KR19990046733A - 미생물슈도모나스에의한도코사핵사노인산(ｄｈａ)의제조방법 - Google Patents

미생물슈도모나스에의한도코사핵사노인산(ｄｈａ)의제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 도코사핵사노인산(docosahexaenoic acid: DHA)을 생산하는 슈도모나스(Pseudomonas sp. YS-180 균주기탁번호 KCCM-10157)와 이 미생물에 의한 DHA의 제조방법에 관한 것이다. 어류의 내장으로부터 DHA의 생산능이 우수한 균주를 형태학적, 배양학적 및 생리학적 특성 조사를 통해 슈도모나스(Pseudomonas sp. YS-180)를 분리 동정하고 최적 생산조건을 확립하였다. 본 발명의 균주 슈도모나스 (Pseudomonas sp. YS-180)는 2% 포도당(w/v), 2% 효모 추출물(yeast extract: w/v) 및 20% 해수(v/v)가 포함된 배지에서 4일동안 진탕 배양하였을 때 가장 많은 DHA를 생산하여 TLC와 GC로 확인하였다. 최적 배양조건은 pH 6.0이고 온도는 20℃에서 DHA 생산량은 96.7mg/L이었으며 균체(biomass)는 7.8g/L였다.

Description

미생물 슈도모나스에 의한 도코사핵사노인산(ＤＨＡ)의 제조방법 {Manufacturing Method for Docosa Hexaenoic Acid using Pseudomonas sp. YS-180}
본 발명은 도코사핵사노인산(docosahexaenoic acid: 이하 DHA라 한다)을 생산하는 슈도모나스(Pseudomonas sp. YS-180 균주기탁번호 KCCM-10157)와 이 미생물에 의한 DHA의 제조방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는 어류의 내장으로부터 불포화 지방산중의 하나인 DHA의 생산능이 우수한 균주를 선별하여 형태학적, 배양학적 및 생리학적 특성 조사를 통해 슈도모나스(Pseudomonas sp. YS-180)를 분리 동정하고 최적 생산조건을 확립하는 방법에 관한 발명이다.
DHA는 1970년대 에스키모인을 대상으로한 역학조사가 시발이 되어 깊은 관심을 끌어온 불포화지방산중의 하나로서 사람의 전두엽의 회백질에 존재하는 인지질 즉 포스파티딜 에타놀아닌(phosphatidyl ethanolanine: PE) 및 포스파티딜 세린 (posphatidyl serine: PS)과 같이 혼합되어 뇌 및 망막과 관련된 고유한 생리작용을 갖고 있다. 또한 항혈전, 항고혈압, 항부정맥, 항암 등 다양한 효능으로 인해 건강식품으로서 각광을 받고 있다. 그러나 DHA는 화학합성이 용이하지 못하며 천연물에서 얻어져야 되는데 지금까지 산업적으로 이들 고도불포화지방산은 주로 고등어, 꽁치, 참치, 전갱이, 정어리, 청어 등과 같은 등이 푸른 생선의 기름에서 추출되어 왔다. 흔히 어유의 지방산은 먹이사슬에 의하여 해양미생물, 즉 조류나 식물성 플랑크톤으로부터 기원하는 것으로 알려져 있다. 그러나 이들을 어유로부터 추출할 경우 어류가 환경오염물질에 오염되어 있을때 식품 및 의약품으로 사용이 부적합하며, 안정적 생산을 기하기 어렵고 어취 등 많은 문제점을 안고 있다. 따라서 일부 연구자들은 먹이사슬을 통해서 뿐만 아니라 등푸른 어류의 장내에서도 DHA 생산균이 공생하리라고 예측하였다. 그에 따라 각종 어류와 해양동물의 장내에서 세균을 분리 배양하여 DHA 생산능력을 검사한 결과 실제로 많은 종류의 DHA 생산균이 분리되었다. EPA와 DHA를 동시에 생산하는 해양미생물로는 크리소피세아스 (Chrysophyceas)에 속하는 이소크리시스 갈바나(Isochrysis galbana), 디노프라겔라이트(Dinoflagellate sp). 및 크립테코디늄 코니이(Crypthecodinium cohnii)가 보고되고 있으며 현재는 생물공학기술을 이용하여 박테리아나 조류에서 EPA와 DHA를 대량 생산하려는 연구가 활발히 진행되고 있다. 와타나베등의 해양 박테리아로부터 EPA 생성물의 지방산 조성(J. Mar. Biotechnol., 4, 104∼112 ,1996), 보우멘 등의 남극 신규 미생물로부터 EPA생산 가능성(Int. J. System. Bacteriol., 47, 1040∼1047, 1997), 비코 등의 해조류로부터 지방산(Phytochemistry, 34, 1521∼ 1533, 1993), DHA생산에 관한 WO 91/11918(1991), 야마자키의 해양세균에 의한 EPA의 생산과 이용(Bio Industry., 6, 491∼501, 1989), 카즈오등의 해양 박테리아로부터 신규 DHA 생성물의 지방산과 지질의 조성( Lipids. 32, 9 p 975∼978, 1997)에 관한 연구가 있으나 미생물로부터 DHA, EPA의 생산에 관한 기초적인 탐색에 불과한 것들이다.
본 발명은 어류의 내장으로부터 불포화 지방산중의 하나인 DHA의 생산능이 우수한 균주를 선별하여 형태학적, 배양학적 및 생리학적 특성 조사를 통해 슈도모나스(Pseudomonas sp. YS-180 균주기탁번호 KCCM-10157)를 분리 동정하고 최적 생산조건을 확립하는 데 목적이 있다.
도 1은 본 발명의 균주 슈도모나스의 전자현미경 사진이다.
도 2는 본 발명의 균주로 배양한 DHA(B)와 시료(A)의 TLC의 RF값을 비교한 그래프이다.
도 3은 본 발명의 균주를 PYM-glucose medium에서 배양한 지방산의 개스크로마토그람이다.
도 4는 본 발명의 균주의 DHA 생산과 바이오매스의 온도에 의한 영향을 나타낸 그래프이다.
도 5는 본 발명의 균주의 DHA 생산과 바이오매스의 온도에 의한 초기 pH의 영향을 나타낸 그래프이다.
도 6은 본 발명의 균주의 DHA 생산과 균체 성장에 포도당농도의 영향을 나타낸 그래프이다.
도 7은 본 발명의 균주의 DHA 생산과 균체성장에 효모추출물의 영향을 나타낸 그래프이다.
도 8은 본 발명의 균주의 DHA 생산과 균체성장에 해수의 영향을 나타낸 그래프이다.
도 9는 본 발명의 균주의 DHA 생산과 균체성장 시간을 나타낸 그래프이다.
본 발명은 어류의 내장으로부터 DHA 생산균을 분리 동정하여 온도, pH, 포도당 농도, 효모 추출물, 해수 등이 DHA 생산에 어떠한 영향이 미치는지를 파악하고 생성물로부터 총지질(Total lipid)을 추출하고 DHA 함량 분석하는 것으로 구성되어 있다.
＜ DHA 생산균주 YS-180의 분리 및 동정 ＞
오징어 내장으로부터 분리한 슈도모나스 YS-180은 그람(Gram) 음성의 직선 (straight rod) 형태이었고 포자는 존재하지 않았으며 운동성이 있었다. 도 1에서 보는바와 같이 여러개의 극성 프라겔라(polar flagella)를 갖고 있었으며 밝은 크림색의 펑티폼(punctiform)을 갖고 있으므로 슈도모나스(Pseudomonas)속으로 판단하였다.
분리주의 배양특성 및 생리적 특성을 표 1에 나타내었으며 이 결과를 버지 메뉴얼(Bergey's manual of manual of systematic bacteriology)와 비교 검토하였다. 분리균은 4∼40℃의 범위에서 pH는 5∼12 범위에서 생육하였으며 9% 이하의 NaCl 농도에서도 생육이 가능하였다. 촉매효소(Catalase), 산화효소(oxidase) 및 지방분해효소(lipase) 활성을 나타내었으며 전분과 셀루로우스는 가수분해하지 못하는 반면 카제인(casein)은 가수분해하였다. 또한 아지닌(arginine), 펩톤 (peptone)으로부터 NH3를 생산하였고 구연산을 이용하였다. 아라비노스(Arabinose), 셀로비오스(cellobiose), 덱스트린(dextrin), 갈락토스(galactose) 등의 당을 이용하는 반면 셀루로우스, 글리세롤(glycerol), 이노시톨(inositol) 등은 이용하지 못하였다. 이상의 특징을 비교한 결과 본 발명의 균주는 슈도모나스(Pseudomonas)속으로 동정되어 Pseudomonas sp. YS-180으로 명명하였으며 이 균주를 1999년 4월 14일 한국종균협회 미생물센터에 KCCM-10157으로 기탁하였다.
표 1. 슈도모나스 YS-180의 형태학적 및 물리적 특성(보기: ＋ 양성, － 음성)
생육학적 특징 생육조건
성장온도 4∼40℃
성장pH 5∼10
NaCl 저해농도 ≤9%
촉매(Catalase) +
산화효소(Oxydase) +
질화효소(Nitrase) -
지질효소(Lipase) +
아르기닌 디하이드로레이스(Arginine dihydrolase) +
전분(Starch) 가수분해 -
카제인(Casein) 가수분해 +
셀룰로우스(Cellulose) 가수분해 -
인돌생산(Indole production) -
설탕으로부터 레반 형성(Levan formation from sucrose) -
암모니아 생성(NH3production from arginine) +
암모니아 생성(NH3production from peptone) +
구연산의 이용성(Utilization of citrate) +
메틸레드 테스트(Methyl red test) +
보게스-프로스카우어 반응(Voges-prosfauer reation) -
질화반응(Nitrate reduction) -
탈질화반응(Denitrification) +
용혈성(Hemolysis) +
O-F test -
유화수소 생성(H2S production) 산화
젤라틴 가수분해(Gelatin hydrolysis) +
당이용성(Utilization of sugar) +
아라비노스(Arabinose) +
셀로비노스(Cellobiose) +
셀루로우스(Cellulose) -
덱스트린(Dextrin) +
과당(Fructose) +
유당(galactose) +
포도당(Glucose) +
글리세롤(Glycerol) -
이노시톨(Inositol) -
＜ 총 지질의 추출 ＞
원심분리하여 모은 균체를 크로로폼 : 메탄올 = 2 : 1, v/v 추출용매에 현탁시키고 5분간 균질시킨 후 15,000rpm, 10분간 원심분리하고 하부의 크로로폼 층을 조심스럽게 분리한 후 감압농축하여 추출하였다.
＜ DHA 함량 분석 ＞
DHA는 AOAC 방법에 따라 정량분석하였다. 추출된 지방산을 일반적인 방법으로 비누화시키고 BF3-메탄올로 에스테르화 시킨 후 TLC(n-Hexan : Ether = 18 : 1) 및 Gas chromatography(capillary column 0.24×30m, FID Shimadzu, Japan)를 사용하여 DHA를 확인하였다. 칼럼 온도는 150℃에서 240℃까지 분당 3℃ 상승시켰고 질소를 운반개스로 사용하였으며 분당 1.5mL/min씩 통과시켰다.
다음의 실시예는 본 발명을 보다 상세히 설명하기 위한 것으로 이들 실시예가 본 발명의 기술적 범위를 제한하는 것은 아니다.
< 실시예 1 >
오징어 내장으로부터 분리한 DHA 생산균에 멸균한 해수로 현탁한 후 PYM-glucose 고체배지(Pepton, 1.04% ; Yeast extract, 0.5% ; Meat extract, 0.25% ; Glucose, 2.0% ; Sea water, 50% ; pH 7.0)를 평판배지에 도말한 후 20℃에서 3일간 배양하였다. 이후 각 colony를 동일 액체배지에 접종하고 20℃에서 3일간 진탕배양한 후 15,000rpm, 10분간 원심분리하여 균체를 모으고 지질을 추출한후 DHA 생산능이 우수한 균주를 분리하였다.
Pseudomonas sp. YS-180으로부터 DHA를 추출하여 전개용매에서 표준품 DHA와 같이 전개시킨 결과는 도 2에서 보는 바와 같이 표준품 DHA와 동일한 Rf 0.66 값을 나타내었다. 또한 개스크로마토그라피에 의해 DHA를 분석한 결과 도 3에서 보는바와 같이 retention time 14.30분에서 단일 피크를 나타내었으며 지방산중 DHA의 함량은 35.77%였다.
배양온도가 DHA 생산에 미치는 영향을 검토한 결과는 도 4와 같고 DHA의 함량 및 균체의 생육은 20℃에서 최대값을 나타냈으며 25℃ 이상의 온도에서 균체의 생육이 급격히 감소하였다.
DHA 생산에 미치는 초기 pH의 영향을 검토한 결과 도 5와 같이 초기 pH 6에서 최대값를 나타내었으며 pH 5 이하와 9 이상에서 급격한 감소를 보였다.
DHA 생산에 미치는 각종 탄소원의 영향을 검토한 결과는 표 2와 같이 포도당을 탄소원으로 사용하였을 경우 61.3mg/L로 가장 높았으며 전분을 탄소원으로 사용했을 경우에는 53.4mg/L를 생산하였다. 또한 포도당의 농도를 검토한 결과는 도 6에 나타난 바와같이 2% 첨가시 가장 생산능이 우수한 것으로 나타났다.
표 2. Pseudomonas sp. YS-180에 의한 탄소원별 DHA 생성능
탄 소 원 biomass(g/ℓ) DHA(mg/ℓ)
과당(Fructose) 1.2 7.2
설탕(Sucrose) 1.5 11.5
포도당(Glucose) 5.0 61.3
전분(Starch) 4.9 53.4
유당(Lactose) 1.1 13.7
질소원이 DHA 생산에 미치는 각종 유기질소원의 영향을 검토한 결과는 표 3과 같다. 쇠고기 추출물, 펩톤, 트립톤, 효모 추출물에서 각각 24.0mg/L, 20.7mg/L, 34.0mg/L, 61.3mg/L을 생산하였으며 효모 추출물 농도의 영향을 검토한 결과는 도 7에서 보는 바와같이 2% 첨가시 86.4mg/L으로 가장 높게 나타났다.
표 3. Pseudomonas sp. YS-180에 의한 질소원별 DHA 생산능력
질 소 원 biomass(g/ℓ) DHA(mg/ℓ)
쇠고기 추출물(Beef extract) 4.3 24.0
옥수수 침지액(Corn steep liquor) 2.1 10.5
맥아 추출물(Malt extract) 1.0 6.0
펩톤(Peptone) 2.5 20.7
콩(Soybeen meal) 0.8 7.6
트립톤(Triptone) 3.5 34.0
효모 추출물(Yeast extract) 5.0 61.3
요소(Urea) 3.2 27.4
해수농도가 DHA 생산에 미치는 영향을 검토한 결과는 표 8에서 나타낸 바와같이 20%(v/v)의 해수농도에서 96.7mg/L으로 가장 높게 나타났으며 그 이상의 농도에서는 점진적으로 감소하였다.
배양시간이 Pseudomonas sp. YS-180 균주에 의한 DHA 생산을 최적배지를 사용하여 경시적으로 검토한 결과를 도 9에 나타냈다. 배양 3일째 DHA 생산량은 96.7mg/L으로 가장 높은 결과를 보였다. Biomass의 양은 4.6g/L에서 7.8g/L로 약 1.5배 상승하였으며, DHA 함량은 54.9mg/L에서 96.7mg/L으로 약 2배 가까이 상승하였다.
＜ 실시예 2 ＞
펩톤 1.04%, 효모 추출물 0.5%, 육즙 0.25%, 포도당 2.0%, 해수 50%로 구성한 배지를 오토클레이브로 멸균하고 pH 7.0으로 조절하여 DHA 생산균인 슈도모나스 (Pseudomonas sp. YS-180)를 접종하여 20℃에서 3일간 배양하였다.
이후 각 콜로니를 효모 추출물 2.0%, 펩톤 1.04%, 트립톤 0.25%, 포도당 2.0%, 해수 20%로 구성한 배지 첨가한 동일 액체배지에 접종하고 20℃에서 3일간 진탕배양한 후 15,000rpm, 10분간 원심분리하여 균체를 모으고 지질을 추출한후 96.7 mg/L DHA를 얻었다.
본 발명에서 분리한 슈도모나스 YS-180 균주로 pH 중성에서 3-6일간 배양하여 고수율의 DHA를 얻었다. DHA는 천연의 불포화 지방산으로서 고혈압, 동맥경화와 같은 성인병 예방에 효과가 크므로 식품, 의약품, 사료 등으로 활용이 크게 기대되고 있다.

Claims (3)

  1. 생선의 내장에서 분리한 균주가 도코사핵사노익산(DHA)을 생산하는 것을 특징으로 하는 슈도모나스(Pseudomonas sp. YS-180, 균주기탁번호 KCCM-10157) 균주.
  2. 청구항 1의 균주를 배지에 접종하여 pH 6.0-7.0으로 하여 20-25℃로 3-6일간 배양하는 것을 특징으로 하는 슈도모나스 균주에 의한 도코사핵사노익산(DHA)의 제조방법.
  3. 제 2항에 있어서, 배지는 펩톤 0.5-1.5 w/v%, 효모 추출물 0.5-2.0 w/v%, 육즙 0.25-0.5 w/v%, 포도당 1.0-3.0 w/v%, 해수 20-50 v/v%로 구성한 배지에 균주를 접종하여 배양하는 것을 특징으로 하는 슈도모나스 균주에 의한 도코사핵사노익산 (DHA)의 제조방법.
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