단세포 오일을 제공하는 것이다. 바람직하게는, 이러한 오일은 기타 다중 불포화 지방산(PUFA)을 상당량 함유하지 않는다. 즉, 총 지방산 함유량의 약 2%를 초과하는 양으로 함유하지 않는다. 일반적으로, 본 발명의 목적은 상업적으로 실용적인 수율로 단세포 오일을 제조하는 것이다. "디자이너(designer)" 오일로서 특징화된 본원의 오일은 추출후 유아용 조제 분유, 유아식, 식이 보충물 및 약제에 사용될 수 있다.
또한, 오메가-3-지방산의 대사 경로에 대한 추가의 지식을 얻는 것이 바람직할 것이다. 동위원소로 표지된 DHA가 이러한 관점에서 매우 유용할 것이다. 그러나, 최근까지 풍부한 양의 동위원소로 표지된 DHA를 제조하는 방법은 공지되어 있지 않았다. 따라서, 이러한 연구를 수행하기 위해 충분한 양의 동위원소로 표지된 DHA를 제공하는 것이 또한 본 발명의 목적이다.
[발명의 요약]
본 발명은 미생물, 특히 와편모충류의 발효기에서의 배양, 고비율의 DHA를 함유하는 단세포 오일을 상당량 제조하기 위한 상기 미생물의 유도 및 상기 오일의 회수에 관한 것이다. 본원에서 사용된 "단세포 오일"이란 단세포(unicellular) 유기체의 지질 생성물을 의미한다. 또한, 본 발명은 약 20중량% 이상의 DHA를 함유하는 단세포 오일을 향상된 양으로 제조할 수 있는 돌연변이 유기체를 포함하며 DHA를 함유하는 단세포 오일을 포함한다.
본 발명은 향상된 수준의 DHA를 함유하는 식용 가능한 오일을 수득하는 경제적인 방법을 제공하는 것이다. 추가로, 상기 방법은 상승된 세포 밀도로 와편모충류의 상업적 배양을 허용한다.
본 발명의 방법에 의해 제조된 식용 가능한 오일은 불쾌한 맛 및 비린내가 적고 또한 통상적 공급원으로부터의 DHA-함유 오일에서 종종 발견되는 환경 오염물질이 없다. 따라서, 본 발명은 추가로 본 발명의 오일을 함유하는 식품을 포함한다.
[도면의 간단한 설명]
제1도, 제2도 및 제3도는 다양한 영양물질의 첨가에 따른 시간 경과에 대한 크립테코디늄 코니(Crypthecodinium cohnii) 바이오매쓰 축적량을 그래프로 나타낸 것이다.
[발명을 실시하는데 있어서의 최상의 양태의 상세한 설명]
본 발명에 따라, DHA를 함유하는 단세포 오일을 제조할 수 있는 미생물을 상기 유기체의 증식을 지지할 수 있는 영양 용액 중에서 발효기에서 배양시킨다. 바람직하게는 단세포 오일은 약 20중량% 이상의 DHA를 함유할 것이다.
DHA를 함유하는 식용 가능한 단세포 오일을 제조할 수 있는 어떤 미생물도 본 발명에서 사용될 수 있다. 예를 들어, 광합성 규조류가 사용될 수 있다. 바람직한 미생물은 크립테코디늄 종(Crypthecodinium sp.)을 포함하는 해수 와편모충류이다. 증식을 위해 환원된 탄소원을 요구하는 절대 종속영양체인 크립테코디늄 코니(Crypthecodinium cohnii)가 특히 바람직하다. 크립테코디늄 코니는, 유일한 PUFA로서 DHA가 충분량(총 PUFA 양의 약 1%를 초과)으로 존재하는 지방산 프로파일을 함유하기 때문에 바람직하다. 상기 유기체의 MK 8840으로 명명된 샘플은 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(American Type Culture Collection at Rockville, Maryland)에 기탁번호 40750으로 기탁되어 있다. 본원에서 사용된 미생물 또는 특정 타입의 미생물은 야생형 균주, 돌연변이체 또는 재조합 타입을 포함한다. DHA를 함유하는 오일을 향상된 수준으로 제조하는 어떤 미생물도 본 발명의 영역내에 있는 것으로 간주된다. 본 발명의 특징 중의 하나는 와편모충류와 같은 미생물의 식용 가능한 오일-생성 능력의 인지 및 이러한 오일의 신뢰성 있는 경제적 공급원을 유지하는 문제에 대한 부수적 해결이다. 따라서, DHA를 함유하는 단세포 오일을 제조하도록 디자인된 야생형 및 재조합 미생물은 본 발명의 하나의 양태이다. 이러한 재조합 유기체는 동일한 기질을 사용하여 제공되는 경우, 동일한 야생형 미생물에 의해 제조되는 양과 비교하여, 단세포 오일로 더 많은 양의 DHA, 더 많은 양의 총 오일 또는 둘 다를 제조하도록 디자인된 것들이다. 또한, 야생형 미생물과 비교하여 DHA를 함유하는 단세포 오일을 동일한 양으로 제조하는 반면에, 더욱 비용 절감적인 기질을 효과적으로 사용하도록 디자인된 것들이 포함된다.
일반적으로, 본 분야의 숙련가는 발효기에서의 배양을 위해 적합한 유기체로서 크립테코디늄 코니를 고려하지 않았었다. 선행 연구가들은 크립테코디늄 코니의 성공적 배양을 위해서 요구되는 극도의 복합 영양물질의 혼합물에 대해 언급하고 있다[참조: Gold et al., Protozoal, 13: 255-257 (1966): Guillard, et al. in "Dinoflagellates", Academic Press (1984); Henderson, et al., Phytochemistry 27:1679-1683(1988)]. 대조적으로, 본 발명은 글루코오즈 및 효모 추출물을 함유하는 단순 배지에서 DHA-생산 미생물의 배양을 달성하였다. 해수와 같은 용액중 이들 성분의 사용은 경제적으로 중요한 증식율 및 세포 밀도를 제공한다. 예를 들어, 3 내지 5일의 발효 과정 동안, 용액 1ℓ당 바이오매쓰 10g 이상, 전형적으로 20 내지 40g의 크립테코디늄 코니 세포 밀도가 수득될 수 있다. 이러한 밀도는 이전까지는 이룰 수 없는 것이었다.
배양이 어떠한 적합한 발효기에서도 일어날 수 있음에도 불구하고, 바람직하게 유기체는 교반 탱크 발효기(STF: stirred tank fermentor) 또는 공기 리프트 발효기(ALF: air lift fermentor)(상기 두가지 타입 모두 본 분야의 숙련가에게 공지되어 있다)에서 증식된다. STF가 선택되는 경우, 교반은 러쉬톤-타입 고효율 터빈 또는 피치된-블레이드 또는 해수용 임펠러(impeller)를 사용하여 제공된다. 교반 및 스파징(sparging)은 미생물로의 산소의 공급을 원활하게 유지시켜 준다. 통상 교반속도는 바이오매쓰가 증가함에 따라 증가하는데 이것은 산소의 요구성이 증가하기 때문이다. 선단 속도(tip speed)는 약 500cm/초 이하, 바람직하게는 약 300cm/초 이하로 유지시키는 것이 바람직하다. 전단없이 더 큰 속도를 견딜수 있는 미생물 균주의 선별은 본 분야의 숙련가의 범위내에 있다. 이러한 균주의 사용은 특별히 본 발명에 포함된다.
상기된 바와 같이, 해수는 영양용액용으로 허용되는 배지이다. 해수는 천연 혼합물. 여과된 혼합물 또는 인공적 혼합물일 수 있으며, 이들 각각은 염도를, 예를 들어, 정상 농도의 1/2 내지 1/4로 감소시키기 위해 수돗물로 희석될 수 있거나 정상 농도의 2배로 농축될 수 있다. 바람직한 예는 인스턴트 오션(Instant OceanR)(10) 상표의 인공 해수이다. 크립테코디늄 코니가 해수 미생물임에도 불구하고, 일부 증식은 염도 0에서 관찰된다. 감소된 염도에서 잘 증식하는 변이체의 사용은 특히 본 발명에 포함된다. 미량영양물질이 첨가될 수 있으며 저염도에서 요구될 수 있다. 그러나, 이러한 미량영양물질은 본 분야의 숙련가에게 공지되어 있으며 통상 해수 또는 수돗물에 존재한다. 선별된 유기체가 크립테코디늄 코니와 같이 종속 영양체인 경우, 탄소원이 첨가된다.
바람직하게는, 해수 배지를 발효기에 첨가한 후, 상기 배지를 함유하는 발효기를 멸균하고 냉각시킨 다음 영양물질 및 미생물의 씨드 집단(seeding population)을 첨가한다. (해수는 영양물질과 함께 멸균할 수도 있지만, 이러한 방법으로의 멸균은 이용가능한 글루코오즈의 손실을 초래할 수 있다.) 영양물질 및 미생물은 동시에 또는 순차적으로 첨가될 수 있다.
씨드의 유효농도는 본 분야의 숙련가에 의해 결정될 수 있다. STF가 사용되는 경우. 발효의 초기에 1ℓ당 약 0.05 내지 1.0g(건조 중량: dry weight equivalent)으로 씨드 집단을 첨가하는 것이 바람직하다. 이것은 약 106개의 세포/ml이다. 따라서, 30ℓ들이 발효기에 대해, 1ℓ당 20g(건조중량)의 밀도의 생존 세포를 함유하는 씨드 배지가 1 내지 3ℓ첨가된다.
산소 수준은 포화 공기 수준의 약 10% 이상의 용존 산소(D.O.: Dissolved Oxygen) 함유량으로 유지된다. DHA의 생합성은 산소를 필요로하므로 DHA의 고수율은 포화공기 수준의 약 10 내지 50%의 D.O. 수준을 필요로 한다. IVVM(1분당 공기 용적/발효기 용적)인 통기 속도와 함께 150 내지 200cm/초의 교반 선단 속도는 배양물 1ℓ당 약 25g(건조 중량)의 바이오매쓰 밀도에서 약 20 내지 약 30%의 D.O. 수준을 제공한다. 세포 밀도가 높을수록 D.O. 수준이 높아지는데, 높은 D.O. 수준은 O2스파징에 의한 증가된 통기 속도에 의해, 또는 발효기에서 공기 압력을 증가시킴으로써 달성될 수 있다.
허용되는 탄소원은 본 분야의 숙련가에게 공지되어 있다. 예를 들어, 탄소는 글루코오즈의 형태로 크립테코디늄 코니에게 제공될 수 있다. 기타 종속 영양체는 본 분야의 숙련가에 의해 쉽게 결정될 수 있는 물질인 기타 환원된 탄소원을 사용할 수 있으며, 독립 영양체는 이산화탄소를 사용한다. 크립테코디늄 코니는 또한 기타 환원되고 보다 복합된 탄소원 상에서도 증식한다. 전형적으로 발효는 1ℓ당 글루코오즈 약 10 내지 50g으로 개시된다. 그 이상의 글루코오즈는 필요한 경우 발효 동안 첨가된다. 또는, 약 50 내지 150g, 바람직하게는 50 내지 100g의 글루코오즈/ℓ가 초기에 첨가될 수 있으므로, 추가의 첨가 빈도를 최소화할 수 있다. 기타 유기체에 제공되는 탄소원의 양은 본 분야의 숙련가에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
환원된 탄소원 이외에, 효모 추출물(YE)과 같은 질소원이 배지에 제공된다. 시판용 효모 추출물도 가능하다. 예를 들어, DIFCO 또는 MARCOR 상표의 효모 추출물이 사용될 수 있다. 효모 추출물은 또한 미량영양물질을 함유하는 유기 질소원이다. 기타 유기 질소원은 본 분야의 숙련가에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 그러나, 이러한 화합물은 일반적으로 효모 추출물보다 더 비싸다. 우레아 또는 질산염 상에서 증식할 수 있는 변이체의 사용은 본 발명의 영역내에 있다. 전형적으로 발효는 약 6 내지 12g의 YE/ℓ로 개시된다. 그 이상의 YE는 필요한 경우 첨가될 수 있다. 전형적인 발효 과정은 수행 과정에 걸쳐 약 8 내지 15g의 YE/ℓ를 필요로 한다. 따라서, 이러한 YE의 양을 초기에 가함에 따라 추가로 첨가할 필요가 감소된다. 정확한 양은 본 분야의 숙련가에 의해 결정될 수 있다. 일반적으로, 글루코오즈:YE의 비는 약 2:1 내지 약 15:1이다.
배양은 특정의 생명지속 온도에서 수행될 수 있다. 일반적으로 크립테코디늄 코니는 약 15 내지 34℃의 온도 범위에서 증식할 것이다. 바람직하게는, 온도는 약 20 내지 30℃로 유지시킨다. 높은 온도에서 증식하는 균주가 바람직한데, 왜냐하면 보다 단축된 이배체 시간(doubling time)을 가지므로 발효시간이 단축되기 때문이다. 기타 미생물을 위한 적당한 온도 범위는 본 분야의 숙련가에 의해 용이하게 결정된다.
배양은 광범위한 pH 범위에 걸쳐, 전형적으로 약 5.0 내지 약 9.0에서 수행될 수 있다. 바람직하게는, 약 6.0 내지 약 7.0의 pH 범위는 증식기를 위해 사용된다. KOH 또는 NaOH와 같은 염기는 접종전에 배지의 pH 범위를 조정하기 위해 사용된다. 발효의 후기 단계동안, 배양 배지는 알칼리성이 되는 경향이 있다. 필요한 경우, 무기산 pH 조정은 증식기동안 알칼리도를 보정하기 위해 사용될 수 있다.
단세포 오일의 생산은 정지기(stationary phase)의 도달에 의해(즉, 질소 고갈 또는 pH 상승에 의해) 와편모충류에서 유도된다. YE 결핍은 제한된 양으로 YE를 제공하여, 배지가 YE는 부족한 상태에서 이용가능한 글루코오즈만이 유지되도록 함으로써 야기 시킨다. 본 발명은 단세포 오일의 효율적인 생산을 촉진시키는 것이 질소원에 대한 탄소원의 비율이라고 인지한다. 글루코오즈와 YE를 사용함에 있어서, 예를 들어, 질소원에 대한 탄소원의 바람직한 비율은 1부의 YE에 대해 약 10 내지 15부의 글루코오즈이다. 기타 탄소원 및 질소원에 대한 유사한 비율이 본 분야의 숙련가에 의해 계산될 수 있다.
오일 제조 유도후, 배양물을 추가로 약 24시간 동안 증식시킨다. 이러한 올레오 합성의 기간 동안, DHA를 함유하는 단세포 오일이 합성되고 오일 점적물은명백히 가시화된다. 본 분야의 숙련가는 첨가된 YE의 양을 기준으로하여 기대량의 세포 바이오매쓰를 달성하는데 필요한 발효 시간을 용이하게 계산할 수 있다. 시간이 경과하면, 배양물을 추가로 24시간 동안 증식시키고 회수한다. 일반적으로 크립테코디늄 코니는, 변할 수 있을 지라도 단세포 오일을 제조하기에 충분한 시간, 대개 약 60 내지 약 90시간 동안 배양된다.
야생형 크립테코디늄 코니를 사용하여 수득한 바이오매쓰의 약 15 내지 30%는 추출가능한 오일을 함유한다. 균주 선별은 상기 퍼센트를 증가시킬 수 있고 이러한 선별은 본 발명의 영역내에 있다. 바람직하게 오일은 일반적으로 하기의 지방산 조정을 갖는 트리글리세라이드를 약 70% 초과로 포함한다.
15 내지 20% 미리스트산(C14:0)
20 내지 25% 팔미트산(C16:0)
10 내지 15% 올레산(C18:1)
30 내지 40% DHA(C22:6)
0 내지 10% 기타
(극성 지질, 예를 들어 포스파티딜 콜린을 포함하는 기타 오일 성분은 또한 DHA에 풍부할 수 있다). 조 오일은 황색-오렌지색으로 특징화되고 실온에서 액체이다. 바람직하게는, 오일은 약 20중량% 이상의 DHA 및 가장 바람직하게는 약 35중량% 이상의 DHA를 함유한다.
유기체는 본 분야의 숙련가에게 공지된 통상의 방법, 예를 들어, 원심분리, 응결 또는 여과에 의해 회수되고 즉시 가공되거나 추가의 가공을 위해 건조될 수 있다. 어떠한 경우에도, 오일은 유효량의 용매를 사용하여 용이하게 추출될 수 있다. 적합한 용매는 본 분야의 숙련가에 의해 결정될 수 있다. 그러나 바람직한 용매에는 순수한 헥산 및 초임계 유체, 예를 들어, 초임계 CO2가 포함된다.
초임계 유체를 사용하는 추출기술은 본 분야의 숙련가에게 공지되어 있으며 문헌[참조: McHugh et al., Supercritical Fluid Extraction, Butterworth, 1986]에 기술되어 있다. 추출용매가 헥산인 경우, 건조한 바이오매쓰에 대한 헥산의 적합한 비율은 건조한 바이오매쓰 1kg당 약 4ℓ의 헥산이다. 헥산을 바람직하게는 교반 반응 용기에서 약 20 내지 50℃의 온도에서 약 2시간 동안 바이오매쓰와 혼합한다. 혼합 후, 바이오매쓰를 여과하고 오일을 함유하는 헥산으로부터 분리한다. 또는, 습윤 바이오매쓰 페이스트(30 내지 35%가 고체)를 더욱 극성인 용매, 예를 들어, 에탄올, 이소프로판올 또는 헥산/이소프로판올 혼합물을 사용하여 직접 추출할 수 있다. 잔류하는 바이오매쓰, 즉 크립테코디늄 코니와 같은 미생물의 식용 가능한 단세포 오일 추출된 바이오매쓰는 약 35 내지 40%의 단백질, 8 내지 10%의 회분(ash) 및 45 내지 50%의 탄수화물을 함유하는 동물 사료로서 사용될 수 있다. 이러한 고 단백질 함유량 및 높은 수준의 DHA 때문에, 전체 바이오매쓰 페이스트는 양식용(예: 새우, 굴, 어류)사료로서 사용될 수 있다.
그 다음에 용매를 본 분야의 숙련가에서 공지된 증류 기술에 의해 오일로부터 제거한다. 통상의 오일 씨드 가공 장치는 여과, 분리 및 증류를 수행하는데 적합하다. 본 분야의 숙련가에게 공지된 추가의 가공 단계는 특수 적용을 위해 필요하거나 바람직한 경우 수행될 수 있다. 또한, 이들 단계는 통상의 식물성 오일 가공에 관련된 단계와 유사하며 DHA-풍부 극성 지질 분획물의 분리를 허용한다.
동위원소로 표지된 단세포 오일(표지된 DHA를 포함)은 본 발명의 방법에 의해 충분한 양으로 용이하게 수득되어 DHA의 대사 경로를 연구할 수 있도록 할 수 있다.13C-글루코오즈 또는14C-글루코오즈가 환원된 탄소 기질로서 제공되는 경우 표지된 DHA가 초래된다.
또한, 본 발명은 유아용 조제 분유 및 유아식 뿐만 아니라 식이 보충물과 같은 식품(이들은 본 발명의 DHA를 함유하는 단세포 오일을 함유한다)을 포함한다. 본 분야의 숙련가는 DHA를 함유하는 유아용 조제 분유가 바람직하다는 것을 인지한 반면, 선행 기술의 유아용 조제 분유는 어유로부터의 DHA를 함유하지만, 이러한 DHA는 부수의 불쾌한 맛 및 기관 감각 수용성(organoleptic) 특성을 갖는다. 더우기, 유아용 조제 분유의 어유 보충물은 항응고 활성을 가지며 가능하게는 아라키돈산 생합성의 감소에 관여하는 것으로 공지된 오메가-3-지방산인 에이코사펜타엔산(EPA)의 첨가를 포함한다. 이러한 작용은 유아용 조제 분유 또는 유아식에서 바람직하지 않으며 본원에서 기술된 단세포 오일은 상당량의 EPA를 함유하지 않는다. 본 발명의 단세포 오일을 함유하는 유아용 조제 분유와 같은 식품은 어유의 불쾌한 기관감각 수용성 특성을 갖지 않는다. 따라서 식품은 유아 및 성인에 의해 똑같이 더욱 용이하게 허용된다. 바람직하게는, 본 발명의 유아용 조제 분유는 DHA를 함유하는 단세포 오일을 약 0.05중량% 함유한다. 고체 조성이 더 높은 본 발명의 유아식은 바람직하게는 DHA를 함유하는 단세포 오일을 약 0.5중량% 함유한다. 상기 두가지 경우 모두에서, 가장 바람직하게는 오일은 약 35% 이상의 DHA를 함유한다.
본 발명은 DHA를 함유하는 단세포 오일을 포함하는 약제학적 제품을 포함한다. 바람직하게는, 이러한 제품은 약 35% 이상의 DHA를 함유한다. 이러한 약제학적 제품은 유아 또는 성인에게 완전 비경구 영양(total parenteral nutrition: TPN)을 제공하는데 사용하기에 적합한 것이다. 추가로 단세포 오일을 함유하는 식이 보충물이 포함된다. 바람직하게는, 이러한 보충물은 상기 오일을 캡슐화하는 젤라틴 캡슐의 형태로 존재하며 임산부 또는 수유모(breast feeding mother)를 위해 적당할 수 있다. 이것은 특히 채식주의자이며 식이요법에서 충분한 양의 DHA를 섭취할 수 없는 여자들에게 중요할 것이다.
또한 본 발명은 DHA를 함유하는 단세포 오일을 포함한다. 바람직하게는, 단세포 오일은 약 20중량% 이상의 DHA를 함유한다. 가장 바람직하게는, 오일은 약 35중량% 이상의 DHA를 함유한다.
본 발명을 일반적으로 기술하였으며, 참조로 하기의 제한없는 특정 실시예를 기술한다.
[실시예 1]
처리 용적이 30ℓ인 STF에 1/2 농도의 인공 해수 배지를 넣는다. 6ℓ의 IO를 18ℓ의 수돗물과 합한다. 배지를 함유하는 발효기를 멸균하고 28℃로 냉각시킨다. 농축 YE 400ml(455g/ℓ), 글루코오즈 시럽 900ml(400g/ℓ) 및 약 2 x 107개의 세포/ml 또는 20g/ℓ의 바이오매쓰를 함유하는 씨드 발효기로부터의 접종물 1ℓ(최종 농도 약 7 x 106개의 세포/ml 또는 바이오매쓰 약 700mg/ℓ를 수득)를 배지에 가한다. 교반을 120cm/초 선단 속도로 고정시키고 통기는 IVVM(1분당 30ℓ)로 고정시킨다. 글루코오즈 시럽(900ml)을 30분후에 가한 다음, 또 다른 4.2ℓ를 42시간에 걸쳐 가한다. 따라서 총 글루코오즈 시럽 6ℓ가 첨가된다. 농축 YE 용액(400ml)을 6시간째에 가하고 총 2.0ℓ가 첨가될 때까지, 또 다른 1.2ℓ를 48시간동안에 걸쳐 가한다. D.O.를 20% 초과로 유지시키기 위해, 24시간째에 교반 선단 속도를 150cm/초로 증가시키고 48시간째에는 160cm/초로 증가시킨다. 72시간째에, 선단 속도를 200cm/초로 증가시키고 배양물을 최종적으로 충전시킨 글루코오즈가 세포성 오일로 전환되기에 충분한 추가의 시간 동안 증식시킨다. 배양 조건을 제 1도에 그래프로 나타내었다. 배양물을 세포 펠렛을 보유시키면서 원심분리에 의해 회수한다. 세포의 회수된 펠렛을 냉동건조(동결 건조)시켜 약 4%의 수분함량으로 만든다. 헥산(2.8ℓ)을 건조한 바이오매쓰에 가하고 유리 케틀(kettle)에서 50℃에서 1.5시간 동안 교반한다. 회전 증발기를 사용하여 헥산을 제거하여 조 DHA-함유 오일 약 175g을 수득한다.
[실시예 2]
처리 용적이 350ℓ인 STF에 I.O.R4.3kg과 수돗물 230ℓ를 합하여 제조된 1/2 농도 인공 해수 배지를 넣는다. 배지를 함유하는 발효기를 멸균하고 28℃로 냉각시킨다. 농축 YE 6.8ℓ(400g/ℓ), 글루코오즈 시럽 12.5ℓ(400g/ℓ) 및 씨드 발효기로부터의 크립테코디늄 코니 접종물 30ℓ(106개의 세포/ml 또는 바이오매쓰 밀도 약 1.3g/ℓ)를 배지에 가한다. 교반은 73cm/초 선단 속도로 고정하고 통기는 IVVM(1분당 280ℓ)로 고정한다. 글루코오즈 시럽(12ℓ)을 약 44시간 후에 가한 다음, 또 다른 43ℓ를 32시간에 걸쳐 가한다. 따라서 총 67.5ℓ의 글루코오즈 시럽이 첨가된다. 글루코오즈 첨가 및 세포 증식을 제2도에 그래프로 나타내었다.
D.O를 20% 초과로 유지하기 위해, 44시간째에 교반 선단 속도를 175cm/초로 증가시키고 55시간째에는 225cm/초로 증가시킨다. 76시간째에, 선단 속도를 150cm/초로 감소시키고 배양물을 최종적으로 충전시킨 글루코오즈가 세포성 오일로 전환되기에 충분한 추가의 시간 동안 증식시킨다. 배양물을 회수한다. 회수된 배양물을 약 4%의 수분 함량으로 건조시킨다. 헥산을 건조한 바이오매쓰에 가하고 유리 케틀에서 25℃에서 2시간 동안 교반시킨다. 회전 증발기를 사용하여 헥산을 제거하여 조 DHA-함유 오일 약 700g을 수득한다.
[실시예 3]
처리 용적이 30ℓ인 STF에 I.O.R565g과 수돗물 15ℓ를 합하여 제조된 완전 농도의 인공 해수의 배지를 넣는다. 상기 배지를 함유하는 발효기를 멸균하고 28℃로 냉각시킨다. 농축 YE 400ml(400g/ℓ), 글루코오즈 시럽 1.9ℓ(400g/ℓ) 및 씨드 발효기로부터의 크립테코디늄 코니 접종물 1ℓ(106개의 세포/ml 또는 약 2.0g/ℓ의 바이오매쓰)를 배지에 가한다. 교반은 80cm/초 선단 속도로 고정하고 통기는 IVVM(1분당 20ℓ)로 고정한다. 추가의 글루코오즈 시럽(1.5ℓ)은 94시간 후에 가하고 또 다른 1.1ℓ를 116시간째에 가한다. 따라서 총 4.5ℓ의 글루코오즈 시럽이 첨가된다. D.O.를 20% 초과로 유지하기 위해, 52시간째에 교반 선단 속도를 160cm/초로 증가시킨다. 66시간째에 정지기를 유도하여 달성하고 pH를 4N KOH를 사용하여 7.0으로 만들고 교반 선단 속도를 수행과정 동안 더이상 증가시키지 않는다. 제3도에 나타낸 바와 같이, 최종적으로 충전시킨 글루코오즈가 세포성 오일로 전환되기에 충분한 추가의 시간 동안 배양물을 증식시킨다. 그 배양물을 회수한다. 회수된 배양물을 약 4%의 함수량으로 건조시킨다. 헥산을 건조한 바이오매쓰에 가하고 유리 케틀에서 50℃에서 1.5시간 동안 교반한다. 회전 증발기를 사용하여 헥산을 제거하여 조 DHA-함유 오일 약 65g을 수득한다.

Claims (16)

  1. 트리글리세라이드 형태의 도코사헥사엔산(DHA) 20% 이상을 갖는 단세포 오일을 생산할 수 있는 와편모충류를 통기된 발효기 내의 환원된 탄소원 및 질소원을 함유하는 영양 용액중에서 영양 용액 1ℓ당 약 10g 이상의 바이오매쓰의 세포 밀도가 수득될 때까지 배양을 지속하고, pH 상승 또는 질소 고갈에 의해 와편모충류가 정지기 상태에 놓이도록 유도하여 영양용액 1ℓ당 약 2g이상의 농도로 단세포 오일을 생산시킨 후, 바이오매쓰를 수거하고 이로부터 단세포 오일을 회수함으로써 생산되는, 트리글리세라이드 형태의 DHA 20% 이상을 포함하는 식용 가능한 단세포 오일.
  2. 제1항에 있어서, DHA가 트리글리세라이드의 30% 이상을 차지하는 70% 이상의 트리글리세라이드를 포함하는 식용 가능한 단세포 오일.
  3. 제1항에 있어서, 단세포 오일이 약 2% 이하의 기타 다중 불포화 지방산을 포함하는 오일.
  4. 제3항에 있어서, 크립테코디늄(Crypthecodinium)속의 외편모충류로부터 수득되는 오일.
  5. 제3항에 있어서, 크립테코디늄 코니(Crypthecodinium cohnii)로부터 수득되는 오일.
  6. 트리글리세라이드 형태의 DHA 20% 이상을 갖는 단세포 오일을 생산할 수 있는 와편모충류를 통기된 발효기내의 환원된 탄소원 및 질소원을 함유하는 영양 용액중에서 영양 용액 1ℓ당 약 10g 이상의 바이오매쓰의 세포 밀도가 수득되도록 배양하고, pH를 상승시키거나 질소를 고갈시켜 와편모충류가 정지기 상태에 놓이도록 유도하여 영양용액 1ℓ당 약 2g이상의 농도로 단세포 오일을 생산시키는 단계; 및 DHA가 트리글리세라이드의 20% 이상을 차지하는 트리글리세라이드를 포함하는 오일 15% 이상을 함유하는 바이오매쓰를 수거하는 단계를 포함하는, 식용 가능한 단세포 오일을 함유하는 와편모충류 바이오매쓰를 생산하는 방법.
  7. 제6항에 있어서, 와편모충류가 크립테코디늄(Crypthecodinium) 속인 방법.
  8. 제7항에 있어서, 크립테코디늄 속의 와편모충류가 크립테코디늄 코니(Crypthecodinium cohnii)인 방법.
  9. 제6항 내지 제8항중 어느 한 항에 있어서, 영양 용액이 해수 또는 인공 해수를 포함하는 방법.
  10. 제6항 내지 제8항중 어느 한 항에 있어서, 영양 용액이 염도가 저하된 해수 또는 염도가 저하된 인공 해수를 포함하는 방법.
  11. 제6항 내지 제8항중 어느 한 항에 있어서, 질소원에 대한 환원된 탄소원의 비가 효모 추출물 1부당 글루코오즈 약 2부 내지 약 15부의 비에 해당되는 방법.
  12. 제6항 내지 제8항중 어느 한 항에 있어서, 실질적인 발효과정 전반에 걸쳐 포화 공기 수준의 약 10%이상의 용존 산소 함유량을 유지함을 추가로 포함하는 방법.
  13. 제6항 내지 제8항중 어느 한 항에 있어서, 통기율이 IVVM(분당 영양 배지 용적당 통기 용적)이상인 방법.
  14. 제6항 내지 제8항중 어느 한 항에 있어서, 미생물이 영양 용액 1ℓ당 약 20g 이상의 밀도로 배양되는 방법.
  15. (a) 약 1/4 농도의 인공 해수, 글루코오즈 1 내지 8% 및 효모 추출물 0.4 내지 0.8%를 함유하는 영양 용액을 초기에 포함하는 발효기에 크립테코디늄 코니 약 105세포/ml(0.5 내지 1.0g 건조중량/ℓ)를 첨가하는 단계;
    (b) 온도 약 15 내지 약 34℃ 및 pH 약 5.0 내지 9.0에서 크립테코디늄 코니를 배양하는 단계;
    (c) 글루코오즈 및 효모 추출물을 영양 용액에 약 56시간 동안 증진적으로 첨가하는 단계;
    (d) 추가의 글루코오즈를 영양 용액에 추가로 약 16시간 동안 첨가하여 크립테코디늄 코니가 오일을 생산하도록 유도하는 단계;
    (e) 발효기를 교반하고 통기시켜 배양과정 전반에 걸쳐 포화 공기 수준의 약 20%이상의 용존 산소 함유량을 유지시키는 단계;
    (f) 약 60 내지 90시간 후에 크립테코디늄 코니를 수거하는 단계; 및
    (g) 식용 가능한 단세포 오일을 회수하는 단계를 포함하여, 20중량% 이상의 DHA를 포함하는 식용 가능한 단세포 오일을 생산하는 방법.
  16. 제6항 내지 제8항중 어느 한 항에 있어서, 바이오매쓰로부터 오일이 회수됨을 추가로 포함하는 방법.
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