KR100558614B1 - 글리코실화된 재조합 온코나아제 및 그의 제조방법 - Google Patents

글리코실화된 재조합 온코나아제 및 그의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 글리코실화된 재조합 온코나아제, 전기 글리코실화된 재조합 온코나아제를 생산하기 위한 발현벡터, 전기 발현벡터로 형질전환된 피키아 효모 및 전기 형질전환된 피키아 효모를 이용한 글리코실화된 재조합 온코나아제의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명의 글리코실화된 재조합 온코나아제는 아미노산 서열 N 말단이 피로글루탐산이고, 69번 아미노산이 8 내지 12개의 만노스를 포함하는 당으로 글리코실화된 것을 특징으로 한다. 본 발명의 글리코실화된 재조합 온코나아제는 천연 온코나아제보다 안정성과 항암활성이 우수하므로, 항암치료에 널리 활용될 수 있을 것이다.
글리코실화된 재조합 온코나아제, 피키아 효모

Description

글리코실화된 재조합 온코나아제 및 그의 제조방법{Glycosylated Onconase and Process for Preparing the Same}
도 1은 글리코실화된 재조합 온코나아제를 생산하는 발현벡터 pHP205의 유전자 지도이다.
도 2a는 온코나아제를 MALDI-TOF 분광분석법으로 분석한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 2b는 글리코실화된 재조합 온코나아제를 MALDI-TOF 분광분석법으로 분석한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 3은 각 온코나아제의 열안정성을 비교한 그래프이다.
도 4a는 단백질 가수분해효소 K를 처리한, 천연 온코나아제의 전기영동 사진이다.
도 4b는 단백질 가수분해효소 K를 처리한, 글리코실화된 재조합 온코나아제의 전기영동 사진이다.
도 4c는 단백질 가수분해효소 K를 처리한, 변이된 재조합 온코나아제의 전기영동 사진이다.
도 5는 각각의 온코나아제의 처리농도의 변화에 따른, 세포 증식율의 변화를 나타내는 그래프이다.
본 발명은 글리코실화된 재조합 온코나아제 및 그의 제조방법에 관한 것이다. 좀 더 구체적으로, 본 발명은 글리코실화된 재조합 온코나아제, 전기 글리코실화된 재조합 온코나아제를 생산하기 위한 발현벡터, 전기 발현벡터로 형질전환된 피키아 효모 및 전기 형질전환된 피키아 효모를 이용한 글리코실화된 재조합 온코나아제의 제조방법에 관한 것이다.
개구리(Rana pipiens)의 알에서 분리된 온코나아제(onconase, ONC)는 RNA 분해효소 A(RNase A)와 30%의 상동성 밖에 갖고 있지 않지만, 입체구조가 비슷하고 활성중심(His10, Lys31, His97)이 잘 보존되어 있어 RNase A 계열의 효소군으로 분류되는데, 암세포에서 세포자멸(apoptosis)을 유도하고, HIV-1의 복제를 억제하는 효과를 나타낸다고 알려져 있다.
온코나아제의 항암기작에 대해서는 많은 연구가 진행되었는데, 지금까지 연구된 결과에 의하면, 온코나아제는 암세포의 표면에 결합한 다음, 식작용(endocytosis)에 의하여 암세포 내로 침투하게 되고, 침투한 암세포내에서 RNA를 분해하여, 결과적으로 세포자멸을 유도함이 알려져 있다. 이러한 온코나아제의 항 암효과는, 세포내에 존재하는 RNA 분해효소 억제자(RNase Inhibitor, RI)와 낮은 결합친화도를 나타내어 보다 용이하게 세포내 RNA를 분해할 수 있고, C 말단의 이중황결합과 N 말단의 수소결합으로 인하여 부여되는 높은 구조적인 안정성을 가지는 온코나아제의 특성에 기인한다고 알려져 있다.
이러한 온코나아제를 활성화된 형태로 대량생산하려는 연구가 활발히 진행되고 있다. 지금까지는 온코나아제를 대량생산하기 위한 대장균 발현시스템이 연구되었다. 그러나, 대장균에서 온코나아제를 생산할 경우에는 대부분 균체 내에서 봉입체의 형태로 생산되므로, 이를 유레아 또는 구아니딘-HCl(guanidine-HCl)로 용해시킨 후, 재접힘과정(refolding)을 수행하고, 글루타티온(glutathione)을 처리하여, 이중 황결합(disulfide bond)을 형성시킴으로써, 활성화된 형태의 온코나아제를 생산한다. 이러한 대장균 발현시스템은 발현시스템 자체는 단순하지만, 시간과 비용이 많이 들고, 이러한 발현시스템으로부터 생산된 재조합 온코나아제는 개구리의 알에서 정제한 천연 온코나아제보다 매우 낮은 항암활성을 나타낸다는 단점이 있었다. 이에, 재조합 온코나아제의 항암활성이 낮은 이유를 지속적으로 연구한 결과, 재조합 온코나아제와 천연 온코나아제는 아미노산의 서열면에서는 동일하지만, 천연 온코나아제는 N 말단에 피로글루탐산 잔기(pyroglutamate residue)를 포함하는 반면, 재조합 온코나아제는 N 말단에 피로글루탐산 잔기를 포함하지 않기 때문인 것으로 밝혀지게 되었다(참조: J. Biol. Chem., 266:245-251, 1991).
아울러, 온코나아제는 69번 아미노산이 글리코실화될 수 있는 아스파라긴이나, 천연 온코나아제에서는 69번 아미노산이 글리코실화되지 않은 형태로 존재한 다. 공지된 바와 같이, 글리코실기는 생체 내에서 매우 중요한 역할을 하고 있다. 예를 들어, 세포-세포, 세포-호르몬의 결합에 중요한 역할을 하고, 열이나 단백질 분해효소의 공격을 저해하는 역할을 수행한다. 특히, 단백질 분해효소의 표적이 되는 단백질의 고리(loop)부분이 글리코실화된 경우에는, 단백질의 안정성이 크게 증가함이 알려져 있다. 또한, 글리코실기가 효소의 활성과 구조 안정성에 미치는 영향에 대해서도 많은 연구가 이루어졌는데, 사람의 ECP(eosinophile cationic protein)를 곤충세포(baculovirus)에서 분비 생산하면, N-글리코실기를 가지는 형태로 생산되는데, 이는 대장균에서 생산한 것보다는 100배 이상의 활성을 가지고 있음이 보고되어 있고(참조: Nucleic Acids Res., 26:3358-3363, 1998), 헤파란 설파타아제(Heparan N-sulfatase)의 1, 3번 글리코실기를 제거하면 효소활성은 1/5로 감소하고, 접힘(folding)과 안정성에 많은 문제가 있음이 보고되어 있으며(참조: Biochem. Biophys. Res. Commun., 280:1251-1257, 2001), 카뎁신(cathepsin E)의 경우 글리코실기 부가위치의 Asn을 Gln으로 바꾼 결과, 최적 산도가 낮아지고 열안정성도 낮아짐이 보고되었고(참조: Eur. J. Biochem., 266:383-391, 1999), 엔도글리코시다아제 H(endoglycosidase H)로 글리코실기를 제거한 UDP-글루쿠로노실트랜스퍼라아제(UDP-glucuronosyltranferase)는 활성과 안정성이 모두 저하됨이 보고되었다(참조: Biochim. Biophys. Acta., 1380:345-353, 1998).
한편, 효모는 옛날부터 술의 양조나 빵의 제조 등에 많이 이용된 인류에게 친숙한 미생물이며, 높은 안전성과 많은 이점을 가지고 있다. 효모는 핵을 가지고 있는 진핵생물이면서 단세포이고 발달된 막계를 가지고 있는 동물세포와 원핵생물 의 특징을 모두 가지고 있는 생물이기 때문에, 고등 진핵생물 유전자의 발현 및 세포 내외의 물질 수송에서 대장균에서는 없는 여러가지 장점을 나타낸다. 또한, 고등 동물세포와 유사한 유전자 발현의 제어기구, 세포 증식의 제어기구 및 분비 단백질의 수식기구를 가지고 있어서, 효모에서 발현된 단백질, 특히 의약품으로 사용되는 경우에는 아직 효모에서의 발현물에만 허가와 사용이 국한되어 있다(참조: Marten & Seo, Chap. 7, Expression Systems and Processes for rDNA Products, ed. by Hatch et al., ACS Symp. ser., pp477, 1991).
다양한 효모중에서도, 사카로마이세스 세레비지에(S. cerevisiae) 및 피키아 패스토리스(Pichia pastoris)는 고등동물세포와 유사한 단백질 생산분비 시스템과 번역 후 수식기능을 가지고 있다. 또한, 진핵생물 외래 단백질을 대장균에서 생산할 경우 불용성의 봉입체를 형성하기 쉬우나, 효모에서는 정확한 입체구조형성(folding) 및 이중 황결합(disulfide bond) 형성, 글리코실기부가 등으로 인하여 가용성으로 생산 분비된다. 특히, 피키아 패스토리스는 사카로마이세스 세레비지에 보다 다음과 같은 장점을 가지고 있다: 첫째, 자신의 분비 단백질이 적고 외래 단백질의 발현량이 높다(참조: Biotechnol. Appl. Biochem., 30:193-200, 1999). 둘째, 메탄올을 단일 탄소원으로 사용할 수 있는 자화효모(methylotrophic yeast)로서, 대규모의 배양이 용이하고 유도물질이 저렴한 메탄올이므로 소요되는 비용이 저렴하다. 셋째, 글리코실기의 길이도 사카로마이세스 보다 20% 정도로 짧고, α-1,3 만노실 트랜스퍼라아제(α-1,3 mannosyl transferase)의 활성이 없으므로, 인체에 독성으로 작용하는 α-1,3 만노오스잔기가 존재하지 않는다.
이러한 효모를 이용할 경우, 전술한 재조합 온코나아제의 문제점을 해결할 수도 있을 것으로 기대되고 있으나, 이에 대한 연구결과는 보고되지 않고 있는 실정이다.
따라서, N 말단에 피로글루탐산 잔기를 포함하여, 천연 온코나아제와 동일한 활성을 나타낼 수 있는 재조합 온코나아제를 제조할 수 있는 방법을 개발하여야 할 필요성이 끊임없이 대두되었다.
이에, 본 발명자들은 N 말단에 피로글루탐산 잔기를 포함하여, 천연 온코나아제와 동일한 활성을 나타낼 수 있는 재조합 온코나아제를 제조할 수 있는 방법을 개발하고자 예의 연구노력한 결과, 효모의 일종인 피키아 패스토리스(Pichia pastoris)에 온코나아제의 유전자를 도입시켜서, 재조합 온코나아제를 제조할 경우, 전기 방법으로 제조된 재조합 온코나아제는 N 말단에 피로글루탐산 잔기를 포함할 뿐만 아니라, 69번 아미노산인 아스파라긴이 글리코실화되어, 천연 온코나아제 보다 안정성과 항암활성이 현저히 우수함을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
결국, 본 발명의 첫 번째 목적은 N 말단에 피로글루탐산 잔기를 포함하고, 글리코실화된 69번 아미노산을 포함하는 재조합 온코나아제를 제공하는 것이다.
본 발명의 두 번째 목적은 전기 글리코실화된 재조합 온코나아제를 생산하기 위한 발현벡터를 제공하는 것이다.
본 발명의 세 번째 목적은 전기 발현벡터로 형질전환된 피키아 효모를 제공하는 것이다.
본 발명의 네 번째 목적은 전기 형질전환된 피키아 효모를 이용하여 글리코실화된 재조합 온코나아제를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 글리코실화된 재조합 온코나아제는 아미노산 서열 N 말단이 피로글루탐산이고, 69번 아미노산이 8 내지 12개의 만노스를 포함하는 당으로 글리코실화된 것을 특징으로 한다.
이하, 본 발명의 글리코실화된 재조합 온코나아제를 보다 구체적으로 설명하기로 한다.
본 발명자들은 대장균 발현시스템을 이용하여 제조된 재조합 온코나아제의 단점을 극복하여, N 말단에 피로글루탐산 잔기를 포함하는 온코나아제를 대량으로 제조할 수 있는 방법을 다각적으로 모색한 결과, 효모 발현시스템에 주목하고, 효모 발현시스템 중의 하나인 피키아 패스토리스(Pichia pastoris) 균주를 이용하여 재조합 온코나아제를 제조하고자 하였다.
먼저, 온코나아제 유전자를 효모에서 발현시키고, 세포외부로 분비시킬 수 있도록, AOX1 프로모터, PHO1 분비 시그날 서열(참조: 대한민국 특허공개 제 1986-381호 및 1987-6185호), 개구리(Rana pipiens)의 온코나아제 유전자(참조: J. Biol. Chem., 266:245-251, 1991) 및 AOX1 터미네이터를 포함하는 발현벡터 pHP205를 작제하고, 이를 이용하여 피키아 패스토리스를 형질전환시켜서 형질전환체를 수득한 다음, 전기 형질전환체를 배양하고, 배양액으로부터 재조합 온코나아제를 수득하였다. 아울러, 대조군으로서, 온코나아제의 69번 아미노산이 글루타민으로 치환된 변이된 온코나아제를 발현시킬 수 있는 발현벡터 pHP205Q를 작제하고, 상술한 것과 동일한 방법을 이용하여, 69번 아미노산이 글리코실화될 수 없는 변이된 재조합 온코나아제를 수득하였다.
상기 수득한 재조합 온코나아제와 변이된 재조합 온코나아제의 N 말단을 분석한 결과, 대장균 시스템에서 제조된 재조합 온코나아제와는 달리 N 말단에 피로글루탐산 잔기를 포함한다는 점에서는 동일한 특성을 나타내었으나, 69번 아미노산의 글리코실화라는 점에서는 서로 다른 특성을 나타내었다.
즉, 재조합 온코나아제의 69번 아미노산인 아스파라긴은 8 내지 12개의 만노스를 포함하는 당으로 글리코실화되었으나, 변이된 재조합 온코나아제의 69번 아미노산인 글루타민은 글리코실화되지 않음을 알 수 있었다.
한편, 전기 재조합 온코나아제의 안정성을 천연 온코나아제 및 변이된 재조합 온코나아제의 안정성과 비교한 결과, 재조합 온코나아제는 열안정성과 단백질 가수분해효소에 대한 안정성이 천연 온코나아제 및 변이된 재조합 온코나아제보다 현저히 우수함을 알 수 있었다.
뿐만 아니라, 전기 재조합 온코나아제의 항암활성을 천연 온코나아제 및 변이된 재조합 온코나아제의 안정성과 비교한 결과, 재조합 온코나아제는 천연 온코나아제 및 변이된 재조합 온코나아제보다 약 50배 이상의 항암활성을 나타냄을 알 수 있었다. 이는 본 발명의 글리코실화된 재조합 온코나아제가 효과적인 항암제로 사용될 수 있음을 시사하는 것이다.
이에, 본 발명자들은 전기 발현벡터 pHP205로 형질전환된 피키아 패스토리스 1168를 "피키아 패스토리스 pH205/SMD1168(Pichia pastoris pHP205/SMD1168)" 이라 명명하고, 이를 2004년 7월 22일자로 국제기탁기관인 한국생명공학연구원 생물자원센터(KCTC: 대전광역시 유성구 어은동 52번지 한국생명공학연구원 소재)에 기탁번호 KCTC 10674BP로 기탁하였다.
본 발명의 글리코실화된 재조합 온코나아제를 제조하는 방법은 프로모터, 분비 시그날 서열, 온코나아제 유전자 및 터미네이터를 순차적으로 포함하는 발현벡터가 효모에 도입되어 형질전환된 형질전환체를 배양하여 배양액을 수득하고, 이로부터 글리코실화된 재조합 온코나아제를 수득하는 단계를 포함한다: 이때, 발현벡터는 특별히 이에 제한되지 않으나, AOX1 프로모터::PHO1 분비 시그날 서열:: 온코나아제 유전자:: AOX1 터미네이터의 순으로 연결하여 작제된 발현벡터를 사용함이 바람직하며, 보다 바람직하게는 1의 유전자지도를 가지는 pHP205를 사용한다. 또한, 효모는 특별히 이에 제한되지 않으나 피키아 패스토리스(Pichia pastoris)를 사용함이 바람직하며, 형질전환체는 특별히 이에 제한되지 않으나, 피키아 패스토리스 pHP205/SMD1168(Pichia pastoris pHP205/SMD1168)(KCTC 10674BP)를 사용함이 바람직하다.
본 발명의 글리코실화된 재조합 온코나아제는 천연 온코나아제보다 안정성과 항암활성이 우수하므로, 항암치료에 널리 활용될 수 있을 것이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상적의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: 효모용 온코나아제 발현벡터의 작제
먼저, pONC(참조: Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A., 95:10407-10412, 1998)를 주형으로 하고 프라이머 1: 5'-ccgctcgagaaaagacaggactggctgactttc-3'(서열번호 2)과 프라이머 2: 5'-cgggatcctagcaagaaccaacaccaacc-3'(서열번호 3)를 이용한 DNA 중합효소연쇄반응(PCR)을 수행하여, 온코나아제 유전자(참조: J. Biol. Chem., 266:245-251, 1991)를 포함하는 약 300bp의 DNA 단편을 수득하였다. 전기 수득한 DNA 단편과 플라스미드 pHIL-S1(Invitrogen Co. Ltd., USA)을 각각 제한효소 XhoI 과 BamHI1으로 처리한 후, 이들을 연결하여 pHIL205를 작제하였다. 이어, PHO1 분비 시그날 서열과 온코나아제 유전자의 코돈쇄(frame)를 맞추기 위해서, 프라이머 3: 5'-ttgcaatctgtcttcgctcaggactggctgactttc-3'(서열번호 4)과 프라이머 4: 5'-gaaagtcagccagtcctgagcgaagacagattgcaa-3'(서열번호 5)를 이용한 돌연변이 키트(Quick-Change Mutagenesis, Stratagene, USA)로 돌연변이를 수행하여 최종적으로 발현벡터 pHP205를 작제하였다(참조: 도 1). 도 1은 글리코실화된 재조합 온코나아제를 생산하는 발현벡터 pHP205의 유전자 지도이다.
한편, 온코나아제의 69번째 아미노산인 아스파라긴(Asn)을 글루타민(Gln)으로 치환시킬 수 있도록, 프라이머 5: 5'-ctgtctgactgccaagttactagtcgtccgtgc-3'(서열번호 6)와 프라이머 6: 5'-gcacggacgactagtaacttggcagtcagacag-3'(서열번호 7)을 이용한 돌연변이 키트로 돌연변이를 수행하여, 발현벡터 pHP205Q를 작제하였다.
실시예 2: 형질전환체의 작제 및 온코나아제의 발현
전기 실시예 1에서 각각 작제된 발현벡터 pHP205와 pHP205Q로 피키아 패스토리스 1168(KCTC 7190)를 각각 형질전환시켰다.
먼저, YPD 배지(1% yeast extract, 2% polypeptone, 2%(w/v) D-glucose) 10ml 배지에서 30℃조건으로 하룻밤 진탕배양하여 수득한 피키아 패스토리스 1168 배양물 0.5ml를 다시 YPD 20ml에 접종하여 O.D600=1.0이 될 때까지 30℃조건으로 진탕배양하였다. 이어, 배양액을 2,000rpm으로 5분간 원심분리하여 배지를 제거한 후, 증류수 및 1M 솔비톨수용액으로 균체를 3회 세척한 다음, 1ml의 1M 솔비톨 수용액에 재현탁시켰다.
전기 실시예 1에서 각각 작제된 플라스미드 20㎍을 제한효소 BglII으로 처리한 다음, 이를 상기 균체 현탁액에 첨가하고, 전기충격방법으로 형질전환시켰다. 이어, 전기 현탁액을 최소선택배지(yeast nitrogen base without amino acid 0.67%, 포도당 2%, Leu 0.003%, His 0.002%) 상에서 30℃의 조건하에, 3일간 배양하여, pHP205로 형질전환된 균체(pHP205/SMD1168)와 pHP205Q로 형질전환된 균체(pHP205/SMD1168Q)를 수득하고, 생육이 양호한 균주를 선별하여, 각각의 형질전환체를 작제하였다.
한편, 전기 각각의 형질전환체를 3L의 YPD 배지에 접종하고, 30℃의 조건하에, 24시간동안 진탕배양하고, 이를 원심분리하여 배지를 제거한 후, 각각 BMMY 배지(1%(w/v) yeast extract, 2%(w/v) peptone, 10%(v/v) 1M potassium phosphate buffer, 10%(v/v) 10X YNB stock 10%(v/v) methanol, pH 6.0) 1,000ml에 접종하고, 30℃의 조건하에, 196시간동안 진탕배양하면서, 매 24시간 마다 메탄올 5ml을 첨가하였다. 그런 다음, 배양액 10㎕를 6,000rpm에서 5분간 원심분리하여, 배양액과 균체를 각각 수득하였다. 전기 수득한 배양액을 동결건조하여 우레아 용해 완충용 액(urea lysis buffer; 50mM Tris-HCl, 100mM dithiothreitol, 2% SDS, 5% mercaptoethanol, 0.1% bromophenol blue, pH 6.8)에 첨가하고, 100℃에서 2분간 가열하고, 이를 전기영동한 결과, pHP205/SMD1168의 경우에는 온코나아제 밴드가 12kDa 및 14kDa 부근에서 관찰되었으나, pHP205/SMD1168Q의 경우에는 온코나아제 밴드가 14kDa 부근에서만 관찰되었는 바, 14kDa의 온코나아제는 69번째의 아스파라긴 잔기에 글리코실기가 부가된 형태임을 알 수 있었다.
이에, 본 발명자들은 전기 글리코실화된 재조합 온코나아제를 발현시키기 위한 발현벡터 pHP205로 형질전환된 피키아 패스토리스 1168을 “피키아 패스토리스 pHP205/SMD1168(Pichia pastoris pHP205/SMD1168)”이라 명명하고, 이를 2004년 7월 22일자로 국제기탁기관인 한국생명공학연구원 생물자원센터(대전광역시 유성구 어은동 52번지 한국생명공학연구원 소재)에 기탁번호 KCTC 10674BP로 기탁하였다.
실시예 3: 온코나아제의 정제
실시예 2에서 수득한 pHP205/SMD1168와 pHP205/SMD1168Q의 배양물을 각각 7,000g에서 원심분리하여 균체를 제거한 후, 상등액을 와트만(Watman) 3mm 여과지를 통과시켜 부유물을 완전히 제거하였다. 초산으로 배양액의 pH를 5.5로 적정하고, 양이온 교환수지(SP-Sepharose, Pharmacia Biotech., USA)를 이용한 양이온 교환 크로마토그래피를 각각 수행하여, 온코나아제를 포함하는 분획을 수득하였다. 전기 분획으로 양이온 교환수지(mono-S, Pharmacia Biotech., USA)를 이용한 양이온 교환 크로마토그래피를 다시 수행하여, 온코나아제를 정제한 결과, 배양액 1리터당 약 10mg의 온코나아제를 수득하였다.
그러나, 전기 정제된 온코나아제에는 글리코실화된 재조합 온코나아제와 글리코실화되지 않은 재조합 온코나아제가 혼합되어 있기 때문에, 전기 정제된 온코나아제를 콘카나발린 A-아가로오스(concanavalin A-agarose) 컬럼에 적용하였다. 그 결과, 완충용액 S(0.1M NaCl, 1mM CaCl2, 1mM MgCl2, 1mM MnCl2, 0.02%(w/v) NaN3, 50mM potassium phosphate, pH 6.0)로 평형화시킨 컬럼에 글리코실화되지 않은 온코나아제는 결합되지 않았으나, 글리코실화된 재조합 온코나아제는 결합되었으며, 결합된 온코나아제는 0.5M 메틸-d-만노피라노시드(methyl-d-mannopyranoside)를 포함하는 완충용액 S에 의하여 용출되었다. 전기 용출된 글리코실화된 재조합 온코나아제를 엔도글리코시다제 H(endoglycosidase H)로 37℃에서 30시간동안 처리하고 전기영동한 결과, 온코나아제와 같은 12kDa에서 밴드가 검출되었다. 이상의 결과로부터, 글리코실화된 재조합 온코나아제의 글리코실기는 만노오스(mannose)가 다량으로 함유된 것임을 알 수 있었고, 글리코실화되지 않은 온코나아제와 글리코실화된 재조합 온코나아제의 비율은 1:4(w/w)임을 확인할 수 있었다. 한편, pHP205/SMD1168Q의 배양액으로부터 정제된 변이된 재조합 온코나아제는 글리코실화되지 않은 형태로만 정제되었다.
실시예 4: 온코나아제의 N 말단서열 분석
전기 실시예 3에서 수득한 글리코실화된 재조합 온코나아제의 N 말단서열 분석(N-terminal sequence analysis)을 수행하였다. 즉, 전기 온코나아제를 전기영동한 후, 임모빌리온 P 멤브레인(Immobilion P membrane, Millipore, USA)으로 전사하였다. 이를 서열분석시스템(Applied Biosystems 494 Sequencing System, Perkin Elmer, USA)에 적용하여 에드만 분해법(Edman degradation)으로 분석한 결과, 충분한 양을 분석했음에도 불구하고 아무런 아미노산도 검출되지 않았다.
이러한 결과는 글리코실화된 재조합 온코나아제의 N 말단의 아미노산이 고리모양의 환 구조를 포함하고 있기 때문에, 에드만 분해법에 의하여 검출되지 않은 것으로 분석되었는 바, 상기 결과로부터 글리코실화된 재조합 온코나아제의 첫 번째 아미노산이 글루타민이고, 이것이 피로글루탐산을 형성함을 예측할 수 있었다.
실시예 5: 온코나아제의 분자량 측정
전기 실시예 3에서 수득한 온코나아제와 글리코실화된 재조합 온코나아제의 분자량을 분광분석기(Voyager-DE STR mass spectrometer, PE Biosystems, USA)를 이용하여 MALDI-TOF(matrix assisted laser desorption/ionization time-of-flight) 분광분석법으로 측정하였다(참조: 도 2a 및 2b). 도 2a는 온코나아제를 MALDI-TOF 분광분석법으로 분석한 결과를 나타내는 그래프이고, 도 2b는 글리코실 화된 재조합 온코나아제를 MALDI-TOF 분광분석법으로 분석한 결과를 나타내는 그래프이다. 도 2a에서 보듯이, 온코나아제의 분자량은 계산치와 정확히 일치하는 11,818Da이었으나, 도 2b에서 보듯이, 글리코실화된 재조합 온코나아제의 분자량은 13,524, 13,691, 13,857, 14,017, 및 14,180 Da으로 다양하게 검출되었다. 상기 글리코실화된 재조합 온코나아제의 분자량은 약 162Da의 차이를 가지며 이는 만노오스의 분자량과 일치함을 알 수 있었는 바, 글리코실기의 구조는 Man8GlcNAc2, Man9GlcNAc2, Man10GlcNAc2, Man11GlcNAc2 및 Man12GlcNAc2로서, 각각 8 내지 12개의 만노스가 포함되어 있음을 알 수 있었다.
실시예 6: 온코나아제의 안정성 측정
전기 실시예 3에서 수득한 글리코실화된 재조합 온코나아제, 변이된 재조합 온코나아제 및 천연 온코나아제의 안정성을 비교하기 위하여, 각 온코나아제의 열안정성 및 단백질 가수분해 효소에 대한 안정성을 측정한 후, 비교하였다.
실시예 6-1: 열안정성 비교
전기 실시예 3에서 수득한 글리코실화된 재조합 온코나아제, 변이된 재조합 온코나아제 및 천연 온코나아제를 각각 0.2mg/ml의 농도로 PBS에 용해시킨 다음, 75℃에서 100℃까지 0.5℃ 간격으로 승온시키면서, 각 온도에서의 온코나아제의 농 도변화를 204nm의 파장을 사용한 편광분석기(J715 CD spectrophotometer, Jasco, JP)를 이용하여 측정하였다(참조: 도 3). 도 3은 각 온코나아제의 열안정성을 비교한 그래프로서, (○)는 글리코실화된 재조합 온코나아제를 나타내고, (●)는 천연 온코나아제를 나타내며, (■)는 변이된 재조합 온코나아제를 나타낸다. 도 3에서 보듯이, 글리코실화된 재조합 온코나아제는 천연 온코나아제 및 변이된 재조합 온코나아제보다 4℃ 높은 용융점을 갖는다는 것을 확인하였는 바, 이로부터 글리코실화 온코나아제의 입체구조가 더 안정함을 알 수 있었다.
실시예 6-2: 단백질 가수분해 효소에 대한 안정성 비교
전기 실시예 3에서 수득한 글리코실화된 재조합 온코나아제, 변이된 재조합 온코나아제 및 천연 온코나아제를 각각 1mg/ml의 농도로 반응완충용액(50mM Tris-HCl, 1mM CaCl2, pH 8.0)에 용해시킨 후, 단백질 가수분해효소 K(proteinase K)를 각각 0.1, 1 및 10mg/ml의 농도로 처리한 다음, 37℃에서 30분 동안 반응시켰다. 이어, 반응을 정지시키고, 각 시료를 전기영동하였다(참조: 도 4a, 도 4b 및 도 4c). 도 4a는 천연 온코나아제의 전기영동 사진이고, 도 4b는 글리코실화된 재조합 온코나아제의 전기영동 사진이며, 도 4c는 변이된 재조합 온코나아제의 전기영동 사진이다. 또한, 각 전기영동 사진에서 1번 레인은 10mg/ml의 단백질 가수분해효소 K를 처리한 실험군을 나타내고, 2번 레인은 1mg/ml의 단백질 가수분해효소 K 를 처리한 실험군을 나타내며, 3번 레인은 0.1mg/ml의 단백질 가수분해효소 K를 처리한 실험군을 나타낸다. 도 4a, 도 4b 및 도 4c에서 보듯이, 천연 온코나아제와 변이된 재조합 온코나아제의 경우에는, 단백질 가수분해효소 K를 처리한 경우, 대부분 가수분해되었고, 단백질 가수분해효소 K를 0.1mg/ml의 농도로 처리할 경우, 일부 단백질이 잔류함을 알 수 있었으나, 글리코실화된 재조합 온코나아제의 경우에는, 단백질 가수분해효소 K를 10mg/ml의 농도로 처리할 경우에도, 단백질이 잔류함을 알 수 있었는 바, 이로부터 글리코실화 온코나아제의 입체구조가 더 안정함을 알 수 있었다.
실시예 7: 항암활성의 비교
전기 실시예 3에서 수득한 글리코실화된 재조합 온코나아제, 변이된 재조합 온코나아제 및 천연 온코나아제의 항암활성을 암세포주인 K-562세포(한국세포주은행)를 이용하여 측정하였다. 즉, 암세포주인 K-562세포를 우태아혈청이 함유된 RPMI 1640 배지(penicillin 100 ug/ml, streptomycin 100 ug/ml함유)에 접종하고, 전기 실시예 3에서 수득한 글리코실화된 재조합 온코나아제, 변이된 재조합 온코나아제 및 천연 온코나아제를 0.001, 0.01, 0.1, 1 및 10mM의 농도로 각각 첨가한 다음, 5%(v/v) CO2농도, 37℃의 조건하에 44시간동안 배양하였다: 이때, 대조군으로는 온코나아제를 처리하지 않은 세포를 사용하였다. 이어, 각각의 배지에 방사선 동위원소로 표지된 티미딘([methyl-3H]thymidine)을 0.20mCi의 농도로 첨가하고 4시간동안 추가로 배양하였다. 배양이 종결된 후, 세포만을 수득하여, 세포에서 새로이 합성된 DNA의 양을 측정하고, 이를 대조군에서 새로이 합성된 DNA의 양으로 나누어, 세포증식율을 계측한 다음, 이를 비교하였다(참조: 도 5). 도 5는 각각의 온코나아제의 처리농도의 변화에 따른, 세포 증식율의 변화를 나타내는 그래프로서, (●)는 천연 온코나아제를 처리한 실험군의 세포 증식율을 나타내고, (■)는 변이된 재조합 온코나아제를 처리한 실험군의 세포증식율을 나타내며, (○)는 글리코실화된 재조합 온코나아제를 처리한 실험군의 세포증식율을 나타낸다. 도 5에서 보듯이, K-562세포의 성장을 50%로 감소시키는 온코나아제의 농도(IC50)가 글리코실화된 재조합 온코나아제는 0.04μM이었으나, 천연 온코나아제 및 변이된 재조합 온코나아제는 2μM임을 알 수 있었으므로, 글리코실화된 재조합 온코나아제의 항암활성이 천연 온코나아제 및 변이된 재조합 온코나아제에 비하여 50배 정도 높음을 확인할 수 있었다.
이상에서 상세히 설명하고 입증하였듯이, 본 발명은 글리코실화된 재조합 온코나아제, 전기 글리코실화된 재조합 온코나아제를 생산하기 위한 발현벡터, 전기 발현벡터로 형질전환된 피키아 효모 및 전기 형질전환된 피키아 효모를 이용한 글리코실화된 재조합 온코나아제의 제조방법을 제공한다. 본 발명의 글리코실화된 재조합 온코나아제는 아미노산 서열 N 말단이 피로글루탐산이고, 69번 아미노산이 8 내지 12개의 만노스를 포함하는 당으로 글리코실화된 것을 특징으로 한다. 본 발명의 글리코실화된 재조합 온코나아제는 천연 온코나아제보다 안정성과 항암활성이 우수하므로, 항암치료에 널리 활용될 수 있을 것이다.
서열목록 전자파일 첨부

Claims (8)

  1. 서열번호 1의 아미노산 서열 N 말단이 피로글루탐산이고, 69번 아미노산이 8 내지 12개의 만노스를 포함하는 당으로 글리코실화된 것을 특징으로 하는, 글리코실화된 재조합 온코나아제.
  2. 제 1항의 글리코실화된 재조합 온코나아제를 효모에서 발현시킬 수 있고, 도 1의 유전자 지도를 가지는 발현벡터 pHP205.
  3. 제 2항의 발현벡터 pHP205로 형질전환된 피키아 패스토리스 pHP205/SMD1168(Pichia pastoris pHP205/SMD1168)(KCTC 10674BP).
  4. 프로모터, 분비 시그날 서열, 온코나아제 유전자 및 터미네이터를 순차적으로 포함하는 발현벡터가 효모에 도입되어 형질전환된 형질전환체를 배양하여 배양액을 수득하고, 이로부터 글리코실화된 재조합 온코나아제를 수득하는 단계를 포함하는, 글리코실화된 재조합 온코나아제의 제조방법.
  5. 제 4항에 있어서,
    발현벡터는 AOX1 프로모터, PHO1 분비 시그날 서열, 온코나아제 유전자 및 AOX1 터미네이터의 순차적으로 포함하는 것을 특징으로 하는
    글리코실화된 재조합 온코나아제의 제조방법.
  6. 제 4항에 있어서,
    발현벡터는 도 1의 유전자지도를 가지는 pHP205인 것을 특징으로 하는
    글리코실화된 재조합 온코나아제의 제조방법.
  7. 제 4항에 있어서,
    효모는 피키아 패스토리스(Pichia pastoris)인 것을 특징으로 하는
    글리코실화된 재조합 온코나아제의 제조방법.
  8. 제 4항에 있어서,
    형질전환체는 피키아 패스토리스 pHP205/SMD1168(Pichia pastoris pHP205/SMD1168)(KCTC 10674BP)인 것을 특징으로 하는
    글리코실화된 재조합 온코나아제의 제조방법.
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