JP3366339B2 - 高効率発現ベクターを用いてサッカロミセスセレビジエから再組合蛋白質を製造する方法 - Google Patents

高効率発現ベクターを用いてサッカロミセスセレビジエから再組合蛋白質を製造する方法

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Description

【発明の詳細な説明】 発明の背景 本発明はDNA組換え技術を利用して酵母から組換え蛋
白質を製造する方法に関するものである。更に詳しくは
本発明は酵母由来遺伝子２種のプロモーター（promoto
r）でなった複合プロモーター、及び酵母の殺傷毒素及
びインタルキン（interleukin）１β（IL−１β）のア
ミノ酸末から構成された分泌信号を有する酵母発現ベク
ターを利用して組換え蛋白質を製造する方法に関するも
のである。
また、本発明は酵母の熱刺激蛋白質150（heat shock
Protein 150）のプロモーターと分泌信号を包含する酵
母発現ベクターを利用して、酵母からhGCSFとhGHのよう
な組換え蛋白質を製造する方法に関するものである。
また、本発明は組換え蛋白質遺伝子を容易に挿入する
ことができるように挿入されたXba I切断部位を有する
酵母発現ベクターを利用して組換え蛋白質を製造する方
法に関するものである。
本発明の発現ベクターを利用して、人間顆粒球群体刺
激因子（human granulocyte colony−stimulating fact
or;hGCSF）及び人間成長ホルモン（human growth hormo
ne;hGH）のような組換え蛋白質らが高い分泌効率で生産
されることができる。骨髄分化増殖実験を通じて人体内
に好中球界顆粒球または単球性大食細胞の群体が形成さ
れる事実が知られているし、これから生体内群体形成を
刺激する因子が存在すると知られている［J.Cell.Comp.
Physiol.66:319（1965）;Aust.J.Exp.Biol.Med.Sci.44:
287（1966）］。
群体形成刺激因子（Colony Stimulating Factor:以下
‘CSF'と略す）と総称される該因子らは生物学的活性の
特異性に従い次のように分類する。
（ｉ）GM−CSF（顆粒球及び大食細胞刺激因子）は顆粒
性白血球または単球性大食細胞の幹細胞を増殖、分化さ
せ群体を形成させて、（ii）Ｍ−CSF（大食細胞刺激因
子）は単球性大食細胞の群体を形成させ、（iii）multi
−CSF（多能性細胞刺激因子）は微分化された多能性幹
細胞を刺激して群体を形成させ、（iv）Ｇ−CSF（顆粒
球刺激因子）は顆粒性白血球群体を形成させる［J.B.C.
252:1998−2033（1977）、J.B.C.252:4045−4052（197
7）、Biochem.J.185:341−343（1980）、J.B.C.258:901
7−9021（1983）］。
GCSHは約20KDaの糖蛋白質として単核細胞、単球性大
食細胞、上皮細胞及び繊維芽細胞のような細胞から生成
される。また人のGCSH（以下、‘hGCSF'と略す）遺伝子
は17番染色体に存在する。GCSFは生体外で好中球の群集
形成を刺激し、IL−３と共に作用して芽細胞、大食細胞
の群体形成を刺激し、一部白血病マイエロマー細胞主は
GCSFにより成熟されるものと知られている。生体内では
好中球数を増加させ、単核細胞の数も増加させる。
hGCSFの臨床的用途は次の通りである。
第一、hGCSFは忠実性腫瘍及び血液悪性腫瘍患者の好
中球減少症に用量依存的に好中球の数を増加させる。
第二、hGCSFは悪性リンパ腫、肺炎、睾丸腫瘍、尿道
上皮癌、急性白血病などに対する化学療法による好中球
減少症を迅速に回復させる。
第三、hGCSFは急性非リンパ性白血病及び慢性骨髄白
血病の骨髄移植の際好中球の数を増加させる。
第四、hGCSFは骨髄異形性症候群による好中球減少症
を迅速に回復させる。
第五、hGCSFは再生不良性貧血にしたがう好中球減少
症を迅速に回復させる。
第六、hGCSFは先天性及び特発症好中球減少症に有用
である。
第七、hGCSFは抗腫瘍化学療法による粘膜炎、熱性好
中球減少症の発生を防止したり減少させる（Drug Evalu
ations Annual1993、American Medical Associations p
2232−2333）。
人間成長ホルモン（以下、‘hGH'と略す）は配糖体と
結合されていなく191個のアミノ酸でなっているし、脳
下垂体前葉より分泌される。分子内二黄化結合を２個有
しているhGHは分子量が22、000ダルトンである。hGHは
最初は前駆体として合成され工程を経てその細胞から分
泌される。
hGHは大人になる前に大量生産され、生存期間中生産
される。
hGHは正常的な成長と発育のために必要であり、hGHが
非正常的に少量生産されると幾つかの矮小発育症が表れ
るしhGHが過度生産されると巨大症または巨大発育症が
表れることもある。
hGHは色々生物学的活性を表し、多様な組織に対して
直接的または間接的に反応する。hGHは線上骨成長速度
及び乳汁分泌に影響を及ぼし糖尿病性インシュリン類似
活性を示す。またhGHは蛋白質合成を増進させて脂質と
炭水化物の代謝作用に影響を及ぼす。
hGHの臨床的用途は次の通りである。
hGHが欠乏され惹起された矮小発育症の場合、小児期
にhGHを投与すれば非正常的な成長を回復させることが
できるものと知られている［Raben、M.S.、J.Clin.Endo
cr.18:901−904（1958）］。hGHはまた肥満症治療に使
用されるし、骨折、火傷、胃出血などのような多様な病
気の治療に効果的である［Proc.of NIAMDD Symp.Publ.
No.74−612（ed.Raiti、S.）（Baltimore、Maryland、1
973）］。
hGH DNAの基本配列は該遺伝子をcDNAでクローニング
して分かることができるし、大腸菌からhGH DNAの発現
が報告されている［Martial et al.、Science 205:602
−605（1979）］。
組換え蛋白質を大量得るため色々遺伝工学的方法が試
みて来た。
先ず、目標遺伝子をクローニングして大腸菌から蛋白
質を発現させる方法が試された［Science 232:61−64
（1986）］。しかし、大腸菌を宿主細胞に使用する場合
には次のような問題点がある。
人体内で蛋白質は先ず前駆体に作られ蛋白質分解によ
り成熟された形態になる。
しかし、大腸菌から蛋白質を発現させる場合には人体
内においてと同様に合成された蛋白質のＮ−末端メチオ
ニンがアミノペプチダーゼにより効果的に除去されず、
それによりメチオニンのある蛋白質とない蛋白質が大腸
菌の細胞質内に混在することもできる。メチオニンのあ
る蛋白質とメチオニンのない蛋白質を互いに分離するこ
とは極めて難しい。
大体の場合、蛋白質は不活性または不溶性状態に発現
されるし脱変性過程（リポルディング）を通じて生物学
的に活性を有した蛋白質に換えてやるが、この際蛋白質
の回収率が相当減少することが多い。
また、精製時バクテリア内毒素（endotoxin）により
汚染される問題もある。
また、大腸菌では蛋白質の翻訳後修飾（post−transl
ational modification）過程がない（例:hGCSHのグリコ
シレーション（glycosylation） 次はクローニングされた目標遺伝子をCHU−２（人間G
CSH生産癌細胞主）または中国産ハムスター卵巣細胞な
どの動物細胞で発現させた。
しかし、動物細胞を宿主細胞にする場合は細胞培養時
値高い血清を使用しなければならないので培養条件が気
むずかしく、大量の培養液から微量の蛋白質を精製しな
ければならないので収率が余りにも少ないという問題点
がある［EMBO J.5:871−876（1980）］（大韓民国特許9
1−5624）。
前記した通り既存の技術らが持っている問題点を解決
するため酵母宿主細胞を利用した発現システムが開発さ
れた。組換え酵母から望むポリペプチドまたは蛋白質を
大量得る方法がLoisonなどによりよく知られている［Bi
o/Technol.4:433−437（1986）;Burrow、Baker's yeas
t、p349−420、in The Yeast vol.3、Rose and Harriso
n、eds.Academic Press、London（1979）］組換え酵母
の発現システムは動物細胞または大腸菌を利用するとき
得られない多い利点を有している。
本発明者達は酵母を利用してhGCSFを製造する方法に
対して研究した。酵母は米国FDAから人体に対する安全
性が認められ、遺伝子発現調節の原理も大部分知らされ
ている［Strathernなど、The Molecular Biology of th
e Yeast Saccharomyces、Metabolism and Gene Express
ion、Cold Spring Harbor Laboratory、N.Y.（198
2）］。
酵母を宿主細胞で使用する場合一般的に人体組織に安
全なものと認められているし、高濃度培養が可能でhGCS
Fを大量生産することができるし、信号ペプチドを利用
して可溶性蛋白質を細胞外に分泌させることができ精製
過程が単純である。
最近Ｂ型肝炎ビールス、インターフェロン、カーフキ
モシン（calf chymosin）、上皮細胞成長因子（epiderm
al growth factor）のような異種蛋白質を酵母から発現
させる方法が報告されている［Valensuelaなど、Nature
298:347−350（1982）;Hitzemanなど、NAR 11:2745−27
63（1983）;McAleerなど、Nature307:178−180（198
4）;Tuiteなど、EMBO、J.1:603−608（1982）;Mellorな
ど、Gene24:1−14（1983）;Urdeaなど、PNAS80:7461−7
465（1983））。
しかし組換え酵母から異種蛋白質を発現させる場合一
般的に酵母から同種蛋白質を発現させた場合と比して極
めて少量生産されるという問題点があって、多い研究者
達が色々発現ベクターを開発して酵母から異種蛋白質発
現を増加させようと努力している［Chenなど、NAR12:89
51−8970（1984）］。
例えば、ヨーロッパ特許84303833には外部目標遺伝子
と酵母のGAL1プロモーターを有しているクローニングベ
クターを利用して酵母からガラクトキナーゼ−ボバイン
プロカイモシン（galactokinase−bovine prochymosi
n）融合蛋白質を生産する方法が開示されている。ま
た、外部遺伝子とGAL1プロモーターを包含する発現ベク
ターに酵母遺伝子であるGAL4を挿入した場合ガラクトー
スにより転写水準を調節してGAL4蛋白質の発現を増加さ
せることで外部蛋白質の生産性を高めることができる
［Laughonなど、PNAS79:6827−6831（1982）］。
ヨーロッパ特許84302723には交配因子α（mating fac
torα）のプロモーターと信号配列を使用して人間イン
ターフェロン、人間血清アルブミン、ボバイン（bovin
e）インターフェロンα−１、α−２、組織プラスミノ
ゲン活性因子（tissue plasminogen activator）、レニ
ーン（rennin）、人間インシュリン類似成長因子（huma
n insulin−like growth factor）などを酵母から発現
させる方法が出ている。
発明の概要 本発明の目的はDNA組換え技術を利用して酵母から組
換え蛋白質を製造する方法を提供にある。具体的に本発
明は酵母由来遺伝子２種のプロモーターで作られた複合
プロモーター、及び酵母の殺傷毒素及び成熟インタルキ
ン１β（IL−１β）のアミノ末端から構成された分泌信
号を有する酵母発現ベクターを用いて組換え蛋白質を製
造する方法を提供する。
本発明の目的は酵母の熱刺激蛋白質150のプロモータ
ーと分泌信号からなる発現ベクターを利用して酵母から
hGCSFを製造する方法の提供にある。
本発明の他の目的は組換え蛋白質遺伝子を容易に挿入
できるようにXba I切断部位を有する酵母発現ベクター
を利用して組換え蛋白質を製造する方法を提供にある。
図面の簡単な説明 図１はYEp2−ｋの製造過程を示したものである。
図２はYEp2KIL20GCの製造過程を示したものである。
図３はpIL20GCの製造過程を示したものである。
図４はYEpHSPGCの製造過程を示したものである。
図５は殺傷毒素先導配列、IL−１βのＮ−末端24個残
基及びhGCSFからなるアミノ酸配列と信号ペプチダーゼ
とKEX2ペプチダーゼにより切断される部位を示したもの
である。
図６は酵母から発現されたhGCSFをSDS−PAGEで分析し
た結果を示したものである。
図７は酵母発現ベクターYEpHSPGCを使用して酵母から
発現されたhGCSFのウェスタンブロット（Western blo
t）結果を示したものである。
図８は細胞、エタノール、hGCSF濃度及びプラスミド
安定度の時間に従い変化を示したグラフである。
図９は酵母から発現されたhGCSFのSDS−PAGE分析結果
を示したものである。
図10は細胞、エタノール、hGH濃度及びプラスミド安
定度の時間に従う変化を示したグラフである。
図11は酵母から発現されたhGHのSDS−PAGE分析結果を
示したものである。
図12は殺傷毒素先導配列、IL−１のＮ−末端24個残基
及びhGHでなるアミノ酸配列と信号ペプチダーゼとKEX2
ペプチダーゼにより切断される部位を示したものであ
る。
図13はpIL20XGHの地図を示したものである。
図14は酵母培養液からhGCSFを精製する過程を示した
ものである。
図15はセパクリルＳ−200コラムクロマトグラフィー
（Sephacryl S−200 column chromatograpy）によるhGC
SFの精製過程を示したものである。
図16はhGCSF精製過程の最後の段階を示したものであ
る。
発明の詳細な説明 本発明者達は酵母から組換えhGCSFを大量生産するた
めには発現水準ばかりでなく分泌効率も増進させなけれ
ばならない点に着目した。
成熟hGCSFを分泌させるためにはhGCSFのアミノ末端部
位に多数の分泌信号を接合させたが、分泌が容易でなか
った。
一方、インタルキン−１βは分泌信号により酵母から
極めて効率的に細胞外に分泌されると報告されたことが
ある。［EMBO J.6:229−234（1987）］。これに本発明
者達はIL−１βのアミノ末端のアミノ酸らが発現された
hGCSFを酵母細胞外に分泌させるのに役に立つだろうと
いう点に着目した。本発明者達はそれで殺傷毒素分泌信
号とIL−１βのアミノ酸20個でなった融合ペプチドをhG
CSF遺伝子前に配置させたときhGCSFが成功的に発現及び
分泌されるのを発見した。このときIL−１βのＮ−末端
24個残基とhGCSFの間に二塩基KEX2切断部位を配置し、
分泌途中KEX2酵素（エンドペプチダーゼ）の蛋白質分解
作用により成熟されたhGCSFが放出されるようにした。
前記のような発現ベクターは殺傷毒素分泌信号−IL−
１βの24個アミノ酸−KEX2切断部位−成熟hGCSFの配列
を有する。前記発現ベクターを利用して発現される蛋白
質は次のような段階を通じて分泌される：合成される蛋
白質がゴルジ（Golgi）内に移動される間に信号ペプチ
ダーゼにより信号ペプチドが切られ、KEX2ペプチダーゼ
によりIL−１β部位が切られ、次に正確なアミノ末端配
列を有する成熟hGCSFが最終的に分泌される。
本発明で使用したhGCSF発現ベクターをより詳しく説
明すれば次の通りである。
hGCSF発現ベクターは、酵母発現ベクターYEpsecl−hI
1［C.Baldariなど、EMBO J.6:229−234（1987）］でCYC
−１プロモーターの代わりに置換されたMF−α１プロモ
ーター；酵母のコードン使用に従い最適化された殺傷毒
素の先導配列（leader sequence）及びIL−１βの24個
アミノ末端で構成された複合分泌信号:hGCSF遺伝子；及
びGAL遺伝子活性化剤であるGAL4で構成されている。該
発現ベクターによりサッカロミセスセレビジエを形質転
換させてウラシルのない最少培地で正しい形質転換体を
選別してhGCSF生産菌株に使用した。該選別された形質
転換体を高濃度培養して組換え遺伝子を発現させた結
果、細胞外hGCSFが大量生産されたし、細胞成長のため
の培養条件及び発酵槽でhGCSF生産が体系的に最適化さ
れた。
本発明者達はまた温度差異により組換えhGCSFの発現
が調節されることができるし、熱衝撃蛋白質のプロモー
ター及び信号先導ペプチドからなる発現ベクターを開発
した。ガラクトースにより誘導されるGALプロモータ
ー、リン（燐）が枯渇され誘導されるPho5プロモータ
ー、ブドウ糖が枯渇され誘導されるADH IIプロモーター
のような誘導可能な他の酵母プロモーターらとは異に熱
衝撃蛋白質（HSP）のプロモーターは温度調節（37〜42
℃）のみで転写を調節して蛋白質合成を調節する。そし
てHSPは先導配列により細胞外に分泌される（PNAS、89:
3671−3675）。本発明者らはHSP150プロモーターとHSP
の先導配列により構築された発現ベクターを利用してhG
CSFを製造する方法を開発した。
また発明者らは他の異種遺伝子の挿入を容易にするた
め、前記言及した交配因子αプロモーターに基づいた発
現ベクターでIL−１βのアミノ酸配列とKEX2前端部位の
間にXba I部位を挿入した。
前記発現ベクターは他の組換え蛋白質の製造に使用さ
れえる。具体的に本発明では、Xba I−BamH I切片をク
ローニング部位に利用してhGHの構造遺伝子を前記発現
ベクターに挿入し、そのhGHは選別された形質転換体か
ら成功的に発現された。また前記選別された形質転換体
の高濃度培養で、hGHが成功的に合成され培養器の細胞
外培地に大量分泌された。
本発明ではたとえhGCSFとhGHを製造するためにのみ前
記発現ベクターを使用したが、前記発現ベクターは他の
組換え蛋白質を生産するためにも使用され得ることを言
及する必要がある。
前記高濃度培養で生産されたhGHの量は1g/L以上であ
り、これは過去報告されている他の酵母由来組換え蛋白
質の培養収率に比べれば相対的に極めて高いものであ
る。したがって、殺傷毒素先導配列−IL−１β−hGHの
アミノ末端24個残基を包含する配列を融合信号ペプチド
に使用する発現ベクターを利用して他の組換え蛋白質を
酵母から効果的に発現させることが可能である。
次の実施例を通じて本発明の内容を更に詳述しようと
する。
実施例は本発明を例示するだけのものであり、本発明
の内容を限定するものではない。
1.YEp2−ｋ製造 発現ベクターYEpsecl−hI1はGal1、10遺伝子の上流性
配列（upstream activation sequence）、CYC−１プロ
モーター、クルイベロマイセスラクチス（kluyveromyce
s lactis）の殺傷毒素先導配列［M.J.R.Starkなど、NAR
12:6011−6031、（1984）］、及びインタルキン−１β
遺伝子で構成されているが、誘導剤であるガラクトスに
よりIL−１βが発現される。
ベクターYEpsecl−hI1をより効率的に作るために殺傷
毒素先導配列を最適化し、CYC−１プロモーターを一層
効率的であるMFα１プロモーターで置換させた。
mRNA転写終結のためGAPDHの転写終結体をhGCSFの３′
側に入れてやってGal遺伝子の活性化剤であるGal4遺伝
子をクローニングして発現ベクターに入れた。
１）殺傷毒素先導配列コードンの最適化 YEpsec−okの製造 ＜実施例１＞殺傷毒素先導配列オリゴヌクレオチドの合
成 酵母発現ベクターYEpsecl−hIlの殺傷毒素先導配列コ
ードンを、サッカロミセスセレビジエから多量に発現さ
れる蛋白質を暗号化するコードンに置換させるため、配
列番号１の配列を有するオリゴヌクレオチドを合成器
（ABI、392DNA/RNA synthesizer）で合成した。（J.Ben
netzen、B.Hall J.Biol.Chem.257:3026−3031）。
YEpsecl−hIlの殺傷毒素先導配列を切り取った所に合
成したオリゴヌクレオチドを挿入するために次の通り処
理した。各オリゴヌクレオチド５′−末端をATPを含ん
だ反応溶液［70mM Tris−HCl（pH7.6）、10mM MgCl2、5
mM DTT（dithiothreitol）］30μｌでT4ポリヌクレオチ
ドキナーゼ（T4polynucleotide kinase;NEB）を利用し
て37℃で１時間反応させ燐酸化させた。二つの反応液を
混ぜ20分間放置した。オリゴヌクレオチドを30℃に徐々
に冷ませながらアニーリング（annealing）させた。
＜実施例２＞YEpsecl−hIl切断 １μｇのYEpsecl−hIlを反応液［20mM Tris−アセテ
ート、10mM酢酸マグネシウム、20mM酢酸カリウム］40μ
ｌで制限酵素（Sac I、Kpn I;NEB）で37℃で１時間反応
させたあと、１％平板アガロスゲルで電気泳動分離し
た。分離のあと、8.4kbのバンドを切り取りJetsorb（GE
NOMED、cat＃110300）を利用して切り取ったDNAバンド
からDNAを溶出して精製した。
＜実施例３＞DNA連結及び形質転換 実施例１でアニリングされた殺傷毒素先導配列のオリ
ゴヌクレオチドと実施例２で制限酵素Sac I、Kpn Iで切
り取られたYEpsecl−hIlを、50mM Tris−HCl、10mM MgC
l2、10mM DTT及び1mM ATPで構成された反応液30μｌに
溶解させ、T4DNAリガーゼ100単位を加えて16℃で一晩反
応させた。Molecular Cloning A Laboratory Manual（S
ambrook、Fritch、Mantiatis.2nd edition.CSH）にした
がい反応液をCaCl2方法で大腸菌XL−1 Blue（supE44hsd
R17recA1 endA1gyrA46thi re1Al Iac- F′［proAB+1acIq
1acZ△M15Tn10（tetr）］）を形質転換させた。形質転
換させたあと、LB−Amp寒天固形培地（10g/1トリプト
ン、5g/1酵母抽出物、10g/l NaCl、100μg/mlアンピシ
リン）に形質転換された大腸菌を塗抹して37℃で20時間
培養した。アンピシリン耐性形質転換体（AmpR）のコロ
ニー（colony）を1.5mlの液体LB−Amp培地で培養した
後、アルカリ溶出方法でプラスミドを溶出させRPM回転
フィルター（BIO101）を利用して精製した。コードン最
適化により殺傷毒素先導配列で制限酵素Sma I所がなく
なるため、制限酵素Sma Iを処理して切断されないプラ
スミドを選り出してYEpsec−okと命名した。
＜実施例４＞単鎖DNA コードン最適化のため置換させた殺傷毒素先導コード
ンの塩基配列を確認するためYEpsec−ok配列分析（sequ
encing）を遂行した。配列分析に必要な単鎖（single−
strand）DNAを作るため次の通り実施した。
実施例３で得たYEpsec−okを更に制限酵素BamH I、Sa
c Iで切断し1.5％アガロスゲルで電気泳動したあと、0.
66kbのDNA切片を切り出した。GENE CLEAN KIT IIを使用
してアガロスゲルで該DNAを溶出し出した。ベクターM13
mp19 1μｇを制限酵素BamH I、Sac Iで切断したあと、G
ENE CHEAN KIT IIを使用して精製した。0.66kbのDNAとM
13mp19を連結（ligation）反応液中でT4DNAリガーゼを
加えて16℃で一晩反応させた。形質転換可能な大腸菌XL
−１ Blueを反応液で形質転換させたあと、Molecular
Cioning A Laboratory Manual（ibid）にしたがい単鎖D
NAを分離した。より詳しくは、一晩培養した、XL−1 Bl
ue培養液200μｌ、Ｘ−Gal（ジメチルホルムアミド中20
mg/ml）40μｌ、IPTG（200mg/ml）４μｌを寒天と一緒
に混ぜ、その混合液をLB固形寒天培地に敷いた。形質転
換された大腸菌を37℃で培養したあと、寒天培地上にで
きた白いプラク（plaque）１個を取った。取ったプラク
を37℃で200μｌのXL−1 Blueと一緒に20mlのLBに接種
して、250rpmで５時間振盪した。培養液を遠心分離し、
上層液に1/5容積のPEG（2.5M NaCl中20％PEG8000）を入
れ氷りに15分間放置しておいた。更に遠心分離したあ
と、上層液を捨てた。沈殿されたM13ビールスペレット
（pellet）を200μl TE緩衝液（10mM Tris−HCl（pH7.
6）、1mM EDTA）に懸濁したあと、フェノール／クロロ
ホルム／イソアミルアルコール（25:24:1）で抽出し
た。遠心分離したあと、上層液に２倍容積のエタノール
を加えてDNAを沈殿させ、70％エタノールでDNAペレット
を洗滌した。ペレットを真空乾燥せたあと20μｌの蒸留
水に溶かした。
＜実施例５＞配列分析 ジデオキシ鎖停止DNA配列分析（dideoxy chain termi
nation DNA sequencing）方法で実施例４で製造された
単鎖プラスミドの塩基配列を分析した。配列分析に使用
された始発体はABI合成器で合成した。
塩基配列分析用オリゴDNAは配列番号２の配列を有す
る。
塩基配列分析結果配列番号３のようにコードンが最適
化された状態でコードン塩基が置換されたことがわかっ
た。
２）GAPDH（glyceraldehyde3−phosphatase dehydrogen
ase）の転写終結体（YEpsec−term）の製造 ＜実施例６＞オリゴヌクレオチドの合成 GAL1、10UAS（upsterm activation sequence）−MFα
１プロモーターに転写を終結させるため配列番号４の配
列を有するGAPDHの転写終結体を合成した。［J.Biol.Ch
em.245:839−845.（1979）］。
合成したあとOPC（oligo purification column）でオ
リゴヌクレオチドを精製し、実施例１の方法にしたがい
燐酸化させアニリングした。
＜実施例７＞YEpsecl−hIl切断 発現される遺伝子の下流（downsterm）にGAPDH転写終
結体を挿入するためYEpsecl−hIlを制限酵素BamH I、Sa
l Iで37℃で１時間処理した。切断されたプラスミドを
１％平板アガロスゲルで分離して約9kbのバンドを切り
出し、Jetsorbを利用して切り取ったバンドからDNAを溶
出した。
＜実施例８＞DNA連結及び形質転換 実施例６で燐酸化、アニリングさせたGAPDHの転写終
結体オリゴヌクレオチドと制限酵素BamH I、Sal Iで切
断されたYEpsec1−hI1をT4DNAリガーゼで16℃で連結さ
せた。
CaCl2方法にしたがい反応液で大腸菌XL−1Blueを形質
転換させて得たアンピシリン耐性形質転換体のコロニー
を1.5mlのLB−Amp培地で培養した。培養あとRPMフィル
ターでプラスミドを精製した。
制限酵素BamH I、Sal Iでプラスミドを切断したあ
と、８％PAGE（polyacrylamide gel electrophoresi
s）で電気泳動した。70bpのDNAバンドのあるプラスミド
をYEpsec−termと命名した。
３）YEpsec−ktの製造 ＜実施例９＞YEpsec−okの切断 １μｇのYEpsec−okを制限酵素Kpn I、Sal Iで37℃で
１時間切断したあと、１％平板アガロスゲルで分離し
た。約3.8kbのバンドを切り出しJetsorbを利用してDNA
を精製した。
＜実施例10＞YEpsec−termの切断 １μｇのYEpsec−termを制限酵素Kpn I、Sa1 Iで37℃
で１時間切断した。１％平板アガロスゲルでプラスミド
を分離して0.6kbのバンドを切り出しDNAを溶出した。
＜実施例11＞DNA連結及び形質転換の切断 実施例９で溶出し出した8.3kbのベクターと実施例10
で溶出し出した0.6kbの挿入部を連結反応液30μｌに溶
解させてT4DNAリガーゼを加えて反応させた。CaCl2方法
にしたがい反応液で大腸菌XL−1Blueを形質転換させ
た。アンピシリン耐性形質転換体のコロニーを1.5mlのL
B−Amp培地で培養したあと、RPM回転フィルターを利用
してプラスミドを分離した。制限酵素でプラスミドを切
断しYEpsec−okに転写終結体が挿入されたプラスミドを
YEpsec−ktと命名した。
４）CYC−１プロモーターをMFα１プロモーターで置換
（Yepαktの製造） 本来YEpsecl−hIlはガラクトス代謝に関与する遺伝子
らの活性化剤であるGal4蛋白質が結合するGAL1−10 UA
S調節部位とCYC−１プロモーターの複合プロモーターで
構成されているが、本発明においてはもっとより効率的
な転写開始点を有するMFα１プロモーター［Kurjanな
ど、Cell.30:933−943（1982）］でCYC−１プロモータ
ーを置換した。
＜実施例12＞MFα１プロモーターのPCR（polymerase c
hain reaction） クローニングの便宜のため適当な切断部位を有する始
発体を利用してPCRを実施してMFα１プロモーターを得
た。
各始発体の５′末端には制限酵素Sal I、Sac Iの切断
部位を有する。
MFα１の転写開始配列増幅用始発体はそれぞれ配列番
号５と配列番号６の配列を有する。
PCRに使用した鋳型はMFα１プロモーターを有するベ
クターp70αＴであった。
50pmolの各始発体、200μM dNTPを包含する100μｌの
反応液［10mM KCl、10mM（NH4）2SO4、20mM Tris−HCl
（pH8.8）、2mM MgSO4、0.1％トリトンＸ−100］に２単
位にVent DNA重合酵素を加えてPCR ROBOT（Fine社）を
使用して次のような温度条件下で35回反応させた。
前処理94℃、300秒； アニリング53℃、40秒； 重合反応72℃、40秒； 熱変成94℃、40秒 後処理53℃、300秒 増幅されたMFα１プロモーターを1.5％平板アガロス
ゲルで電気泳動して150bpのDNAバンドを確認してゲルか
ら溶出した。制限酵素Sal I、Sac Iで溶出されたDNAを
切断した。
＜実施例13＞YEpsec−ktの切断 １μｇのYEpsec−ktを制限酵素、Xho I、Sac Iで37℃
で１時間切断した。切断されたプラスミドを１％平板ア
ガロスゲルで分離して約8.8kbのDNAバンドを切り出した
あと、Jetsorbを利用してDNAを溶出した。
＜実施例14＞連結及び形質転換 実施例12でSal I、Sac Iで切断して製造したMFα１プ
ロモーターと実施例13でXho I、Sac Iで切断して製造し
た8.3kbのベクターを連結反応液30μｌ中でT4DNAリガー
ゼを加えて反応させた。反応液で大腸菌XL−1Blueを形
質転換させたあと、アンピシリン耐性形質転換体のコロ
ニーを1.5ml LB−Amp培地で培養したあと、プラスミド
を精製した。Xho I部位Sal I部位が旨く連結された場合
前記二制限酵素でプラスミドを切断することができない
ので、制限酵素Xho IとSal Iで切断できないプラスミド
を選別してYEpαktと命名した。
５）Gal4遺伝子（YEpα ktGAL4）の製造 ガラクトスが炭素源に存在するときガラクトス代謝に
関与する遺伝子ら（Ga17、10、１、Gal2、Mel1）は活性
化剤であるGAL4蛋白質により酵母で発現される［Johnst
oneなど、Proc.Natl.Acad.Sci.USA.79:6971−6975（198
2）］。
かかる誘導は各遺伝子の転写レベルで起こることにな
るが、GAl4蛋白質は転写活性因子として作用する。YEps
ec1−hI1のGal1（kinase）−Gal10（epimerase）にはGA
L4の結合部位であるUAS［Cirtonなど、J.Bacteriol.15
8:269−278（1984）］がある。YEpsec1−hI1は酵母２μ
circleの複製開始の高写本数（high−copy number）プ
ラスミドである。GAL4蛋白質は染色体DNAにより暗号化
されるのでガラクトスにより誘導されるときGAL1−10UA
Sで結合できるGAL4蛋白質の濃度が低い。充分発現させ
難い。GAL4蛋白質の量を充分維持させるためGal4遺伝子
をYEpsec1−hI1に挿入させた。
＜実施例15＞GAL4遺伝子のPCR GAL4遺伝子をPCRするためにそれぞれ配列番号７と配
列番号８の配列を有する始発体を合成した。
鋳型としてはサッカロミセスセレビジエ2805のゲノム
DNAを使用した。
PCRは次の組成で実施した:50pmolの各始発体、200μM
dNTPを包含する100μｌの反応液［10mM KCl、10mM（NH
4）2SO4、20mM Tris−HCl（pH8.8）、6mM MgSO4、0.1％
トリトンＸ−100］に２単位のVent DNA重合酵素を加え
てPCR ROBOT（Fine社）を使用して実施した。次のよう
な温度条件下で35回反応をさせた。
前処理94℃、300秒； アニリング53℃、50秒； 重合反応72℃、260秒； 熱変性94℃、50秒； 後処理53℃、300秒 増幅されたGAL4遺伝子を１％平板アガロスゲルに電気
泳動して約3.5kbのDNAバンドを確認しゲルから溶出した
あと、制限酵素EcoR Iで切断した。
＜実施例16＞pUCGAL4の製造 pUC18を制限酵素EcoR Iで37℃で１時間切断したあ
と、CIP（calf intestinal phosphatase、NEB）を処理
して脱燐酸化した。EcoR Iで切断されたプラスミドをJe
tsorbを利用して精製した。前記EcoR Iで切断したGAL4
遺伝子とpUC18を連結反応液30μｌ中でT4DNAリガーゼを
加えて16℃で一晩反応させた。CaCl2方法にしたがい反
応液で大腸菌XL−1Blueを形質転換させたあと、コロニ
ーを培養しRPM回転フィルターを利用してプラスミドを
精製した。制限酵素EcoR Iでプラスミドを切断したとき
3.5kbのDNAバンドがみえるのを選別してpUCGAL4と命名
した。
＜実施例17＞YEpα ktGAL4 YEpα ktにGAL4遺伝子を挿入するため次のように実施
した。
pUCGAL4を制限酵素EcoR Iで切断したあと、１％平板
アガロスゲルで電気泳動して約3.5kbのDNAバンドを切り
出しゲルから溶出して精製した。YEpαkt 1μｇを制限
酵素EcoR Iで37℃で１時間切断したあと、CIPを処理し
てプラスミドを脱燐酸化し切断されたベクターをJetsor
bを利用して精製した。EcoR Iで切断したGAL4遺伝子とY
Epαktを連結反応液中でT4DNAリガーゼを加えて16℃で
一晩反応させた。CaCl2方法にしたがい反応液で大腸菌X
L−1Blueを形質転換させたあと、コロニーを培養してプ
ラスミドを精製した。制限酵素EcoR Iでプラスミドを切
断したとき3.5kbのバンドが見えるものを選別してYEpα
ktGAL4と命名した。
６）YEp2−ｋの製造 ＜実施例18＞YEp2−ｋの製造 YEpαktGAL4には制限酵素Kpn I切断部位が二つ存在す
る。１個は殺傷毒素先導配列の末端に存在し他の１個は
選択標示であるleu2−ｄ遺伝子内に存在する。本発明で
は酵母の選択標示としてURA3を利用するためleu2−ｄ遺
伝子内に存在するKpn I切断部位を除去した。YEpαktGA
LをKpn Iで部分切断したあと、50μｌの反応液［10mM T
ris−HCl pH8.0、5mM MgCl2、5mM DTT、100μM dNTP、5
0μg/ml BSA］の中でT4DNA重合酵素を加えて室温で１時
間反応させKpn I部位を断面末端で作った。ATPとT4DNA
リガーゼを加えて断面末端Kpn I部位を16℃で一晩反応
させた。CaCl2方法にしたがい大腸菌XL−1Blueを形質転
換させたあと、1.5mlのLB−Amp培地でコロニーを培養し
てプラスミドを精製した。制限酵素でプラスミドを切断
してleu2−ｄ遺伝子内のKpn Iが除去されたプラスミド
をYEp2−ｋと命名した。
II. GCSFのクローニング（Yep2KGCの製造） ＜実施例19＞hGCSFの製造 GCSFをPCRするため配列番号９と配列番号10の配列を
有するオリゴヌクレオチドを合成した。
hGCSFをPCRするための鋳型としては大食細胞cDNAライ
ブラリー［macrophage cDNA library（Clontech）］
を使用した。50pmolの各始発体、200μM dNTPを包含す
る100μｌの反応液［10mM KCl、10mM（NH4）2SO4、20mM
Tris−HCl（pH8.8）、2mM MgSO4、0.1％TritonX−10
0］に２単位のVent DNA重合酵素を加えてPCR ROBOT（F
ine社）を使用して次のような温度下で35回反応させ
た。
前処理94℃、300秒； アニリング53℃、30秒； 熱変性94℃、30秒： 後処理53℃、300秒 増幅したhGCSF遺伝子を１％平板アガロスゲルで電気
泳動して0.5kbのDNAバンドを確認して精製したあと、制
限酵素Kpn I、BamH Iで切断した。
＜実施例20＞YEpsec−ktの切断 １μｇのYEp2−ｋを制限酵素Kpn I、BamH Iで切断し
たあと、１％平板アガロスゲルで電気泳動してIL−１β
切片を捨ててあとのベクター部分をとり溶出し出した。
＜実施例21＞DNA連結及び形質転換 Kpn I、BamH Iで切断したGCSF遺伝子とYEp2−ｋを連
結反応液30μｌ中でT4DNAリガーゼと反応させた。反応
液で大腸菌XL−1Blueを形質転換させたあと、コロニー
を培養してプラスミドを精製した。制限酵素Kpn I、Bam
H Iでプラスミドを切断したときGCSF切片が挿入された
ものをYEp2KGCと命名した。
III. YEpGalMFの製造 一般的なクローニングベクターであるYEp352［J.E.Hi
llなど、Yeast.2:163−167（1986）］でGCSFを発現させ
るため次の通り実施した。YpGX265Gal 4からGCSF発現に
必要な部分を得て、発現ベクターYEpGalMFを構築してGC
SF発現に利用した。
＜実施例22＞GAL4−GAL1、10UAS−MFαｌのPCR YpGX265GAL4［米国特許番号５、013、652］からGAL4
−GAL1、10にあるUAS−MFα１を得るためにGAL4とMFα
１プロモーターに相補的な始発体を使用してPCRを遂行
した。
MFα１プロモーターに相補的な始発体とGAL4に相補的な
始発体はそれぞれ配列番号11と配列番号12の配列を有す
る。
500pmolの各始発体、200μＭ dNTPを包含する100μ
ｌの反応液に２単位のVent DNA重合酵素を加えてPCR R
OBOT（Fine社）を使用して次のような温度条件下で35回
反応させた。
前処理94℃、300秒； アニリング53℃、30秒； 重合反応72℃、30秒； 熱変成94℃、30秒； 後処理53℃、300秒 増幅したGAL4−GAL1、10UAS−MFα１遺伝子を１％平
板アガロスゲルで電気泳動して約4kbのDNAバンドを確認
しゲルから溶出したあと、制限酵素Sac I、EcoR Iで切
断した。
＜実施例23＞YEp352の切断 １μｇのYEp352を制限酵素Sac I、EcoR Iで37℃で１
時間切断したあと、プラスミドを１％平板アガロスゲル
で電気泳動して約kbのDNAバンドを切り出しJetsorbを利
用して溶出し出した。
前処理94℃、300秒； アニリング50℃、30秒； 重合反応72℃、30秒； 熱変性94℃、30秒； 後処理53℃、300秒 ＜実施例24＞DNA連結及び形質転換 Sac I、EcoR Iで切断したYpGX265GAL4のGAL4−GAL1、
10UAS−MFα１とYEp352を連結反応液30μｌ中でT4DNAリ
ガーゼを加えて反応させた。反応液で大腸菌XL−1Blue
を形質転換させたあと、コロニーを培養してプラスミド
を精製した。制限酵素Sac I、EcoR Iでプラスミドを切
断したとき3.5kbのバンドがみえるのを選別してYEp2Gal
MFと命名した。
IV. YEp2kIL20GCの製造 ＜実施例25＞IL20GCSFの製造 １）殺傷毒素先導配列、IL−１βのアミノ末端の24アミ
ノ酸及びエンドテプチダーゼKEX2切断部位をPCRするた
め配列番号13と配列番号14の配列を有する始発体をそれ
ぞれ合成した。
鋳型としてはYEp2−ｋを使用した。50pmolの各始発
体、200μM dNTPを包含する100μｌのPCR反応液に２単
位のVent DNA重合酵素を加えて次のような条件下で35回
反応させた。
前処理94℃、300秒； アニリング50℃、30秒； 重合反応72℃、30秒； 熱変性94℃、30秒； 後処理53℃、300秒 増幅した殺傷毒素先導配列ILβ24AAを1.5％平板アガ
ロスゲルで電気泳動して約80bpのDNAバンドを切り出し
ゲルから溶出して精製した。PCRで増幅されたDNAは配列
番号15の配列を有する。
２）前記１）のPCR産物とGCSFのカルボキシ末端に相補
的なオリゴヌクレオチドを使用してGCSFをPCRで増幅し
た。
GCSFのカルボキシ末端に相補的な配列番号16の配列を
有するオリゴヌクレオチドを合成した。
鋳型としては実施例21で得たYEp2KGCを使用した。50p
molの始発体、殺傷毒素配列のDNA、IL−１βの24AA、20
μM dNTPを包含する100μｌの反応液に２単位のVent D
NA重合酵素を加えて次のような温度条件下で35回反応さ
せた。
前処理94℃、300秒； アニリング50℃、30秒； 重合反応72℃、30秒； 熱変性94℃、30秒； 後処理53℃、300秒 増幅したIL20GCSFを１％平板アガロスゲルで電気泳動
して約0.66kbのDNAバンドを切り出しゲルから溶出して
精製した。IL20GCSFを制限酵素Sac I、BamH Iで切断し
たあと精製した。
＜実施例26＞YEp2−ｋの切断 YEp2−k1μｇを制限酵素Sac I、BamH Iで37℃で１時
間切断した。切断されたプラスミドを１％アガロスゲル
で電気泳動して約12kbのDNAバンドを切り出しJetsorbを
利用して溶出した。
＜実施例27＞DNA連結及び形質転換 実施例26で得たSac I、BamH Iで切断したIL20GCSFとY
Ep2−ｋを連結反応液30μｌ中でT4DNAリガーゼを加えて
反応させた。
反応液で大腸菌XL−1Blueを形質転換させたあと、コ
ロニーを培養してプラスミドを精製した。制限酵素でプ
ラスミドを切断しIL20GCSFが挿入されたものを選別して
YEp2kIL20GCと命名した。
V. pIL20GCの製造 ＜実施例28＞YEp2kIL20GCの切断 YEp2kIL20GCからIL20GCSF−GAPDH転写終結体を得るた
め、制限酵素Kpn I、Sac Iで37℃で１時間プラスミドを
切断した。切断されたプラスミドを前記と同様の方法で
分離して約0.66kbサイズのDNAを精製した。
＜実施例29＞YEpGalMFの切断 YEpGalIMF1μｇを制限酵素Kpn I、Sac Iで37℃で１時
間切断した。切断されたプラスミドを前記のような方法
で分離、精製した。
＜実施例30＞DNA連結及び形質転換 Kpn I、Sac Iで切断されたIL20GCSF−GAPDH転写終結
体とYEpGalMFを連結反応液30μｌ中でT4DNAリガーゼで
連結させた。反応液で大腸菌を形質転換させた。コロニ
ーを培養して、プラスミドを精製した。制限酵素でプラ
スミドを切断し、IL20GCSF−GAPDH転写終結体が挿入さ
れたものを選別してpIL20GCと命名した。
VI. YEpHSPGCの製造 HSP150は酵母を37℃〜42℃で培養するとき分泌される
糖蛋白質の一種である。HSP150のかかる性質を用いれば
容易にhGCSFの発現を調節することができる。先ずHSP15
0のプロモーターと分泌信号をクローニングしたあと、h
GCSF遺伝子を挿入してYEpHSPGCを製造した。
＜実施例31＞HSP150プロモーター及び先導配列のPCR HSP150プロモーターと先導配列をPCRするためそれぞ
れ配列番号17と配列番号18の配列を有する始発体を合成
した。
該始発体を使用してS.セレビジエゲノムDNAから約0.4
kbのHSP150プロモーターと先導配列をPCRで増幅した。
精製後Kpn IとSal Iでプラスミドを切断した。
＜実施例32＞YEpHSPGCの製造 YEp2KGCでMFα１プロモーターと殺傷毒素先導配列をH
SP150プロモーターと先導配列に置換し、そのプラスミ
ドをYEpHSPGCと命名した。
VII. pIL20GCとYEp2kIL20GCによるhGCSFの発現 ＜実施例33＞酵母の形質転換 hGCSFを酵母で発現させるため、pIL20GCとYEp2kIL20G
Cで酵母を形質転換させた。
S.セレビジエ2805（ａ、pep4::HIS3、pro1−δ、can
l、GAL1、his3δ、ura3−52）を3ml YEPD（１％酵母抽
出物、２％ペプトン、２％ブドウ糖）培地に接種して30
℃、250rpmで一晩培養した。培養された細胞を15mlのYE
PD培地に再接種した。OD600が約１程度になったとき、
培養液を遠心分離したあと、アルカリ陽イオン−酵母形
質転換キット（Bio101）方法［Alcali Cation−Yeast
transform kit protocol］にしたがい形質転換可能
な酵母を作った。酵母ペレットをTE緩衝液で洗滌したあ
と、アセト酸リチウム溶液に懸濁して30℃、120rpmで培
養した。懸濁液を遠心分離しペレットをTE緩衝液に懸濁
させ、形質転換させるプラスミド、運搬体DNA、ヒスタ
ミンが入っているエペンドルフチューブ（eppendorf t
ube）に入れ混じってやった。常温で15分間放置したあ
と、PEGを加えて30℃で10分間おいた。反応液を42℃で
５分間熱衝撃を実施して遠心分離後、SOS培地200μｌに
懸濁した。懸濁液をSD寒天固形培地［0.8g/l Complete
Supplement Medium−URA（Bio101）、6.7g/l Yeast
Nitrogen Base without Amino Acid（DIFCO）、２％ブ
ドウ糖、1.5％寒天］に塗抹して30℃で三日間培養しUR
A+コロニーを選別した。pIL20GCで形質転換された酵母
をサッカロミセスセレビジエGCl、YEp2kIL20GCで形質転
換された酵母をサッカロミセスセレビジエK2GCとそれぞ
れ命名し、1995年９月27日大韓民国大田所在の韓国科学
技術研究院付設生命工学研究所（KRIBB）遺伝子銀行に
寄託した（受託番号それぞれKCTC 0193 BP、KCTC 0195
BP）。
＜実施例34＞GCSFの発現 コロニーをSD培地に接種して30℃、250rpmで一晩培養
した。培養液を遠心分離したあと、ペレットを1ml YEPG
al（１％酵母抽出液、２％ペプトン、２％ガラクトス）
培地に懸濁させ、30℃、250rpmで15時間培養してhGCSF
を発現させた。培養液を遠心分離した後、上層液0.5ml
をBSA10μg/mlと10％TGAと混ぜて氷りに20分間放置し
た。13000rpm、４℃で10分間遠心分離してhGCSFを沈殿
させた。
ペレットに20μｌ蒸留水と20μl 2X SDS染料［125mM
Tris−HClpH6.8、４％SDS、20％グリセロール、10％２
−メルカプトエタノール］を加えて溶かしたあと、16％
SDS（ドデシル 硫酸ナトリウム）−PAGE［Laemmli、Na
ture.227:680−684］で電気泳動をしクマーシーブルー
（Coomasie blue）で染色した。その結果hGCSF18.7kDa
のバンドが見えた。
＜実施例35＞発酵培養液でhGCSFの生産 ａ）染色及び培地 hGCSFは組換えブラスミドpIL20GCで形質転換された酵
母の流加式培養液で発現させ生産した。種菌培地（seed
media）は１リットル当ブドウ糖20g、アミノ酸のない
YNB（yeast nitrogen base）6.7g及びCMS−Ura（comp
lete supplement mixture missing uracil）0.8gを
包含した。回分式培養及び流加式培養に使用された培地
の組成は次の通りである。
（１）回分式培養（1L当） ａ）KH2PO4 10g （NH4）2SO4 2g CaCl22H2O 0.5g NaCl 0.5g 微量金属溶液（trace metal solution） 10ml ビタミン溶液 1ml カサミノ酸（Casamino acids） 5g トウィン80（Tween80） 0.6g ｂ）MgSO4・7H2O 0.5g ｃ）ブドウ糖 10g ａ）、ｂ）及びｃ）の成分は個別的に121℃で15分間
滅菌した。
（２）流加式培養 １）成長期（1L当） ａ）（NH4）2SO4 3g KH2PO4 5g ビタミン溶液 3.5ml 微量金属溶液 5ml カサミノ酸 多様の量 トウィン80 0.6g ｂ）MgSO4・7H2O 4g ｃ）ブドウ糖 多様の量 成長期培地でカサミノ酸に対する配列の濃度比は0.5
〜4.5にした。
２）誘導期または産物生産期（1L当） ａ）（NH4）2SO4 3g KH2PO4 5g ビタミン溶液 3.5ml 微量金属溶液 5ml 酵母抽出物 多量の量 トウィン80 0.6g ｂ）MgSO4・7H2O 4g ｃ）ガラクトス 多様の量 誘導期培地で酵母抽出物に対するブドウ糖の濃度比は
0.5−３にした。
ａ）、ｂ）及びｃ）の成分は個別的に121℃で15分間
滅菌した。
微量金属溶液は１リットル当次の組成を包含する。:F
eSO42.78g、ZnCl2・2H2O 1.36g、CuSO4・5H2O0.8g、Na
2MoO4・2H2O 2.42g、CoCl2・6H2O 2.38g及びMnSO4
1.69g。ビタミン溶液は100ml当次の組成を包含する：イ
ノシトル（inositol）0.6g、Ca−パントテネート（Ca−
pantothenate）0.12g、ピリドキシン（pyridoxine）HCl
0.12g、チアミン（thiamine）0.12g、ビオチン（bioti
n）0.01g。
ｂ）培養及びhGCSF生産 種菌培地と同様の組成の寒天平板培地で組換え酵母を
培養し、コロニーを15％グリセロール溶液に懸濁したあ
と、−70℃で保管した。培養時に−70℃に保管された組
換え酵母を前記寒天平板培地に塗抹し30℃で48時間培養
した。そしてコロニーをシェークフラスコ（shake flas
k）（250mL）の種菌培地に接種し30℃で250rpmで培養し
た。24時間あと、該種菌培地を５％回分式培地に接種し
30℃、pH5.5である5L発酵槽で培養した。培地でブドウ
糖が消耗されると連結されたパンプで流加式培養の成長
期培地を加えて発酵槽のモジュール（module）を調節し
た。培地流入速度は下記のような式で調節してブドウ糖
の濃度を100mg/L以下に維持した。
μ＝μ０（Ｓ）（１−X/Xm） Fi＝（μ Xi Vi）／（SO Yx） Vi+1＝Vi＋Fi（Δｔ） Xi+1 Vi+1＝Xi Vi exp（μΔｔ） So:添加培地でブドウ糖の濃度（g/L） X:培養液内酵母の濃度（（g/L） Xm:細胞質量抑制常数（g/L） μ：特異成長速度（hr-1） V:培養液体積（Ｌ） F:流入速度（L/hr） Δt:30秒 成長期で酵母の濃度が25−35g/Lに至ったとき、添加
培地を誘導期培地で換えた。流入速度（volumetric fee
d rate）を調節してガラクトスの濃度を10−35g/Lに維
持した。攪拌速度と空気流入速度を調節して発酵培養液
内溶解された酸素の濃度を空気飽和の約40％に維持し
た。培養液を発酵槽で取り細胞密度エタノール濃度、hG
CSF濃度及びプラスミドの安定度を分析した。そり結
果、hGCSFは発酵培養液で230mg/Lの濃度で生産され、エ
タノールが濃縮されるのを抑制しプラスミドの安定度が
90％以上維持された。
VIII. YEpHSPGCによるhGCSFの発現 ＜実施例36＞酵母の形質転換及びGCSFの発現 アルカリ陽イオン酵母形質転換キットBio 101を利用
してYEpHSPGCでS.セレビジエ2805を形質転換させ形質転
換体をUra+で選別した。YEpHSPGCで形質転換された酵母
をサッカロミセスセレビジエHGCAと命名し1995年９月27
日大韓民国大田所在韓国科学技術研究院付設生命工学研
究所遺伝子銀行に寄託した（受託番号KCTC0194BP）。ウ
ラシルのないSD培地で生長した酵母コロニーを3ml液体
培地に接種して36℃、250rpmで培養した。培養液を遠心
分離してペレットを1ml YEP Gal培地［１％酵母抽出
液、２％ペプトン、２％ガラクトス］に懸濁したあと、
37℃、250rpmで18時間培養した。遠心分離したあと、ペ
レットと上層液に分け、それぞれにSDS染料を加え16％S
DS−PAGEを遂行して蛋白質を分析した。上層液では誘導
により生じた組換え蛋白質バンドが見えなかったが、ペ
レットでは新しい主要バンドが20.1kDaに表れた。hGCSF
Ab（Ｒ＆Dsystem）と抗マウスIg Ｇ−アルカラインホ
スパターゼを利用してウェスタンブロットを実施した結
果、20kDaの蛋白質が免疫反応を示した。
IX. pIL20XGCによるhGCSFの発現 ＜実施例37＞pIL20XGCの製造 クローニングの便宜のため、pIL20GCにXba I部位を挿
入した。
１）PCR 先ず、Xba I部位を包含する配列番号19のオリゴヌク
レオチドを合成器（ABI、392DNA/RNA synthesizer）で
合成した。
PCRは前記の始発体とMFαに対して相補的な配列番号2
0の始発体を使用して実施した。
鋳型としてはpIL20GCを使用した。それぞれ50pmolの
始発体、200μM dNTPを包含する100μｌのPCR反応液に
２単位のVent DNA重合酵素を加えて次のような条件下で
35回反応させた。
前処理90℃、60秒； アニリング45℃、５秒； 重合反応72℃、15秒； 熱変性94℃、５秒； 後処理53℃、30秒 殺傷毒素先導配列−IL−１β−24−AAの増幅されたDN
Aを１％平板アガロスゲルで電気泳動して80bpのDNAバン
ドを溶出して精製した。
PCRにより得られたDNAは配列番号21の塩基配列を有す
る。
PCRによりXba I部位を挿入したとき、アミノ酸配列は
変化がなく塩基配列の水準でのみ置換された。
２）前記で合成されたPCR産物とhGCSF遺伝子のＣ−末端
に対して相補的なオリゴヌクレオチドからhGCSF遺伝子
を得た。
hGCSF遺伝子のＣ−末端に対して相補的なオリゴヌク
レオチドは配列番号22の配列を有する。
鋳型としてはpIL20GCを使用した。50pmolの始発体、
殺傷毒素先導配列−IL−１β−24−AA−Xba I−KEX2の
増幅されたDNA及び20μM dNTPを包含する反応液100μｌ
に２単位のVent DNA重合酵素を加えて次のような条件下
で35回反応させた。
前処理90℃、60秒； アニリング55℃、５秒； 重合反応72℃、15秒； 熱変性94℃、７秒； 後処理53℃、30秒 増幅された産物（殺傷毒素先導配列−IL−１β−Ｎ−
末端（24AA）−Xba I−KEN2−hGCSF）を１％平板アガロ
スゲルで電気泳動して0.66kbのDNAバンドを溶出し、制
限酵素Sca IとBamH Iで切断したあと精製した。pIL20GC
1μｇをSac IとBamH Iを使用して37℃で１時間切断し
た。切断されたプラスミドを１％アガロスゲルで電気泳
動しJetsorbを使用してDNAを溶出した。Sac IとBamH I
により切断されたPCR産物とプラスミドpIL20GCを連結反
応液30μｌに入れT4DNAリガーゼで反応させた。反応液
で大腸菌XL−１ Blueを形質転換させた。コロニーを培
養してあと、プラスミドを精製した。制限酵素Xba Iに
より切断されたプラスミドを選別してpIL20XGCと命名し
た。
＜実施例38＞酵母の形質転換 hGCSFを酵母で発現させるため、pIL20XGCで酵母を形
質転換させた。S.セレビジエ2805（ａ、pep4::H153、pr
o 1−δ、can1、GAL1、his3δ、ura3−52）を3ml YEPD
培地に接種して30℃、250rpmで一晩培養した。培養され
た細胞を15ml YEPDの培地に再接種した。OD600が約１程
度になったとき培養液を遠心分離したあと、アルカリ陽
イオン−酵母形質転換キット（Bio101）方法にしたがい
形質転換可能な酵母を作った。酵母ペレットをTE緩衝液
で洗滌した後、アセト酸リチウム溶液に懸濁して30℃、
120rpmで培養した。懸濁液を遠心分離しペレットをTE緩
衝液に懸濁させ、形質転換させるプラスミド、運搬体DN
A、ヒスタミンが入っているエペンドルフチューブに入
れ混じってやった。常温で15分間放置したあと、PEG溶
液を加えて30℃で10分間おいた。反応液を42℃で５分間
熱衝撃を実施し遠心分離した後、ペレットはSOS培地200
μｌに懸濁した。懸濁液をSD寒天固形培地に塗抹して30
℃で三日間培養しURA+コロニーを選別した。
該酵母菌株を大韓民国大田所在韓国科学技術院付設生
命工学研究所遺伝子銀行に寄託した（受託番号KCTC 033
0 BP）。
＜実施例39＞hGCSFの発現 コロニーをSD培地3mLに接種して30℃、250rpmで一晩
培養した。培養液を遠心分離したあと、ペレットを1ml
YEPGal培地に懸濁し30℃、250rpmで15時間培養してhG
CSFを発現させた。培養液に2X SDS染料［125mM Tris−H
Cl pH6.8、４％SDS、20％グリセロル、10％ ２−メル
カプトエタノール］を同量加えた後、５分間加熱した。
蛋白質を15％SDS−PAGE［Laemmli;Nature.227:680−68
4］で分離しクーマシーブルーで染色した。その結果、p
IL20GCを使用した場合と同じ水準にhGCSFが発現され
た。
X. 発現されたhGCSF蛋白質の精製 ＜実施例40＞硫酸アンモニウム沈殿 酵母細胞培養液を10、000×ｇで10分間遠心分離し上
騰液を（NH4）2SO4で85％に飽和させ24時間４℃で放置
した。生成された沈殿物を10、000×ｇで30分間遠心分
離し、ペレットを50mM Tris（pH7.8）、0.1mM EDTA、1
mM DTT緩衝溶液に溶かし不溶性物質は10、000×ｇで10
分間遠心分離して除去した。前記全ての過程は４℃で実
施した。このように得たhGCSFゲル−浸透クロマトグラ
フィー（gel−permeation chromatography）により精
製した。
＜実施例41＞ゲル−浸透クロマトグラフィー ゲル−浸透クロマトグラフィーのため充填物質として
セパクリル−Ｓ−200（Pharmacia社）を50mM Tris（pH
7.8）、1mM DTT、0.1mM EDTA緩衝液で洗滌したあとコラ
ム（0.6×100cm）に充填した。前記で（NH4）2SO4沈殿
物を試料として20ml培養液で蛋白質を濃縮させたものを
コラムに注入して50mM Tris（pH7.8）1mM DTT、0.1mM
EDTA緩衝液で溶出した。280nmにおいての吸光度を基準
として各ピークの蛋白質を集め冷凍乾燥して濃縮した。
各ピークの試料をSDS−PAGEで分析した結果、第一ピー
クでhGCSFバンドと幾つかの他の蛋白質らが検出され
て、第二ピークの試料で培地ペプチド／蛋白質が検出さ
れた（図15）。セパクリルＳ−200ゲル浸透クロマトグ
ラフィーを通じて大部分の培地ペプチド／蛋白質が除去
された。ゲル浸透クロマトグラフィーにより部分的に精
製されたhGCSF試料を次のC4逆相HPLCに使用した。
＜実施例42＞C4逆相HPLC ゲル浸透クロマトグラフィーを通じて部分的に精製さ
れたhGCSFをC4コラムを利用した逆相HPLC方法で純粋精
製した。使用したC4コラムはVydac社製品でコラムサイ
ズは1.0×25cmであった。流速は2ml/minとした。試料約
100μｇをコラムに注入した。コラムは0.1％TFA（水
で）を５分間溶出させたあと、0.1％TFA（アセトニトリ
ルで）を０−100％に至る線状勾配で溶出させた。hGCSF
は0.1％TFA（アセトニトリルで）90％で溶出された。SD
S−PAGEで分析した結果hGCSFは純粋に分離されたことが
確認された（図16）。実施例44−46で記述された前記精
製過程でhGCSFの回収率は８％であって、培養液1L当約1
5mgの純粋hGCSFが得られた。
XI. 精製されたhGCSFのＮ−末端アミノ酸分析 ＜実施例43＞精製されたhGCSFのＮ−末端アミノ酸分析 C4逆相HPLCで分離されたhGCSFをPVDF膜にブロット（b
lotting）してＮ−末端アミノ酸配列を分析した。
Ｎ−末端アミノ酸配列は成熟したhGCSFのものと殆ど
一致した（NH2−Thr−Pro−Leu−Gly−Pro−COOH）。該
分析は基礎科学支援研究所ソウル分所に依頼して実施し
た。分析に使用した蛋白質シクェンシングする機具のモ
デル名はMilligen 6600Bでありエドマン分解方法（Edma
n degradation method）でPTH−アミノ酸誘導体を作っ
た後、HPLCで分析した。
移動相A:35mMアンモニウムアセテート緩衝液（pH4.
8） 移動相B:100％アセトニトリル 温度:50℃ またポリマーカプリング方法を使用してアミノ酸配列
を決定した。膜ディスク（membrane disk、PVDF）の両
側面にＡ溶液5mlずつスポッティング（spotting）した
あとドライヤーで15〜20秒間乾燥した。55℃熱板上に膜
ディスクを置いてＢ溶液30mlスポッティングしたあと、
７分間乾燥させた（10分を超えないようにした）。膜デ
ィスクの両側面にＣ溶液5mlずつスポッティングしたあ
と、ドライヤーで15〜20秒間乾燥させた。55℃熱板上に
膜ディスクを置いて、Ｄ溶液30mlをスポッティングした
あと、５分間乾燥させた。Ｂ溶液20mlをスポッティング
したあと５分間乾燥させた。エタノール、水、メタノー
ルで洗滌した。
Ａ）PITC溶液（エチルアセテート中10nmol/μｌ） Ｂ）緩衝溶液（50％v/vメタノール中２％v/vトリエチル
アミン） Ｃ）DITC溶液（エチルアセテートに0.1％w/v） Ｄ）重合体溶液［（Ｂ溶液中0.1％w/vポリアリルアミン
ヒドロクロライド（低分子量）） 前記の方法でアミノ酸配列を分析した結果、第一番目
サイクルでスレオニン（threonine）、第二番目サイク
ルでプロリン（proline）、第三番目サイクルでルイシ
ン（leucine）、第四番目サイクルでグリシン（glycin
e）、第五番目サイクルでプロリン（proline）が検出さ
れた。
したがって、本発明で製造されたhGCSFのＮ−末端ア
ミノ酸配列はNH2−Thr−Pro−Leu−Gly−Proであり、こ
れは生理活性を有した純粋な人間GCSFと一致する。
XII. pIL20XGHを利用したhGHの発現 ＜実施例44＞人間生長ホルモン（hGH）のPCR hGHをPCRするため、成熟人間生長ホルモンのＮ−末端
とＣ−末端に相補的なそれぞれ配列番号23と配列番号24
の配列を有するオリゴヌクレオチドを合成した。
50pmolの各始発体と200μM dNTPを包含する100μｌの
反応液［10mM KCl、10mM（NH4）2SO4、20mM Tris−HCl
（pH8.8）、2mM MgSO4、0.1％トリトンＸ−100］に２単
位のVent DNA重合酵素を加えた。鋳型としては人間脳下
垂体cDNAライブラリーを利用して次のような条件で35回
PCR反応させた。
前処理94℃、60秒； アニリング60℃、５秒； 重合反応72℃、15秒； 熱変性94℃、７秒； 後処理531℃、30秒 １％平板アガロスゲルで約0.6kbのDNAバンドが見えた
し、該バンドを精製し、制限酵素Xba IとBamH Iで切断
した。pIL20XGC1μｇを制限酵素Xba IとBamH Iで37℃で
１時間切断し、１％アガロスゲルで分離した。そしてhG
CSF切片を除去しベクターのあとの部分を選別して溶出
した。Xba IとBamH Iで切断されたhGH遺伝子及びpIL20X
GCを連結溶液30μＬでT4DNAリガーゼで連結した。反応
液で大腸菌IL−1Blueーを形質転換させコロニーを培養
してプラスミドを精製した。プラスミドを制限酵素Xba
IとBamH Iで切断し、hGH遺伝子を包含するプラスミドを
選別してpIL20XGHと命名した。
＜実施例45＞酵母の形質転換 hGHを酵母から発現させるため、pIL20XGHで酵母を形
質転換させた。S.セレビジエ2805（ａ、pep4::HIS3、pr
o 1−δ、can1、GAL1、his3δ、ura3−52）を3ml YEPD
培地に接種して30℃、250rpmで一晩培養した。培養液を
15mlのYEPD培地に再接種した。OD600が約１程度になっ
たとき培養液を遠心分離したあと、アルカリ陽イオン−
酵母形質転換キット（Bio101）方法にしたがい形質転換
可能な酵母を作った。酵母ペレットをTE緩衝液で洗滌し
た後、アセト酸リチウム溶液に懸濁して30℃、120rpmで
培養した。懸濁液を遠心分離しペレットをTE緩衝液に懸
濁させ、形質転換させるプラスミド、運搬体DNA、ヒス
タミンが入っているエペンドルフチューブに入れ混じっ
てやった。常温で15分間放置したあと、PEGを加えて30
℃で10分間おいた。反応液を42℃で５分間熱衝撃を実施
し、SOS培地200μｌに懸濁した。懸濁液をSD寒天固形培
地に塗抹して30℃で三日間培養しURA+コロニーを選別し
た。
該酵母菌株を大韓民国大田所在韓国科学技術院付設生
命工学研究所遺伝子銀行に寄託した（受託番号KCTC0331
BP）。
＜実施例46＞hGHの発現 コロニーをSD培地に接種して30℃、250rpmで一晩培養
した。培養液を遠心分離したあと、ペレットを1ml YEPG
al培地に懸濁し、30℃、250rpmで15時間培養してhGHを
発現させた。培養液に2X SDS染料［125mM Tris−HCl pH
6.8、４％SDS、20％グリセロール、10％２−メルカプト
エタノール］を加えて溶かしたあと、５分間加熱した。
15％SDS−PAGE［Laemmli、Nature.227:680−684］で分
離しクーマシーブルーでゲルを染色した。その結果、約
22kDaに該当するhGHバンドが検出された。
＜実施例47＞発酵培養液でhGHの生産 （ａ）染色及び培地 hGHは組換えプラスミドpIL20XGHで形質転換された酵
母の流加式培養液を通じて生産した。種菌培地の組成は
hGCSF発酵で使用したものと同様のものを使用した。回
分式培養及び流加式培養に使用された培地の組成は次の
通りである。
（１）回分式培養（1L当） 実施例35と同様 （２）流加式培養 １）成長期（1L当） ａ）（NH4）2SO4 3g KH2PO4 5g ビタミン溶液 3.5ml 微量金属溶液 5ml カサミノ酸 136g トウィン80 0.6g ｂ）MgSO4・7H2O 4g ｃ）ブドウ糖 409g ２）誘導期または産物生産期（1L当） ａ）（NH4）2SO4 3g KH2PO4 5g ビタミン溶液 3.5ml 微量金属溶液 5ml 酵母抽出物 167g トウィン80 0.6g ｂ）MgSO4・7H2O 4g ｃ）ガラクトス 333g ａ）、ｂ）及びｃ）の成分は個別的に121℃で15分間
滅菌した。
微量金属溶液とビタミン溶液の組成は実施例35と同様
である。
（ｂ）培養及びhGH生産 成長期で酵母の濃度が25−35g/Lに至ったとき、添加
培地を前記誘導期培地に換えた。培地の流入速度を調節
して培養液内ガラクトスの濃度を約18g/Lに維持した。
他の言及のない限り培養液貯蔵と培養方法は実施例35の
ものと同様にした。その結果、エタノール濃縮は無視し
てもよい程であったが、プラスミド安定度は80％以上で
あって、培養液でhGH濃度は1300mg/Lまで増加した。
（１）一般情報 （ｉ）出願人:HANIL SYNTHETIC FIBER Co.,Ltd. JANG,Ki−Ryong MOON,Jae−Woong BAE,Cheon−Soon YANG,Doo−Suk LEE,Jee−Won SEONG,Baik−Lin （ii）発明の名称： 高効率発現ベクターを用いてサッカロスミセス セレビ
ジエから組換え蛋白質を製造する方法 （iii）配列の数:24 （２）配列番号１の情報 （ｉ）配列の特性： （Ａ）配列の特性:64塩基双 （Ｂ）タイプ：核酸 （Ｃ）鎖の数:2重 （Ｄ）形態：直線状 （ii）分子タイプ：オリゴヌクレオチド （xi）配列の表示：配列番号１ （２）配列番号２の情報 （ｉ）配列の特性： （Ａ）長さ:17塩基 （Ｂ）タイプ：核酸 （Ｃ）鎖の数:1重 （Ｄ）形態：直線状 （ii）分子タイプ：オリゴヌクレオチド （xi）配列の表示：配列番号２ （２）配列番号３の情報 （ｉ）配列の特性： （Ａ）長さ:81塩基 （Ｂ）タイプ：核酸 （Ｃ）鎖の数:1重 （Ｄ）形態：直線状 （ii）分子タイプ：オリゴヌクレオチド （xi）配列の表示：配列番号３ （２）配列番号４の情報 （ｉ）配列の特性： （Ａ）長さ:71塩基双 （Ｂ）タイプ：核酸 （Ｃ）鎖の数:2重 （Ｄ）形態：直線状 （ii）分子タイプ：オリゴヌクレオチド （xi）配列の表示：配列番号４ （２）配列番号５の情報 （ｉ）配列の特性： （Ａ）長さ:35塩基 （Ｂ）タイプ：核酸 （Ｃ）鎖の数:1重 （Ｄ）形態：直線状 （ii）分子タイプ：オリゴヌクレオチド （xi）配列の表示：配列番号５ （２）配列番号６の情報 （ｉ）配列の特性： （Ａ）長さ:36塩基 （Ｂ）タイプ：核酸 （Ｃ）鎖の数:1重 （Ｄ）形態：直線状 （ii）分子タイプ：オリゴヌクレオチド （xi）配列の表示：配列番号６ （２）配列番号７の情報 （ｉ）配列の特性： （Ａ）長さ:36塩基 （Ｂ）タイプ：核酸 （Ｃ）鎖の数:1重 （Ｄ）形態：直線状 （ii）分子タイプ：オリゴヌクレオチド （xi）配列の表示：配列番号７ （２）配列番号８の情報 （ｉ）配列の特性： （Ａ）長さ:36塩基 （Ｂ）タイプ：核酸 （Ｃ）鎖の数:1重 （Ｄ）形態：直線状 （ii）分子タイプ：オリゴヌクレオチド （xi）配列の表示：配列番号８ （２）配列番号９の情報 （ｉ）配列の特性： （Ａ）長さ:30塩基 （Ｂ）タイプ：核酸 （Ｃ）鎖の数:1重 （Ｄ）形態：直線状 （ii）分子タイプ：オリゴヌクレオチド （xi）配列の表示：配列番号９ （２）配列番号10の情報 （ｉ）配列の特性： （Ａ）長さ:33塩基 （Ｂ）タイプ：核酸 （Ｃ）鎖の数:1重 （Ｄ）形態：直線状 （ii）分子タイプ：オリゴヌクレオチド （xi）配列の表示：配列番号10 （２）配列番号11の情報 （ｉ）配列の特性： （Ａ）長さ:36塩基 （Ｂ）タイプ：核酸 （Ｃ）鎖の数:1重 （Ｄ）形態：直線状 （ii）分子タイプ：オリゴヌクレオチド （xi）配列の表示：配列番号11 （２）配列番号12の情報 （ｉ）配列の特性： （Ａ）長さ:36塩基 （Ｂ）タイプ：核酸 （Ｃ）鎖の数:1重 （Ｄ）形態：直線状 （ii）分子タイプ：オリゴヌクレオチド （xi）配列の表示：配列番号12 （２）配列番号13の情報 （ｉ）配列の特性： （Ａ）長さ:21塩基 （Ｂ）タイプ：核酸 （Ｃ）鎖の数:1重 （Ｄ）形態：直線状 （ii）分子タイプ：オリゴヌクレオチド （xi）配列の表示：配列番号13 （２）配列番号14の情報 （ｉ）配列の特性： （Ａ）長さ:57塩基 （Ｂ）タイプ：核酸 （Ｃ）鎖の数:1重 （Ｄ）形態：直線状 （ii）分子タイプ：オリゴヌクレオチド （xi）配列の表示：配列番号14 （２）配列番号15の情報 （ｉ）配列の特性： （Ａ）長さ:183塩基双 （Ｂ）タイプ：核酸 （Ｃ）鎖の数:2重 （Ｄ）形態：直線状 （ii）分子タイプ：オリゴヌクレオチド （xi）配列の表示：配列番号15 （２）配列番号16の情報 （ｉ）配列の特性： （Ａ）長さ:33塩基 （Ｂ）タイプ：核酸 （Ｃ）鎖の数:1重 （Ｄ）形態：直線状 （ii）分子タイプ：オリゴヌクレオチド （xi）配列の表示：配列番号16 （２）配列番号17の情報 （ｉ）配列の特性： （Ａ）長さ:33塩基 （Ｂ）タイプ：核酸 （Ｃ）鎖の数:1重 （Ｄ）形態：直線状 （ii）分子タイプ：オリゴヌクレオチド （xi）配列の表示：配列番号17 （２）配列番号18の情報 （ｉ）配列の特性： （Ａ）長さ:33塩基 （Ｂ）タイプ：核酸 （Ｃ）鎖の数:1重 （Ｄ）形態：直線状 （ii）分子タイプ：オリゴヌクレオチド （xi）配列の表示：配列番号18 （２）配列番号19の情報 （ｉ）配列の特性： （Ａ）長さ:22塩基 （Ｂ）タイプ：核酸 （Ｃ）鎖の数:1重 （Ｄ）形態：直線状 （ii）分子タイプ：オリゴヌクレオチド （xi）配列の表示：配列番号19 （２）配列番号20の情報 （ｉ）配列の特性： （Ａ）長さ:21塩基 （Ｂ）タイプ：核酸 （Ｃ）鎖の数:1重 （Ｄ）形態：直線状 （ii）分子タイプ：オリゴヌクレオチド （xi）配列の表示：配列番号20 （２）配列番号21の情報 （ｉ）配列の特性： （Ａ）長さ:165塩基双 （Ｂ）タイプ：核酸 （Ｃ）鎖の数:2重 （Ｄ）形態：直線状 （ii）分子タイプ：オリゴヌクレオチド （xi）配列の表示：配列番号21 （２）配列番号22の情報 （ｉ）配列の特性： （Ａ）長さ:33塩基 （Ｂ）タイプ：核酸 （Ｃ）鎖の数:1重 （Ｄ）形態：直線状 （ii）分子タイプ：オリゴヌクレオチド （xi）配列の表示：配列番号22 （２）配列番号23の情報 （ｉ）配列の特性： （Ａ）長さ:43塩基 （Ｂ）タイプ：核酸 （Ｃ）鎖の数:1重 （Ｄ）形態：直線状 （ii）分子タイプ：オリゴヌクレオチド （xi）配列の表示：配列番号23 （２）配列番号24の情報 （ｉ）配列の特性： （Ａ）長さ:40塩基 （Ｂ）タイプ：核酸 （Ｃ）鎖の数:1重 （Ｄ）形態：直線状 （ii）分子タイプ：オリゴヌクレオチド （xi）配列の表示：配列番号24 （２）配列番号25の情報 （ｉ）配列の特性： （Ａ）長さ:241残基 （Ｂ）タイプ：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数:1重 （Ｄ）形態：直線状 （ii）分子タイプ：ペプチド （xi）配列の表示：配列番号25
フロントページの続き (72)発明者 ムーン，ジェ−ウーン 大韓民国，テジョン―シ 305―390，ユ ソン―ク，ションミン―ドン，サムスン プールン エーピーティー．，113― 903 (72)発明者 ベ，チョン−スーン 大韓民国，テジョン―シ 305―390，ユ ソン―ク，ションミン―ドン，サムスン プールン エーピーティー．，113― 701 (72)発明者 ヤン，ドゥ−スク 大韓民国，テジョン―シ 305―390，ユ ソン―ク，ションミン―ドン，サムスン プールン エーピーティー．，113― 603 (72)発明者 リー，ジー−ウォン 大韓民国，テジョン―シ 305―390，ユ ソン―ク，ションミン―ドン，サムスン プールン エーピーティー．，111― 302 (72)発明者 ソン，バイク−リン 大韓民国，テジョン―シ 305―390，ユ ソン―ク，ションミン―ドン，サムスン プールン エーピーティー．，111― 301 (56)参考文献 特開 昭57−208990（ＪＰ，Ａ) 特表 平７−503844（ＪＰ，Ａ) 特表 平７−503368（ＪＰ，Ａ) 米国特許5013652（ＵＳ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12N 15/00 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＪＩＣＳＴファイル（ＪＯＩＳ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ)

Claims (18)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】酵母由来プロモーターと酵母由来分泌信号
    とを含んで構成される発現ベクターにおいて、前記酵母
    由来プロモーターはGAL1−10 UASと交配因子α１（MFα
    １）のプロモーターを含む複合プロモーターであり、前
    記酵母由来分泌信号は殺傷毒素先導配列とIL−１βのア
    ミノ酸末端アミノ酸24個（24AA）を含む、ことを特徴と
    する発現ベクター。
  2. 【請求項２】前記殺傷毒素先導配列は酵母コードンを使
    用して最適化させる、請求項１に記載の発現ベクター。
  3. 【請求項３】前記酵母由来のプロモーターと前記酵母由
    来分泌信号の他に転写終結体とGAL4遺伝子をさらに含
    む、請求項１または２に記載の発現ベクター。
  4. 【請求項４】前記転写終結体はGADPHの転写終結体であ
    る、請求項３に記載の発現ベクター。
  5. 【請求項５】GAL1−10 UAS−MFα１のプロモーター−殺
    傷毒素先導配列−IL−１βのアミノ酸末端24AA−KEX2−
    hGCSF−GADPH転写終結体−GAL4を含む発現ベクター（YE
    p2kIL20GC）である、請求項１に記載の発現ベクター。
  6. 【請求項６】請求項５に記載の発現ベクターで形質転換
    させて得た形質転換体サッカロミセスセレビジエK2GC
    （受託番号KCTC 0195 BP）。
  7. 【請求項７】GAL4−GAL1−10 UAS−MFα１のプロモータ
    ー−殺傷毒素先導配列−IL−１βのアミノ酸末端24AA−
    KEX2−hGCSF−GADPH転写終結体−GAL4を含む発現ベクタ
    ー（pIL20GC）である、請求項１に記載の発現ベクタ
    ー。
  8. 【請求項８】請求項７に記載の発現ベクターで形質転換
    させて得た形質転換体サッカロミセスセレビジエGC1
    （受託番号KCTC 0193 BP）。
  9. 【請求項９】酵母由来プロモーターと酵母由来分泌信号
    とを含んで構成される発現ベクターにおいて、前記酵母
    由来プロモーターはGAL1−10 UASと熱衝撃蛋白質（Heat
    shock Protein（HSP））のプロモーターを含む複合
    プロモーターであり、前記酵母由来分泌信号はHSPの先
    導配列である、ことを特徴とする発現ベクター。
  10. 【請求項１０】前記熱衝撃蛋白質はHSP150である、請求
    項９に記載の発現ベクター。
  11. 【請求項１１】GAL1−10 UAS−HSPのプロモーター−HSP
    の先導配列−hGCSF−GADPH転写終結体−GAL4を含む発現
    ベクター（YEpHSPGC）である、請求項９に記載の発現ベ
    クター。
  12. 【請求項１２】請求項11に記載の発現ベクターで形質転
    換させて得た形質転換体サッカロミセスセレビジエHGCA
    （受託番号KCTC 0194 BP）。
  13. 【請求項１３】GAL1−10 UAS−MFα１のプロモーター−
    殺傷毒素先導配列−IL−１βのアミノ酸末端24AA−Xba
    I−KEX2−hGCSF−GADPH転写終結体−GAL4を含む発現ベ
    クター（pIL20XGC）である、請求項１に記載の発現ベク
    ター。
  14. 【請求項１４】請求項13に記載の発現ベクターで形質転
    換させて得た形質転換体サッカロミセスセレビジエXGC
    （受託番号KCTC 0330 BP）。
  15. 【請求項１５】請求項６、８、12または14に記載の形質
    転換体を培養してhGCSFを製造する方法。
  16. 【請求項１６】GAL1−10 UAS−MFα１のプロモーター−
    殺傷毒素先導配列−IL−１βのアミノ酸末端24AA−Xba
    I−KEX2−hGH−GADPH転写終結体−GAL4を含む発現ベク
    ター（pIL20XGH）である、請求項１に記載の発現ベクタ
    ー。
  17. 【請求項１７】請求項16に記載の発現ベクターで形質転
    換させて得た形質転換体サッカロミセスセレビジエXGH
    （受託番号KCTC 0331 BP）。
  18. 【請求項１８】請求項17に記載の形質転換体を培養して
    人間成長ホルモンを製造する方法。
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