SU1762761A3

SU1762761A3 - Способ получени полипептида со свойствами фактора некроза опухоли

Info

Publication number: SU1762761A3
Application number: SU874202872A
Authority: SU
Inventors: Ямагиси Юнити; Кавасима Хитоси; Фурута Рюдзи; Котани Хиротада; Наката Катухиса
Original assignee: Дайниппон Фармасьютикал Ко., Лтд (Фирма)
Priority date: 1986-06-20
Filing date: 1987-06-19
Publication date: 1992-09-15
Also published as: US4990455A; HUT46065A; PH26714A; DK312387A; DE3750056T2; ATE107362T1; AU592196B2; EP0251037B1; EP0251037A3; AU7450887A; EP0251037A2; KR880000471A; DE3750056D1; DK312387D0; HU210118B

Abstract

Изобретение относитс к медицине и биотехнологии и может быть использовано дл получени человеческого фактора некроза опухолей (ФИО). Целью изобретени вл етс повышение противоопухолевой активности In vivo при низкой цитотоксиче- ской активности in vitro. Способ заключаетс в том, что конструируют плазмиды pHPL-115, pH PL147, pHPL-Ser. трансформируют ими штамм бактерий E.coll HB 101, культивируют штаммы с последующим выделением и очисткой целевого продукта.

Description

Изобретение относитс к области медицины и биологии и может быть использовано дл получени человеческого фактора некроза опухолей (ФНО).

Целью изобретени вл етс повышение противоопухолевой активности in vivo, при низкой цитотоксической активности In vitro.

Способ заключаетс в том, что конструируют плазмиды pHTP16V. pHTP31T, pHTP32S. pHTP32D. рНТР32Н. pHTP36V, РНТР73Р. рНТР98Н, рНТРЮЗР. рНР1-115, рНМУ-32. рНТР115Н. pHTP115D, pHTP115S. pHTP115G, рНТР115Т, pHtP117H, pHTP1311, pHTP143V, трансформируют ими штамм E.coll HB 101 культивируют штаммы с последующим выделением и очисткой целевого продукта.

Пример 1. Построение экспрессион- ной плазмиды рНМУ-32.

Клонированную кДНК, кодирующую человеческий ФНО, выдел ют обработкой эндонуклеазами рестрикции Pst1, использу рекомбинантную плазмиду pHTNF13, полученную по методике, описанной в Европейской патентной публикации № 155549.

Клонированную кДНК дополнительно обрабатывают зндонуклеазами рестрикци- онными Ava t и Hind tl дл выделени ДНК фрагмента, содержащего основную часть области кодировани полипептида человеческого ФНО. Выделенный ДНК-фрагмент называют ФНО-ДИК-фрагментом.

ФНО-ДНК-фрагмент имеет размер около 600 п.о.

ФНО-ДНК-фрагмент затем обрабатывают эндонуклазой рестрикции эндонуклеаз Нра II и Bgl II дл разрезани его на три ДНК-фрагмента. Фрагменты выдел ют. Эти ДНК-фрагменты названы, соответственно фрагмент ДНК-1, фрагмент ДНК-2 и фрагмент ДНК-3.

Затем фрагменты ДНК-1 и ДНК-3 комбинируют , использу Т4-ДНК-диагазу со спеN3

Ы

дующим химическим синтезированным оли- годезоксирибонуклаостидным адаптером

(а)

5 -CGGGCCTATGCCCTCC-3 3 -CCGGATACGGG-5Свйзанный ДНК-фрагмент именуют фрагментом NY-ДНК. Фрагмент NY-ДНК последовательно св зывают со следующими двум химически синтезированными олиго- дезоксирибонуклеотидными адаптерами (Ь) и (с)

(b)5 -AACTAGTACGCAAGrTCAGGTAAGGAGGTTATC-3

3 -TTGATCATGCGTTCAAGTGCATTCCTCCAATAGCTA-5

(c)5 -GATTATGTCATCTTCl CGAACC-31

3 -ATACAGTAGAAGAGCTTGGGGGT-5

Результирующий ДНК-фрзгмент именуют пептидо-кодирующим ДНК-фрагментом.

ДНК-фрзгмент (размером около 380 п.о.), содержащий trp промоторную область, выдел ют из плазмиды рСТ-1 с помощью двойной обработки эндонуклеазами Нра I и Aat И. Последовательность оснований trp- промоторной области указанного ДНК- фрагмента в 380 п.о. известна. Указанный ДНК-фрагмент 380 из п.о. св зывают с пептидо-кодирующим ДНК-фрагментом, как это описано выше. Св занный ДНК фрагмент именуют промотор-пептидокодирую- щим ДНК-фрагментом.

Отдельно от этого, плазмиду pBR322 обрабатывают эндонуклеазами рестракции Ava I и Pvu II, и результирующий ДНК-фрагмент (размером околи 3,7 т.п.о.) выдел ют с помощью гельзлектрофореза в 0,7% агаро- зе. После заполнени области между его липкими концами и тупыми концами с использованием ДНК-полимеразы 1 Е.соП (фрагмент Кленова) и четырех видов дезок- сирибонук л еоти дотри фосфатов (дГТФ, дАТФ, дТТФ и дЦТФ), оба конца св зывают с помощью Т4-ДНК-лигазы дл построени новой плазмиды, котора обозначена PBRS6.

Плазмиду pBRS6 расщепл ют эндонуклеазами растрикции Aat II и Hind III на два ДНК-фрагмента. ДНК-фрагмент (размеры около 3,6 т.п.о) выдел ют и св зывают с помощью Т4-ДНК-лигазы с промогорпеитидо- кодирующим ДНК-фрагментом, полученным выше, дл построени зкспрессионной плазмиды pHNY-32. Дл получени полипептида ФНО-32У, содержащего 155 аминокислот, и с аминокислотной последовательностью, в которой аспарагиновый остаток в 32-ом положении от N-конца заменен тирозином (Туг).

2. Получение ФНО-32У

Экспрессионную плазмиду pHNY-32 ввод т в E.coli HB101 обычным способом (S.N.Cohen и др.. Proc, Natl. Acad. Sci США, 69.2110(1972)).

Трансформант (HB101)pHNY-32) культивируют при 37°С около суток в LB-бульоне (состав: 1 % триптона, 0,5% дрожжевого экстракта , 1% NaCi, pH 7,5). Культурой инокупируют 10 объемов среды М9 (состав: 1,5% N32HP04-12H20. 0.3% КН2Р04. 0,05% NaCI. 0,1% , 2 мг/л витамина В1, 0,45% ка- заминокислоты, 1 мМ Мд$04, 0,1 мМ CaCl2 и 0,4% глицерина), содержащей ампициллина в концентрации 25 мкг/мл (37°С, 1 ч).

Затем добавл ют 3-индолакриловую кислоту до конечной концентрации 20 мкг/мл. После этого культивирование продолжают еще 24 ч и клетки отдел ют центрифугированием . Полученные клетки суспендируют в 50 мМ буфера Трис-ИС (рН 8), содержащего 0,1% лизозима и 30 мМ NaCI, и оставл ют на 30 мин на лед ной бане. После неоднократной обработки клеточной суспензии замораживанием в бане с сухим льдом в этаноле и оттаиванием при 37°С клеточный экстракт отдел ют центрифугированием.

Клеточный экстракт диализуют относительно 20 мМ буфера Трис-НС (рН 7,8) и

центрифугированием диализата получают осветленную жидкую часть. Жидкую часть нанос т на колонку с ДЭАЗ-Сефарозой CL- 6В (фармаци ), предварительно уравновешенную 20 мМ буфером Трис-HCI (рН 7,8).

После промывани колонки тем же буфером с целью удалени неадсорбированных компонентов целевой полипептид (ФНО-32У) злюируют в услови х линейного градиента концентрации NaCI от нул до 0,3 М в том

же буфере. Каждую фракцию подвергают электрофорезу на НДС-полиакриламидном геле и фракции, содержащие полипептид с молекул рным весом около 17 килодальтон, собирают и объедин ют. Объединенные

фракции диализуют относительно 20 мм буфера Трис-HCI (рН 7,8) и вновь подвергают колоночной хроматографии на ДЭАЭ-Сефа- розе CL-6B в вышеприведенных услови х, но с элюированием более легким градиентом концентрации NaCI.

Содержащие целевой полипептид фракции собирают, объедин ют и концентрируют ультрафильтрованием с Диафло на мембранах УМ 10 (Амико).

И наконец, концентрат подвергают гельфильтрации на колонке Биогель Р-6 (Био-Рад) с применением в качестве элюен- та 5 мМ фосфатного буфера в солевом рас- таоре и получением очищенного ФНО-32У (выход 20,8 мг/л).

N-концевую аминокислотную последовательность очищенного ФНО-32У с помощью автоматического разложени по Эдм-ну на приборе дл определени аминокислотных последовательностей (Эпплайд Виосистемс. модель 470А).

В результате установлено, что N-конце- вой аминокислотой ФНО-32У вл етс остаток серина, т.е. метиониновый остаток, обусловленный кодоном запуска тринслл- ции (АТС) удален из очищенного продукта.

Пример 2.1. Построение зкспресси- онной плазмиды рНРЫ 15.

ФНО-ДНК-фрагмент, полученный в примере 1 (1), обрабатывают эндонуклеаза- ми Pvu II и Tag I дл разрезани его на четыре ДНК-фрагмента. Фрагменты выдел ют .

Эти ДНК-фрагменты именуют, соответственно , фрагмент ДНК-4, фрагмент ДНК-5, фрагмент ДНК-б и фрагмент ДНК-7. Фрагмент ДНК-5 дополнительно обрабатывают эндонуклеазой Ddlf и получают ДНК-фрагмент именуемый фрагментом ДНК-8.

Фрагмент ДНК-8 комбинируют с фрагментом ДН К-4, а затем св зывают со следующими двум химически синтезированными олигодезоксирибонуклеотидными адаптерами (d) и (е).

(d) S -TGAGGCCAAGCCCTGGTATGAGCTCAT- 3

3--CCGGTTCGGGACCATACTCGA-51 И

(е) 5 -CTATCTGGGAGGGGTCTTCCAG-3p 3--GTAGATAGACCCTCCCCAGAAAGGTC-5

К полученному ДНК-фрагменту, использу Т4-ДНК-лигазу, дополнительно прив зывают фрагмент ДНК-6 и фрагмент ДНК-7. Результирующий ДНК-фрагмент именуют PL-ДНК-фрагментом.

Экспрессионную плазмиду pHPL-115 стро по методике примера 1, но вместо NV-ДНК-фрагмента используют PL-ДНК- фрагмент.

2. Получение ФНО-1151.

По методике примера 1-(2) получают трансформант HB101(pHPL-115).

Тра нсформант (НВ101(рНРЫ15) культивируют в течение ночи при 30°С в бульоне LB (состава: 1 % триптона. 0,5% дрожжевого экстракта, 1% NaCI, pH 7,5). Культуру иноку- лируют в 10 объемах модифицированной среды М9 (1,5% Na2HP04-12H20, 0,3% КН2РО4. 0,05% NaCI. 0.1% МЩС, 2 мг/л витамина В1,0,45% касаминовой кислоты, 1 мМ MgaSO, 0,1 мМ CaCIa и 0,4% глицерина) содержащей ампициллин в количестве 25 мкг/мл. при 37°С в течение 1 ч.

Затем добавл ют 3-индолакриловую кислоту до конечной концентрации 20 мкг/мл. После этого культивирование дополнительно продолжают в течение 24 ч. клетки собирают центрифугированием, суспендируют в 50 мМ буфера трис-HCI (рН 8), содержащего О 1 % лизоцима и 30 мП .l и оставл ют в

лед ной ванне в течение 30 мин После этого суспензию клеток многократно обрабатывают замораживанием (сухой лед-этанол) и оттаиванием (при 37°С), клеточный экстракт

собирают центрифугированием.

Клеточный экстракт диализуют в буфере 20 мМ трис-HCI (рН 7,8), диализат центрифугируют . Йадосадочную жидкость нанос т на колонку ДЭАЗ-Сефзроза CL-6B, предвари0 тельно уравновешенную с помощью 20 мМ буфера трис-HCI (рН 7,8). После промывки колонки тем же буфером дл удалени неадсорбированных компонентов, требуемый полипёптид элюируют с использованием

5 линейного градиента концентрации NaCI от О до 0,3 М в том же буфере. Каждую фракцию подвергают ДСН-полиакриламидному гель- электрофорезу и фракции, содержащие полипептид , имеющий молекул рную массу

0 около 17 килодальтонов, собирают и объедин ют .

Объединенную фракцию диализируют относительно 20 мМ буфера трис-HCI (рН 7,8), а затем ее снова подвергают хроматог5 рафии в колонке ДЭАЭ-сефароза CL-бВ описанным образом, но элюирование провод т в услови х более слабого градиента концентрации Nad.

Фракции, содержащие целевой пол0 ипептид собирают, объедин ют и концентрируют с помощью аппарата Диафлоу с использованием мембраны УМ 10.

Наконец, концентрат подвергают гель- фильтрации на колонке Бзйо-Гель Р-6 с

5 использованием содержащего фосфатный буфер солевого раствора в качестве элюен- та дл получени очищенного ФН02-1 t5L

3. Определение аминокислотной последовательность .

0 Аминокислотные последовательности очищенного OHO-115L и его пептидного фрагмента анализируют с помощью автоматизированного разложени по Эрдману на приборе дл определени последовательно5 сти аминокислот в белках.

Пептидный фрагмент получают в следующих услови х, 500 мкг очищенного ФНО-115L инкубируют с 10 мкг лизил-эндо- пептидазы в 5 мМ буфера трис-HCI (рН 8),

0 содержащего 4 М мочевину в общем обьеме 0,1 мл. После инкубировани при 35°С в течение 15 ч, результирующие переваренные пептиды выдел ют высокоэффективной жидкостью и хроматографией, в услови х

5 линейноградиентного элюировани от 10% до 50% ацетонитрила, содержащего 0,07% трифторуксусной кислоты, в 0,1% трифто- руксусной кислоте, при расходе 1 мл/мин в течение 60 мин. Пептидные фрагменты выдел ют из каждой фракции и подвергают ИУ

аминокислотные последовательности анализу с помощью метода автоматического разложени по Эдману.

Подтверждено, что аминокислота в положении 115 от L-конца ФНО-115L вл етс лейциновым остатком.

N-концева аминокислота очищенного ФНО-115L вл етс сериновым остатком, что указывает на удаление метионинового остатка, обусловленного кодоном запуска трансл ции (АТС).

Пример 6. Получение других полипептидных мутантов-1 человеческого ФИО,

1.Построение экспрессионных плаз- мид.

Экспрессионную плазмиду дл получени полипептида, состо щего из 155 аминокислот и имеющего аминокислотную последовательность, в которой аспарагино- вый остаток в положении 32 от N-конца за- менен другой аминокислотой, например His, Asp и Ser стро т по методике примера 2-{1), за исключением того, что вместо синтетического адаптера (а) используют один из приведенных ниже химически синтези- ровэнных Олигодезоксирибонуклеотидных аде п торов:

5 -CGGGCCCACGCCCTCC-3

3 -CCGGGTGCGGG-5

(дл замены остатком His)

S -CGGGCCGATGCCCTCC-S

3 -CCGGCTACGGG-5 (дл замены остатком Asp) или

5 -CGGGCCAGCGCCCTCC-3

3 -CCGGTCGCGGG-5

(дл замены остатком Ser).

Эти плазмиды обозначены как соответственно: рНТР32Н. pHTP32D. pHTP32S.

2.Получение полипептидного мутанта человеческого ФНО.

Каждую из экстрессионных плазмид, полученных в разделе 1. ввод т в E.coll НВ101 традиционным методом, и трансформант культивируют по методике примера 2-(2).

Целевой полипептид очищают от клеточного экстракта по методике примера 2-(2).

Пример 7. Получение других полипептидных мутантов-2 человеческого ФНО.

1. Построение экспрессионных плазмид .

Экспрессионную плазмиду дл получени полипептида, состо щего из 155 аминокислот и имеющего аминокислотную последовательность, в которой пролиновый остаток в 115-м положении от N-конца заменен другой аминокислотой, например Ser, Asp и Gly стро т по методике примера 2-(1): за исключением использовани одного из

химически синтезированных Олигодезоксирибонуклеотидных адаптеров, приведенных ниже, вместо синтетического адаптера (d): 5 -TGAGGCCAAGCCCTGGTATGAGTCCAT-3

S -CCGGTTCGGGACCATACTCAG-S (дл замены остатком Ser) S -TGAGGCCAAGCCCTGGTATGAGGACAT-S1

S -CCGGTTCGGGACCATACTCCC-S1 (дл замены остатком Asp) 5--TGAGGCCAAGCCCTGGTATGAGGGCAT-3

S -CCGGTTCGGGACCATACTCCC-S (дл замены остатком Gly).

Эти плазмиды обозначены как pHTP115S. pHTP115D. pHTP115G1. соответственно .

2. Получение полипептидных мутантов человеческого ФНО.

Каждую из экспрессионных плазмид. полученных в разделе 1 ввод т в E.coli НВ101 обычным путем, и трансформант культивируют по методике примера 2-{2).

Целевой полипептид выдел ют и очищают из клеточного экстракта по методике примера 2-(2).

Пример 8. Получение полипептидного мутанта ФНО 117Н-человеческого ФИО. обозначенного ФНО-117Н,

1.Построение зкспрессионных плазмид .

Экспрессионную плазмиду дл получени полипептида, состо щего из 155 аминокислот и имеющего аминокислотную последовательность, соответствующую последовательности от аминокислоты N 1 до № 155 в табл.1, в которой тирозиновый остаток в 117-м положении с N-конца заменен на другую кислоту, например His стро т по методике примера 2-(1), за исключением использовани приведенного ниже химически синтезированного олигодезоксирибонукле- отидного адаптера вместо синтетического адаптера (е):

S -CCATCTGGGAGGGGTCTTCCAGrS 3M3TAGGTAGACCCTCCCCAGAAGGTC-51 Данна плазмида обозначена как РНТР117Н.

2.Получение ФНО-117Н Экспрессионную плазмиду, полученную в разделе(1) ввод т в E.coli HB101 обычным путем, и трансформант культивируют по методике примера 2-(2).

Целевой полипептид выдел ют и очищают из клеточного экстракта по существу по методике примера 2-(2).

Пример 9. Получение других полипептидных мутантов ФНО человека.

По методике примера 2-(1) конструиру- ют экспрессионные плазмиды. рНГР1бдл получени ФНО-16У, рНТКШ Лпч ФИО

31Т, HTP36V - дл OHO-36V, pHTP73P - дл ФНО-73Р. рНТР98Н - дл ФНО-98Н, рНТР103Р-дл ФНО-103Р,рНТР115Т-дл ФНО-115Н, рНТР115Н - дл ФНО-115Н, рНТР1311-дл ФНО-1311 ирНТР143-дл ФНО-143У, которыми трансформируют Escherlchla coli. Трансформанты культивируют и затем полипептиды выдел ют и очищают по методике примера 2-(2) со следующими результатами:

CPHO-16V - полипептид с аминокислотной последовательностью формулы (1), в которой 16-ый Ala заменен Val (выход 17,5 мг/л);

ФНО-31Т - полипептид с аминокислот- ной последовательностью формулы (1), в которой 31-ый Ala заменен Thr (выход 26,4 мг/л);

ФНО-36У - полипептид с аминокислотной последовательностью формулы (1), в ко- торой 36-ой Ala заменен Val (выход 8,9 мг/л):

ФНО-73Р - полипептид с аминокислотной последовательностью формулы (1), в которой 73-ий Leu заменен Pro (выход 2,1 мг/л);

ФНО-98Н-полипептид с аминокислотной последовательностью формулы (1), в которой 98-ой Pro заменен His (выход 3,2 мг/л);

ФНО-ЮЗР - полипептид с аминокис- лотной последовательностью формулы (1), в которой 103-ий Thr заменен Pro (выход 15,9 мг/л);

ФНО-115Т - полипептид с аминокислотной последовательностью формулы (1), в которой 115-ый Pro заменен Thr (выход 20,5 мг/л);

ФНО-115Н - полипептид с аминокислотной последовательностью формулы (1), в которой 115-ый Pro заменен His (выход 23,2 мг/л);

ФНО-1311 - полипептид с аминокислотной последовательностью формулы (1), в которой 131-ый Ser заменен Не (выход 17 мг/л);

ФНО-143 - полипептид с аминокислотной последовательностью формулы (1). в которой 143-ий Ala заменен Val (выход 16,5 мг/л).

Claims

Формула изобретени

Способ получени полипептида со свойствами фактора некроза опухоли, предусматривающий конструирование реком- бинантной плазмидной ДНК с мутацией в гене, кодирующем фактор некроза опухоли, трансформацию полученными ДНК штаммов Escherichia coli, культивирование, выделение и очистку конечного продукта с

последующим определением аминокислотной последовательности и целевого белка, отличающийс тем, что, с целью повышени противоопухолевой активности In vivo, при низкой цитотоксической активности In vitro конструируют рекомбинант- ные плазмидные ДНК pHTP16V, pHTP31T, pHTP32S pHTP32D. рНТР32Н. рНМУ-32, pHTP36V, pHTP73P, pHTP98P, pHTP103f pHPL-115, pHTP115H, pHTP115D. PHTP115S, pHTP115G, pHTP115T, pHTP117P, pHTP1311 или pHTP143V, трансформируют плазмидами бактерии штамма Escherlchla coll HB101, а очистку целевого продукта осуществл ют нанесением клеточного лизата на колонку с ДЭАЭ-Сефарозой. уравновешенную 20 мМ трис-HCI буфером при рН 7,8, элюирование провод т с помощью линейного градиента концентрации NaCI от 0 до 0,3 М в том же буфере, затем осуществл ют полиакриламидный гельзлек- трофорез. полученную фракцию диализуют с помощью 20 мМ буфера трис-HCI рН 7,8 и нанос т на колонку с ДЭАЗ-Сефарозой, а элюирование провод т с помощью слабого градиента NaCI, элюат концентрируют , концентрат подвергают очистке гельфильтрацией с использованием фос- фатсодержащего буфера в качестве злюен- та, при этом целевой белок характеризуетс следующей аминокислотной последовательностью:

Ser Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Val Ala His Val Va Ala Asn Pro Glu Ala Glu Gly Gin Leu Gin Trp Leu Asn Aro Arg Ala Asn Ala Leu Leu Ara Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn Gin Leu Val Val Pro Ser Glu Gly Leu Tyr Leu lie Tyr Ser Glu Val Leu Phe Lys Gly Gin Gly Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu Thr His Thr lie Ser Arg jle Ala Val Ser Tyr Gin Thr Lys Val Asn Leu Leu Ser Ala le Lys Ser Pro Cys Gin Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala Lys Pro Trp Tyr Glu Pso lie Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gin Leu Glu Lys Gly Asp Aro Leu Ser Ala Glu jle Asn Arg Pro Asp Tyr Leu Asp Phe Ala Glu Ser Gly Gin Val Tyr Phe Gly lie fie Ala

с заменой 16-й аминокислоты Ala на Val 31-ой - -Ala- - Thr 326-ой Asn Asp, His, Ser или Туг 36-ой Ala Val 73-ей Leu Pro 98-ой 103-ей - -Thr- -Pro 115-ой - -Pro- - Leu, His, Ser, Gly. Asp или

117-ой-н-Туг- -His 131-ой- -Ser- - lie 143-ей- -Ala- -Val