FI94773C - Menetelmä trombiini-inhibiittorien tuottamiseksi - Google Patents

Menetelmä trombiini-inhibiittorien tuottamiseksi Download PDF

Info

Publication number
FI94773C
FI94773C FI865003A FI865003A FI94773C FI 94773 C FI94773 C FI 94773C FI 865003 A FI865003 A FI 865003A FI 865003 A FI865003 A FI 865003A FI 94773 C FI94773 C FI 94773C
Authority
FI
Finland
Prior art keywords
dna
yeast
sequence
dna sequence
gly
Prior art date
Application number
FI865003A
Other languages
English (en)
Swedish (sv)
Other versions
FI865003A (fi
FI865003A0 (fi
FI94773B (fi
Inventor
Jutta Heim
Walter Maerki
Bernd Meyhack
Original Assignee
Ciba Geigy Ag
Ucp Gen Pharma Ag
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from GB858530631A external-priority patent/GB8530631D0/en
Application filed by Ciba Geigy Ag, Ucp Gen Pharma Ag filed Critical Ciba Geigy Ag
Publication of FI865003A0 publication Critical patent/FI865003A0/fi
Publication of FI865003A publication Critical patent/FI865003A/fi
Application granted granted Critical
Publication of FI94773B publication Critical patent/FI94773B/fi
Publication of FI94773C publication Critical patent/FI94773C/fi

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2405—Glucanases
    • C12N9/2408—Glucanases acting on alpha -1,4-glucosidic bonds
    • C12N9/2411—Amylases
    • C12N9/2428—Glucan 1,4-alpha-glucosidase (3.2.1.3), i.e. glucoamylase
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/81—Protease inhibitors
    • C07K14/815—Protease inhibitors from leeches, e.g. hirudin, eglin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
    • C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C12N15/90—Stable introduction of foreign DNA into chromosome
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2405—Glucanases
    • C12N9/2408—Glucanases acting on alpha -1,4-glucosidic bonds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/036—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif targeting to the medium outside of the cell, e.g. type III secretion
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/33—Fusion polypeptide fusions for targeting to specific cell types, e.g. tissue specific targeting, targeting of a bacterial subspecies

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Description

94773
Menetelmä trombiini-inhibiittorien tuottamiseksi -Förfarande för framställning av trombininhibitorer
Keksintö liittyy yhdistelmä-DNA-tekniikan alueeseen ja koskee menetelmää desulfatohirudiinin, joka on trombii-nin inhibiittori, valmistamiseksi geenitekniikalla aikaansaatujen eukaryoottisten solujen avulla, mainittuja geenitekniikalla aikaansaatuja eukaryoottisia soluja, desulfato-hirudiinin geeniä kantavia yhdistelmävektoreita, menetelmiä mainittujen eukaryoottisten solujen valmistamiseksi ja mainittuja yhdistelmävektoreita.
Hirudiini on antikoagulantti, jota esiintyy luonnostaan verijuotikkaissa (Hirudo’ medicinalis). Hirudiini ei ole yksi ainut proteiini, vaan se koostuu vähintään kolmesta komponentista, jotka ovat nimeltään hirudiinivarlantti 1 ((HV1), hirudiinivariantti 2 (HV2) (ks.. eurooppalainen pa-tenttihakemusjulkaisu no. 158 564) ja "des-(Val)2~hirudii-ni" (ks. eurooppalainen patenttihakemusjulkaisu no. 158 986). Variantit eroavat rakenteeltaan toisistaan useiden aminohappojen osalta (erityisesti siten, että HV1:n N-pään sekvenssi on Val-Val-Tyr, H2sn vastaava sekvenssi on Ile-Thr-Tyr ja "des-(Vai) 2~hirudiinin" vastaava sekvenssi on Thr-Tyr)) , mutta niissä on hydrofobisten aminohappojen kertymä N-päässä ja polaaristen aminohappojen kertymä C-päässä, tyrosiinitähde (Tyr®^) sulfaattimonoesterinä, kolme disul-fidisiltaa ja antikoagulanttiaktiivisuus yhteistä.
. Hirudiini, jonka K.-arvo (kompleksidissosiaatiovakio) —11 1 on 6 x 10 M, on voimakkain tunnettu trombiinin inhibiittori ja sille on ominaista spesifinen affiniteetti trombiinin suhteen. Hirudiini ei inhiboi muita veren koaguloitu-mistapahtumaketjuun osallistuvia entsyymejä. Toisin kuin hepariinilla, joka on tavanomaisessa koagulbituniisenestote-rapiassa etusijalle asetettava antikoagulantti, on hirudii-nilla suora inhiboiva vaikutus trombiiniin ja, toisin kuin ensin mainittu, se ei vaikuta antitrombiini III:n kautta. Puhdistetun hirudiinin ainut farmakologisesti havaittavis- 2 94773 sa oleva vaikutus on veren koaguloitumisen esto ja verisuonitukosten ennaltaehkäisy. Kun hirudiinia annettiin laskimonsisäisesti koirille, jopa suurina annoksina, ei havaittu vaikutusta sydämen lyöntitiheyteen, hengitykseen, verenpaineeseen, trombosyyttimäärään, fibrinogee-niin tai hemoglobiiniin. Rotilla, sioilla ja koirilla suoritetuissa kokeissa on hirudiini osoittautunut tehokkaaksi koeolosuhteissa aikaansaatuihin verisuonitukoksiin (indusoitu joko staasilla tai trombiini-injektiolla), en-dotoksiinishokissa ja DIC:ssä (disseminated intravascular coagulation). Suorissa vertailukokeissa on hirudiini aina osoittautunut hepariinia paremmaksi. Lisäksi hirudii-nin toksisuus on erittäin vähäinen, se ei ole antigeeninen ja se osoittaa lähes täydellistä puhdistumaa (clearance) biologisesti aktiivisessa muodossa munuaisten kautta.
Vaikka hirudiini onkin ollut pitkään tunnettu, se ei ole vielä saavuttanut sitä laajaa terapeuttista käyttöä, jota voitaisiin odottaa sen erinomaisten biologisten ominaisuuksien perusteella. Sen erittäin rajoitettu saatavuus on vakava este sen laajalle lääketieteelliselle käytölle. Tähän asti hirudiinivalmisteita on ollut saatavissa oleellisesti ottaen vain luonnonmateriaalista (verijuotikas-uutteet), joka on kallista ja vaikeasti saatavissa, ja käyttämällä aikaavieviä ja kalliita eristys- ja puhdistusmenetelmiä (ks. P. Walsmann et ai., Pharmazie 36, 653 (1981); eurooppalainen patenttihakemusjulkaisu no. 158 986). 65 aminohaposta koostuvan suhteellisen pitkän sekvenssin huomioonottaen, ei tavanomainen peptidisynteesikään taloudellisista syistä tarjoa suurta apua. Näin ollen tarvitaan uusia menetelmiä riittävien hirudiinimäärien tuottamiseen, jotta sen terapeuttinen teho ja laaja terapeuttinen käyttö antikoagulaatiohoidossa voidaan tutkia yksityiskohtaisissa kliinisissä kokeissa.
Erityisesti yhdistelmä-DNA-tekniikka tarjoaa tällaisia tuotantomenetelmiä. Tällä menetelmällä on mahdollista tuottaa mitä erilaisimpia fysiologisesti aktiivisia polypeptidejä, kun viljellään vastaavalla tavalla geneet-
il 1111 Hill I I i UI
3 94773 tisesti muunnettua isäntäorganismia. Tässä yhteydessä on syytä mainita, että verijuotikkaat tuottavat hirudiinia desulfatohirudiiniprekursorin kautta, joka sulfatoidaan luennan jälkeen. On odotettavissa, että muilta isänniltä kuin verijuotikkailta puuttuu spesifinen sulfaatin siirtoon tarkoitettu entsyymisysteemi, ja näin ollen ne tuottavat desulfatohirudiineja paremminkin kuin hirudiineja. Biologinen aktiivisuus ei kuitenkaan kärsi sulfaattiryh-män puutteen vuoksi, mikä ilmenee desulfatohitudiinipro-teiinista, joka saadaan poistamalla sulfaattiryhmän entsymaattisesti vastaavan hirudiiniproteiinin Tyr 63-täh-teen fenolisesta hydroksiryhmästä (ks. eurooppalainen patenttihakemus julkaisu no. 142 860).
Äskettäin julkaistussa eurooppalaisessa patenttihakemus julkaisussa no. 158 564 selostetaan desulfatohiru-diinivarianttien 1 ja 2 ja niiden analogien tuottamista E. coli-solujen avulla, jotka ovat transformoituneet plas-mideilla, jotka sisältävät vastaavan desulfatohirudiinin rakennegeenin. Viljeltyjen E. coli-solujen solu-uutteista mitattu antikoagulanttiaktiivisuus antitrombiiniyksikköinä (anti-trombin units; ATU) on 3000 - 4000 ATU/ODg00/l viljelmää, joka vastaa pitoisuutta 0,2 mg hirudiinia/OD/1 (perustuen arvioituun ominaisaktiivisuuteen 15.000 -200 000 ΑΤϋ/mg puhdasta hirudiinia).
Luultavasti transformoituneilla E. coli-soluilla saavutettu huono hirudiiniaktiivisuus johtuu siitä, että suurin osa hirudiiniproteiinista kertyy inaktiivisessa muodossa sytoplasmaan johtuen molekyylin väärästä laskostumisesta. Oikea laskostuminen riippuu kolmen disulfidisillan muodostumisesta hirudiinimolekyylin sisään, jotka sillat ovat olennaisia entsyymiaktiivisuudelle (ks. P. Walsmann et ai., supra). Myös monet muut luontaisesti erittyvät nisäkäsproteiinit, kuten naudan kasvuhormoni, ihmisen plasminogeenin kudosaktivaattori ja ihmisen γ-interferoni, ovat samoin oleellisesti ottaen inaktiivisia, kun ne kertyvät tuottajamikro-organismien sytoplasmaan (ks. R.A.
Smith et ai., Science 229, 1219 (1985)). On ilmeistä, että • 94773 erittymistie saattaa suosia disulf idisi,llan muodostumista, koska useimmat disulfidisiltoja sisältävät proteiinit ovat ekstrasellulaarisia. On olemassa myös muita seikkoja, jotka tekevät erittymisestä toivottavan.
Erittyneet proteiinit on usein helpompi havaita ja puhdistaa kuin solunsisäisesti kertyneet tuotteet; haluttujen tuotteiden erittyminen kasvualustaan poistaa tarpeen rikkoa isäntäorganismit tuotteen talteenottarai-seksi; joi Heikin heterologisilla proteiineilla voi olla toksinen vaikutus isäntäorganismiin. Erittyessään ne eivät ehkä niin helposti häiritse solun normaaleja toimintoja; erittyneet proteiinit eivät joudu proteolyyttisten entsyymien hajottavalle vaikutukselle alttiiksi yhtä helposti kuin solujen sisään kertyneet proteiinit, sillä ne käyvät ensinmainittujen kimppuun solujen hajoamisen jälkeen.
DNA koodittaä useimpia erittyviä proteiineja prepro-teiineina, joissa on signaalipeptidi liittyneenä kypsän aminohapon sekvenssin aminopäähän. Signaalipeptidillä on oleellinen osa siinä, että proteiini:- joutuu luennan yhteydessä endoplasmisen retikulumin (ER) kalvoihin.
SignaalipeptIdaasi katkaisee signaalipeptidin aikaisessa vaiheessa ER:n luminaalisella puolella. Tätä seuraa-va siirtyminen ulommalle solukalvolle tarvitsee Golgin laitetta ja eritysrakkukoita. Proteiini erittyy joko periplasmiseen tilaan (esim. happofosfataasi, invertaasi) tai kasvualustaan (esim. α-tekijä, tappajatoksiini) .
Koska kaikilla eukaryooteilla näyttää olevan samat * mekanismit geneettisen informaation ilmentämiseen ja il mentyneiden proteiinien lajitteluun, tapahtuu eukaryoot-tisten geenien ilmentyminen eukaryoottisessa isännässä suuremmalla teholla kuin E. colissa. Eukaryoottisista organismeista on hiiva helpoin käsitellä ja viljellä. Hiivassa on ilmennetty onnistuneesti lukuisia heterolo-gisia proteiineja. Tähän mennessä ei kuitenkaan ole ollut mahdollista määritellä niitä proteiinin oleellisia piir- 5 94773 teitä - lukuunottamatta liittynyttä signaalipeptidiä jotka mahdollistavat proteiinin tehokkaan erittymisen kasvualustaan. Näin ollen ei ole mahdollista tehdä luotettavia ennusteita siitä, erittyykö proteiini vai ei. Niinpä, vaikka 90 % transformoituneen hiivan (sisältää preglukoamyläasin geneettisen informaation) erittyy kasvualustaan (PCT-patenttihakemusjulkaisu no. 84/2921) ja suuria epidermaalisen kasvutekijän (EGF) tiittereitä löytyy sellaisen hiivan viljelmästä, joka sisältää EGF-geenin, johon on liittyneenä α-tekijän signaalipeptidin sekvenssi (eurooppalainen patenttihakemusjulkaisu no.
116 210), löytyy vain pieniä määriä β-endorfiinia ία-tekijän signaalipeptidi', PCT-patenttihakemusjulkaisu no. 84/4330), leukosyytti-interferoni Asta (invertaasin signaalipeptidi, eurooppalainen patenttihakemusjulkaisu no.
127 304) , ihmisen γ-interferonia, ihmisen·seerumialbu-miinia, naudan interferoneja a1 ja a2, plasminogeenin ku-dosaktivaattoria, renniiniä ja ihmisen insuliinin kaltaista kasvutekijää*(α-tekijän signaalipeptidi, eurooppalainen patenttihakemusjulkaisu no. 123 544), leukosyytti-interferoneja D ja A, γ-interferonia ja ihmisen kasvuhormonia (MGH) (interferonin ja HGHsn signaalipeptidit, vastaavasti, eurooppalainen patenttihakemusjulkaisu no.
88 632) kasvualustasta eikä mitään Pseudomonas-karboksi-peptidaasi G2(CPG2):tä (G2(CPG2):n signaalipeptidi, eurooppalainen patenttihakemusjulkaisu no. 121 352) tai plasminogeenin kudosaktivaattoria (PH05-signaalipeptidi, eurooppalainen patenttihakemusjulkaisu no. 143 081) erity transformoituneen hiivan toimesta kasvualustaan.
Huomattavia ponnisteluja on suunnattu sekä perustutkimukseen että kaupallisiin sovellutuksiin hiivan käyttämiseksi heterologisten geenien ilmentämiseksi. Proteiinit, jotka ilmentyvät hiivassa, ovat usein olleet lääketieteellisesti tai terapeuttisesti tärkeitä ihmis-proteiineja. Useimpien näiden proteiinien yhteydessä ponnistelut on suunnattu erittymiseen hiivasta. Tähän on useita syitä: 6 94773 1) Suurin osa ihmisen tai imettäväisten terapeuttisista proteiineista on erittyviä (esim. vereen).
2) Useimmat eritysproteiinit sisältävät disulfidisidok-siä, jotka eivät mahdollisesti muodostuisi oikein sytoplasmassa. Tästä johtuen eritysreitin läpi kulkeminen lisää mahdollisuutta saada virheettömästi laskostuneet, aktiiviset molekyylit.
3) Vähäinen määrä kontaminoivia proteiineja hiivakasva-tusalustassa tekevät erittyneen, heterologisen proteiinin puhdistamisen melko yksinkertaiseksi.
Erittyminen määritellään syntetisoidun tuotteen vapautumisena soluista. Signaali (esim. signaalipeptidi) tarvitaan ohjaamaan juuri syntetisoitu tuote eritysreitin rakkuloihin. Eritysrakkuloiden sisältö vapautuu rakkuloiden yhtyessä plasmamembraaniin. Hiivassa selvä soluseinä rajoittaa plasmamembraanin ja soluseinän välillä olevan tilan periplasmiseksi tilaksi. Vapautunut tuote on siten joko periplasmisessa tilassa (soluun liittyneenä mutta plasmamembraanin ulkopuolella) tai solusta todella vapautuneena ympäröivässä kasvualustassa. Homologisilla hiiva-proteiineilla on esimerkkejä molemmista tilanteista: hapan fosfataasi fPHOSi ja invertaasi (SUC2) jäävät peri-plasmiseen tilaan, kun taas a- ja α-tekijä, feromonipep-, tidaasi (BAR1) ja killer-toksiini vapautuvat alustaan (vrt. EP 123294, sivu 4, ensimmäinen kappale).
Tässä patenttihakemuksessa esitetyt vaatimukset koskevat heterologisen proteiinin desulfatohirudiinin erittymistä kasvualustaan.
• ·
Tunnettu tekniikka vuonna 1986, koskien heterologisten proteiinien erittymistä alustaan hiivalla, on koottu taulukkoon l, jossa esitetään luettelo lukuisista kombinaatioista, jotka on otettu kirjallisuudesta, yhdessä tulosten kanssa, joissa proteiini erittyy alustaan tai ei erity. Tämä lista ei ole ollenkaan täydellinen. Se on 94773 7 yritys esittää tunnetun tekniikan taso sillä rajoituksella, että epäonnistumisia proteiinin viemisessä kasvatusalustaan ei ehkä ole julkaistu, kun taas positiiviset tulokset on hyvin dokumentoitu. Täydennyksenä on esitetty eräitä lisätietoja, joita ei ollut saatavilla 1986 (7 viitettä).
Taulukko 1
Vieraiden proteiinien erittyminen hiivasta: julkaistut tiedot
Ekspressiokasetti Tuote Viite
Prom. Sign.sekv. Geeni Alusta Solu MFal aFL β-endorphin + Bitter, 1984 (doc. D2) MFal aFL EGF >90% Brake, 1984 MFal aFL TGFa >90« Derynck, 1988 EMO glucoamylase glucoamylase >90% Innes,1985 ADC1 a-amylase n a-amylase 90% 10% Thomsen, 1983 MFal aFL HIR 90% 10% Loison, 1988 MFal aFL IGF1 80% 20% Bayne, 1988 ADHI AT III AT III 80% 20% Broeker,1987 GAL10 lysozyme lysozyme 60% 40% Jigami,1986 MFal aFL m GM-CSF 65% 35% Ernst, 1987 MFal OFL h GM-CSF 50% 50% Ernst, 1987 PGK limmunoglob. limmunoglobulin 40% 60% Hood, 1985 TPI SUC2 a-AT 20% 80% Moir,1987 PGK IFN-γ IFN-γ 17% 83% Hitzeman, 1983 PGK LelFD LelFD 4% Hitzeman,1983 PGK SUC2 IFN-a2 7% Chang, 1986 MFal aFL prochymosin 0.6% Smith, 1985 SUC2 SUC2 prochymosin 4.2% Smith, 1985 PGK chymosin prochymosin 0% Mellor,1983 GAP thaumatin thaumatin 0% Edens,1984 PH05 PH05 t-PA 0% Lemontt,1985
Lisätietoja esittävät Kingsman et ai. (1985, sivu 398). Taulukosta 1 käy selvästi ilmi, että erityssignaalin liittyminen tiettyyn koodittavaan sekvenssiin ei auto- 8 94773 staattisesti takaa tuotteen kulkeutumista kasvatusalustaan. Taulukko 1 osoittaa, että tehokas erittyminen kasvatusalustaan saavutetaan ensi sijassa α-tekijän ohjaus-sekvenssillä tai vieraiden proteiinien aidoilla signaali-peptideillä. Hiivan signaalipeptidejä hapanta fosfataasia (PH05) tai invertaasia (SUC2) ei kuitenkaan ole menestyksellisesti käytetty heterologisten proteiinien erittämi-seksi kasvatusalustaan.
S janaa1ipeptidit vastaan prepro-ohiaussekvenssi:
Erittyneet polypeptidit tai proteiinit eukaryoottisissa soluissa omaavat tyypillisesti signaalit, jotka ohjaavat molekyylin eritysreitin organelleihin.
Signaalipeptidit ovat lyhyitä (15-25 aminohappoa), hydrofobisia sekvenssejä, joilla on tietty konsensus (von Heijne, 1983, 1984). Signaalipeptidit ovat erittyneiden proteiinien Nl^-terminaalisia pidentymiä, jotka ohjaavat proteiinin endoplasmaattiseen kalvostoon (ER) ja välittävät translokaation membraanin läpi. Signaalipeptidaasi lohkaisee prekursorin ja vapauttaa kypsän molekyylin ER:n onteloon. Signaalipeptidaasi lohkaisee ensi sijassa pienten, neutraalien aminohappojen (Ala, Cys, Ser, Thr) jälkeen, mutta ei koskaan varautuneiden aminohappojen (Asp, Glu, Lys, Arg) jälkeen (von Heijne, 1983). Esimerkkejä ovat PH05- ja invertaasisignaalipeptidit.
Prepro-ohjaussekvenssit ovat pituudeltaan vaihtelevia (a-tekijän ohjaussekvenssi on 85 aminohapon pituinen). Pre-. sekvenssi toimii kuten signaalipeptidi ohjaten proteiinin ER:ään. Signaalipeptidaasin lohkaisemisen jälkeen pro-sekvenssi yhä säilyy liittyneenä NH2-terminaalisena piden-tymänä kyseessä olevaan proteiinin tai peptidiin. Kaksi-emäksiset aminohapot ovat prosessointisignaali endopep-tidaasille yscF Golgissa kypsän tuotteen vapautumiseksi 9 94773 (α-tekijä tai killer-toksiini, katso N. Skipper et ai. (1984)).
Lohkaiseminen signaalipeptidaasilla ja prosessointi endo-peptidaasilla yscF ovat hiivan kaksi eri tapaa vapauttaa kypsä tuote eritysreitiltä. Hiivassa erittyneet, homologiset proteiinit, kuten hapan fos£ataasi ja invertaasi, joita koodittavat signaalisekvenssin sisältävä geeni, sijaitsevat lopuksi periplasmisessa tilassa, kun taas homologiset proteiinit, esim. α-tekijä tai killer-toksiini, joita koodittavat prepro-ohjaussekvenssin sisältävä geeni, erittyvät yleensä kasvatusalustaan, (katso viite EP 123294). Näistä syistä johtuen ammattimies vuonna 1985 olisi arvellut prepro-ohjaussekvenssien olevan funktio-naalisesti erilaisia kuin signaalisekvenssit ja siten hirudiinin erittymiseksi suunniteltu menetelmä, jossa käytetään ac-tekijää ja joka on esitetty vireillä olevassa, aikaisemmin jätetyssä EP-patenttihakemuksessa nro 200655, on erilainen kuin tässä hakemuksessa esitetty lähestymistapa.
t 9
Hiivan a-tekijällä, joka samoin erittyy kasvatusalustaan (EP 123295), on Nl^-terminaalinen pidentymä, joka ei ole tyypillinen eritysohjaussekvenssille. Prosessointi tapah-; tuu lohkaisulla kaksiemäksisten aminohappojen takaa.
Brake et ai. (1985) esittävät Cold Spring Harbor-tiedon-annossa proteiinikuljetuksesta ja erittymisestä seuraa-vaa: "eritysmekanismi a-tekijälle on jäänyt täysin tuntemattomaksi" (sivu 103) ja "aminoterminaaliset pidentymät eivät sisällä hydrofobisia signaalisekvenssejä, joita ta-;· vallisesti löytyy erittyneiden proteiinien prekursoreis-ta" (sivu 106). Kirjoittajat päättelevät, että a-tekijä on "luultavasti muodostunut aivan erilaisella mekanismilla " (sivu 107). Vähän aikaa sitten McGrath et ai. (1989) ja Sterne et ai. (1989) ovat osoittaneet, että a-tekijän vapauttaa MATa-soluista transmembraaninen peptiditranslo-kaattori (tai moninkertainen lääkeaineresistentti prote- 94773 10 iini) riippumatta klassisesta eritysreitistä. Näin ollen a-tekijä noudattaa omaa reittiään solun pinnalle riippumattomana eritysreitistä. Alan ammattimies tunnisti jo vuonna 1985, että a-tekijän ohjaussekvenssi ei ole tavanomainen signaalisekvenssi von Heijnen esittämässä mielessä ja että erittymiseen johtavan tien täytyy olla erilainen. Siitä johtuen a-tekijän ohjaussekvenssiä ei myös koskaan pidetty tavanomaisten hiivasignaalipeptidi-en, kuten happamen fosfataasin tai invertaasin, funktionaalisena ekvivalenttina.
Mitä tulee feromonipeptidaasiin (BAR1), joka on neljäs homologinen hiivaproteiini, jonka vuonna 1986 tiedettiin erittyvän kasvatusalustaan (katso viite EP 123294), sen prekursorin DNA-sekvenssit ja eritysmekanismi olivat tuntemattomia tämän hakemuksen jättöaikana.
Erittymisen määrittävät tekijät hiivassa:
Proteiinien erittyminen käsittää ohjautumisen eritys-reitin organelleihin, kulkeutumisen plasmamembraaniin ja vapautumisen solusta. Organellit suovat edulliset olosuhteet hiivan proteiinien prosessoinnille, oikealle laskostumiselle ja aktiivisen konforinaation muodostumiselle.
Heterologisille tuotteille olosuhteet ovat erilaiset: oikea prosessointi ei ole välttämättä ennustettavissa, koska signaalipeptidit tai ohjaussekvenssipidentymät luovat uusia aminohappoliitoksia, jotka voivat olla tai olla olematta prosessoivien entsyymien substraatteja. Signaa-.. lipeptidilohkaisu tapahtuu hyvin aikaisessa vaiheessa eritysreitillä. Pro-sekvenssit (pro-aFL) kuitenkin ryhmittyvät uudelleen liittymällä heterologiseen tuotteeseen ja prosessoituvat vasta myöhään plasmamembraaniin tapahtuvan kuljetuksen aikana. Riippuen tuotteen aminohapposekvenssistä pro-sekvenssin mukanaololla tai poissaololla voi ilmeisesti olla ennalta aavistamaton vaikutus heterologi- Ί t mm i i » *t t 11 94773 sen tuotteen laskostumiseen, membraanivuorovaikutuksiin ja stabiilisuuteen.
Taulukosta 1 nähdään, että vieraat proteiinit erittyvät parhaiten hiivassa, kun käytetään niiden omia signaa-lisekvenssejä tai α-tekijän ohjaussekvenssiä, kun taas hiivan invertaasin (SUC2) tai happamen fosfataasin (ΡΗ05Ϊ signaalipeptidit näyttävät olevan epäsopivia signaaleja vieraiden proteiinien erittymiseksi kasvatusalustaan. Kingsman et ai. (1985, sivu 401) esittivät katsausartikkelissa, joka koski heterologisten geenien ilmentämistä S. cerevisjaella, että "tällä hetkellä ei ole vahvaa näyttöä siitä, että niiden (SUC2 ja PH05) signaalisekvenssit ohjaisivat muita proteiineja mieluummin kasvatusalustaan kuin periplasmiseen tila'an" ja "Potentiaalisesti paljon lupaavampi erityssysteemi käyttää hiivan pariutumisfero-monin, α-tekijän eritys- ja prosessointisignaaleja" (vrt. tässä yhteydessä lähestymistapaa, joka on valittu julkaisussa EP 200655 verrattuna edellä esitettyyn). Tämä väittämä hyvin tunnetun hiiva-asiantuntijan lausumana heijastaa tunnettua tekniikkaa vuonna 1985, jolloin tämän patenttihakemuksen etuoikeushakemus jätettiin.
Tämän kokemuksen perusteella, mikä vallitsee hiivailmen-tämisen alalla, PHOS- tai SUC2-sicmaalipeptidin käyttö kypsän, vieraan proteiinin, kuten desulfatohirudiinin, ilmentämiseksi ei ollut itsestään selvä valinta 1985 ja havainto, että desulfatohirudiini erittyy kasvatusalustaan, oli odottamaton.
;. Taulukko 1 osoittaa myös, että a) erilaiset heterologiset proteiinit käyttäytyvät kombinaatiossa α-tekijän ohjaussekvenssin kanssa eri tavalla erittymisessä: epidermaalinen kasvutekijä (epidermal growth factor =EGF) ja prokymosiini ilmentyvät hiivassa α-tekijän promoottorin ohjauksen alaisina ja prepro-o- 12 94773 tekijän ohjaussekvenssillä. Ne erittyvät kasvatusalustaan 90%risesti (Brake 1984) ja vastaavasti 0,6%risesti (Smith 1985).
b) Prokymosiini ei erity hiivassa omalla signaalisekven-sillään (Mellor, 1983), invertaasisignaalipeptidillä (Smith, 1985) eikä α-tekijän ohjaussekvenssillä (Smith, 1985).
Egliini C, kuten hirudiini, on iilimatoproteiini, joka lisäksi on kooltaan suunnilleen saman suuruinen (70 aminohappoa), se ei erity ollenkaan hiivalla vaikka on käytetty samaa ilmentämiskasettia kuin desulfatohiru-diinille (paitsi, että egliini Cm geenillä on korvattu desulfatöhirudiinin geeni, pJDB207/PH05-EGL, katso tämän hakemuksen esimerkki 32).
Nämä tulokset tukevat huomiota, että itse proteiinien parametrit myötävaikuttavat siihen, erittyvätkö ja siirtyvätkö ne kasvatusalustaan vai jäävätkö ne solun sisälle.
Edellä mainituista esimerkeistä voi päätellä, että vuonna 1986, jolloin tämä patenttihakemus jätettiin, ei voitu mitenkään ennustaa, eikä voida yhä vieläkään ennustaa, , täyttääkö tuntematon proteiini vaatimukset erittymiseen hiivassa ja erityisesti vapautumiseen kasvatusalustaan.
Yhteenvetona esitämme, että - hiivaeritys vapauttaa aluksi tuotteen periplasmiseen tilaan, - ainoastaan harvat homologiset hiivaproteiinit vapautuvat kasvatusalustaan, - heterologisten proteiinien erittymiseksi on pääasiassa käytetty α-tekijän ohjaussekvenssiä tai proteiinien alkuperäisiä signaalipeptidejä, 13 94773 - hiivan happamen fosfataasin tai invertaasin signaali-peptidejä ei onnistuttu käyttämään heterologisten proteiinien erittämiseksi kasvatusalustaan, - tästä syystä, jos menetelmän, jolla toteutettaisiin hiivan signaalisekvenssin liittyminen kiinnostuksen kohteena olevaan proteiiniin, lähtökohtaa arvioitaisiin, ilmeinen valinta vuonna 1986 tehokkaaksi erityssignaalik-si olisi ollut prepro-a-tekijän ohjaussekvenssi tai luonnollisesti liittyneet signaalipeptidit, - ei ollut ilmeistä Kingsmanin et ai. (1985) ennakkoluuloisen käsityksen ja hiivan ilmentymisalalla saadun kokemuksen (taulukko 1) perusteella käyttää sen sijaan happamen fosfataasin (ΡΗ05Ϊ tai invertaasin (SUC2) sig-naalisekvenssejä eikä se ollut ymmärrettävästi odotettua, mistä syystä oli yllättävää havaita syntetisoituneen desulfatohirudiinin erittyminen kasvatusalustaan, kun käytettiin PH05- tai SUC2-siqnaalisekvensse1ä, - kypsän proteiinin oikea prosessointi ja vapautuminen ei ole ennalta arvattavissa johtuen uusista liitoksista ohjaussekvenssien ja heterologisten proteiinien välillä, - proteiinin aminohapposekvenssillä on ennalta arvaamaton vaikutus siihen kulkeutuuko proteiini alustaan vai ei.
Seuraavassa viiteluettelo täydellisenä: • · 14 94773
Bayne^UL ct al., Gene 66(1988)235
Brake,AJ. et aL, ProcJNatLAcad.Sci.USA 81(1984)4642
Brake,AJ. et aL, in Current Communication in MoLBioL "Protein Transport and
Secretion",1985, Cold Spring Harbor Laboratory
Broeker,M. et aL, Biochim.et Biophys Acta 908(1987)203
Chang,ON. et aL, MoLCelLBioL 6(1986)1812
Derynck,R.M.A. US 4,742,003 (1988)
EdensJ- et aL, Cell 37(1984)629 ErnstJJ1. et aL, Bio/Technology 5(1987)831 HitzcmaiULA. et aL EP 88,632 (1983)
InmsJvLA. et aL, Science 228(1985)21 Jigami,Y. ct aL, Gene 43(1986)273
Kingsman^LM. et aL Biotechnology and Genetic Engineering Reviews 3(1985)377 LcmonttJJF. et aL, DNA 4(1985)419 Loisort, G. ct aL, EP 200655 (1986)
Loison,G. et aL, Bio/Technology 6(1988)72
McGrath, JJP., et aL in Yeast Cell Biology (1989)202, Cold Spring Harbor Laboratory
MellorJ. et aL, Gene 24(1983)1
Moiret aL, Gene 56(1987)209
Skipper, N. et aL, EMBO J. 3 (1984) 107-111
Smith^LA. et aL,Sdcnce 229(1985)1219
Steme, R. et aL in Yeast Cell Biology (1989)203, Cold Spring Harbor Laboratory
Thomsen,KJL, Carlsberg Res. Commun. 48(1983)545 von Heijne,G., EurJ.Biochem. 133(1983)17 von Hdjne,G., EMBO J. 3(1984)2315
Wood,CR. et aL, Nature 314(1985)446 • · : . Nyt on siten yllättäen havaittu, että hirudiiniaktiivi- suutta omaavia proteiineja erittyykasvualustaan eukaryoot- ι5 94773 tisten organismien toimesta, jotka sisältävät DNA:ta, jossa on signaalipeptidiä koodittava sekvenssi ylävirrassa ja lukuvaiheistuksessa desulfatohirudiinin ra-kennegeenin suhteen.
Esillä oleva keksintö tarjoaa menetelmän hirudii-niaktiivisuutta omaavien proteiinien tuottamiseksi ja erittämiseksi eukaryoottisen isäntäorganismin toimesta. Edelleen keksintö tarjoaa yhdistelmävektoreita, joissa on signaalipeptidiä koodittava DNA-sekvenssi ylävirrassa ja lukuvaiheistuksessa desulfatohirudiinin rakennegeenin suhteen, sekä mainituilla yhdistelmävektoreilla transformoituneita eukaryoottisia isäntäorganismeja.
1. Menetelmä desulfatohirudiinin tuottamiseksi
Keksintö koskee menetelmää hirudiiniaktiivisuutta omaavien proteiinien tuottamiseksi siten, että sopivissa ravinneolosuhteissa viljellään eukaryoottista isäntäorga-nismia, joka on transformoitunut yhdistelmävektorilla, jossa on yksi tai useampia liitettyjä DNA-jaksoja, joista kdkin sisältää eukafyoöttisen ilmentymisenohjaussekvenssin, DNA-jakson joka koostuu ensimmäisestä DNA-sekvenssistä, joka koodit-taa signaalipeptidiä ja on ylävirrassa ja lukuvaiheistuksessa toisen DNA-sekvenssin suhteen, joka koodittaa kypsää desulfatohirudiinia, joka mainittu DNA-jakso on mai-* nitun ilmentämisenohjaussekvenssin transkriptionaalises- sa ohjauksessa,ji eukaryoottiset transkriptionlopetussig-naalit sisältävänDNA-sekvenssin, ja kasvualustasta eristetään hirudiiniaktiivisuutta omaavat proteiinit ja haluttaessa eristetään solun sisältä soluun liittyvä hiru-diiniaktiivsuutta omaava mahdollinen lisäproteiini ja haluttaessa muunnetaan saatu hirudiiniaktiivisuutta omaava proteiini toiseksi hirudiiniaktiivisuutta omaavaksi proteiiniksi.
Termillä "kypsää desulfatohirudiinia koodittava DNA-sekvenssi" halutaan kattaa kaikki hirudiiniaktiivisuutta omaavia kypsiä proteiineja koodittavat rakennegeenit, joi- ·· 16 94773 den tiedetään olevan olemassa, ja/tai jotka voidaan eristää verijuotikkaan perimästä, kuten kypsän desulfatohi-rudiinin varianttien HV1, HV2, PA ja des-(Vai)2~desulfa-tohirudiinin rakennegeenit (ellei viimeksimainittu ole pelkkä HV1-geenin ilmentymisen jälkituote). Termillä "kypsä desulfatohirudiini" tarkoitetaan desulfatohirudii-neja, joista puuttuvat mahdolliset pre- ja prosekvenssit.
"Hirudiiniaktiivisuutta omaavilla proteiineilla" tarkoitetaan sellaisia erittävistä isäntäsoluista saatuja proteiineja, joilla on trombiinia inhiboiva vaikutus, ja jotka reagoivat positiivisesti hirudiinin vasta-aineiden kanssa, ja joilla on desulfatohirudiinin primääriraken-ne, sekä näiden proteiinien muunnettuja, kuten sulfatoi-tuja, johdannaisia, esimerkiksi vastaavia hirudiineja, ja näiden lyhennettyjä johdannaisia, kuten desulfatohirudii-neja, joiden C-päästä puuttuu 1-7 aminohappoa.
Näitä proteiineja ovat erityisesti kaavan (I) mukaiset johdannaiset X Tyr Thr Asp Cys Thr Glu Ser Gly Gin Asn Leu Cys
Leu Cys Glu Gly Ser Asn Vai Cys Gly Gin Gly Asn Lys Cys
Ile Leu Gly Ser Asp Gly Glu Lys Asn Gin Cys Vai Thr Gly
Glu Gly Thr Pro Lys Pro Gin Ser His Asn Asp Gly Asp Phe
Glu Glu Ile Pro Glu Glu Tyr Leu Gin
R
<D, jossa kaavassa X on dipeptiditähde Val-Val- (HV1) tai Thr (des-(Vai)2~hirudiini) ja R on Tyr:n fenolinen hydroksi-ryhmä tai ryhmä, jonka kaava on -O-SO^H, sekä johdannai-·** set, joista puuttuu C-pään aminohappo Gin, C-pään dipepti- di -Leu-Gln, C-pään tripeptidi -Tyr(R)-Leu-Gln tai C-pään tetrapeptidi -Glu-Tyr(R)-Leu-Gln, tai kaavan (II) mukaiset johdannaiset 1 il iu > «im i : . ,> · 94773 17
Ile Thr Tyr Thr Asp Cys Thr Glu Ser Gly Gin Asn Leu Cys
Leu Cys Glu Gly Ser Asn Vai Cys Gly Lys Gly Asn Lys Cys
Ile Leu Gly Ser Asn Gly Lys Gly Asn Gin Cys Vai Thr Gly
Glu Gly Thr Pro Asn Pro Glu Ser His Asn Asn Gly Asp Phe
Glu Glu Ile Pro Glu Glu Tyr Leu Gin
J
R
(II) (HV2), jossa R on määritelty edellä, tai vielä eräs veri-juotikkaan tuottama hirudiinivariantti nimeltään hirudiini-PA (J. Dodt, Väitöskirja, Miinchenin yliopisto, Länsi-Saksa, 1984) , joka on kaavan (III) mukainen
Ile Thr Tyr Thr Asp Cys Thr Glu Ser Gly Gin Asn Leu Cys
Leu Cys Glu Gly Ser Asn Vai Cys Gly Lys Gly Asn Lys Cys
Ile Leu Gly Ser Gin Gly Lys Asp Asn Gin Cys Vai Thr Gly
Glu Gly Thr Pro Lys Pro Gin Ser His Asn Gin Gly Asp Phe
Glu Pro Ile Pro Glu Asp Ala Tyr Asp Glu
R
(III) (PA) , jossa R on määritelty edellä.
Etusijalle asetettava hirudiiniaktiivisuuden omaava proteiini on kaavan I mukainen siten, että X on Val-Val-ja R on Tyr:n fenolinen hydroksiryhmä, sekä tämän johdannaiset, joissa C-päätä on lyhennetty yhdestä seitsemään aminohapolla, erityisesti yhdestä neljään aminohapolla, i. Sopivia eukaryoottisia isäntäorganismeja ovat korkeampien organismien, erityisesti nisäkkäiden, solut ja erityisesti vakiintuneet ihmisen tai eläinten solulinjat, kuten VERO-tai HeLa-solut, tai kiinalaisen hamsterin munasarjan so-lulinja (CHO), ja hiivat, kuten Saccharomyces cerevisiae. Tämän keksinnön mukaisia edullisia isäntäorganismeja ovat '1 hiivat, erityisesti Saccharomyces cerevisiae-kannat.
is 94773
Eukaryoottista isäntäorganismia, joka sisältää edellämainitut DNA-sekvenssit, viljellään alalla tunnetuilla menetelmillä.
Näin ollen tämän keksinnön mukaisia transformoituneita hiivasoluja viljellään nestemäisessä alustassa, joka sisältää assimiloituvia hiili- ja typpilähteitä sekä epäorgaanisia suoloja.
Monenlaiset hiililähteet soveltuvat käytettäviksi. Esimerkkejä edullisista hiililähteistä ovat assimiloituvat hiilihydraatit, kuten glukoosi, maltoosi, mannitoli tai laktoosi, asetaatit, kuten natriumasetaatti, joita voidaan käyttää yksin tai sopivina seoksina. Sopivia typpilähteitä ovat esimerkiksi aminohapot, kuten kasaminohapot, peptidit ja proteiinit ja niiden hajoamistuotteet, kuten tryp-toni-, peptoni- tai lihauutteet, ja edelleen hiivauute, mal-lasuute, maissinliuotusvesi ja ammoniumsuolat, kuten am-moniumkloridi, -sulfaatti tai -nitraatti, joita voidaan käyttää joko yksin tai sopivina seoksina. Käytettäviksi sopivia epäorgaanisia suoloja ovat esimerkiksi natriumin, kaliumin, magnesiumin ja kalsiumin sulfaatit, kloridit, fosfaatit ja karbonaatit. Ravinnealusta voi lisäksi sisältää kasvua edistäviä aineita. Kasvua edistäviä aineita ovat mm. hivenaineet, kuten rauta, sinkki, mangaani tms. ja yksittäiset aminohapot.
** Hiivasolut, jotka ovat transformoituneet autonomises ti replikoituvilla plasmideilla, esimerkiksi hiivan 2μ-DNA: ta(infra) sisältävillä plasmideilla, ovat eri määrin taipuvaisia menettämään saamansa yhdistelmäplasmidin. Tästä syystä tällaisia hiivasoluja pitää kasvattaa valintapaineessa eli olosuhteissa, jotka vaativat jonkun plasmidin • ♦ koodittaman geenin ilmentymisen kasvaakseen. Useimmat tällä hetkellä käytössä olevista ja tämän keksinnön mukaisten yhdistelmävektorien (infra) sisältämistä geeneistä koodittavat aminohappojen tai puriinien biosynteesin entsyymejä. Tämä edellyttää synteettisten minimia- . lustojen käyttöä, joista puuttuu kyseinen aminohappo tai • » · ' -«.· I , , fc· .
19 54773 puriiniemäs. Kuitenkin voidaan yhtä hyvin käyttää geenejä, jotka antavat vastustuskyvyn sopivalle biosidille (esim. geenejä, jotka antavat vastustuskyvyn sykloheks-imidin, aminoglykosidin G418, raskasmetallin tms. suhteen). Hiivasoluja, jotka antavat antibioottiresistenssin, kasvatetaan vastaavaa antibioottia sisältävissä kompleksi-alustoissa, jolloin saavutetaan suuremmat kasvunopeudet ja korkeammat solutiheydet.
Kromosomiin integroituneella DNA:11a transformoituneet hiivasolut eivät vaadi selektiivisiä kasvuolosuhteita. Nämä transformoituneet solut ovat riittävän stabiileja voidakseen kasvaa ilman valintapainetta. Näitä soluja on edullista kasvattaa kompleksialustoissa.
Hiivasolut, joissa on konstitutiivisella promoottorilla (esim. ADHI, GAPDH) varustettu yhdistelmäplasmidi, ilmentävät desulfatohirudiinigeeniä mainitun promottorin ohjauksessa ilman indusointia. Jos kuitenkin desulfato-hirudiinigeeni on säädellyn praroottorin (esim. PGK tai PH05) ohjauksessa, pitää kasvualustan koostumusta muuttaa, jotta saavutetaan mRNA-transkriptien maksimaaliset määrät, eli käytettäessä PH05-promoottoria pitää kasvualustan epäorgaanisen fosfaatin pitoisuuden olla pieni, jotta tämä promoottori kytkeytyy päälle.
Viljely suoritetaan tavanomaisilla menetelmillä. Viljelyolosuhteet, kuten lämpötila, alustan pH ja fermen-tointiaika valitaan niin, että valmistuu maksimimäärä desulfatohirudiinia. Valittua hiivakantaa on edullista kasvattaa aerobisissa olosuhteissa pinnanalaisviljelmi-nä ravistellen tai sekoittaen lämpötila-alueella noin 25 - 35°C, mielellään noin 30°C:ssa, pH-alueella 4-8, • < esimerkiksi pH-arvossa noin 7, noin 4-20 tuntia, mielellään siihen asti, kunnes saavutetaan maksimaalinen proteiinisaanto.
Yllättäen on havaittu, että riippumatta isäntäorga-nismista ja käytetystä signaalipeptidistä, suurin osa tuotetuista hirudiiniyhdisteistä erittyy kasvualustaan, ··« 20 94773 kun taas vain pieni osuus jää solun yhteyteen. Tarkka suhde (erittyneet yhdisteet/solun yhteydessä olevat yhdisteet) riippuu fermentointiolosuhteista ja käytetystä talteenottomenetelmästä. Yleensä suhde on noin 9:1 tai suurempi. Näin ollen erittynyt hirudiiniosuus dominoi aina voimakkaasti.
Hirudiiniyhdisteet voidaan eristää viljelyalustasta tavanomaisilla menetelmillä. Esimerkiksi ensimmäinen vaihe on yleensä solujen eristäminen kasvuliuoksesta sentri-fugoimalla. Saatu emäliuos voidaan rikastaa hirudiini-yhdisteiden suhteen polyetyleeni-imiinikäsittelyllä, jotta suurin osa ei-proteiinimateriaalista poistuu, ja sen jälkeen proteiinit voidaan saostaa kyllästämällä liuos ammoniumsulfaatilla tai lisäämällä trikloorietikkahap-poa. Isännän proteiinit, jos niitä on läsnä, voidaan myös saostaa tekemällä liuos happamaksi etikkahapolla (esim. 0,1 %:sella, pH 4 - 5). Rikastamista hirudiiniyh-disteiden suhteen voidaan vielä jatkaa uuttamalla etikka-happoemäliuos n-butanolilla. Muita puhdistusvaiheita ovat mm. suolanpoisto, kromatografiset menetelmät, kuten ioninvaihtokromatografia, geelisuodatuskromatogra-fia, partitiokromatografia, HPLC, käänteisfaasi-HPLC tms. Seoksen aineosien erottaminen voidaan myös saada aikaan dialyysillä, varauksen perusteella käyttämällä geelielektro-foreesia tai kantaja-aineesta vapaata elektroforeesia, molekyylipainon perusteella käyttämällä sopivaa Sephadex-pylvästä, affiniteettikromatografiällä, käyttämällä esimerkiksi vasta-aineita, erityisesti monoklonaalisia vasta-aineita, tai trombiinin avulla, joka on kytketty sopivaan kantaja-aineeseen affiniteettikromatografiaa varten, tai muilla menetelmillä, erityisesti kirjallisuudesta tunnetuilla.
Jos halutaan eristää mahdollisia soluihin yhteydessä olevia hirudiiniyhdisteitä eli sellaisia, jotka ovat kertyneet solun sisään tai periplasmiseen tilaan, tarvitaan eräitä lisäpuhdistusvaiheita. Niinpä, jos hi-rudiiniproteiinit ovat kertyneet solujen sisään, muodos- tl ie t HIK I HH < 21 94773 tuu haluttujen proteiinien ensimmäinen talteenottovaihe proteiinien vapauttamisesta solujen sisältä. Useimmissa menetelmissä solunseinä poistetaan ensin entsymaattisella hajotuksella käyttämällä glukosidaaseja (infra). Sitten näin saadut sferoplastit käsitellään pinta-aktiivisilla aineilla, kuten Triton silla. Vaihtoehtoisesti soveltuvat solujen rikkomiseen mekaaniset voimat, kuten leikkausvoi-ma (esim. X-puristin, ranskalainen puristin) tai ravistelu lasihelmien kanssa. Jos isäntä, erityisesti hiiva, erittää hirudiiniyhdisteet periplasmiseen tilaan, voidaan käyttää yksinkertaisempaa menetelmää. Proteiini otetaan talteen ilman solujen lysoimista suorittamalla solunsei-nän entsymaattinen poisto tai käsittelemällä kemiallisilla aineilla, esimerkiksi tiolireagensseilla tai EDTAslla, jotka vaurioittavat solunseinää niin, että tuotettu proteiini vapautuu.
On yllättäen havaittu, että desulfatohirudiiniyhdis-teiden lisäksi, jotka vastaavat"kypsää desulfatohirudii-nia koodattavaa DNA-sekvenssiä", voidaan emäliuoksesta eristää eräitä muita desulfatohirudiiniyhdisteitä, jotka eroavat odotetuista yhdisteistä siten, että niiden C-päästä puuttuu 1-4 aminohappoa. Niinpä sellaisten hiivasolujen viljely, jotka kantavat desulfatohirudiini-varianttia HV1 koodittavaa geeniä, tuottaa tulokseksi tätä varianttia sekä pienemmillä saannoilla desulfatohirudiiniyhdisteitä, joista puuttuu C-pään aminohappo Gin (des-(Gin®**)-desulfatohirudiini), C-pään dipeptiditähde -Leu-Gln (des- (Leu^ ,Gln^) -desulfatohirudiini) , C-pään tripeptiditähde -Tyr-Leu-Gln (des-(Tyr^,Leu^,Gln^)-desulfatohirudiini) tai C-pään tetrapeptiditähde -Glu-Tyr-Leu-Gln (des-(Glu^,Tyr^,Leu6^ ,Gln*^) -desulfatohirudiini.
Nämä yhdisteet saattavat olla muodostuneet primäärisenä ilmentymistuotteena syntyneen desulfatohirudiinin (osittaisen) proteolyyttisen hajoamisen tuloksena ja niitä on löydetty kaikista kasvuliuoksista riippumatta käytetystä hiivaisännästä ja fermentointiolosuhteista.
··- 22 9 4 7 7 3
Des-(Gin65)-desulfatohirudiini, des-(Tyr63,Leu64,
Gin65)-desulfatohirudiini ja des-(Glu6^,Tyr63,Leu6^,Gln65)-desulfatohirudiini ovat uusia ja kuuluvat tämän keksinnön kohteisiin.
Hirudiiniaktiivisuuden havaitsemiseen voidaan käyttää hirudiinin tai desulfatohirudiinin vasta-aineita (esimerkiksi hybridoomasoluista saatavia monoklonaalisia vasta-aineita) , trombiinikoetta (M.U. Bergmeyer (toim.) Methods in Enzymatic Analysis, Voi. II, s. 314 - 316, Verlag Chemie, Weinheim (Länsi-Saksa) 1983) tai veren koaguloitu-miskoetta (F. Markwardt et ai., Thromb. Haemost. _47, 226 (1981)) .
Tällä menetelmällä saadut hirudiiniyhdisteet voidaan muuntaa sinänsä tunnetulla tavalla erilaisiksi hirudiini-yhdisteiksi.
Niinpä esimerkiksi kaavojen I - III mukaiset yhdisteet, joissa R on Tyr:n fenolinen hydroksiryhmä, voidaan sulfaatin, kuten dinatriumsulfaatin, ja tyrosiinisulfo-transferaasin, jota on saatavissa esimerkiksi verijuonikkaan soluista, kanssa tapahtuvalla reaktiolla muuntaa kaavojen I-III mukaisiksi yhdisteiksi, joissa R on kaavan -0S03H mukainen ryhmä.
Saatu desulfatohirudiiniyhdiste, esimerkiksi desul-fatohirudiinivariantti HV1, voidaan myös muuntaa johdan-naisekseen, jonka C-päästä puuttuu 1-7 aminohappoa, käyttämällä esimerkiksi sopivaa karboksipeptidaasia, kuten karboksipeptidaasia Y.
Keksinnönmukaiset transformoituneet eukaryoottiset isäntäorganismit voidaan valmistaa yhdistelmä-DNA-teknii-kan menetelmillä seuraavien vaiheiden avulla: rakennetaan DNA-älue, joka sisältää eukaryoottisen ilmentymisenohjaussekvenssin, DNA-jakson, jossa on ensin signaalipeptidiä koodittava DNA-sekvenssi ylävirrassa ja lukuvaiheistuksessa toisen DNA-sekvenssin suhteen, joka koodittaa kypsää desulfatohirudiinia, ja joka DNA-jakso on mainitun ilmentyntiisenohjaussekvenssin transkriptio- naalisessa ohjauksessa, sekä DNA-sekvenssin, joka sisältää ·' 23 94773 eukaryoottiset transkriptionlopetussignaalit, - valmistetaan yhdistelmävektori, joka sisältää edellä rakennetun DNA-alueen, transformoidaan sopiva eukaryoottinen isäntäorganismi näin saadulla yhdistelmävektorilla, - ja valitaan transformoituneet isäntäsolut transformoi-tumattomien isäntäsolujen joukosta.
2. DNA-rakenteet, jotka sisältävät signaalipeptidiä koo-dittavan alueen ja desulfatohirudiinia koodittavan alueen
Keksintö koskee DNA-rakennetta, joka sisältää euka-ryoottisen ilmentymisenohjaussekvenssin, DNA-jakson, jossa on ensin signaalipeptidiä koodittava DNA-sekvenssi ylävirrassa ja lukuvaiheistuksessa toisen DNA-sekvenssin suhteen, joka koodittaa kypsää desulfatohirudiinia, ja joka DNA-jakso on mainitun ilmentymisenohjaussekvenssin transkriptionaalisessa ohjauksessa, sekä DNA-sekvenssin, joka sisältää eukaryoottiset transkriptionlopetussignaalit.
Erilaisia ilmentymisenohjaussekvenssejä voidaan käyttää signaalipeptidiä ja desulfatohirudiinia koodattavien sekvenssien ilmentymisen säätelyyn. Erityisen käyttökelpoisia ovat transformoinnissa käytetyssä isännässä voimakkaasti ilmentyvien geenien ilmentymisenohjaussekvens- e ·« sit.
Nisäkässoluissa käytetyt ilmentymisenohjaussekvens-sit ovat mielellään viruksista johdettuja. Nisäkässoluissa käytettäviksi sopivia ilmentymisenohjaussekvenssejä ovat esimerkiksi Simian-virus 40:n (SV40) early- ja late-promottori, vaccinia-promottori, HTLV-promoottori ja poly-ooma-viruksesta tai adenovirus 2:sta johdettu promoottori.
Ilmentymisenohjaussekvenssit hiivalle, joka on edullisin isäntäorganismi tässä keksinnössä käytettäväksi, johdetaan hiivan, erityisesti Saccharomyces cerevisiaen, perimän DNA:sta. Desulfatohirudiinin ilmentämiseen on *· edullista käyttää voimakkaasti ilmentyvän hiivageenin il- 24 94773 mentymisenohjaussekvenssiä. Niinpä voidaan käyttää TRP1-geenin, ADHI- tai ADHII-geenin, happofosfataasigeenin (PH05), isosytokromi c-geenin, enolaasigeenin, glyseral-dehydi-3-fosfaattidehydrogenaasigeenin (GAPDH), 3-fosfo-glyseraattikinaasigeenin (PGK), heksokinaasigeenin, pyru-vaattidekarboksylaasigeenin, fosfofruktokinaasigeenin, glukoosi-6-fosfaatti-isomeraasigeenin, 3-fosfoglyseraat-timutaasigeenin, pyruvaattikinaasigeenin, trioosifosfaatti-isomeraasigeenin, fosfoglukoosi-isomeraasigeenin tai glukokinaasigeenin promoottoria tai hiivan parittelufero-monigeenien, jotka koodittavat a- tai α-tekijää, promoottori. On myös mahdollista käyttää yhdistelmäpromoottorei-ta, joissa on ylävirran aktivointisekvenssit (engl. upstream activation sequences, UAS), jotka kuuluvat yhdelle hiivageenille, ja alavirran promoottorielementit, funktionaalinen TATA-alue mukaanluettuna, jotka kuuluvat toiselle hiivageenille, kuten yhdistelmäpromoottoria, jossa on hiivan PH05-geenin UAS(t) ja hiivan GAPDH-geenin alavirran promoottorielementit, funktionaalinen TATA-alue mukaanluettuna. Tämän keksinnön mukaiset edulliset vektorit sisältävät promoottorin, joka säätelee transkriptiota. Tämän tyyppiset promoottorit, esim. PH05-geenin promoottori ja PH05-GAPDH-yhdistelmäpromoottori, voidaan kytkeä päälle ja pois päältä kasvuolosuhteita muuttamalla. Esimerkiksi PHO5-promoottori voidaan kytkeä pois päältä ja takaisin päälle silloin, kun halutaan, vain kohottamalla tai pienentämällä kasvualustan epäorgaanisen fosfaatin pitoisuutta. Vielä eräs tämän keksinnön mukainen edullinen promoottori on GAPDH-geenin promoottori ja erityisesti sen funktionaalinen fragmentti, joka alkaa GAPDH-geenin » nukleotidista, joka on välillä -300 - -180, erityisesti nukleotidista -263 tai -199 ja loppuu nukleotidiin -5.
Signaalipeptidiä ("signaalisekvenssi") koodittava DNA-sekvenssi on edullista johtaa eukaryoottisesta, esim. hiivan geenistä, joka koodittaa sellaista polypeptidiä, jota tavallisesti erittyy. Sopivia signaalisekvenssejä ' ovat esimerkiksi hirudiinin signaalisekvenssi, joka saa- 25 94773 daan verijuotikkaan perimän DNA:sta, hiivan signaalisek-venssit, kuten hiivan invertaasin, a-tekijän, a-tekijän, feromonipeptidaasin tai "tappajatoksiinin" geenin tai pois päältä kytkettävissä olevan happofosfataasigeenin signaalisekvenssi ja preprosekvenssi ja Aspergillus awamo-rin glukoamylaasin signaalisekvenssi. Vaihtoehtoisesti voidaan rakentaa yhdistettyjä signaalisekvenssejä liittämällä käytettyyn promoottoriin luontaisesti liittyvän geenin signaalisekvenssin (jos sellainen on) osa hirudiinin signaalisekvenssin osaan. Sellaiset yhdistelmät asetetaan etusijalle, jotka mahdollistavat tarkan katkeamisen signaalisekvenssin ja kypsän desulfatohirudiinin aminohapposekvenssin välistä. Myös lisäsekvenssejä, kuten pro- ja spacer-sekvenssejä, jotka voivat sisältää spesifisiä prosessointisignaaleja, voidaan sisällyttää rakenteisiin edesauttamaan prekursorimolekyylien tarkkaa prosessointia. Vaihtoehtoisesti voidaan tuottaa yhteenliitettyjä proteiineja, jotka mahdollistavat oikean kypsymisen in vivo tai in vitro. Prosessointisignaalit voivat sisältää esim. Lys-Arg-tähteen, jonka hiivan Golgi-kalvois-sa sijaitseva endopeptidaasi tunnistaa. Tämän keksinnön mukainen edullinen signaalisekvenssi kuuluu hiivan PH05-geenille ja koodittaa signaalipeptidiä
Met Phe Lys Ser Vai Vai Tyr Ser Ile Leu Ala Ala Ser Leu ·· Ala Asn Ala tai hiivan invertaasigeenille ja koodittaa signaalipeptidiä
Met Leu Leu Gin Ala Phe Leu Phe Leu Leu Ala Gly Phe Ala Ala Lys Ile Ser Ala.
Edullisia kypsää desulfatohirudiinia koodittavia DNA-sekvenssejä ovat edellä määriteltyjen desulfatohirudiinien rakennegeenit. Etusijalle asetettava DNA-sekvenssi koodittaa desulfatohirudiinivarianttia 1 (HV1) ja sen kaava on seuraava • · .
94773 26
GTTGTTTACACCGACTGCACCGAATCTGGTCAGAACCTGTGCCTGTGCGAAGGT
CAACAAATGTGGCTGACGTGGCTTAGACCAGTCTTGGACACGGACACGCTTCCA
TCTAACGTTTGCGGTCAGGGTAACAAATGCATCCTGGGTTCTGACGGTGAAAAAAACCAG
AGATTGCAAACGCCAGTCCCATTGTTTACGTAGGACCCAAGACTGCCACTTTTTTTGGTC
TGCGTTACCGGTGAAGGTACCCCGAAACCGCAGTCTCACAACGACGGTGACTTCGAA
ACGCAATGGCCACTTCCATGGGGCTTTGGCGTCAGAGTGTTGCTGCCACTGAAGCTT
GAAATCCCGGAAGAATACCTGCAG CTTTAGGGCCTTCTTATGGAC GTC.
Eukaryoottiset transkriptionlopetussignaalit sisältävä DNA-sekvenssi on mielellään sopivat transkription-lopetus- ja polyadenylointisignaalit sisältävä eukaryoot-tisen geenin 3'-reunasekvenssi. Sopivia 31-reunasekvens-sejä ovat esimerkiksi käytettyyn’ilmentyraisenohjaussek-venssiin luontaisesti liittyvää geeniä vastaavat sekvenssit. Jos hiivaa käytetään isäntäorganismina, ovat hiivan PH05-geenin reunasekvenssit edullisia reunasekvenssejä.
Tämän keksinnön mukaisen DNA-rakenteen molemmat päät on ··· edullista varustaa synteettisellä deoksinukleotidikytkijäl- lä, joka mahdollistaa rakenteen sijoittamisen ja kloonaamisen kloonausvektorissa.
Eukaryoottinen ilmentymisenohjaussekvenssi, signaali-peptidiä koodittava DNA-sekvenssi, kypsää desulfatohiru-diinia koodittava DNA-sekvenssi ja eukaryoottiset lopetus-signaalit on liitetty toimivasti toisiinsa eli ne on asetettu peräkkäin niin, että niiden normaalit toiminnot säilyvät. Niinpä järjestys on sellainen, että ilmentymisenoh jaussekvenssi saa aikaan signaalipeptidin ja desulfa-tohirudiinin geeniyhdistelmän oikean ilmentymisen, trans-. kriptionlopetussignaalit saavat aikaan transkription oikean päättymisen ja polyadenyloitumisen ja signaalisekvenssi on 27 9 4 7 7 3 liittynyt desulfatohirudiinigeeniin siten, että desulfato-hirudiinin erittyminen tapahtuu. Näin ollen, jos ilmenty-misenohjaussekvenssi ja signaalisekvenssi on johdettu eri geeneistä, on ilmentymisenohjaussekvenssi edullista liittää signaalisekvenssiin sen geenin suuren mRNA:n alun ja ATG:n välissä, joka luonnostaan liittyy ilmentymisen-ohjaussekvenssiin. Signaalisekvenssillä pitäisi olla oma ATG luennanaloitusta varten. Näiden sekvenssien yhteenliittäminen on edullista suorittaa synteettistä! oligo-deoksinukleotidikytkijöiden avulla, jotka sisältävät endo-nukleaasin tunnistuskohdan. Toisaalta voidaan signaali-sekvenssin viimeinen kodoni liittää suoraan desulfatohi-rudiinin geenin ensimmäiseen kodoniin.
Keksinnönmukaiset DNA-rakenteet voidaan valmistaa alalla tunnetuilla menetelmillä, kuten esimerkiksi liittämällä eukaryoottinen ilmentymisenohjaussekvenssi, DNA-jakso, jossa on signaalipeptidiä koodittava DNA- sekvenssi ylävirrassa ja lukuvaiheistuksessa toisen DNA-sekvenssin suhteen, joka koodittaa kypsää desulfatohiru-diinia, ja eukaryoottiset transkriptionlopetussignaalit sisältävä DNA-sekvenssi toisiinsa sillä tavalla, että DNA-jakso ilmentyy eukaryoottisessa organismissa, joka saa myös aikaan tuotetun desulfatohirudiinin erittymisen.
Eri DNA-sekvenssien yhteenliittäminen niin, että saadaan aikaan keksinnönmukainen DNA-rakenne, voidaan suorittaa liittämällä yhteen tasaiset päät tai käyttämällä apuna sopivia yhteisiä katkaisukohtia tai synteettisiä kytkijämolekyylejä ja samalla huolehtimalla siitä, että yhteenliittyminen tapahtuu oikealla tavalla, jotta näiden DNA-sekvenssien normaalit toiminnot säilyvät. Niinpä signaalisekvenssi ja desulfatohirudiinigeeni voidaan liittää yhteen tasaisten päiden avulla. Toinen mahdollisuus saada aikaan oikea liitos signaalisekvenssin ja desulfatohirudiinigeenin välille sisältää signaalisekvenssin katkaisun läheltä 3'-päätä, jos mahdollista, *·* ja desulfatohirudiinin katkaisun läheltä 5'-päätä, jos 28 94773 mahdollista/ niin/ että kummastakin sekvenssistä jää puuttumaan tietty määrä emäspareja. Tämän jälkeen voidaan rakentaa synteettinen oligodeoksinukleotidikyt-kijä siten, että liitettäessä katkaistu signaalisek-venssi ja katkaistu desulfatohirudiinigeeni toisiinsa yhdistävän oligodeoksinukleotidin avulla puuttuvat emäs-parit palautuvat ja desulfatohirudiinigeeni on oikeassa lukuvaiheistuksessa signaalisekvenssin suhteen.
Desulfatohirudiinia koodittava DNA-sekvenssi voidaan eristää verijuotikkaan perimän DNA:sta tai valmistamalla komplementaarinen kaksisäikeinen desulfatohiru-diinin DNA (desulfatohirudiini ds cDNA) desulfatohirudiinin mRNA:sta tai valmistamalla kemiallisilla ja entsymaatti-silla menetelmillä geeni, joka koodittaa desulfatohirudiinin aminohapposekvenssiä.
Perimän desulfatohirudiini-DNA ja desulfatohirudiinin kaksisäikeinen cDNA saadaan esimerkiksi käyttämällä sinänsä tunnettuja menetelmiä. Esimerkiksi perimän desulfatohirudiini-DNA saadaan desulfatohirudiinigeenin sisältävästä verijuotikkaan geenipankista kloonaamalla verijuotikkaan DNA-jaksot mikro-organismiin ja tunnistamalla desulfatohirudiini-DNA:n sisältävät kloonit esimerkiksi pesäkehybridisaatiolla käyttämällä koettimena radioaktiivisesti leimattua, desulfatohirudiinin DNA:lie spesifistä oligodeoksinukleotidia, joka sisältää vähintään • ·« 15, mieluummin 15-30 deoksinukleotidia. Saadut DNA-fragmentit sisältävät tavallisesti desulfatohirudiinigeenin lisäksi muita, ei-toivottuja DNA-jaksoja, jotka voidaan poistaa käsittelemällä sopivilla ekso- tai endo-nukleaaseilla.
Kaksisäikeinen desulfatohirudiinin cDNA voidaan valmistaa esimerkiksi eristämällä mRNA sopivista verijuotik-kaan soluista, jotka on mielellään indusoitu tuottamaan hirudiinia, rikastamalla saatu mRNA-seos desulfatohirudiini -mRNA: n suhteen sinänsä tunnetulla tavalla, käyttämällä mRNA:ta templaattira yksisäikeisen cDNA:n valmistuksessa, *. syntetisoimalla tästä RNA:sta riippuvaisen DNA-polymeraa- 29 9 4 7 7 3 sin avulla kaksisäikeinen cDNA ja kloonaamalla viimeksimainittu sopivaan vektoriin. Kloonit, jotka sisältävät desulfatohirudiinin cDNA:n tunnistetaan esimerkiksi edellä kuvatulla tavalla pesäkehybridisaatiolla käyttämällä koettimena radioaktiivisesti leimattua, desulfatohiru-diinille spesifistä oligodeoksinukleotidia.
Desulfatohirudiinigeeni voidaan valmistaa myös kemiallisella synteesillä. Menetelmälle on tunnusomaista se, että mainitun geenin koodattavasta säikeestä ja komplementaarisesta säikeestä syntetisoidaan jaksoja kemiallisesti ja saadut jaksot muunnetaan entsymaattisesti desulfatohirudiinin rakennegeeniksi.
DNA:n kemiallinen synteesi tunnetaan alalla hyvin ja siinä käytetään tavanomaisia menetelmiä. S.A. Narang (Tetrahedron 3j), 3 (1983)) on esittänyt yhteenvedon sopivista menetelmistä. Erityisesti voidaan käyttää eurooppalaisessa patenttihakemusjulkaisussa no. 146 785 kuvattuja menetelmiä, joka julkaisu liitetään tässä viitteeksi.
Vastaavalla tavalla voidaan signaalisekvenssi rakentaa kemiallisella synteesillä tai eristää sopivan eu-karyoottisen organismin kromosomaalisesta DNA:sta.
3. Yhdistelmävektoreita, jotka sisältävät DNA-rakenteita, " joissa on signaalipeptidiä koodittava alue ja desulfato- hirudiinia koodittava alue
Edelleen keksintö tarjoaa yhdistelmävektorin, jossa on yksi tai useampia liitettyjä DNA-jaksoja, joista kukin sisältää eukaryoottisen ilmentymisenohjausseksenssin, DNA-jaksan, joka koostuu ensimmäisestä DNA-sekvenssistä, joka koodittaa signaalipeptidiä ja on ylävirrassa ja lukuvaiheistuksessa toisen DNA-sekvenssin suhteen, joka koodittaa kypsää desul-fatohirudiinia, joka mainittu DNA-jakso on mainitun ilmentymisenoh jaussekvenssin transkriptionaalisessa ohjauksessa, ja eukaryoottiset transkriptionlopetussignaalit si-; : sältävän DNA-sekvenssin.
30 94773
Keksinnön mukaiset yhdistelmävektorit voidaan valita yhdistelmäplasmidien ja lineaaristen DNA-vektorien joukosta ja valintaan vaikuttaa lisäksi se isäntäorganismi, joka on tarkoitus transformoida.
Keksintö koskee erityisesti lineaarista DNA-vekto-ria, jossa on yksi tai useampia liitettyjä DNA-jaksoja, joista kukin sisältää eukaryoottisen ilmetymisenohjaus-sekvenssin, DNA-jakson, joka koostuu ensimmäisestä DNA-sekvenssistä, joka koodittaa signaalipeptidiä ja on ylävirrassa ja lukuvaiheistuksessa toisen DNA-sekvenssin suhteen, joka koodittaa kypsää desulfatohirudiinia, joka mainittu DNA-jakso on mainitun ilmentymisenohjaussekvens-sin trankriptionaalisessa ohjauksessa, ja eukaryoottiset transkriptionlopetussignaalit sisältävän DNA-sekvenssin, ja mainittu iImentyrnisenohjaussekvenssi ja mainittu transkriptionlopetussignaalit sisältävä sekvenssi on johdettu samasta eukaryoottisesta geenistä. Keksintö koskee erityisesti lineaarista DNA-vektoria, joka sisältää PH05-promoottorin, edellä mainitun DNA-jakson ja PH05:n 3'-reuna-alueen.
Homologisten 3'- ja 5'-reunasekvenssien ansiosta koko lineaarinen DNA-vektori, joka sisältää signaalipeptidiä koodittavan alueen ja desulfatohirudiinia koodittavan alueen, integroituu stabiilisti vastaavaan isännän kromo-somiin eli hiivan PH05-promoottorin ja hiivan PH05-geenin 3'-reuna-alueiden ollessa kyseessä hiivan kromosomin II PH05-lokukseen.
Keksintö koskee myös erityisesti yhdistelmäplasmi-deja, jotka ilmentymisenohjaussekvenssin, edellä mainitun DNA-jakson ja transkriptionlopetussignaalit sisältävän sekvenssin lisäksi sisältävät lisä-DNA-sekvenssejä, jotka eivät ole välttämättömiä tai ovat vähemmän tärkeitä promoottorin toiminnan kannalta eli desulfatohirudiinigee-nin ilmentymisen kannalta, mutta saavat aikaan tärkeitä toimintoja esimerkiksi mainituilla yhdistelmäplasmideilla transformoituneiden solujen lisääntymisessä. Lisä-DNA- sekvenssit voivat olla johdettuja prokaryoottisista ja/tai
» I
31 54773 eukaryoottisista soluista ja ne voivat -sisältää kromoso-maalisia ja/tai ekstrakromosomaalisia DNA-sekvenssejä. Lisä-DNA-sekvenssit voivat olla peräisin (tai koostua) plasmidi-DNA:sta, kuten bakteerin tai eukaryootin plasmi-di-DNA:sta, virus-DNA:sta ja/tai kromosomaalisesta DNA:sta, kuten bakteerin, hiivan tai korkeamman eukaryootin kromosomaalisesta DNA:sta. Etusijalle asetettavat yhdistelmäplas-midit sisältävät lisä-DNA-sekvenssejä, jotka on johdettu bakteeriplasmideista, erityisesti Escherichia colin plas-midista pBR322 tai sen sukulaisplasmideista, bakteriofaa-gista λ, hiivan 2y-plasmidista ja/tai hiivan kromosomaa-lisesta DNA:sta.
Keksinnönmukaisissa edullisissa yhdistelmäplasmideis-sa sisältävät lisä-DNA-sekvenssit hiivan replikoitumisen aloituskohdan ja vaiintamerkin hiivaa varten. Yhdistelmä-plasmidit, jotka sisältävät hiivan replikoitumisen aloituskohdan, esim. autonomisesti replikoituvan jakson (ars) pysyvät yllä hiivasoluissa kromosomin ulkopuolella trans-formoinnin jälkeen ja replikoituvat autonomisesti mitoosissa. Yhtä hyvin voidaan käyttää yhdistelmäplasmideja, jotka sisältävät hiiva 2y-plasmidi-DNA:n kanssa homologisia sekvenssejä. Nämä yhdistelmäplasmidit integroituvat rekombinaatiolla solussa jo ennestään oleviin 2y-plasmi-deihin tai replikoituvat autonomisesti.
*· Mitä tulee hiivan geneettiseen valintamerkkiin, voi daan käyttää mitä tahansa merkkigeeniä, joka mahdollistaa transformanttien valinnan merkin fenotyyppisen ilmentymisen perusteella. Sopivia hiivan merkkejä ovat erityisesti sellaiset, jotka ilmentävät antibioottiresistenssiä, tai auksotrofisten hiivamutanttien ollessa kyseessä geenit, jotka täydentävät isännän vajavaisuuksia. Tällaiset geenit antavat esimerkiksi vastustuskyvyn sykloheksimidi-antibiootin suhteen tai prototrofiän auksotrofiselle hii-vamutantille, kuten esimerkiksi URA1-, URA3-, ARG4-, LE02-, HIS4-, HIS3-, TRP5- tai TRP1-geeni.
·, On myös edullista, jos keksinnönmukaisissa yhdistel- ** mäplasmideissa läsnä olevat lisä-DNA-sekvenssit sisältävät 32 94773 replikoitumisen aloituskohdan ja geneettisen valintamerkin bakteeri-isännälle, erityisesti Escherichia colille.
On olemassa hyödyllisiä seikkoja, jotka liittyvät E. colin replikoitumisenaloituskohdan ja E. colin merkkigeenin läsnäoloon hiivan yhdistelmäplasmidissa. Ensinnäkin voidaan saada suuria määriä yhdistelmäplasmidi-DNA:ta kasvattamalla ja vahvistamalla E. colissa ja toiseksi on yhdistelmä-plasmidien rakentaminen edullista suorittaa E. colissa käyttämällä hyväksi koko E. coliin perustuvaa kloonausteknologiaa. E. colin plasmidit, kuten pBR322 tms., sisältävät sekä E. colin replikoitumisen aloituskohdan että E. colin geneettiset merkit, jotka antavat antibioottiresistenssin, esimerkiksi tetrasykliinin ja ampisilliinin suhteen, on edullista sisällyttää hiivan yhdistelmävek-torien osiksi.
Lisä-DNA-sekvensseistä, jotka sisältävät esimerkiksi replikoitumisen aloituskohdat ja geneettiset merkit hiiva- ja bakteeri-isännälle (ks. edellä), käytetään tästedes nimitystä "vektori-DNA", joka yhdessä edellä mainitun DNA-rakenteen, jossa on mm. ilmentymisenohjaussekvenssi ja desulfatohirudiinigeeni, muodostaa tämän keksinnön mukaisen yhdistelmäplasmidin.
Tämän keksinnön mukaiset yhdistelmävektorit voivat sisältää yhden tai useampia DNA-liitännäisiä, joissa kus-sakin on mm. ilmentymisenohjaussekvenssi, signaalipepti-diä koodittava DNA-sekvenssi ja kypsää desulfatohirudiinia koodittava DNA-sekvenssi. Jos yhdistelmävektorit sisältävät useita DNA-liitännäisiä, mielellään 2-4 DNA-liitän-näistä, nämä voivat olla peräjärjestyksessä tai eri kohdissa yhdistelmävektorissa. Etusijalle asetettavat yhdistelmävektorit sisältävät yhden DNA-liitännäisen tai perä-järjestyksessä olevia DNA-liitännäisiä. Erityisen edullista on järjestää DNA-liitännäiset siten, että niillä on pää ja häntä vastakkain.
Tämän keksinnön mukaiset yhdistelmäplasmidit valmistetaan alalla tunnetuilla menetelmillä. Yhdistelmävekto- . rien valmistusmenetelmässä tuodaan yksi tai useampia DNA- e-, 33 94773 rakenteita, jotka sisältävät eukaryoottisen ilmentymisen-ohjaussekvenssin, DNA-jakson, joka koostuu ensimmäisestä DNA-sekvenssistä, joka koodittaa signaalipeptidiä ja on ylävirrassa ja lukuvaiheistuksessa toisen DNA-sekvenssin suhteen, joka koodittaa kypsää desulfatohirudiinia, joka mainittu DNA-jakso on mainitun ilmentymisenohjaussekvens-sin transkriptionaalisessa ohjauksessa, ja eukaryoottiset transkriptionlopetussignaalit sisältävän DNA-sekvenssin, sellaisenaan tai mainitun DNA-rakenteen kompo nentit peräkkäisesti ennalta määrätyssä järjestyksessä vektori-DNA:hän.
Keksinnönmukaisten yhdistelmäplasmidien rakentaminen suoritetaan tavanomaisilla yhteenliittämismenetelmillä. Plasmidien komponentit liitetään yhteen yhteisten restrik-tiokohtien välityksellä ja/tai synteettisten kytkijämole-kyylien välityksellä ja/tai tasaisten päiden yhteenliittä-misellä.
Keksinnön mukaiset lineaariset DNA-vektorit vastaavat oleellisesti ottaen kohdassa 2 määriteltyjä DNA-raken-teita ja ne valmistetaan analogisella tavalla.
4. Eukaryoottisten isäntäorganismien transformointi Tämä keksintö koskee myös eukaryoottisia isäntäorga-.·; nismeja, jotka ovat transformoituneet yhdistemävektorilla, jossa on yksi tai useampia DNA-liitännäisiä, joista kukin sisältää eukaryoottisen ilroentymisenohjaussekvenssin, DNA-jakson, joka koostuu ensimmäisestä DNA-sekvenssistä, joka koodittaa signaalipeptidiä ja on ylävirrassa ja lukuvaiheistuksessa toisen DNA-sekvenssin suhteen, joka koodittaa ; kypsää desulfatohirudiinia, joka mainittu DNA-jakso on mainitun ilmentymisenohjaussekvenssin transkriptionaalisessa ohjauksessa, ja eukaryoottiset transkriptionlopetussignaalit sisältävän DNA-sekvenssin, sekä näiden organismien mutantteja.
Sopivia eukaryoottisia isäntäorganismeja ovat erityi-sesti edellä mainitut, joista erityisesti voidaan mainita 34 94773 hiivalajit, jotka kuuluvat sukuihin Kluyveromyces, Candida, Pichia, Yarrowia, Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Torulopsis ja näille läheiset suvut (ks. J- Lodder, The Yeasts, Amsterdam 1971), ja erityisesti Saccharomyces cerevisiae-kannat.
Transformoituneet eukaryoottiset isäntäorganismit valitaan sellaisten eukaryoottisten isäntäorganismien joukosta, jotka ovat transformoituneet yhdistelmäplasmidil-la, joka sisältää yhden tai useampia DNA-liitännäisiä, joissa kussakin on eukaryoottinen iImentyrnisenohjaussekvenssi, DNA-jakso, joka koostuu ensimmäisestä DNA-sek-venssistä, joka koodittaa signaalipeptidiä ja on ylävirrassa ja lukuvaiheistuksessa toisen DNA-sekvenssin suhteen, joka koodittaa kypsää desulfatohirudiinia, joka mainittu DNA-jakso on mainitun ilmentymisenohjaussekvenssin trans-kriptionaalisessa ohjauksessa, ja eukaryoottiset transkrip-tionlopetussignaalit, tai sellaisten eukaryoottisten isäntäorganismien joukosta, joiden kromosomiin mainittu(mainitut) DNA-liitännäinen(set) ovat integroituneet stabiilisti.
Mainittujen transformoituneiden eukaryoottisten isän-täsolujen valmistusmenetelmässä transformoidaan eukaryoottiset isäntäsolut yhdistelmävektorilla, jossa on yksi tai useampia DNA-liitännäisiä, joista kukin sisältää eukary-oottisen ilmentymisenohjaussekvenssin, DNA-jakson, joka < koostuu ensimmäisestä DNA-sekvenssistä, joka koodittaa signaalipeptidiä ja on ylävirrassa ja lukuvaiheistuksessa toisen DNA-sekvenssin suhteen, joka koodittaa kypsää desulfatohirudiinia, joka mainittu DNA-jakso on mainitun ilmentymisenohjaussekvenssin transkriptionaalisessa ohjauksessa, ja eukaryoottiset transkriptionlopetussignaa-: lit.
Eukaryoottisten isäntäsolujen transformointi tapahtuu alalla tunnetuilla menetelmillä. Esimerkiksi hiivan transformointi yhdistelmävektorei11a voidaan suorittaa julkaisussa Hinnen et. ai, Proc. Natl. Acad. Sei. USA , 75, 1929 (1978) kuvatulla menetelmällä. Kyseinen menetel- • l " " ! · 94773 mä voidaan jakaa kolmeen vaiheeseen: (1) Hiivan solunseinän tai sen osien poisto käyttämällä erilaisia glukosidaasivalmisteita, kuten etanan
R R
suolinestettä (esim. Glusulase tai Helicase ) tai mikro- p organismeista saatuja entsyymiseoksia (esim. Zymolase ) osmoottisesti stabiloiduissa liuoksissa (esim, 1 M sorbitoli) .
(2) "Paljaat" hiivasolut (sferoplastit) käsitellään DNA-vektorilla PEG:n (polyetyleeniglykolin) ja Ca2+-ionien läsnäollessa.
(3) Solunseinä regeneroidaan ja transformoituneet solut valitaan kiinteässä agar-kerroksessa. Tämä regene-rointi on edullista suorittaa peittämällä sferoplastit agariin. Sferoplastit voidaan esimerkiksi sekoittaa sulaan agariin (noin 50°C). Kun liuos jäähdytetään hiivan kasvulämpötilaan (noin 30°C), saadaan kiinteä kerros. Tämän agar-kerroksen tarkoituksena on estää sferoplastien oleellisten makromolekyylien diffuusio ja menetys ja näin edesauttaa solunseinän regeneroitumista. Solunseinän regeneroituminen voidaan kuitenkin myös saada aikaan (vaikkakin pienemmällä teholla) viljelemällä sferoplasteja ennalta muodostetun agarkerroksen päällä.
Regenerointiagar on edullista valmistaa niin, että transformoituneiden solujen regenerointi ja valinta voi- <· daan suorittaa samanaikaisesti. Koska valintamerkkeinä • » käytetään yleensä hiivageenejä, jotka koodittavat aminohappojen biosynteettisten teiden entsyymejä,(supra), on regenerointi edullista suorittaa hiivan minimiagaralustas-sa. Jos hyvin suuria regeneroitumistehoja tarvitaan, on seuraava kaksivaiheinen menettely edullinen: (1) solun-: , seinä regeneroidaan ravinnerikkaassa kompleksialustassa ja (2) transformoituneet solut valitaan viljelemällä solukerroksen kopio selektiivisissä agar-aialjoissa.
Kun edellä mainittua lineaarista DNA-vektoria käytetään eukaryoottisten hiivasolujen transformointiin, on transformointi edullista suorittaa toisen vektorin läsnä-S ollessa, joka sisältää valintamerkin hiivalle. Tämä yh- 36 94773 teistransformointi mahdollistaa rikastamisen niiden isän-täsolujen suhteen, jotka ovat ottaneet vastaan DNA:ta, jonka suhteen ei voida tehdä valintaa. Koska transfor-mointikelpoiset solut ottavat vastaan minkä tahansa tyyppistä DNA:ta, sisältää suuri prosentuaalinen osuus soluista, jotka ovat transformoituneet valintavektorilla, mjö s mahdollisen lisä-DNA:n (kuten edellä mainitun lineaarisen DNA-vektorin).
Transformoituneiden eukaryoottisten isäntäsolujen ja erityisesti transformoituneiden hiivakantojen, jotka sisältävät keksinnönmukaisen yhdistelmäplasmidin, tai joiden kromosomiin desulfatohirudiinigeenin sisältävä lineaarinen DNA-vektori on integroitunut stabiilisti, desulfato-hirudiinintuotantokykyä voidaan parantaa mutatoinnilla ja alalla tunnetuilla valintamenetelmillä. Mutatoituminen voidaan saada aikaan esimerkiksi UV-säteilytyksellä tai sopivilla kemiallisilla reagensseilla. Erityisen edullista on proteaasivajäiden mutanttien, erityisesti hiivamutant-tien, tuottaminen, jotta soluissa tuotetun desulfatohirudii-nin hajoaminen solujen sisällä vältetään. Sopivat mutan-tit voidaan valita ja eristää tavanomaisilla menetelmillä.
Esillä oleva keksintö koskee erityisesti DNA-raken-teita, jotka sisältävät desulfatohirudiinigeenin, yhdistel-mävektoreita, transformoituneita eukaryoottisia isäntäso- * luja ja menetelmiä niiden valmistamiseksi sekä menetelmiä hirudiiniaktiivisuutta omaavien proteiinien valmistamiseksi, kuten esimerkeissä on selostettu.
Seuraavassa kokeellisessa osassa selostetaan tämän keksinnön eri toteutustapoja viittaamalla liitteenä oleviin piirroksiin, jotka ovat seuraavat: » : ' Kuvat 1 ja 2 ovat kaaviokuvat plasmidien pML300 ja pML305 rakentamisesta vastaavasti.
Kuva 3 esittää plasmidin pHRi148 rakentamista, joka sisältää trp-promoottorin.
Kuva 4 esittää ilmentämispalsmidin pML310 rakenta- . mistä.
*- Kuva 5 on kaavioesitys kypsää desulfatohirudiinia 37 94773 koodittavan DNA-jakson eristämisestä.
Kuva 6 on kaavioesitys ilmentämisplasmidin rakentamisesta desulfatohirudiinin erittämistä varten.
Kuva 7 on kaavioesitys ilmentämisplasmidin rakentamisesta desulfatohirudiinin solunsisäistä ilmentämistä varten.
Kuva 8 esittää PH05:n BamHI-Sall-restriktiojakson DNA-sekvenssiä, joka sisältää PH05-promoottorialueen.
Kuva 9 esittää GAPDH-geenin promoottorialueen DNA-sekvenssiä.
Kuva 10 on kaavioesitys plasmidin pGAPDH-EL rakentamisesta.
Kuva 11 esittää GAPDH-promoottorifragmenttien sekvenssejä plasmideissa pGAPDH-FL ja pGAPDH-EL.
Kuva 12 esittää plasmidin pJDB207/PHO5(Eco)-HIR rakentamista.
Kuva 13 esittää plasmidin pJDB207/PAPEL-HIR(UASl+ UAS2) rakentamista.
Kuva 14 esittää plasmidin pJDB207//GAPEL-HIR/D rakentamista.
Kuva 15 on kaavioesitys plasmidin pJDB207/GAPFL-I-HIR rakentamisesta.
Kuvissa on käytetty seuraavia lyhenteitä: p = promoottori, SS = signaalisekvenssi, t = terminaattori, L = ·· kytkijä.
Keksintöä valaistaan seuraavilla esimerkeillä. Esimerkeissä käytetyt lyhenteet tarkoittavat seuraa- vaa: TNE liuos, joka sisältää 100 mM NaCl, 50 mM Tris.HCl pH 7,5 ja 5 mM EDTA, SDS natriumdodekyylisulfaatti EDTA etyleenidiamiinitetraetikkahappo DTT 1,4-ditiotreitoli (1,4-dimerkapto-2,3-butaani- dioli) BSA naudan seerumialbumiini ,·· EtBr etidiumbromidi 38 94773
Tris tris(hydroksimetyyli)aminometaani
Tris.HCl tris:in monohydrokloridi
Esimerkki 1: Suojatun nukleosidipolystyreenihartsin valmistus *·^·»· MMT-0-T-0-C0CH,CH,C0-NHCH, _ -< P) 750 mg meripihkahapon anhydridiä ja 910 mg 4-dime-tyyliaminopyridiiniä lisätään liuokseen, jossa on 2,57 g (5 mmol) 5'-(4-metoksitrityyli)-tymidiiniä (MMT-O-T-OH) 20 ml:ssa absoluuttista pyridiiniä, ja saatu seos jätetään huoneenlämpötilaan 16 tunniksi. Pyridiiniliuos väkevöi-dään ja sekoitetaan 200 mlsaan etyyliasetaattia, uutetaan ravistelemalla 2 x 200 ml:11a 0,1 M fosfaattipuskuria lisäten kummallakin kerralla 10 ml kyllästettyä nat-riumkloridiliuosta, pestään vielä kyllästetyllä natrium-kloridiliuoksella, kuivataan, väkevöidään ja lisätään ti-poittain heksaania. Saostunut tuote erotetaan ja hierretään kahdesti eetterin kanssa ja liuotetaan sen jälkeen 300 ml saan etyyliasetaattia ja uutetaan ravistelemalla 0 °C:ssa 180 ml:n kanssa 0,1 M kaliumbisulfaattia pH 2,5. Pestään kahdesti vedellä ja sen jälkeen etyyliasetaatti-liuos kuivataan natriumsulfaatilla, suodatetaan, lisätään ·*· 0,5 ml pyridiiniä ja koko liuos väkevöidään ja laimennne-
·· I
taan lisäämällä tipoittain heksaania. Saostunut meripihka-happo johdannainen suodatetaan talteen.
1,0 g tätä yhdistettä sekä 190 mg N-hydroksisukkin-imidiä liuotetaan seokseen, jossa on 4 ml etyyliasetaattia ja 2 ml dimetyyliformamidia, ja sen jälkeen lisätään 0°C:ssa Ν,Ν'-disykloheksyylikarbodi-lmidiä (370 mg). Seoksen an-netaan seistä yön yli jääkaapissa, saostunut Ν,Ν'-disyklo-heksyyliurea suodatetaan pois ja suodos laimennetaan etyyliasetaatilla, uutetaan kylmällä 0,1M natriumbikarbonaatilla ja vedellä, kuivataan ja haihdutetaan kuiviin vakuumis-sa. Jäännös kromatografoidaan etyyliasetaatilla silikagee-\ Iissä. TLC:. Rf 0,45 dikloorimetaanin ja metanolin seokses- 39 . 94773 sa (9:1) .
100 mg tätä N-sukkinimidoyylimeripihkahapon esteriä sekoitetaan 20 tuntia 1 g:n kanssa aminometyylipolystyreeniä (amiinipitoisuus 110 μπιοΐ/g) seoksessa, jossa on 2 ml dikloorimetaania ja 4 ml dimetyyliformamidia. Poly-meerihartsi suodatetaan talteen ja uutetaan pesemällä di-metyyliformamidilla, metanolilla, dikloorimetaanilla ja metanolilla. Kuivaamisen jälkeen aminoryhmät, jotka eivät ole reagoineet, asetyloidaan sekoittamalla hartsia 6 ml:ssa pyridiiniä etikkahappoanhydridin (1 ml) ja 4-di-metyyliaminopyridiinin (100 mg) kanssa 30 minuuttia. Polymeerihartsi uutetaan pesemällä dikloorimetaanilla, dimetyyliformamidilla, metanolilla ja dikloorimetaanilla ja kuivataan vakiopainoon. Spektroskooppinen metok-sitrityylimääritys (MMT) antaa lataukseksi 57 ymol/g.
Esimerkki 2:
Seuraava suojattu nukleosidi/polystyreenihartsi valmistetaan esimerkin 1 mukaisesti: MMT-0-Glb-0C0CH2CH2C0NHCH2-./ \._( p) käyttämällä lähtöaineena 5 * — (4-metoksitrityyli)-N-isobuty-ryyli-deoksiguanosiinia, lataus 32 ymol/g.
* · c
Esimerkki 3: Trinukleotidin synteesi 0
MMT-0--T-O- — 0--CH2CH2CN
lx~\
Cl L ->3 40 - 94773 a) Dinukleotidin synteesi 7/73 g (15 mmol) 5'-(4-metoksitrityyli)-tymidiiniä (MMT-O-T-OH) konsentroidaan kahdesti haihduttamalla absoluuttisen pyridiinin kanssa. Jäännös liuotetaan 20 ml: aan absoluuttista tetrahydrofuraania ja lisätään tipoit-tain samalla sekoittaen ja kosteudelta suojattuna 80 ml; aan 2-kloorifenyyli-di-(1-bentsotriatsolyyli)-fosfaatin 0,2M tetrahydrofuraaniliuosta ja sen jälkeen reaktioseos-ta sekoitetaan 1 tunti huoneenlämpötilassa. Saatu 2-kloo-rifenyyli-1-bentsotriatsolyyli-5'-(4-metoksitrityyli)-tymidiini-3'-fosfaatti jaetaan kolmeen erään.
а) Hydrolyysi trietyyliammonium-2-kloorifenyyli-5 * — (4— metoksitrityyli)-tymidiini-3'-fosfaatiksi 100 ml 0,5 M trietyyliammoniumbikarbonaattia lisätään kolmasosaan edellä saatua 2-kloorifenyyli-1-bentsotriatsolyyli-5 '-(4-metoksitrityyli)-tymidiini-3'-fosfaat-tiliuosta samalla jäähdyttäen. 15 minuutin kuluttua suoritetaan uutto dikloorimetaanilla. Dikloorimetaaniliuos pestään vedellä, väkevöidään ja sen jälkeen lisätään ti-poittain petrolieetteriä. Saatu sakka suodatetaan pois imulla, uutetaan pesemällä eetteri-petrolieetteriseok-sella (1:1) ja kuivataan vakuumissa. TLC: 0,35 di- ... kloorimetaani-metanoli-vesiseoksessa (75:22:3).
«« - б) Esteröinti 2-syanoetyyli-2-kloorifenyyli-5'-(4-metoksitrityyli) -tymidiini-3'-fosfaatiksi ja 4-metoksitrityyli-suojaryhmän poisto 1,3 ml 2-syanoetanolia ja 2 ml pyridiiniä lisätään ·· kolmasosaan 2-kloorifenyyli-1-bentsotriatsolyyli-5'-(4- metoksitrityyli)-tymidiini-3'-fosfaattia. Seos jätetään seisomaan huoneenlämpötilaan yön ajaksi. Liuottimet tislataan pois vakuumissa ja jäännös liuotetaan etyyliasetaattiin ja uutetaan useaan keitaan 0,1 M fosfaattipuskurilla pH 7 ja vedellä ravistellen. Orgaaninen faasi kuivataan, väkevöidään ja li- φ .* sätään tipoittain heksaaniin. Sakka suodatetaan pois, liuo- il iti i mii i ii n 41 94773 tetaan 50 ml:aan dikloorimetaanin ja metanolin seosta 7:3 ja 0°C:ssa lisätään liuos, jossa on 3,8 g p-toleeenisulfo-nihapon raonohydraattia 75 ml:ssa dikloorimetaanin ja metanolin seosta 7:3. Reaktioliuos laimennetaan 2 tunnin kuluttua dikloorimetaanilla ja uutetaan ravistelemalla kylmän natriumbikarbonaattiliuoksen kanssa. Orgaaninen faasi väkevöidään ja lisätään heksaania. Saostunut 2-syanoetyy-li-2-kloorifenyyli-tymidiini-3'-fosfaatti kromatografoi-daan silikageelillä käyttämällä dikloorimetaani-metanoli-seosta 96:4. TLC: 0,45 dikloorimetaani-metanoliseok- sessa (9:1).
γ) Kondensointi 5'-(4-metoksitrityyli)-3'-syanoetyyli-bis-tymidiinidinukleotidiksi 2,2 g 2-syanoetyyli-2-kloorifenyyli-tymidiini-3'-fosfattja dehydratoidaan haihduttamalla kahdesti absoluuttisen pyridiinin kanssa ja saatu tuote liuotetaan 20 ml: aan absoluuttista tetrahydrofuraania ja lisätään jäljellä olevaan 2-kloorifenyyli-1-bentsotriatsolyyli-5'-(4-metoksitrityyli) -tymidiini-3'-fosfaattiliuoksen kolmasosaan.
Kun on pidetty 18 tuntia huoneenlämpötilassa, reaktioliuok-seen lisätään jääjäähdytystä käyttäen 10 ml vettä ja 200 ml etyyliasetaattia. Orgaaninen faasi pestään useaan kertaan natriumbikarbonaatilla ja vedellä, kuivataan natriumsul-faatilla ja väkevöidään pieneen tilavuuteen. Dinukleoti-di, jonka fosfaattiryhmä, 5'-pää ja 3'-pää ovat suojattuja, saostetaan lisäämällä se tipoittain eetterin ja hek-saanin seokseen 1:1, TLC: R^ 0,48 dikloorimetaani-meta- noliseoksessa (9:1).
i b) Trinukleotidin synteesi: 1,17 g (1 mmol) edellä saatua täysin suojattua di-nukleotidia liuotetaan 30 ml:aan dikloorimetaanin ja metanolin seosta 7:3 ja samalla jäällä jäähdyttäen lisätään liuos, jossa on 1,9 g p-tolueenisulfonihapon monohydraat- • tia 20 ml:ssa dikloorimetaanin ja metanolin seosta 7:3.
% r 42 94773 2 tunnin kuluttua lisätään jääkylmä natriumbikarbonaatti-liuos ja uutetaan kahdesti dikloorimetaanilla. Orgaaninen faasi kuivataan, väkevöidään ja lisätään tipoittain heksaaniin. Saostunut epäpuhdas dinukleotidi, jossa on vapaa 5'-hydroksiryhmä, kromatografoidaan silikageelissä käyttämällä metanoligradienttia (2 - 8%) dikloorimetaanis-sa. TLC: 0,33 dikloorimetaanin ja metanolin seokses sa (9:1).
850 mg tätä 5'-hydroksi-dinukleotidia ja 1,06 g tri-etyyliammonium-2-kloorifenyyli-5'-(4-metoksitrityyli)-tymidiini-31-fosfaattia (ks. kohta a)a)) haihdutetaan kahdesti pyridiinistä ja liuotetaan sen jälkeen 10 ml:aan absoluuttista pyridiiniä ja sen jälkeen lisätään 560 mg 1-mesityleenisulfonyyli-3-nitro-1,2,4-triatsolia (MSNT).
2 tunnin kuluttua lisätään 2 ml jääkylmää vettä ja tästä tunnin kuluttua uutetaan dikloorimetaanilla. Orgaaninen faasi pestään kyllästetyllä natriumbikarbonaattiliuoksella ja vedellä, kuivataan, väkevöidään ja lisätään eetteriä. Saostunut trinukleotidi puhdistetaan kromatografisesti silikageelillä. R^ 0,45 dikloorimetaanin ja metanolin seoksessa (9:1).
Esimerkki 4: Esimerkin 3 mukaisesti valmistetaan seuraa- van yleisen kaavan mukaiset suojatut trinukleotidit •« o o o 1 1 2 1 3 1
MMT—O—B —O—P—O—B — O—P—O—B — O-P-OCH2CH2CN
,_a\ lr\ h. >=/ \_./ \=/ ci c5i ci joista käytetään lyhennettä Nukleotideista B^, B^ 3 ja B käytetään seuraavia lyhenteitä: A * N-bentsoyyli-deoksiadenosiini . C = N-bentsoyyli-deoksisytidiini tl aa i ilku i i « * 94773 G = N-isobutyryyli-deoksiguanosiini T = tymidiini
Yhdiste Yhdiste TTT 0.45 ATG 0.48 TTC 0.55 ACT 0.53 TCT 0.46 ACC 0.48 TAC 0.56 ATT 0.55 TGC 0.44 ACA 0.53 TAG 0.60 AAC 0.46 TGT 0.42 AAA 0.51 TGA 0.44 AGT 0.45 CTT 0.53 AGG 0.38 CTG 0.46 GTT 0.45 CCT 0.45 GTC 0.44 CCC 0.59 GTG 0.35 CCG 0.47 GCA 0.49 CCA 0.51 GCG 0.48 CAT 0.55 GAT 0.44 CAC 0.51 GAC 0.48 CGC 0.46 GAG 0.48 CGA 0.38 GAA 0.50 CAG 0.44 GGC 0.42 CGG 0.38 GGT 0.46 CGT 0.49 GGG 0.35 GGA 0.44 a) Ohutkerroskromatogrammi silikageelissä käyttämällä dikloorimetaanin ja metanolin seosta 9:1.
Esimerkki 5: DNA-säikeen 96/67 emäksestä no. 96 emäkseen no. 162 ulottuvan DNA-jakson syntetisointi (pituus 67 emästä) a) 2-syanoetyylisuojaryhmän poistaminen trinukleotideista 44 9 4 7 7 3 10 yl esimerkin 3 tai 4 mukaista trinukleotidia liuotetaan kosteudelta suojattuna 60 vitaan pyridiini-asetonitriili-trietyyliamiiniseosta 1:1:1. Kun seosta on pidetty 1 tunti huoneenlämpötilassa, siihen lisätään 0. 7.ml peroksidivapaata eetteriä tipoittain ja sakka sent-rifugoidaan talteen. Saatu epäpuhdas trietyyliammonium-suola liuotetaan 50 yl:aan pyridiiniä ja tämän jälkeen saostetaan uudestaan 0,5 ml:11a eetteriä, sakka sentrifu-goidaan talteen ja kuivataan vakuumissa 15 tuntia.
b) Osittain suojattujen trinukleotidien liittäminen poly-styreenihartsiin sidottuun oligonukleotidiketjuun
Kaikki toimenpiteet suoritetaan kosteudelta suojattuna reaktioastiassa, jonka kapasiteetti on 220 yl, käyttämällä mikroprosessorilla ohjattua liuottimien ja reagens-sien lisäystä. 13 mg (0,74 vmol) tymidiini-polystyreeni-hartsia (esimerkki 1) sijoitetaan reaktioastiaan ja suoritetaan seuraavat toimenpiteet: 1. Metyleenikloridi, 2 ml/min, 4 min; 2. Metyleenikloridi/isopropanoli (85:15), 2 ml/min, 2 min; 3. Sinkkibromidi (1M) ja 1,2,4-.triatsoli (0*02 M) metylee-nikloridin ja isopropanolin (85:15) seoksessa, 2 ml/min, 2-3,5 min; ... 4. Metyleenikloridi/isopropanoli (85:15), 2 ml/min, 4 min; 5. Trietyyliammoniumasetaatti (0,5 M) DMF:ssä, 2 ml/min, 5 min; 6. Molekyyliseulalla kuivattu pyridiini, 2 ml/min, 3 min; 7. Tetrahydrofuraani (peroksidivapaa, molekyyliseulalla kuivattu), 2 ml/min, 3 min; : 8. Typpivirta, 10 min; • · 9. Injektoidaan 10 ymol trinukleotidia GTC (trietyyliam-moniumsuola kohdasta a)) ja 8,9 mg (30 ymol) 1-mesitylee-nisulfonyyli-3-nitro-1,2,4-triatsolia (MSNT) liuotettuina 150 yl:aan pyridiiniä.
10. 45°C, 20 min.
11. Pyridiini, 2 ml/min, 4 min; ·«
!l ttt:L anti IIIH
45 9 4 7 7 3 12. Etikkahappoanhydridin (5 %) ja 4-dimetyyliaminopyri-diinin (2,5 %) pyridiiniliuos, 2 ml/min, 4 min; 13. Pyridiini, 2 ml/min., 4 min? 14. Pyridiini/isopropanoli (1:1), 2 ml/min, 3 min.
Kaikki 14 toimenpidettä toistetaan 21 kertaa, mutta yhdeksännessä toimenpiteessä käytetään GTC:n tilalla vastaavasti seuraavia trinukleotideja trietyyliammoniumsuola-muodossa (kohta a)) seuraavassa järjestyksessä: GCA, ACC, GAA, CCC, TAC, AGG, TGA, CGC, TAC, CGT, GTG, CCA, AAA, AAA, TGA, CGG, TGA, TTC, GGG, CCT, CAT. Keskimääräinen saanto kytkentäreaktiossa on 97 %. Lopputuotteen rakenne on seu-raava:
MMT-CATCCTGCGTTCTGACGGTGAAAAAAACCAGTGCGTTACCGGTCAAGGTACCCCGAAACCGCAC
TCT- polystyreeni c) DNA-jakson poistaminen kantaja-aineesta ja suojaryh-mien poistaminen 40,0 mg (noin 0,60 ymol) DNA-synteesihartsia 96/67 pidetään 3 tuntia 50°C:ssa ja 12 tuntia huoneenlämpötilassa liuoksessa, jossa on 66 mg (0,40 mmol) o-nitrobentsal-doksiimia ja 50 UI (0,40 mmol) 1,1,3,3-tetrametyyliguani-diinia 400 Ulissa 95 % pyridiiniä. Kun pyridiini on puhallettu pois typellä, jäännökseen lisätään 1,6 ml ammoniakin 33 %:sta vesiliuosta ja saatua seosta pidetään 24 tuntia 50°C:ssa suljetussa astiassa.
Nestefaasi vapautetaan ammoniakista vakuumissa ja pestään 3 kertaa käyttämällä kullakin pesukerralla 3 ml peroksidivapaata dietyylieetteriä. Kun pienempimolekyy-liset aineosat poistetaan Biogel P6-pylväässä (100 - 200 . mesh, 3 x 66 cm, 0,01 M trimetyyliammoniumbikarbonaatti, *-· pH 7,5, 1,5 ml/min), saadaan 285 OD-yksikköä (260 nm) DNA:ta.
HPLC-pylväässä (PRP-1/Hamilton, 250 x 4,6 mm) erotetaan kaikkiaan 60 OD-yksikköä DNA:ta. Gradientti (liuos A: 0,05 M trietyyliamnöniumasetaatti pH 7,0? liuos B: liuos Aiasetonitriili (1:1)) 30 % B:tä A:ssa-^-60 % B:tä A:ssa 20 minuutissa 50°C:ssa nopeudella 2 ml/min. Lipo- 46 94773 fiilinen pääpiikki (retentioaika noin 14 min) otetaan talteen, väkevöidään DE52-selluloosa-pylväässä (Whatman), eluoidaan ja saostetaan etanoleilla. 4-metoksitrityyli-suojaryhmän poistamiseksi sakka liuotetaan 50 ylsaan etik-kahappo-vesiseosta (4:1) ja pidetään huoneenlämpötilassa 45 minuuttia. Reaktiotuote lyofilisoidaan, saostetaan etanolilla ja puhdistetaan elektroforeettisesti 8 %:sessa polyakryyliamidigeelissä (7M urea). Haluttua DNA-kokoa vastaava vyöhyke leikataan irti ja tuote elektroeluoidaan, konsentroidaan DE52-selluloosalla ja DNA 96/67 , jonka rakenne on seuraava 5 *-CATCCTGGGTTCTGACGGTGAAAAAAACCAGTGCGTTACCGGTGAAGGTACCCCGAAACCG CACTCT-3' saostetaan etanolilla.
Esimerkki 6: Seuraavat DNA-jaksot (5'-3') valmistetaan esimerkin 5 mukaisesti: 1/58 CTGCAATTCATCGTTGTTTACACCCACTGCACCGAATCTCGTCAGAACCTGTGCCTGr 46/64 komplementaarinen
CACAACCCAGGATGCATTTGTTACCCTCACCGCAAACGTTAGÄACCTTCCCACAGGCACAGCTT
• i 154/64 komplementaarinen CAGCATCCTACTCCAGGTATTCTTCCGGGATTTCTTCGAAGTGACCGTCGTTCTGAGACTGCGG Esimerkki 7: Fragmenttien 1/58, 46/64 komplementaarinen, « 96/67 ja 154/64 komplementaarinen fosforylointi 5'-päiden fosforylointi ja radioaktiivinen leimaus 32 suoritetaan (Y- P)ATP:llä ]a T^-polynukleotidikinaasilla (Boehringer) käsikirjassa Molecular Cloning, A Laboratory Manual, toim. T. Maniatis et al., Cold Spring Harbor Lab., .- 1982, s. 125 kuvatulla tavalla.
•I IU t Iitti l iiM I
• 94773
Esimerkki 8: Polymerointi kahdenteeksi II (desulfatohi- rudiini HV1-geenin F2_fragmentti)
Kinasoidut fragmentit 96/67 ja 154/64 (50 pmol kumpaakin) liuotetaan 24 yltään vettä ja saatua liuosta kuumennetaan 3 minuuttia 90°C:ssa ja sen jälkeen jäähdytetään 12°C:een 5 minuutin kuluessa. Lisätään 4 yl endo-R-pusku-ria (0,1 M tris.HCl pH 7,5, 66 mM MgCl2, 66 mM β-merkapto-etanoli, 0,6 M NaCl),10 yl deoksinukleosiditrifosfaatti- -3 seosta (dATP, dCTP, dGTP, TTP, kunkin pitoisuus 2 x 10 M, pH säädetty ammoniakilla arvoon 7,0) ja 2 yl (10 yksikköä) DNA-polymeraasi I:n Klenow-fragmenttia (Boehringer) ja saatua seosta inkuboidaan 30 minuuttia 12°C:ssa. Reaktio pysäytetään kuumentamalla 3 minuuttia 90°C:ssa ja sen jälkeen seosta varastoidaan -80°C:ssa jatkokäsittelyyn asti.
Vastaavalla tavalla saatetaan kinasoidut fragmentit 1/58 ja 46/64 reagoimaan keskenään niin, että syntyy kahdenne I (desulfatohirudiinigeenin F^-fragmentti).
Kahdenteiden I ja II rakenteet ovat seuraavat:
Kahdenne I
CTCGAATTCATGCTTGTTTACACCCACTGCACCGAATCTGGTCAGAACCTGTCCCTGTGCGAAGGTTC
CACCTTAAGTACCAACAAATGTCGCTGACCTGGCTTAGACCAGICTTGGACACCCACACGCTTCCAAG
TAACCTTTCCGCTCAGCCTAACAAATCCATCCTGGGTTCTG
ATTGCAAACCCCACTCCCATTGTTTACGTAGGACCCAAGAC
• * *
Kahdenne II
CATCCTGGGTTCTCACGGTCAAAAAAACCAGTGCGTTACCGGTGAAGGTACCCCGAAACCGCAGTCTC
CTAGCACCCAACACTGCCACTTTTTTTCGTCACCCAATGGCCACTTCCATGGGGCTTTGGCGTCAGAG
ACAACGACGCTCACTTCCAAGAAATCCCGGAACAATACCTCCACTAGGATCCTG
TGTTGCTCCCACTGAAGCTTCTTTACGGCCTTCTTATGGACGTCATCCTAGGAC
Seuraava kaavio 1 esittää desulfatohirudiinigeenin F.j ja F2 fragmenttien valmistusta.
48 9 4 7 7 3
Kaavio 1: Desulfatohirudiini HV1-geenin ja F.j-F^DNAsn F^- ja F2~fragmentin valmistus l/58 96/67 46/64 154/64 T4-polynukleotidi- j T4-polynukleotidi- kinaasi I kinaasi emäspariutus I emäspariutus tunn- -ππτπ
iDNA-polymeraasi I I DNA-polymeraasi I
(Klenow), dNTP:t 1 (Klenow), dNTP:t □rnuimiiiiiimiiiiiiii i rrmniuntiiirmniinn i t ti r
EcoRI EcoRII EcoRII BaaHI
F^-fragmentti F2~fragmentti i(alakloonaus) J (alakloonaus)
EcoRII JecoRII
□nmiminoriin _(πιιιιιιιιιιιιιιιππ • * t t
EcoRI EcoRII EcoRII jcaHI
1 emäspariutus T4 DNA-ligaasi
I ΙΙΙΙΙΙΙΙΙΙΙΙΓΙΙΓΓΙΙΙΙΙΙΙΙΙΙΙΙΙΙΙΙΙΙΙΤΤΗΊΤΙΙΙΙΙΙΙΙΙΙ I
t t t
EcoRI EcoRII BamHI
F^-F^-DNA (desulfatohirudiinigeeni) m m 49 . 9 4 7 7 3
Esimerkki 9: Fragmenttien 1/58, 46/64 (kinasoitu), 96/67 (kinasoitu) ja 154/64 polymerointi ja yhteenliittäminen; desulfatohirudiini HV1-geenin valmistus
Fragmentit 1/58, 46/64 (kinasoitu), 96/67 (kinasoitu) ja 154/64 (50 pmol kutakin) liuotetaan 48 ylraan vettä ja saatua liuosta kuumennetaan 3 minuuttia 90°C:ssa ja jäähdytetään 5 minuutissa 12°C:een. Lisätään 8 yl endo-R-pus-kuria (ks. esimerkki 8), 20 yl deoksinukleosiditrifosfaat-tiseosta (dATP, dCTP, dGTP, TTP, kunkin pitoisuus 0,002 M, pH säädetty ammoniakilla arvoon 7,0) ja 2 yl (10 yksikköä) DNA-polymeraasi I:n Klenow-fragmenttia (Boehringer) ja in-kuboidaan 30 minuuttia 12°C:ssa. Reaktio pysäytetään kuumentamalla 3 minuuttia 90°C:ssa ja DNA erotetaan etanoli-saostuksella sen jälkeen, kun on suoritettu fenoli-kloro-formiuutto. Saatu DNA-seos liuotetaan 100 yl:aan ligaa-sipuskuria (66 mM tris.HCl pH 7,5, 6,6 mM MgC^r 10 mM di-tiotreitoli>. 5 mM ATP) ja 50 yksikköä (2 yl) T4 DNA-li-gaasia (Biolabs) lisätään seokseen ja näin saatua seosta inkuboidaan 20 tuntia 20°C:ssa. Reaktio pysäytetään kuumentamalla 5 minuuttia 70°C:ssa ja DNA seostetaan talteen etanolilla sen jälkeen kun on uutettu fenoli-kloroformilla. Suoritetaan erottaminen 8 %:sessa polyakryyliamidigee-lissä (denaturoiva) elektroforeesilla, yhteenliittämistuo-· te, jonka koko on 217 emäsparia, elektroeluoidaan, konsent roidaan DE52-selluloosapylväässä ja eluoinnin jälkeen saos-teatan etanolilla.
Desulfatohirudiinigeenin rakenne on seuraava:
CTCGAATTCATGGTTGTTTACACCGACTGCACCGMTCTGCTCAGAACCTCTCCCTGTCCCAAGCT ; GACCTTAAGTACCAACAAATGTCCCTGACGTGGCTTAGACCAGTCTTGGACACGGACACCCTTCCA
9 9
TCTAACCTTTGCCGTCAGCGTAACAAATGCATCCTGCGTTCTCACGGTGAAAAAAACCAGTGCGTT
ACATTGCAAACGCCAGTCCCATTGTTTACGTAGGACCCAAGACTGCCACTTTTTTTGGTCACGCAA
ACCGCTCAAGCTACCCCGAAACCCCAGTCTCACAACGACGCTGACTTCGAAGAAATCCCGGAAGAA
TCCCCACTTCCATCCCGCTTTGGCGTCAGAGTCTTGCTGCCACTGAAGCTTCTTTAGGGCCTTCTT
TACCTGCAGTAGGATCCTG
ATCCACCTCATCCTACCAC
♦ f 50 · 94773
Desulfatohirudiinigeenin valmistaminen näistä neljästä fragmentista on selostettu seuraavassa kaaviossa 2:
Kaavio 2: Hirudiinigeenin rakentaminen neljästä synteet tisestä fragmentista 1/58 96/67 <*6/64 154/64 T^-polynukleotidikinaasi * emäspariuttaminen -rrm nm-nm_ l-DNA-polymeraasi I (Klenow) ldNTP:t imimmiiiniLiii.iLLiin nm niiiiiiiiiiiiiriiiiiiiiiiij | T4 DNA-ligaasi
I i IM M M n m ΙΊΤΓΤΙΙ111111 n mu u II 1111 m MM H t im 11 MIMH
T ί
EcoRI BaaHI
DNA
(desulfatohirudiinigeeni)
Esimerkki 10: Desulfatohirudiini HV1 -geenin F^DNAtn sisältävän plasmidin pML300 rakentaminen a) Linearisoidun vektorin pBR322/EcoRI/PvuII rakentaminen 5 yg pBR322-plasmidi-DNA:ta katkaistaan 5 yksiköllä PvuII-restriktioendonukleaasia (Biolabs) 200 yl:ssa liuosta, jossa on 100 μ?/™1 liivatetta, reaktioajan ollessa 1 tunti 37°C:ssa. Sitten tämän liuoksen pitoisuudeksi sää- • 1
tl tili HUI I I I IES
51 94773 detään 100 mM tris.HCl (pH 7,5), 50 mM NaCl ja DNA katkaistaan 30 yksiköllä EcoRI-restriktioendonukleaasia (Biolabs) reaktioajan ollessa 2 tuntia 37°C:ssa. Sitten liuoksen pitoisuudeksi säädetään 50 mM tris.HCl pH 8 ja DNA-pitoisuuden ollessa 10 yg/yl inkuboidaan 2 yksikön kanssa vasikan sisäelinten emäsfosfataasia (Boehringer) 30 minuuttia 37°C:ssa. Entsyymi inaktivoidaan kuumentamalla 60 minuuttia 65°C:ssa. Sitten liuos standardisoidaan TNE:llä, uutetaan fenolilla ja kloroformilla (1 tilavuus) ja katkaistu DNA seostetaan 2 tilavuudella alkoholia -20°C:ssa yön yli.
Vektori (pBR322/EcoRI/PvuII, 2297 emäsparia), joka on leikattu pBR322 DNA:sta erotetaan pienestä DNA-fragmen-tista (2067 emäsparia) geelielektroforeesilla 1 %:sessa matalalla sulavassa agaroosissa (Biorad) tris-asetaatti-EDTA-puskurissa pH 8. Kun agaroosigeelin sisältämä DNA on värjätty EtBr:llä, alue, joka sisältää pBR322/EcoRI/ PvuII-vektorin DNA-vyöhykkeen (= 2297 emäsparia), leikataan irti geelistä ja nesteytetään pitämällä 10 minuuttia 65°C:ssa. Tähän DNA-liuokseen lisätään 20 tilavuutta TNE: tä ja DNA puhdistetaan menetelmällä Mueller et ai., J. Mol. Biol. 124, 343 (1978) käyttämällä DE-52-kromatografiaa, suoritetaan uutto fenoli/kloroformilla ja DNA saos-tetaan -20°C:ssa yön aikana. DNA-sakka liuotetaan 50 yli
*· aan liuosta, jossa on 0,01 M tris.HCl (pH 8) ja 0,1 mM
EDTA, ja varastoidaan -20°C:ssa käyttöön asti. Näin saadaan 1,4 yg ( = 3,2 pmol päitä) DNA:ta.
b) F^ —DNA/EcoRI:n valmistus ·: 24 ng (» 1,3 pmol päitä) kemiallisesti syntetisoi
tua F^-DNAs ta (ks. esimerkki 8) katkaistaan 5 yksiköllä EcoRI-restriktioendonukleaasia (Biolabs) 50 yi:ssa liuosta, jossa on 100 mM tris-HCl (pH 7,5), 50 mM NaCl ja 100 yg/ml liivatetta, reaktioajan ollessa 30 minuuttia 37°C:ssa. Näin saatuun liuokseen lisätään 0,06 yg (= 0,14 pmol päitä) linearisoitua vektoria pBR322/EcoRI/PvuII
52 94773 esimerkki 10a). Sitten entsyymi inaktivoidaan kuumentamalla 10 minuuttia 65°C:ssa ja liuos standardisoidaan TNE:llä ja uutetaan fenoli/kloroformilla. DNA saostetaan alkoholilla. Saostettua DNA:ta varastoidaan alkoholin alla -20°C:saa siihen asti, kun se tarvitaan j atkokäsittelyyn.
c) pBR322/EcoRI/PvuII-vektori-DNA:n liittäminen F^-DNA/ EcoRI:hin ja plasmidin pML300 rakentaminen
Esimerkissä 10b) saatu DNA-sakka, joka sisältää mainitut kaksi DNA-fragmenttia, liuotetaan 20 yl:aan liosta, jossa on 50 mM tris.HCl (pH 7,8), 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, 0,5 mM ATP ja 100 yg/1 liivatetta, ja sen jälkeen käsitellään 25 yksiköllä/yl DNA-ligaasia (Biolabs) 15°C:ssa 3 tuntia. Tällä tavalla saadaan yhdistelmäplasmidi pML300, joka sisältää F^-DNA:n, liuoksena.
d) E. coli HBl01:n transformointi plasmidilla pML300
Kalsiumilla esikäsiteltyjä E. coli HB101-soluja, jollaisia tarvitaan transformoinnissa, tuotetaan menetelmällä Mandel et ai., J. Mol. Biol. ^3, 159 (1970).
Kohdassa c) saatua liuosta, joka sisältää yhdis- • telmäplasmidin pML300, kuumennetaan 10 minuuttia 65°C: ssa, jotta DNA-ligaasi saadaan inaktivoiduksi ja sen jälkeen jäähdytetään 37°C:een. 10 yl tätä reaktio- seosta lisätään 150 yl:aan kalsiumilla käsiteltyjä E. coli HBl01-soluja MgCl2-pitoisuuden ollessa 10 mM ja tris.HCl (pH 7,3)-pitoisuuden 10 mM 200 yl:n kokonais- ♦ · « * solususpensiotilavuudessa.
Sitten tätä seosta jäähdytetään jäällä 30 minuuttia, kuumennetaan 2 minuuttia 42°C:ssa ja sen jälkeen jätetään seisomaan 37°C:een 50 minuutiksi 1 ml:ssa L-alustaa (ks. esimerkki 18). Sitten seos levitetään 0,2 ml:n eris- ... sä 5 agar-maljalle (McConkey Agar, Difco) , ijotka sisältä vät 60yg/ml ampisilliinia (Serva) . Agar-maljoja inkuboi- sl : aa i uisi l i i rt 53 9 4 7 7 3 daan 37°C:ssa 16-18 tuntia. Näin saadaan 484 ampisil-liinille vastustuskykyistä, transformoitunutta E. coli HB101-pesäkettä.
e) F^-DNA:n sisältävien pesäkkeiden seulonta 470 transformoitunutta pesäkettä (esimerkki 10d) painetaan nitroselluloosasuodattimelle B85 (Schleicher & Schull). Pesäkkeet lysoidaan ja niiden denaturoitunut DNA kiinnitetään suodattimelle menetelmällä M. Grunstein ja D.S. Hogness (Proc. Natl. Acad. Sei. USA 72, 3961 (1979)). Sen jälkeen suodattimille suoritetaan esihyb-ridisointi 20 ml:ssa (per suodatin) liuosta, jossa on 4 x SET (liuos, jossa on 30 mM tris.HCl (pH 8), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA) , 0,1 % (paino/tilavuus) Ficoll 400 (Pharmacia, 0,5 % SDS, 50 yg/ml denaturoitua vasikan ka-teenkorvan DNA:ta, 4 tunnissa 64°C:ssa. Sen jälkeen nit-roselluloosasuodattimia käsitellään 20 ml:ssa (per suodatin) liuosta, jossa on 5 x SET, 0,2 %(paino/tilavuus) Ficoll 400, 0,2 % SDS ja 50 yg/ml denaturoitua vasikan kateen- korvan DNA:ta, 16 tuntia 64°C:ssa 3^P:llä radioaktiivi- 3 4 sesti leimatun koettimen (noin 10 - 10 Cerenkov-cpm per suodatin) kanssa. Koettimena käytetään oligonukleotidia 46/64 (komplementaarinen) (ks. esimerkki 6).
:· Sitten suodattimet pestään ensin kahdesti liuoksella, jossa on 2 x SET ja 0,2 % SDS, huoneenlämpötilassa ja sen jälkeen kahdesti liuoksessa, jossa on 2 x SET ja 0,5 % SDS, 60°C:ssa (ensin 30 minuuttia ja sitten 60 minuuttia). Sitten suodattimet kuivataan 3 MM-paperin (Whatman) välissä ja kuvataan -80°C:ssa röntgenfilmi lie (Fuji) käyttämäl-lä vahvistusvarjostinta (Ilford) valotusajan ollessa 1-2 vuorokautta.
Saadussa autoradiogrammissa havaitaan 71 positiivista pesäkettä (kloonia), joita voidaan käyttää prosessointiin, ja yksi niistä nimetään pML300:ksi.
54 94773
Esimerkki 11: Plasmidin pML305 rakentaminen, joka sisäl tää desulfatohirudiini HV1-geenin F2~DNA:n (kuva 2) a) Linearisoidun vektorin pBR322/BamHI/PvuII tuottaminen 5 yg pBR322-plasmidi-DNA:ta katkaistaan 30 yksiköllä BamHI-restriktioendonukleaasia 30 minuuttia 37°C:ssa liuoksessa, jossa on 100 mM NaCl, 6 mM tris.HCl (pH 7,9) , 6 mM MgClj ja 100 yg/ml liivatetta. Sen jälkeen lisätään 15 yksikköä PvuII-restriktioendonukleaasia ja saatua liuosta inkuboidaan 2 tuntia 37°C:ssa.
Reaktioseosta kuumennetaan 10 minuuttia 70°C:ssa entsyymien inaktivoimiseksi. Tämän jälkeen kyseiset kaksi DNA-jaksoa erotetaan toisistaan geelielektroforee-silla 1 %:sessa matalalla sulavassa agaroosissa, joka tris-asetaatti-EDTA-puskurissa (ks. esimerkki 10a) .
pBR322 BamHI/PvuII-vektorin DNA-vyöhyke (* 2672 emäsparia) leikataan irti, nesteytetään ja puhdistetaan menetelmällä Mueller et ai. (supra) käyttämällä DE-52-kro-matografiaa. Näin saadaan 0,75 yg (= 1,5 pmol päitä) DNA:ta.
b) Fj-DNA/BaraHIin aikaansaaminen ·' 25 yg (= 1,3 pmol päitä) kemiallisesti syntetisoi tua F2~DNA:ta (esimerkki 8) katkaistaan 16 yksiköllä BamHI-restriktioendonukleaasia (Biolabs) 20 yl:ssa liosta, jossa on 150 mM NaCl, 6 mM tris.HCl (pH 7,9), 6 mM MgCl2 ja 100 g/ml liivatetta, reaktioajan ollessa 30 minuuttia 37°C:ssa. 60 ng (= 96 nmol päitä) lineari- soitua vektoria pBR322/BamHI/PvuII (esimerkki 11a) lisätään sen jälkeen liuokseen ja koko liuos standardisoidaan TNEsllä ja uutetaan fenoli/kloroforroilla ja DNA saos-tetaan 2 tilavuudella alkoholia. Saostunutta DNA:ta varastoidaan alkoholin alla -20°C:ssa jatkokäsittelyyn asti.
♦♦ c) pBR322/BamHI/PvuII-vektori-DNA:n liittäminen Fj-DNA/ 55 . 94773
BamHI:hin ja plasmidin pML305 rakentaminen
Esimerkissä 11b) saatu DNA-sakka, joka sisältää mainitut kaksi DNA-jaksoa, liuotetaan 20 yl:aan liuosta, jossa on 50 mM tris.HCl (pH 7,8) , 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, 0,5 mM ATP ja 100 yg/ml liivatetta, käsitellään 15 yksiköllä/ yl DNA-ligaasia (Biolabs) käsittelyajan ollessa 3 tuntia 15°C:ssa. Tällä tavalla saadaan yhdistelmäplasmi-di pML305, joka sisältää F0-DNA:n, liuoksena.
lm d) E. coli HB101:n transformointi plasmidilla pML305
Kalsiumilla käsitellyt E. coli HBl01-solut transformoidaan esimerkissä 10d) kuvatulla tavalla. Käytetään 10 yl esimerkissä 11c) saatua reaktioseosta. Transformoinnis-sa saadaan 313 ampisilliinille vastustuskykyistä pesäkettä.
e) Fj-DNAin sisältävien pesäkkeiden seulonta 65 transformoituneesta pesäkkeestä (esimerkki 11d) tutkitaan F2~DNA:n läsnäolo esimerkissä 10e) kuvatulla tavalla. Radioaktiivisena koettimena käytetään oligonukleo-tidia 154/64 (komplementaarinen) (ks. esimerkki 6). Auto-radiogrammin perusteella saadaan 2 positiivista pesäkettä, joista yksi nimetään pML305:ksi.
* Esimerkki 12: Kloonien pML300 ja pML305 tunnusmerkit
Yhdistelmäplasmidien pML300 ja pML305 DNA:t eristetään Ish-Horowitz:in menetelmällä (Molecular Cloning, A Laboratory Manual, toim. T. Maniatis et al., Cold Spring Harbor Lab., 1982, s. 368). F^DNA-liitännäisen ja F2~ ·' DNA-liitännäisen nukleotidisekvenssit varmistetaan Maxamin ja Gilbertin menetelmällä (Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 74, 560 (1977); ks. myös Meth. Enzym. 65, 499 (1980)).
Tätä tarkoitusta varten 10 yg pML300 plasmidi-DNA:ta katkaistaan EcoRI-restriktioendonukleaasilla ja 10 yg pML305 plasmidi-DNA:ta katkaistaan BamHI-restriktioendonuk- j ·· 56 94773 leaasilla ja linearisoidut DNA:t eristetään geelieluutiol-la agaroosigeelistä (ks. esimerkki 10a)). Eristetyt DNA:t pilkotaan sen jälkeen emäsfosfataasilla ja kromatografoi- daan DE-52:lla (ks. esimerkki 11a)). Sitten DNA:t leima- 32 taan radioaktiivisesti 5'-päästään(γ- P)ATP:llä (ominais-aktiivisuus 5000 Ci/mmol, Amersham) käyttämällä T^-polynuk-leotidikinaasia (P-L Biochemicals).
Sitten radioaktiivisesti leimatut DNA:t katkaistaan toisella restriktioendonukleaasilla (EcoRII). Syntyneet DNA-fragmentit eristetään geelieluutiolla agaroosista. pML300:n tapauksessa F^-DNA:n sekvenssi määritetään sen jälkeen EcoRII-EcoRI*-fragmentista (noin 109 emäsparia) ja pML300:n tapauksessa F2-DNA:n sekvenssi määritetään EcoRII-BamHI*-fragmentista (noin 122 emäsparia).
(* tarkoittaa, radioaktiivisesti leimattua DNA:n päätä).
F^-DNA:lie ja F2-DNA:lle saadut nukleotidisekvens-sit ovat identtisiä esimerkissä 8 esitettyjen kanssa.
Esimerkki 13: Ilmentämisplasmidin pML310 rakentaminen a) Linearisoidun vektorin pHRil48/EcoRI/BamHI rakentaminen, joka sisältää trp-promoottori-operaattorin (kuva 3 ja kuva 4) • * ' A. Plasmidin p159 rakentaminen 10 ug plasmidia pBRHfcrp (saksalainen hakemus julkaisu no. 3 111 405) katkaistaan 50 yksiköllä EcoRI:tä 60 minuuttia 37°C:ssa ja fenoliuuton jälkeen reaktioseos fraktioidaan sakkaroositiheysgradientisssa (5-23%) liuoksessa, jossa j* on 50 mM tris.HCl (pH 8,0) ja 1 mM EDTA, käyttämällä TST41- roottoria (Kontron AG). Sentrifugointi kestää 14 tuntia nopeudella 40 000 kierr./min lämpötilassa 15°C. 0,3 ml:n jakeet kerätään ISCO-gradientinkerääjällä nopeudella 1 ml/min. Jakeet, jotka sisältävät pienemmän fragmentin, yhdistetään ja liuos standardisoidaan TNE:llä ja suoritetaan saostus 2 tilavuudella etanolia -20°C:ssa. Eppen- 57 94773 dorf-sentrifugissa sentrifugoimalla saatu DNA liuotetaan 100 yl:aan liuosta, jossa on 10 mM tris.HCl pH 7,5 ja 0,5 mM EDTA. 5 yg tätä DNA-fragmenttia katkaistaan 5 yksiköllä BglII:ta (Biolabs) reaktioajan ollessa 60 minuuttia 37°C:ssa. Reaktioseos uutetaan fenolilla ja kloroformilla ja DNA:ta inkuboidaan 2 tilavuuden kanssa etanolia -80°C:ssa 10 minuuttia ja sen jälkeen DNA sent-rifugoidaan talteen ja liuotetaan uudestaan 50 yl:aan liuosta, jossa on 50 mM tris.HCl (pH 8,0). Tästä liuoksesta otetaan 2 yl (0,2 yg DNA:ta) ja inkuboidaan DNA-pi-toisuudessa 10 ng/yl 50 mM tris.HCl-liuoksessa (pH 8,0) 1 yksikön kanssa vasikan suolen emäsfosfataasia (Boehringer) 30 minuuttia 37°C:ssa. Entsyymi inaktivoi-daan kuumentamalla liuosta 60 minuuttia 65°C:ssa. 0,04 yg tätä DNA:ta otetaan erilleen ja 5'-päiden osalta suori- 32 tetaan inkubointi 10 yCi:n kanssa /γ- P/ATP:tä (5000 Ci/mmol, Amersham) käyttämällä 5 yksikköä T4-polynukleo-tidikinaasia (P-L Biochemicals) 20 yl:n reaktiotila-vuudessa, joka sisältää 50 mM tris.HCl (pH 9,5) , 10 mM MgCl2 ja 5 mM DTT, reaktioajan ollessa 30 minuuttia 37°C: ssa. Radioaktiivinen näyte sekoitetaan leimaamattoman näytteen kanssa (ks. edellä) ja DNA-fragmentit fraktioidaan 5-23 %:sessa sakkaroositiheysgardientissa, joka on tehty liuokseen, jossa on 50 mM tris.HCl (pH 8,0) ja ·; 1 mM EDTA, käyttämällä TST60-roottoria. Sentrifugointi kestää 5 tuntia nopeudella 60 000 kierr./min lämpötilassa 15°C. Kerätään 0,2 ml:n jakeet. Kunkin jakeen radioaktiivisuus määritetään mittaamalla Cerenkov-säteily ja fragmentit tunnistetaan tällä tavoin. Halututjakeet, jotka sisältävät pienen DNA-fragmentin, yhdistetään ja *: DNA seostetaan 2 tilavuudella etanolia, DNA sentrifugoi- daan talteen ja liuotetaan uudestaan 20 yl:aan liuosta, jossa on 10 mM tris.HCl pH 7,5 ja 0,5 mM EDTA.
32 P:llä leimattu EcoRI-Bg1II-DNA-fragmentti katkaistaan osittain 0,2 yksiköllä Taql:tä (Biolabs) 50 yl:n reaktiotilavuudessa reaktioajan ollessa 10 minuuttia 37 ·« n C:ssa. Reaktioseoksen pitoisuudeksi säädetään 0,2 % SDS, 58 94773 16% qlvseriiniä, 10 mM ΕΠΕΑ ja 0,05 % brcrriifenolisinistä ja ENA-fraa-mentit erotetaan 6 %:sessa polyakryyliamidigeelissa tris-boraatti-EDTA:ssa (A.C. Peacock et ai., Bioche mistry 6, 1818 (1967)). Vyöhyke, joka sisältää halutun EcoRI-TaqI-fragmentin (suurin osittainen katkeamistuote) tunnistetaan autoradiogrämmillä. Tämä fragmentti (L, ks. kuva 3) uutetaan geelistä ja puhdistetaan (W. Möller et ai., supra) ja liuotetaan 10 yl:aan liuosta, jossa on 10 mM tris.HCl pH 7,5 ja 1 mM EDTA.
Vastaanottajana käytetään plasmidia pBR322, joka katkaistaan Clalillä ja EcoRI:llä. 2 yg pBR322:ta katkaistaan 4 yksiköllä Clalrtä (Biolabs) 20 yl:n reaktiotilavuu-dessa reaktioajan ollessa 60 minuuttia 37°C:ssa. Proteiini uutetaan fenolilla ja sen jälkeen DNA saostetaan 2 tilavuudella etanolia -80°C:ssa 10 minuutissa. DNA sent-rifugoidaan talteen ja katkaistaan sen jälkeen 10 yksi-källä EcoRIstä (Biolabs) 30 minuutissa 37°C:ssa 20 yl:n reaktiotilavuudessa. Sen jälkeen lisätään 2 tilavuutta 0,1 M tris.HCl (pH 8,7) ja saatua liuosta inkuboidaan 1 yksikön kanssa vasikan emäsfosfataasia (Boehringer) 37°C: ssa 30 minuuttia. Sen jälkeen fosfataasi inaktivoidaan inkuboimalla 65°C:ssa 60 minuuttia. 100 ng vastaanottaja-plasmidia inkuboidaan 5 yl:n kanssa L-DNA-fragmenttia 15 yl;n reaktiotilavuudessa, jossa on 10 mM MgCl2, 20 mM ·; tris.HCl (pH 7,8), 10 mM DTT ja 0,5 mM ATP, käyttämällä 30 yksikköä DNA-ligaasia reaktiotilavuuden yl:aa kohti (Biolabs) reaktioajan ollessa 2 tuntia.
5 yl tätä liuosta lisätään seokseen, joka sisältää 150 yl kalsiumkloridilla käsiteltyjä E. coli HB101-soluja (supra) liuoksessa, jossa on 10 mM MgCl2, 10 mM CaCl2 ja *1' 10 mM tris.HCl (pH 7,5) golususpension kokonaistilavuuden ollessa 200 yl. Seosta jäähdytetään 20 minuuttia jäällä, kuumennetaan 1 minuutti 42°C:ssa ja sen jälkeen inkuboidaan 10 minuuttia 20°C:ssa. Lisätään 1 ml tryptonialustaa (tryp-tonialusta sisältää 10 g bacto-tryptonia (Difco); 1 g hiivauutetta (Difco); 1 g glukoosia; 8 g NaCl ja 294 mg ·· ) ; M.t »Iti I I I iti 59 94773
CaClj^21^0 1 litrassa tislattua vettä) ja saatua seosta inkuboidaan 30 minuuttia 37°C:ssa sekoittamalla samalla kierrosnopeudella 300 kierr./min. Seosta viljellään kahdella agar-maljalla (McConkey Agar, Difco; 0,6 ml/malja), johon on lisätty 50 yg/ml ampisilliiniä (Sigma). Maljoja inkuboidaan 12 - 17 tuntia 37°C:ssa.
10 eri pesäkkeestä eristetään plasmidi-DNA seuraa-valla tavalla:
Kullakin pesäkkeellä ympätään 10 ml tryptonialustaa, joka sisältää 50 ug/ml ampisilliiniä, 25 ml sn Erlenmeyer-pulloissa. Viljelmiä sekoitetaan 15 - 18 tuntia 37°C:ssa nopeudella 300 kierr./min. Solut sentrifugoidaan talteen (Sorval, HS-4-roottori, 10 minuuttia, 4000 kierr./min, 4°C). Näin saadaan noin 0,1 g soluja, jotka uudelleensus-pendoidaan 1 ml saan 50 mM tris.HCl-liuosta (pH 8,0). 0,25 ml lysotsyymiliuosta (10 mg/ml 50 mM tris.HCl-liuoksessa (pH 8,0); Sigma markkinoi lysotsyymiä), inkuboidaan 10 minuuttia 0°C:ssä ja sen jälkeen lisätään 0,15 ml 0,5 mM EDTA (pH 7,5). Kun on inkuboitu vielä 10 minuuttia 0°C: ssa, lisätään 60 μΐ 2 %:sta TritonX-100 (Merck). Kun on pidetty 30 minuuttia 0°C:ssa, näytettä sentrifugoidaan 30 minuuttia nopeudella 15 000 kierr./min 4°C:ssa Sorval SA-600-roottorissa. Emäliuoksesta poistetaan proteiini 1 tilavuudella fenolia (kyllästetty TNEsllä). Faasit ero-• tetaan sentrifugoimalla (Sorval HB-4-roottori) 10 minuut
tia nopeudella 5000 kierr./min 4°C:ssa. Ylempi faasi uutetaan kahdesti 1 tilavuudella kloroformia. Lisätään haiman RNAasia A (Sigma; 10 mg/ml TNEsssä, esilämmitetty 10 minuuttia 85°C:ssa), kunnes lopullinen pitoisuus on 25 yg/ml ja sen jälkeen seosta inkuboidaan 40 minuuttia ; 37°C:ssa. Sitten liuoksen pitoisuudeksi säädetään 1 M
NaCl ja 10 % polyetyleeniglykolia 6000 (Fluka, käsitelty 20 minuuttia 120°C;ssa autoklaavissa) ja inkuboidaan 2 tuntia -10°C:ssa. Sakka kerätään Sorval HB-4-rootto-rissa (20 minuuttia nopeudella 10 000 kierr./min, 0°C) ja liuotetaan uudestaan 100 yl:aan TNEstä. DNA-liuos uutetaan 1 tilavuudella fenolia ja DNA saostetaan 2 60 9 4 7 7 3 tilavuudella etanolia saostusajan ollessa 10 minuuttia -80°C:ssa. Sakka otetaan talteen sentrifugoimalla Eppen-dorf-sentrifugissa ja DNA-liuotetaan 20 yl:aan liuosta, jossa on 10 mM tris.HCl (pH 7,5) ja 0,5 mM EDTA. 8-10 yg plasmidi-DNA:ta saadaan 10 ml:n viljelmästä.
Plasmidi-DNA:t analysoidaan sen jälkeen, kun on suoritettu katkaisut seuraavilla enstyymeillä:
Kussakin tapauksessa 0,5 ygslle plasmidi-DNA:ta suoritetaan seuraavat katkaisut: Hpal (Biolabs), Hpal (Biolabs) + EcoRI (Biolabs) ja Cal (Biolabs) käyttämällä tavanomaisia menetelmiä ja noudattamalla entsyyminvalmistajan ohjeita. DNA:t fraktioidaan 1 %:sessa agaroosigeelissä, liuoksessa, jossa on 40 mM tris-asetaattia (pH 7,8), 1 mM EDTA ja 0,5 yg/ml etidiumbromidia. Halutut plasmidit sisältävät Hpal-kohdan ja kolmen katkaisun jälkeen antavat suuren DNA-fragmentin lisäksi 2 pienempää fragmenttia, jotka ovat suurempia kuin pBR322:n pieni EcoRI-Clal-fragmentti. Yksi näistä plasmideista nimetään p159:ksi (ks. kuva 3).
B. Plasmidin pHRi145 rakentaminen 2 yg p159 DNA:ta katkaistaan 10 yksiköllä EcoRI:tä (Biolabs) 30 minuuttia 37°C:ssa. Suoritetaan fenoliuutto ja DNA seostetaan etanolilla ja liuotetaan sentrifugoinnin .< jälkeen 10 yl:aan liuosta, jossa on 10 mM tris.HCl (pH 7,5) ja 0,5 mM EDTA. EcoRI:llä katkaistu DNA käsitellään vielä 5 yksiköllä DNA-polymeraasia (Klenow-fragmentti) (Boeh-ringer) liuoksessa, jossa on 10 mM MgCl2/ 10 mM 8-merkapto-etanolia, 50 mM NaCl, 0,1 mM cLATP (P&L Biochemicals) ja 0,1 mM dTTP (P&L Biochemicals) käsittelyajan ollessa 15 mi-·: nuuttia 12°C:ssa. Sen jälkeen polymeraasi inaktivoidaan inkuboimalla 5 minuuttia 85°C:ssa. Reaktioseokselle suoritetaan kymmenkertainen laimentaminen liuoksella, jossa on 20 mM tris.HCl (pH 7,8), 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, 0,5 mM ATP (Sigma) ja inkuboidaan 30 yksikön kanssa T^ DNA-li-gaasia per yl reaktioseosta 1 tunti 15°C:ssa.
E. coli transformoidaan 50 ng:lla DNA:ta (edellä ku- rl <11 l <111 I t }« : 61 94773 vatulla tavalla) ja viljellään McConkey-agarmaljoissa, joissa on 50 yg/ml ampisilliinia.
10 eri pesäkkeestä eristetään plasmidi-DNA edellä kuvatulla tavalla. Plasmidi-DNA:t analysoidaan katkaisemalla EcoRI:llä. Halutut plasmidit ovat vastustuskykyisiä EcoRI:lle. Analyysi suoritetaan edellä kuvatulla tavalla. Yksi halutuista plasmideista nimetään HRi145:ksi (kuva 3).
C. Plasmidin pHRi148 rakentaminen 2 yg pHRi145 DNA:ta käsitellään 5 yksiköllä Clal:tä (Boehringer) 60 minuuttia 37°C:ssa ja sen jälkeen proteiini poistetaan fenoliuutolla. DNA saostetaan etanolilla ja liuotetaan sen jälkeen 20 yl:aan liuosta, jossa on 10 mM tris.HCl (pH 7,5) ja 0,5 mM EDTA. Ulostyöntyvät päät täytetään, kuten edellä, käyttämällä DNA polymeraasi I:tä (Klenow-fragmentti) paitsi, että dATP ja dTTP korvataan dCTPsllä (P&L Biochemicals) ja dGTP:llä (P&L Biochemicals). Polymeraasi inaktivoidaan inkuboimalla 5 minuuttia 85°C: ssa. Reaktioseokseen lisätään 2 tilavuutta 0,1 M tris.HCl (pH 8,7) ja sen jälkeen inkuboidaan 0,5 yksikön kanssa vasikan fosfataasia (Boehringer) 30 minuuttia 37°C:ssa. Reaktioseoksesta poistetaan proteiini fenoliuutolla. DNA saostetaan etanolilla ja liuotetaan 8 yl:aan liuosta, jossa on 10 mM tris.HCl (pH 7,5) ja 0,5 mM EDTA.
Kemiallisesti syntetisoitu DNA-kytkijä, jonka kaava on 5'-GAATTCCATGGTACCATGGAATTC-3' fosforyloidaan 5'-päästään inkuboimalla 8 pmol kytkijää 32 —1 .V 5 yCisn kanssa /γ- P/ATP:tä (5500 Ci.mmol , Amersham) 8 ylin reaktiotilavuudessa, joka sisältää 0,1 mM rATP (Sigma), 50 mM tris.HCl (pH 9,5), 10 mM MgCl2, 5 mM DTT ja 2 yksikköä T^-polynukleotidikinaasia (P&L Biochemicals), reaktioajan ollessa 30 minuuttia 37°C:ssa. Reaktio pysäytetään jäädyttämällä -80°C:een.
«
Sitten tämä radioaktiivisesti leimattu kytkijä kä- 94773 62 sitellään 1 yg:lla Callitä ja fosfataasilla ja liitetään yhteen pHRi145 DNA:n (ks. edellä) kanssa 20 ulissa reak-tioseosta, joka sisältää 0,5 mH rATP (Sigma), 10 mM DTT (Calbiochem) , 20 mM tris.HCl (pH 7,8), 10mM MgCl2 ja 800 yksikköä T4 DNA-ligaasia (Biolabs). Inkubointiaika on 2 tuntia 15°C:ssa. Ligaasi inaktivoidaan inkuboimalla 10 minuuttia 85°C:ssa. Sitten lisätään 2 tilavuutta vettä ja natriumkloridipitoisuudeksi säädetään 10 mM ja sen jälkeen lisätään 20 yksikköä Kpnl:tä (Biolabs) 30 minuutin kuluessa 37°C:ssa. Uutetaan fenolilla ja kloroformilla, seos fraktioidaan 0,9 %:sella matalalla sulavalla aga-roosigeelillä (Biorad) liuoksessa, jossa on 40 mM tris-asetaattia (pH 7,8), 1 mM EDTA ja 0,5 yg/ml etidiumbromidia. UV-sä-teilytyksellä näkyvä vyöhyke, jonka liikkuvuus on sauna kuin vastaavankokoisella DNA-merkillä, leikataan irti pienellä veitsellä. Tämä geelin osa sulatetaan 5 minuutissa 65°C: ssa ja sen jälkeen jäähdytetään 37°C:een. Näin saadaan tilavuudeksi noin 20 yl. Tästä liuoksesta otetaan 5.yl ja sitä inkuboidaan 12 tuntia 15°C:ssa 400 yksikön kanssa T^-ligaasia (Biolabs) 10 ylin reaktiotilavuudessa, jonka pitoisuudeksi on säädetty 0,5 mM ATP, 10 mM DTT, 10 mM MgCl2, 20 mM tris.HCl (pH 7,8), 1/10 tilavuutta liuosta, jossa on 100 mM tris.HCl (pH 7,5), 100 mM CaCl2 ja 100 mM MgCl2· lisätään ligaasiseokseen (kiinteytetty 15°C:ssa) ja *·* koko näin saatua seosta inkuboidaan 5 minuuttia 65°C:ssa.
Sitten tällä liuoksella transformoidaan kalsiumilla käsitellyt E. coli HB101rsolut edellä kuvatulla tavalla. Viljely suoritetaan McConkey-agarmaljoilla, joissa on 50 yg/ml ampisilliinia.
10 eri pesäkkeestä eristetään plasmidi-DNA edellä t ♦ kuvatulla tavalla, ja DNA-laaduille suoritetaan seuraavat restriktioentsyymianalyysit. 0,5 yg kutakin plasmidi-DNA: ta katkaistaan peräkkäisesti Kpnl:llä (Biolabs), Ncol:llä (Biolabs) ja EcoRI:llä (Biolabs) entsyyminvalmistajan ohjeiden mukaan. Katkaisutuotteen fraktioidaan 1 % isissä aga-x ' roosigeeleissä liuökseässa,; jossa on 40 mM trisrasetaattia (pH 7,8) , 1 mM EDTA ja 0,5 yg/ml etidiumbromidia. Kaikissa plasmi- 63 94773 deissa on yksi kutakin näistä katkaisukohdista. Yksi plas-midi nimetään HRi148:ksi.
Plasmidi HRi148 sisältää tryptofäänin promoottori-operaattorin ja ribosominsitoutumiskohdan ATG:hen asti se mukaanluettuna. Hirudiinin geeni ja myös muita heterolo-gisia geenejä voidaan liittää tämän plasmidin EcoRI-kohtaan, Ncol-kohtaan tai Kpnl-kohtaan, joita on läsnä vain yksi kutakin. Lisäksi tämä rakenne mahdollistaa heterologisen geenin suoran liittämisen ja ilmentymisen ilman, että vastaavassa geenissä itsessään on läsnä luennan aloitukselle tarpeellista ATG-kodonia. Tämä voidaan helposti suorittaa katkaisemalla Ncolsllä ja täyttämällä ulkonevat päät DNA polymeraasi Iillä edellä kuvatulla tavalla tai katkaisemalla Kpnlillä ja poistamalla ulkonevat päät nukleaasilla . Näin plasmidi HRi148 on ilmen-tämisplasmidi, jolla on laaja käyttöalue.
D. Linearisoidun vektorin pHRil48/EcoRI/BamHI aikaansaaminen 5 yg plasmidi-DNA:ta pHRi148 katkaistaan restriktio-endonukleaaseilla EcoRI ja BamHI. Katkaistu vektori-pHRil48/EcoRI/BamHI eristetään tiheysgradienttisentrifu-goinnilla.
b). F^-DNA/EcoRI/EcoRII:n ja F2-DNA/BamHI/EcoRIE;n aikaansaaminen I. F^-DNA/EcoRI/EcoRII:n aikaansaaminen 5 yg pML300:n plasmidi-DNA:ta katkaistaan ensin 1 tunti 37°C:ssa 10 yksiköllä EcoRI-restriktioendonukleaa-sia 50 yl:ssa liuosta, jossa on 100 mM tris.HCl (pH 7,5), 50 mM NaCl ja 100 yg/ml liivatetta. Erä (0,5 yg) tätä linearisoitua plasmidi-DNA/EcoRI:tä eristetään geelieluu-tiolla agaroosigeelistä (ks. esimerkki 10a) ja leimataan radioaktiivisesti /γ-^Ρ/ΑΤΡ:llä (ks. esimerkki 12). Plasr •« midi-DNA/EcoRIsn pääosa sekoitetaan sen jälkeen tämän ra- 94773 64 dioaktiivisesti leimatun DNA:n kanssa, katkaistaan EcoRII-restriktioendonukleaasilla ja EcoRII-EcoRI*-DNA-frag-mentti (109 emäsparia) erotetaan geelielektroforeesilla 8 %:sessa polyakryyliamidissa. 200 yg F^-DNA/EcoRI*/ EcoRII:ta eristetään geelieluutiolla.
II) F2-DNA/BaftHI/EcoRII-fragmentin aikaansaaminen 5 yg pML305-plasmidi-DNA:ta katkaistaan 10 yksiköllä BamHI-restriktioendonukleaasia. Erä (0,5 yg) tätä lineari-soitua plasmidi-DNA/BamHI:tä eristetään geelieluutiolla agaroosigeelistä (ks. esimerkki 10a)) ja leimataan radio-aktiivisesti /γ-32Ρ/ΑΤΡ:llä (ks esimerkki 12). Plasmidi-DNA/BamHI :n pääosa sekoitetaan sen jälkeen tämän radioak-tiivisesti leimatun DNA:n kanssa, katkaistaan EcoRII-restriktioendonukleaasilla ja EcoRII-BamHI'-DNA-fragment-ti (122 emäsparia) erotetaan geelielektroforeesilla 8 %: sessa polyakryyliamidissa. 250 yg F2-DNA/BamHI*/EcoRII:ta eristetään.
c) F^-DNA:n ja F2~DNA:n yhteenliittäminen ja ilmentämis-plasmidin pML310 rakentaminen 10 ng ( = 473 nmol päitä) F^-DNA/EcoRI/EcoRII:ta ja • 9 ng (=496 nmol päitä) F2"DNA/BamHI/EcoRII:ta käsitel lään 20 yl:n tilavuudessa DNA-ligaasilla aiemmin kuvatulla tavalla (esimerkki 10c). Sitten seos uutetaan feno-li/kloroformilla ja DNA saostetaan alkoholilla. DNA-sakka liuotetaan esimerkissä 10c) kuvatulla tavalla ja katkaistaan restriktioendonukleaaseilla EcoRI ja BamHI.
• · 4 2‘: Sitten liuos standardisoidaan TNEsllä ja lisätään 30 ng (= 50 nmol päitä) vektori-DNAsta pHRil48/EcoRI/BamHI (ks. esimerkki 13aD). Sitten liuos uutetaan uudestaan fenoli/kloroformi11a ja DNA saostetaan alkoholilla. Saos-tettu DNA-seos käsitellään esimerkissä 10c) kuvatulla tavalla T4 DNA-ligaasilla (Biolabs). Tällä tavalla saadaan liuos, joka sisältää yhdistelmäplasmidin, jossa on 65 · 94773 liitännäisenä F^j-F^DNA (desulfatohirudiinigeeni) .
d) E. coli HB101:n transformointi plasmidilla pML310
Kalsiumilla käsiteltyjen E. coli HB101-solujen transformointi suoritetaan esimerkissä 10d) kuvatulla tavalla. Käytetään 10 yl esimerkissä 13c) saatua reaktio-seosta. Näin saadaan 420 ampisilliinille vastustuskykyistä pesäkettä.
e) F1-F2“DNA:n sisältävien pesäkkeiden seulonta 18 transformoituneesta pesäkkeestä (esimerkki 13d) tutkitaan esimerkin 10e) mukaisella tavalla, sisältävätkö ne F^-F2_DNA:n. Radioaktiivisena koettimena käytetään esimerkeissä 5 ja 6 kuvattua oligodeoksinukleotidiseosta. Autoradiogrammin perusteella saadaan 12 positiivista pesäkettä, :joista viisi nimetään seuraavasti: pML310, pML311, pML312, pML313 ja pML314.
Esimerkki 14: Kloonin pML310 karakterisointi
Yhdistelmäplasmidin pML310 sisältämä F^-F2~DNA-sekvenssi karakterisoidaan määrittämällä F1~F2-DNA:n sekvenssi Maxamin ja Gilbertin menetelmällä (supra), *' kuten esimerkissä 12 on kuvattu. 10 tg plasmidi-DNA:ta tutkitaan. F^-F2~DNA:n nukleotidisekvenssi on identtinen synteettiselle desulfatohirudiinigeenille mainitun sekvenssin kanssa.
Esimerkki 15: Desulfatohirudiini HVl:n ilmentäminen hii- *: vassa
Kemiallisesti syntetisoitua hirudiinigeeniä lisätään eli amplifioidaan 206 emäsparin EcoRI-BamHI-liitännäisenä plasmidissa pML310 (ks. esimerkki 14). Geeni leikataan irti plasmidista ja ilmennetään hiivassa pois päältä kyt-*· kettävissä olevan PH05-promoottorin ohjauksessa. Rakenne 66 94773 sisältää 541 emäsparin PH05-pranoottoriseäcwenssin ja täydellisen PH05-signaalisekvenssin (51 nukleotidia, jotka koodit-tavat 17 aminohappoa), kuten eurooppalaisessa patenttihakemus julkaisussa no. 143 081 on selostettu. Tämä sekvenssi liitetään lukuvaiheistukseen kypsää hirudiinia koodittavan sekvenssin kanssa, joka sekvenssi alkaa valiinin kodonilla, joka on luontaisen kypsän hirudiinin Nl^-pään aminohappo. Hirudiinigeenin jatkona on 3'-päässä DNA-fragmentti, joka antaa PH05:n transkriptionlopetus-signaalit. Ilmentämisplasmidin vektoriosa sisältää hiivan 2y-sekvenssit, hiivan LEU2-geenin hiivassa tapahtuvaa valintaa varten ja ampisilliiniresistenssigeenin sekä E. colin replikoitumisen aloituskohdan E. colissa tapahtuvaa valintaa ja lisäämistä eli amplifiointia varten.
Nämä toimenpiteet on selostettu kuvissa 5, 6 ja 7.
Desulfatohiiudiinigeenin 5' -pään nukleotidi sekvenssin säätäminen
Desulfatohirudiinia koodittava nukleotidisekvenssi alkaa GTT:llä, joka vastaa Nl^-pään valiinia lopullisessa geenituotteessa. Jotta E. colissa tapahtuva alakloonaus ja ilmentäminen olisi helpompaa, on koodittavan sekvenssin 5'-päähän lisätty kahdeksan nukleotidia, jotka sisältävät
EcoRI-katkaisukohdan ja ATG-aloituskodonin. Jotta hiru- *.!! diinia koodittava geeni saataisiin tarkalleen liitetyksi PH05-signaalipeptidiä koodittavaan sekvenssiin, pitää nämä lisänukleotidisekvenssit poistaa. Tämä saadaan aikaan muut- tamalla EcoRI-katkaisukohta tasapäiseksi ja lisäämällä synteettinen oligonukleotidi, joka sisältää Hgal:n tunnis- tuskohdan sellaisessa kohdassa, että Hgal:llä suoritettu :: katkaisu tapahtuu välittömästi ennen GTT-kodonia tämän • · · ylävirrassa.
Hgal-katkaisukohdan tuominen desulfatohirudiinigeenin eteen (ks. kuva 5) .. 8 ug plasmidia pML310 (ks. esimerkki 13c) katkaistaan 67 9 4 7 7 3 täysin restriktioendonukleaasilla EcoRI·. Suoritetaan uutto fenoli/kloroformilla ja DNA (pML310/EcoRI) saoste-taan etanolilla. 5'-pään ulostyöntyvät päät poisteaan S^-nukleaasilla. 4 yg pML310/EcoRI-DNA:ta pilkotaan 100 yl:ssa liuosta/ jossa on 250 mM NaCl/ 1 mM ZnSO^, 30 mM natriumasetaattia pH 4/6 ja 20 yksikköä/ml S^-nukleaasia (Sigma), reaktioajan ollessa 45 minuuttia 37°C:ssa.
Suoritetaan uutto fenoli/kloroformilla ja DNA seostetaan etanolilla. DNA (pML310/EcoRI/S^) uudelleensus-pendoidaan 100 yl:aan 50 mMTris>.HCl-liuosta (pH 8/0) ja inkuboidaan 1 tunti 37°C:ssa 2 yksikön kanssa vasikan suolen emäsfosfataasia (CIAP, Boehringer). Entsyymi inaktivoidaan kuumentamalla 1,5 tuntia 65°C:ssa.
Inkubointiseoksen NaCl-konsen-traatioksi säädetään 150 mM. Defosforyloitu DNA (pML310/EcoRI/S.j /CIAP) puhdistetaan adsorboimalla DE52-ioninvaihtopylvääseen (Whatman) matalasuolaisessa puskurissa (150 mM NaCl/ 10 mM Tris.HCl pH 8/0/ 1 mM EDTA) ja sen jälkeen eluoidaan kor-keasuolaisella puskuriliuoksella (1/5 M NaCl, 10 mM Tris.
HC1 pH 8,0/ 1 mM EDTA). DNA saostetaan etanolilla ja uu-delleensuspendoidaan veteen niin, että pitoisuudeksi tulee 0/8 mg/ml.
Oligonukleotidi/ jonka kaava on %* 5'-AGCGTCGACGCT-3 * syntetisoidaan fosfotriesterimenetelmällä (Itakura et ai., J. Am. Chem. Soc. 103, 706 (1981)). Oligonukleotidisekvens-si on itsekomplementaarinen ja sisältää restriktioendonuk-leaasin Hgal tunnistuskohdan -GACGC-. Kun kaksi yksisäi- « ♦♦ keistä ketjua emäspariutetaan, saadaan.12 emäsparia sisäl tävä DNA-kytkijä.
1,2 g synteettistä yksisäikeistä oligodeoksinukleo-tidia fosforyloidaan 30 minuuttia 37°C:ssa 10 \l:ssa liuosta, jossa on 60 mM Tris.HCl pH 7,5, 10 mM MgCl^# 5 mM DTT, 30 yCi fi -^P/ATP:tä (3000 Ci.mmol Amersham) ja • ^ 6 yksikköä T^-polynukleotidikinaasia (Boehringer), ja tä- - 94773 68 män jälkeen inkuboidaan vielä 15 minuuttia 37°C:ssa niin, että läsnä on 0,5 mM ATP:tä. Sitten seosta inkuboidaan 10 minuuttia 75°C:ssa entsyymin inaktivoimiseksi, jonka jälkeen sen annetaan jäähtyä huoneenlämpötilaan emäspa-riutumisen tapahtumiseksi.
0,6 yg (170 pmol) ^Prllä leimattua kytkijä-DNA:ta sekoitetaan 2,4 yg:aan (1,75 pmol päitä) pML310/EcoRI/S^/ CIAPrtä ja liitetään yhteen 20 yl:ssa liuosta, jossa on 60 mM Tris.HCl pH 7,5, 10 mM MgCl2, 5 mM DTT, 3,5 mM ATP ja 800 yksikköä DNA-ligaasia (Biolabs), reaktioajan ollessa 20 tuntia 15°C:ssa. Ligaasi inaktivoidaan kuumentamalla 10 minuuttia 85°C:ssa ja ylimääräiset kytkijämole-kyylit poistetaan saostamalla DNA siten, että läsnä on 10 mM EDTA:ta pH 7,5, 300 mM natriumasetaattia pH 6,0 ja 0,54 tilavuutta isopropanolia. Kun seosta on pidetty 30 minuuttia huoneenlämpötilassa, DNA pelletoidaan ja uudelleensuspendoidaan 45 yIraan yhteenliittämisseosta (määritelty yllä) ja liitetään yhteen 6 tuntia 15°C:ssa, jotta saadaan rengasmainen DNA.
1 ylsn erä ja 3 ylrn erä yhteenliittämisseosta lisätään 100 ylraan kalsiumilla käsiteltyjä, transformoin-tikelpoisia E. coli HB101-soluja (valmistettu menetelmällä D. Hanahan, J. Biol. Chem. 1_66, 557 (1983)). Solut jätetään jään päälle 30 minuutiksi ja sen jälkeen inkuboidaan 3 minuuttia 42°C:ssa, jäähdytetään jäällä 2 minuuttia ja seuraavaksi inkuboidaan 1 tunti 37°C:ssa 400 ylrssa SOC-alustaa. Kunkin näytteen solut konsentroidaan 100 ylrksi ja viljellään LB-agarmaljoissa, joissa on 50 yg/ml ampi-silliiniä.
12 transformoitunutta amp -pesäkettä viljellään eriksi seen LB-alustassa, joka sisältää 100 yg/ml ampisilliiniä.
Plasmidi-DNA valmistetaan menetelmällä D.S. Holmes et ai., Anal. Biochem. 114, 193 (1981). Synteettisen oligonukleo-tidikytkijän läsnäolo varmistetaan DNA-sekvenssinmäärityk-sellä käyttämällä alukkeena.yksisäikeistä DNA-fragmenttia, joka hybridisoituu hirudiinia koodittavan säikeen kanssa.
;* Yksi klooni, joka sisältää kytkijä-DläArn oikeassa asemassa 69 · 94773 ennen hirudiinigeeniä, nimetään pML310L:ksi.
Esimerkki 16: PH05-signaalisekvenssin ja desulfatohiru- diinin rakennegeenin liittäminen yhteen a) 0,2 ke:n desulfatohirudiinifragmentin eristäminen (kuva 5) 12 yg plasmidia pML310L katkaistaan täysin restrik-tioendonukleaaseilla BamHl ja Pvul. Suoritetaan uutto fe-noli/kloroformilla ja DNA seostetaan etanolilla ja kyseiset kaksi restriktiofragmenttia erotetaan 1,2 %:sessa agaroosigeelissä tris-boraatti-EDTA-puskuris-sa pH 8,3. Etidiumbromidilla värjätty 0,84 ke:n PvuI-BamHI-fragmentti eristetään geelisiivusta. DNA elektro-eluoidaan dialyysipussissa, joka on täytetty 3 ml:11a 0,2 x TBE-puskuria. Suljettu pussi upotetaan TBE-pusku-riin pH 8,3 (90 mM Tris-emästä, 90 mM boorihappoa, 2,5 mM EDTA). Kun on pidetty yllä 100 mA:n virtaa 30 minuuttia, virran polaarisuus käännetään 45 sekunniksi, jotta DNA saadaan irroitetuksi dialyysikalvosta. Dialyysi-pussissa oleva, geelisiivua ympäröivä puskuri otetaan talteen, sen NaCl-pitoisuudeksi säädetään 150 mM ja se lasketaan DE52-ioninvaihtopylvään läpi (Whatman).
DNA eluoidaan korkeasuolapuskurilla (1,5 M NaCl, 10 mM Tris.HCl pH 8,0, 1 mM EDTA), saostetaan etanolilla ja uudelleenliuotetaan veteen niin, että pitoisuudeksi tulee 0,1 mg/ml.
0,84 ke:n PvuI-BamHI-fragmentti, joka on saatu pML310L:stä, katkaistaan vielä restriktioendonukleaasilla Hgal. Tämä katkaisu saa aikaan 198 emäsparin Hgal-BatttHI-fragmentin, joka sisältää kypsän desulfatohirudiinin täydellisen koodittavan sekvenssin. Lisäkatkaisu Alul:llä ei kajoa 198 emäsparin Hgal-BamHI-fragmenttiin, mutta eliminoi toisen, samaa kokoa olevan Hgal-fragmentin.
0,2 ke:n Hgal-BamHI-fragmentti erotetaan muista . fragmenteista 1,5 %:sessa agaroosigeelissä 70 94773 TBE-rpuskurissa ja talteenotto suoritetaan elektroeluu-tiolla (kuten edellä on kuvattu). DNA puhdistetaan DE52-ioninvaihtokromatografiällä ja etanolisaostuksella. DNA uudelleensuspendoidaan veteen niin, että pitoisuudeksi tulee 30 yg/ml (0,2 pmol/yl).
b) PH05-promoottoriosan eristäminen, joka sisältää osan PH05-signaalisekvenssistä (kuva 6).
Plasmidi p31/PH05-TPA18 (ks. eurooppalainen patenttihakemus julkaisu no. 143 081) sisältää PHO5-promoottorin ja PH05-signaalisekvenssin liitettyinä lukuvaiheis-tuksessa vieraaseen rakennegeeniin (t-PA). 584 emäsparin
BamHI-Ball-fragmentti sisältää PH05-promoottorin ja koko PH05-signaalisekvenssin lukuunottamatta 3'-pään kahdeksaa nukleotidia.
8 yg p31/PH05-TPA18-DNA:ta katkaistaan restriktio-endonukleaasilla Ball (16 tuntia 37°C:ssa). DNA puhdistetaan fenoli/kloroformiuutolla ja etanolisaostuksella.
DNA uudelleensuspendoidaan veteen niin, että pitoisuudeksi tulee 0,7 mg/ml.
PH05-signaalisekvenssin ja desulfatohirudiinia koodattavan alueen välille saadaan aikaan oikea liitos synteettisellä kytkijällä, jonka kaava on seuraava: :: (1) 5 · -CCAATGCA-3 ' (2) 3'-GGTTACGTCAACA-5'
Kahdeksan nukleotidia kytkijän 5'-päässä (51-CCAATGCA) edustavat PH05 signaalisekvenssin osaa, joka ulottuu Ball-kohdasta prosessointikohtaan. Oligonukleo-. tidin (2) viisi yli menevää 5'-nukleotidia sopivat desul- fatohirudiinia koodattavan sekvenssin 5'-pään Hgal-katkai-sukohtaan.
Yksittäiset yksisäikeiset oligonukleotidit (1) ja (2) syntetisoidaan fosfotriesterimenetelmällä (Itakura et ai, supra). 1,1 yg oligonukleotidia (1) ja 1,8 yg . oligonukleotidia (2) fosforyloidaan erikseen 5'-päistään, il Hi ; rillit i i i iti 71 94773 sekoitetaan keskenään ekvimolaarisina määrinä ja emäs-pariutetaan esimerkissä 15 kuvatulla tavalla.
1,3 yg (200 pmol) fosforyloitua, kaksisäikeistä kyt-kijä-DNA:ta liitetään 7 yg:aan (1,8 pmol) Ball:llä katkaistua p31/PH05-TPA18:ta 40 yl:ssa liuosta, jossa on 60 mM Tris.HCl pH 7,5, 10 mM MgCl2, 3,5 mM ATP, 5 mM DTT ja 1400 yksikköä DNA-ligaasia (Biolabs), reaktio-ajan ollessa 16 tuntia 15°C:ssa. Ligaasi inaktivoidaan kuumentamalla 10 minuuttia 85°C:ssa. Kytkijäylimäärä poistetaan saostamalla DNA siten, että läsnä on 10 mM EDTA, 300 mM natriumasetaattia pH 6,0 ja 0,54 tilavuutta isopropanolia. DNA uudelleensuspendoidaan ja katkaistaan vielä restriktioendonukleaasilla BamHI. Suoritetaan uutto fenoli/kloroformilla, DNA saostetaan etanolilla ja kyseiset kaksi restriktiofragmenttia erotetaan 1,2 %: sessa agaroosigeelissä. joka on tehty tris-boraatti-EDTA-puskuriin pH 8,3. 0,6 ke:n fragmentti eristetään geelistä. DNA elektroeluoidaan ja jatkopuhdistetaan DE52-ioninvaihto-kromatografiällä ja etanolisaostuksella. 0,6 ke:n BamHi-Hgal-DNA-fragmentti uudelleensuspendoidaan veteen niin, että pitoisuudeksi tulee 40 yg/ml.
c) pJDB207-hiivavektorifragmentin eristäminen (kuva 6) ·· 9 yg plasmidia pJDB207R/PHO5-TPA( 12-2) (ks. euroop palainen patenttihakemusjulkaisu no. 143 081) katkaistaan restriktioendonukleaasilla BamHI. Kun katkaisu on suoritettu täydellisesti, suoritetaan fenoliuutto ja DNA saostetaan etanolilla. DNA uudelleensuspendoidaan 50 mM Tris.HCl-liuokseen pH 8,0 pitoisuuteen 0,1 mg/ml ja pii- ·. kotaan 7 yksiköllä vasikan sisäelinten emäsfosfataasia 1 tunti 37°C:ssa. Fosfataasi inaktivoidaan kuumentamalla 1,5 tuntia 65°C:ssa ja DNA puhdistetaan DE52-ioninvaihto-kromatografiällä (ks. esimerkki 15) ja etanolisaostuksella.
6,8 ke:n suuri BamHI-fragmentti erotetaan 1,2 %:sessa agaroosigeelissä tris-boraatti-EDTA-puskurissa pH 8,3. DNA elektroeluoidaan ja puhdistetaan DE52- 72 94773 ioninvaihtokromatografiällä ja etanolisaostuksella. DNA liuotetaan veteen niin, että pitoisuudeksi tulee 0,4 mg/ml (0,1 pmol/yl).
d) PH05-promoottorifragmentin ja desulfatohirudiinin ra-kennegeenin liittäminen pJDB207-hiivavektorifragmenttiin (kuva 6) pJDB207-hiivavektori, PH05-promoottorifragmentti, jossa on PH05-signaalisekvenssi, ja desulfatohirudiinin rakennegeeni eristetään kaikki DNA-fragmentteina (ks. esimerkki 16 a - c) ja liitetään yhteen niin, että muodostuu ilmentämisplasmidi.
0,3 pmol 0,6 ke:n BamHI-Hgal-fragmenttia, joka on saatu p31/PH05-TPAl8:ta, ja 0,3 pmol 0,2 ke:n Hgal-BamHI-fragmenttia, joka on saatu pML310L:stä, liitetään 0,1 pmol:iin 6,8 ke:n BamHI-fragmenttia, joka on saatu pJDB207R/PHO5-TPA(12-2):sta, 10 yl:ssa liuosta, jossa on 60 mM Tris.HCl pH 7,5, 10 mM MgCl2, 5 mM DTT, 1 mM ATP ja 400 yksikköä DNA-ligaasia, reaktioajan ollessa 20 tuntia 15°C:ssa.
1 yl:n erä yhteenliittämisseosta lisätään 100 yl:aan transformointikelpoisia E. coli HB101-soluja, jotka on valmistettu Hanahan:in menetelmällä (supra). Transfor- ·· mointimenetelmä on tuon julkaisun mukainen. Soluja vil- «· jellään LB-agar-maljoissa, joissa on 50 yg/ml ampisillii-nia.
24 amp -pesäkettä kasvatetaan erikseen LB-alustassa, jossa on 100 yg/ml ampisilliinia. Plasmidi-DNA analysoidaan liitännäisen koon ja suunnan suhteen katkaisemalla : , restriktioendonukleaasilla Pstl. Yksi klooni, jossa liitän- « .
näinen on oikeassa suunnassa, nimetään pJDB207/PHO5-HIR:ksi.
Esimerkki 17: Saccharomyces cerevisiae-kannan GRF18 transformointi
Plasmidi pJDB207/PHO5-HIR tuodaan Saccharomyces ce- t * revisiae-kantaan GRF18 (a, his3-11, his3-15, leu2-3, leu2- V3 94773 p 112, can ) käyttämällä Hinnen et al:n (supra) transfor-mointimenetelmää. 5 yg plasmidi-DNA:ta lisätään 100 yl: aan sferoplastisuspensiota ja saatu seos käsitellään po-lyetyleeniglykolilla. Sferoplastit sekoitetaan 10 ml: aan regenerointiagaria ja levitetään hiivan minimialus-taa sisältäviin maljoihin, joissa ei ole leusiinia.
Poimitaan yksi transformoitunut hiivapesäke ja sitä kasvatetaan hiivan minimialustassa, joka ei sisällä leusiinia. Pesäke nimetään seuraavasti:
Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB207/PHO5-HIR
Esimerkki 18: S. cerevisiae GRF18/pJDB207/PHO5-HIR-kannan viljely S. cerevisiae GRF18/pJDB207/PH05-HIR-soluja viljellään sekoittaen 20 ml:ssa hiivan minimialustaa (Difco Yeast Nitrogen Base-alusta ilman aminohappoja ja sisältäen 2 % glukoosia ja 20 ml/1 L-histidiiniä) 30°C:ssa, kunnes solu- 7 tiheys on 3 x 10 solua/ml. Solut pestään 0,9 %:sessa NaCl-liuoksessa ja sen jälkeen niillä ympätään 50 ml:n viljelmät, joissa käytetään matala-P^-minimialustaa. Matala-P^-minimialusta valmistetaan vastaamaan Difcon Yeast Nitrogen Base-alustaa (ilman aminohappoja) siten, että se sisältää 0,03 g/1 KHjPO^, 1 g/1 KC1 ja 10 g/1 L-asparagiinia (NH^^SO^n tilalla, 2 % glukoosia ja 1 g/1 L-histidiiniä. Viljelmät ympätään solutiheyteen korkeintaan 4 x 106 solua/ml ja viljelmiä sekoitetaan 30°C:ssa korkeintaan 42 tuntia nopeudella 200 kierr./min.
Esimerkki 19: Desulfatohirudiiniyhdisteiden eristäminen S. cerevisiae GRF18/pJDB207/PHO5-HlR:stä « . · · a) Desulfatohirudiiniyhdisteiden eristäminen kasvualustasta A. Hirudiiniyhdisteiden rikastaminen RP-C18-pylvääseen 18, 26 ja 42 tunnin fermentointiajan jälkeen ote-1 taan kulloinkin kymmenen 10 ml:n näytettä kasvualustasta 74 94773 ja näytteet rikastetaan proteiinien suhteen suorittamalla suolanpoisto ja väkevöimällä Bond Elut C-18-pylväässä (1 ml, Analytical International). Kun näytteet on tuotu pylvääseen ja neste on poistettu vakuumissa, pylväs pestään kahdesti 1,5 ml:11a liuosta, jossa on vesi-asetonitriili-seosta (9:1) ja 0,1 %:sta trifluorietikkahappoa, joiden kahden viimeksimainitun seossuhde on 9:1. Hirudiiniyhdis-teet eluoidaan vesi-asetonitriili-0,1 % etikkahapolla (6:4).
2 ml eluaattia väkevöidään Speed Vac-konsentraattorissa (Savant) lopulliseen tilavuuteen 400 μΐ. Hirudiiniyhdis-teet tunnistetaan HPLC-analyysillä vertaamalla aitoon desulfatohirudiiniin sekä trombiini-inhibointimenetelmällä. Näytteet sisältävät noin 0,2-2 yg/ml hirudiiniyhdisteitä.
B. Ioninvaihtokromotografia DEAE-selluloosapylväässä 1 1 kasvualustaa otetaan talteen 42 tunnin fermen-taatioajan kuluttua ja sentrifugoidaan. Emäliuos sijoitetaan DE53-selluloosa-anioninvaihtopylvääseen (Whatman) pH 7,5 (olosuhteet: pylväs 2,5 x 15,5 cm (76 ml); eluoin- tipuskuri A: 20 mM ammoniumasetaatti, 100 mM NaCl, pH 7,5; eluointipuskuri B: 20 mM ammoniumasetaatti, 4 M NaCl pH 5,0; virtaus 66 ml/h). Pylväs pestään 228 ml:11a puskuria A ja sen jälkeen eluoidaan lineaarisella suolagradientilla käyttämällä puskureita A ja B 228 ml kutakin. Kerätään 22 ml:n jakeet. Hirudiiniyhdisteet eluoituvat jakeissa 71 - 74 (88 ml) ja ne tunnistetaan trombiini-inhibointi-määrityksellä. Aktiivisia jakeita dialysoidaan yön yli 4°C:ssa 20 mM ammoniumasetaattia vastaan. Sen jälkeen erät lyofilisoidaan kahdesti. Lyofilisaatit sisältävät . desulfatohirudiiniyhdisteitä käänteisfaasi-HPLV:n perus- « teella määritettynä.
C. Geelisuodatus Sephadex G-50-pylväässä ja lopullinen puhdistus HPLC:llä Pääjae (80 ml eluaattia), joka on aktiivinen trom- 75 94773 biini-inhibointikokeessa, dialysoidaan (4°C, yön yli) 20 mM ammoniumasetaattia pH 7,5 vasten ja sen jälkeen väkevöidään kiertohaihduttimella 35 C:ssa 5 ml:n lopulliseen tilavuuteen.
Saatu kirkas vesiliuos sijoitetaan Sephadex G-50 fine-pylvääseen (Pharmacia) pakatun kolonnin tilavuuden ollessa 160 ml ja pylväs (2,5 x 64 cm, Biorad) tasapainotetaan 5 %:sella etikkahapolla. Pääaktiivisuus, joka sisältyy 50 ml:aan eluaattia (jakeet 5-7, virtaus 50 ml/h, 25 min/jae), väkevöidään kiertohaihduttimessa ja sen jälkeen sille suoritetaan käänteisfaasi-HPLC-erotus. Erillisten jakeiden erät (500 yl) väkevöidään 1:10 käyttämällä "speed vac"-konsentraattoria (Savant) ja niistä tutkitaan desulfatohirudiiniyhdisteet käänteisfaasi-HPLC-analyysillä. Liuokset sisältävät desulfatohirudiiniyhdisteitä. Jae 6 (18 ml) sisältää pienimmän prosentuaalisen osuuden sekundäärisiä ainesosia ja se jatkopuhdistetaan puoliprepa-ratiivisella käänteisfaasi-HPLCsllä.
Koeolosuhteet: Vydac 218 TP 510 RP-HPLC-pylväs, 10 x 250 mm; jakeen 6 erät G00 yl väkevöitynä 1:10) per erotus; AUFS 0,5 220 nm:ssä; virtausnopeus 2 ml/min.
Eluentti: A: 0,1 % trifluorietikkahappo; B: asetonit- riili/vesi 8:2 + 0,07 % trifluorietikkahappoa,1 min 16 % B:tä, jonka jälkeen lisätään 40 minuutin kuluessa 64 %: *.! iin B:tä. Saadut jakeet laimennetaan suhteessa 1:1 vedellä ja lyofilisoidaan. Jäännös koostuu puhtaista desulfatohirudiiniyhdisteistä.
b) Desulfatohirudiiniyhdisteiden eristäminen S. cerevi-siae GRF18/pJDB207/PH05-HIR-solu-uutteesta i
Solut hajotetaan tavalliseen tapaan (ks. eurooppalainen patenttihakemusjulkaisu no. 100 561). Emäliuos, joka on käsitelty 2 %:sella etikkahapolla, sentrifugoidaan (12 000 kierr./min, 10°C). Lisätään ammoniakkia niin, että lopulliseksi pH:ksi tulee 7,5 ja hieman samea liuos (50 ml) jatkokäsitellään edellä kuvatulla· tavalla (ks. esimerk- 76 94773 ki 19a). Hirudiiniyhdisteet tunnistetaan edellä kuvatulla tavalla, so. trombiinin inhibointikokeella ja käänteis-faasi-HPLC:llä.
Esimerkki 20: S. cerevisiae GRF18/pJDB207/PHO5-HIR- kantaa fermentoimalla saadun tuoteseoksen analyysi a) 2 ml:n erätedellä valmistettua (ks. esimerkki 19b) emäliuosta kuivataan "Speed Vac"-konsentraattorissa suur-tyhjössä. Näytteet liuotetaan erikseen 100 yl:aan vettä ja niille suoritetaan HPLC-analyysi (koe-olosuhteet no. 1, ks. jäljempänä). Erillisten jakeiden aikaansaama trombiinin inhibitio tutkitaan. Jakeet, joiden retentioajat ovat 16,5 min ja 17,7 min, saavat aikaan trombiinin inhiboitu-misen. Näiden kahden jakeen suhde (ilmentymissaanto) on noin 4:1. Aminohappokoostumuksen perusteella nämä jakeet edustavat desulfatohirudiinia.
b) Esimerkissä 19a kuvatulla tavalla saaduille jakeille, jotka osoittautuivat aktiivisiksi trombiinin inhi-bointikokeessa, suoritetaan HPLC-analyysi kahta eri tilannetta edustavissa koeolosuhteissa.
Koeolosuhteet no. 1: Nucleosil (MN) C18, 5 ym RP- HPLC-pylväs, 4,6 x 120 mm; 50 yl hirudiiniyhdisteitä per , erotus, att. 6 214 nm:ssä; virtausnopeus 1,2 ml/min; eluentti: A: 0,1 % trifluorietikkahappo, B: asetonitriili/ vesi 8:2 sisältäen 0,08 % trifluorietikkahappoa, 2 minuuttia 16 % B:tä ja sen jälkeen nosto 50 minuutissa 64 %:iin B:tä. Vastapaine 66 bar.
, Koeolosuhteet no. 2: Kuten edellä, mutta gradient- tina 2 minuuttia 20 % B:tä ja sen jälkeen nosto 40 mi-nuuttissa 80 %:iin B:tä.
Jakeet otetaan 1 minuutin välein (kaikkiaan 45) ja niille suoritetaan trombiinin inhibointikoe. Jakeet 17 -19 osoittautuivat aktiivisiksi. Lisäksi jakeiden 17 ja 77 94773 18 sisältämien aktiivisten hirudiiniyhdisteiden aminohappokoostumus/ N-pää ja N-pään sekvenssi määritetään. Yhtä jaetta (no. 17) verrataan lisäksi aitoon desulfatohirudii-niin, joka saadaan saattamalla verijuotikkaan luontainen hirudiini reagoimaan aryylisulfataasientsyymin kanssa.
Saadut tulokset on esitetty taulukossa 1:
Taulukko 1: _~------------- _ ,__, . Trombiinin
Fetentioaika Fetentioaika inhiboitxira-
Jae (min) (min) nen
Olosuhteet n:o 1 olosuhteet n:o 2__(%)
Jae 17 16.5 13.7 96
Jae 18 17.7 14.7 86
Jae 19 18. 7 ” aitö desul- 16. 5 13.6 86.
fatohirudii- ni_________
Jakeiden 17 ja 18 saantojen suhde on jälleen noin 4:1.
c) 200 ml:n erät emäliuosta valmistetaan edellä kuvatulla tavalla (ks. esimerkki 19a) ja niille suoritetaan HPLC-analyysi (olosuhteet no. 3, ks. jäljempänä) ja FPLC-'·” erotus (olosuhteet no. 4) . Yksittäisten jakeiden kyky in hiboida trombiinia tutkitaan. Jakeet/ joiden retentio-ajat ovat 8,9 min (piikki 1), 11,1 min (piikki 2) ja 12,1 min (piikki 3), inhiboivat trombiinia voimakkaasti. Näiden kolmen yhdisteen suhde (ilmentymissaantojen) on noin 1:4:1. HPLC-analyysin mukaan ovat huippuja 2 ja 3 vas-ί taavat yhdisteet identtisiä esimerkissä 20b) kuvattujen hirudiiniyhdisteiden (jakeet 17 ja 18) kanssa vastaavasti. Tulosten yhteenveto on esitetty.taulukossa 2: i 78 9 4 7 7 3
Taulukko 2:
Retentioaika Fetentioaika Retentioaika (c) NaCl Jae (min) (min) (min) olosuhteet olosuhteet n:o 1 olosuhteet n:o 2 olosuhteet n:o 3 n:o 4
Säkki 1 14.0 11.6 8.0 365 mM
Säkki 2 16.5 13.7 11.1 340 mM
(jae 17)
Säkki 3 17.7 14.7 12.1 360 mM
(jae 18)
Koeolosuhteet no. 3: Vydac 218 TP-B5 RP-HPLC-pylväs, 4,0 x 120 mm, 15 ug hirudiiniyhdistettä per erotus, att.
7 214 nm:ssä, virtausnopeus 1,2 ml/min; eluentti A: 0,1 % trifluorietikkahappo, B: asetonitriili, joka sisältää 0,08 % trifluorietikkahappoa, 2 minuuttia 16 % B:tä ja sen jälkeen nosto 20 minuutissa 40 %:iin B:tä; vastapaine 80 bar.
Koeolosuhteet no. 4: Pharmacia Mono Q FPLC-anionin- vaihtopylväs, 5,0 x 50 mm, 15 yg hirudiiniyhdistettä per • erotus, AUFS 0,01 280 nm:ssä, virtausnopeus 1,0 ml/min; eluointipuskurigradientti; puskuri A: 20 mM Tris.HCl pH 7,5; puskuri B: puskuri A sisältäen 1 M NaCl pH 7,5, 9 minuuttia 15 %:tä ja sen jälkeen nosto 21 minuutissa 70 %:iin B: tä.
Esimerkki 21: S. cerevisiae GRF 18/pJDB207/PHO5-HIR-kan- nan fermentoinnissa saatujen desulfatohirudiiniyhdisteiden karakterisointi HPLC-analyysin mukaan ovat kasvualustasta eristetyt jakeiden 17 (tai piikki 2) ja 18 (piikki 3) (ks. esimerkki .· 20, taulukot 1 ja 2) hirudiiniyhdisteet ovat identtisiä solu- 75 94773 uutteista eristettyjen yhdisteiden kanssa (solunsisäiset hirudii-niyhdisteet). Näillä yhdisteillä sekä piikin 1 (ks. taulukko 2) yhdisteellä on seuraavat tunnusmerkilliset ominaisuudet: a. Aminohappokoostumuksen määrittäminen
Noin 2,5 ug puhdasta hirudiiniyhdistettä hydrolysoidaan 24 tuntia 6 N suolahapolla 110oC:ssa ja sen jälkeen analysoidaan menetelmällä Chang et ai., DABS-Cl-method, Methods in Enzymology 9J[, 41 (1983). Hydrolysaatin koostumus on seuraava:
Piikki 1 (ks. taulukko 2)
Aminohappo Hydrolysaatti Aminohappo Hydrolysaatti
Asp 9.2 (9) Ile 2.1 (2)
Thr 4.1 (4) Leu 3.3 (3)
Ser 4.0 (4) Tyr 1.9 (2)
Glu 12.4 (12) Phe 1.2 (1)
Pro 3.1 (3) His 1.0 (1)
Gly 9.0 (9) Lys 3.1 (3)
Vai 3.4 (4) Met 0 (0) kystiini 2.5 (3) kaikkiaan (63) 8° 94773
Piikki 2 (jae 17, ks. taulukot 1 ja 2)
Aminohappo Hydrolysaatti Aminohappo Hydrolysaatti
Asp 9.9 (9) Ile 2.1 (2)
Thr 4.0 (4) Leu 4.4 (4)
Ser 3.9 (4) Tyr 1.2 (2)
Glu 12.8 (13) Phe 1.2 (1)
Pro 3.1 (3) »is 1.2 (M
Gly 9Λ (9) Lys 2.9 (3)
Vai 27 (4) Het O (0) kystiini (3) kaikkiaan (65)
Piikki 3 (jae 18, ks. taulukot 1 ja 2)
Aminohappo Hydrolysaatti Aminohappo Hydrolysaatti
Asp 10.0 (9) Ile 1.9 (2)
Thr 3.9 (4) Leu 3.3 (4)
Ser 4.1 (4) Tyr 1.8 (2)
Glu 12.5 (12) Phe 1.1 (1)
Pro 3.1 (3) His 1.0 (1)
Gly 8.7 O) 2.8 (3)
Vai 3‘l (4) Met 0 (0) kystiini 2.4 (3) kaikkiaan (64) b. Osittainen sekvenssianalyysi 18 Vg:lle puhdasta hirudiiniyhdistettä suoritetaan tavanomainen sekvenssianalyysi Edmanin menetelmällä ja N-:· pään fenyylitiohydantoiiniaminohapot (PTH) määritetään RP-HPLC-menetelmällä. Saadut tulokset olivat seuraavat: il m t UiMi I t t fr» ei 94773
Piikki 2 (jae 17, ks. taulukot 1 ja 2)
Sykli t 5
Aminohappo vai Vai Tyr Thr Asp n.d. Thr Glu Ser Gly Sykli 11 '5
Aminohappo G In Asn Leu n.d. Leu n.d. Glu Gly Ser
Sykli 20 25
AminohappoAsn Vai n.d. Gly n.d. Gly Asn Lys n.d.
Sykli 29 35
Aminohappo Ile Leu Gly Ser Asp Gly Glu Lys Asn
Sykli 38 40 45
Aninohappo n. d. n.d. Vai Thr Gly Glu Gly Thr Pro Lys 48 50
Pro n.d. Ser h.d.
(n.d. = ei määritetty) ·. Piikki 1 (ks. taulukko 2)
Sekvenssi syklistä 1 sykliin 29 sama kuin yllä.
Piikki 3 (jae 18, ks. taulukot 1 ja 2)
Sekvenssi syklistä 1 sykliin 27 sama kuin yllä.
. , Tutkittujen biosynteettisten hirudiiniyhdisteiden ’· N-pään sekvenssit ovat näin ollen identtiset aidon hiru- diinin N-pään sekvenssin kanssa.
C. C-pään analyysi
Hirudiiniyhdisteet pilkotaan karboksipeptidaasi Y:llä 82 . 9 4 7 7 3 ja vapautuneet aminohapot määritetään aminohappoanaly-saattorilla (ks. J.Y. Chang, R. Knedel, D.G. Braun, Bio-chem. J. 199, 547). saadut tulokset olivat seuraavat:
Piikki 1 (ks. taulukko 2) C-pään aminohapot: -Glu-Tyr
Piikki 2 (jae 17, ks. taulukot 1 ja 2) C-pään aminohapot: -Glu-Tyr-Leu-Gln
Piikki 3 (jae 18, ks. taulukot 1 ja 2) C-pään aminohapot: -Glu-Tyr-Leu d. Näennäiset molekyylipainot
Desulfatohirudiiniyhdisteet (30 ug) analysoidaan SDS-urea-geelissä (SUDS gel? ks. Kyte et ai., Anal. Biochem. 133, 515 (1983)). Ennen värjäystä Coomassie-sinisellä suoritetaan kiinnitys 12 %:sella trifluorietikkahapolla. Havaitaan yksi nyöhyke, joka vastaa näennäistä molekyyli-painoa 6000 - 7000 daltonia.
e. Molekyylipainon määritys FAB-MS:llä
Desulfatohirudiiniyhdisteille suoritetaan nopea-atomipommi tus positiivisella ionimassaspektrometrialla (engl. fast atom bombardment positive ion mass spectrometry; FAB-MS) . Laite: ZAB-HF-massaspektrometri, VG-Analytical Ltd.,
Manchester; matriisi: tioglyseroli; ksenonpommitus; ioni-energia 10 KeV; ulkoinen kalibrointi: Cs26J25 (ro°lekyyli” paino 6887,9) ja Cs28J27 (7147,76). Saadut tulokset olivat seuraavat:
Piikki 1 (ks. taulukko 2) i empirinen kaava C276H421N77°107S6 molekyylipaino (laskettu): 6722,23 molekyylipaino (mitattu): 6719,3
Piikki 2 (jae 17, ks. taulukot 1 ja 2) empirinen kaava C287H440N80°110S6 molekyylipaino (laskettu): 6963,5ί8 molekyylipaino (mitattu): 6963,44 83 9 4 7 7 3
Molekyylipaino on saatu kahden eri mittauksen keskiarvona .
Piikki 3 (jae 18, ks. taulukot 1 ja 2) empirinen kaava: C282H432N78°108S6 molekyylipaino (laskettu): 6835,39 molekyylipaino (mitattu): 6832,9
Esitettyjen tulosten perusteella piikin 1 yhdiste on desulfatohirudiini (1-63), piikin 2 yhdiste on identtinen aidon desulfatohirudiinin (1-65) kanssa ja piikin 3 yhdiste on uusi desulfatohirudiini (1-64).
f. Ihmisen trombiinin ja hirudiinin kompleksin dissosiaa-tiovakio
Ihmisen trombiinin ja desulfatohirudiinin muodostamien kompleksien dissosiaatiovakiot KD määritettiin menetelmällä S.R. Stone ja J. Hofsteenge, Biochemistry 25, 4622 - 4628 (1986), ja ne on esitetty yhteenvetona seuraa-vassa taulukossa. Taulukossa en myös saaduille kolmelle desulfatohirudiinilaadulle saadut ominaisaktiivisuudet (yksiköinä ATU/mg ilmaistuina engl. anti-trenbin unit).
·1 Kd/M/ cminaisaktiivi- suus (ATO/mg) hiivan desulfatohirudiini (1-65) 2,9 x 10 13 11000 hiivan desulfatohirudiini (1-64) 3,9 x 10 9600 hiivan desulfatohirudiini (1-63) 3,0 x 10 ^ 8900 « g) Transformoituneesta hiivasta saatuja muita desulfato- hirudiiniyhdisteitä
Desulfatohirudiiniyhdisteseos, joka on saatu fermen-toimalla ja puhdistamalla esimerkissä 19 kuvatulla tavalla, erotetaan tarkemmin osiinsa ja karakterisoidaan yksityiskohtaisesti.
94773 84
Puolipreparatiivinen valmistus Vydac 218 TP 510 RP-HPLC-pylväässä antaa edellä kuvattujen desulfatohiru-diiniyhdisteiden {ks. esimerkki 21e) lisäksi desulfato-hirudiininkaltaisia yhdisteitä, jotka eluoituvat pylväästä retentioajalla 8,1 minuuttia.
Tämä materiaali karakterisoidaan nopea-atomipommitus-massaspektrometrialla (FAB-MS), aminohappoanalyysillä, osittaisella sekvenssinmäärityksellä ja C-pään analyysillä.
FAB-MS osoittaa, että materiaali on kahden yhdisteen seos, joiden molekyylipainot ovat 6429,5 ja 6556,8 vastaavasti .
Aminohappokoostumus on seuraava:
Aminohappo Hydrolysaatti Aminohappo Hydrolysaatti Asx 8.9 (9) Ile 2.1 (2)
Thr 3.7 (4) Leu 3.6 (3)
Ser 4.1 (4) Tyr 0.9 (1)
Glx 10.7 (11) Phe 1.1 (1)
Pro 3.2 (3) His 1.2 (1)
Gly 9.7 (9) Lys 3.2 (3)
Vai 3.3 (4) Met O (O) kystiini 33 (33 kaikkiaan (51)
Osittainen sekvenssianalyysi • Sykli 123
Aminohappo Vai Vai Tyr C-pään analyysi (ks. esimerkki 21c) 59 60 61 62 C-pään aminohapot; -Ile-Pro-Glu-(Glu) « Näiden tietojen pohjalta tämä seos koostuu desulfato-hirudiinista (1-61) ja desulfatohirudiinista (1-62).
Esimerkki 22; Desulfatohirudiiniyhdisteiden ilmentäminen hiivassa, jossa on desulfatohirudiinigeeni on ilman signaali-i* sekvenssiä (kuva 7) .
il m 1 uh f f t st - * 85 9 4 7 7 3 a) pJDB207-vektorifragmentin eristäminen 6 yg plasmidia pJDB207R/IF(a-3) (eurooppalainen patenttijulkaisu no. 100 561) katkaistaan täydellisesti restriktioendonukleaasilla BamHI. Saadut DNA-fragmentit (6,85 ke ja 1,15 ke) saostetaan etanolilla ja sekoitetaan 400 yl:aan 50 mM Tris.HCl-liuosta pH 8,0. Lisätään 4,5 yksikköä vasikan suolen fosfataasia (Boeh- ringer). Seosta inkuboidaan 1 tunti 37°C:ssa ja sen jälkeen fosfataasi inaktivoidaan kuumentamalla 1,5 tuntia 65°C:ssa. Liuoksen pitoisuudeksi säädetään 150 mM NaCl ja se sijoitetaan DE52-anioninvaihtopylvääseen (Whatman) (tilavuus 100 ui), joka on sitä ennen tasapainotettu liuoksella, jossa on 10 mM tris.HCl pH 7,5, 150 mM NaCl ja 1 mM EDTA. Kun on suoritettu pesu samalla puskurilla, DNA eluoidaan 400 yl:lla puskuria, jossa on 1,5 M NaCl, 10 mM tris.HCl pH 7,5 ja 1 mM EDTA, ja saostetaan etanolilla. Suuri 6,85 ke:n BamHI-fragmentti erotetaan pienestä fragmentista 1,2 %:sessa agaroosigeelissä tris-boraatti-EDTA-puskurissa pH 8,3.
b) 534 emäsparin PH05-promoottorifragmentin eristäminen 6 yg plasmidia p31/R (eurooppalainen patenttijulkaisu no. 100 561) katkaistaan restriktioendonukleaaseilla * EcoRI ja BamHI. Saadut 3 DNA-fragmenttia erotetaan 1,2 %:sessa agaroosigeelissä tris-boraatti-EDTA-puskurissa pH 8,3. 534 emäsparin BamHI-EcoRI-frag- mentti eristetään. Se sisältää PHO-promoottorin trans-kriptionaloituskohdat mukaanlukien.
c) Desulfatohirudiinia koodittavan 206 emäsparin DNA-fragmentin eristäminen 9 yg plasmidia pML310 (ks. esimerkki 13c) katkaistaan täysin restriktioentsyymeillä BamHI ja EcoRI. Syntyneet kaksi DNA-fragmenttia erotetaan 1,2 %:sessa agroosigee-lissä tris-boraatti-EDTA-puskurissa pH 8,3.
86 94773 206 emäsparin EcoRI-BamHI-fragmentti eristetään.
d) DNA-fragmenttien yhteenliittäminen
Kohdissa a - c (ks. edellä) mainitut kolme DNA-fragmenttia otetaan agaroosigeelipaloista elektroeluu-tiolla, puhdistetaan DE52-anioninvaihtimissa (Whatman), säestetään etanolilla ja uudelleensuspendoidaan veteen.
0,1 pmol (0,45 yg) 6,85 ke:n BamHI-vektorifragmenttia, 0,3 pmol (0,1 yg) 534 emäsparin BamHI-EcoRI PH05-promoot-torifragmenttia ja 0,25 pmol (34 ng) pML310:n 206 emäsparin EcoRI-BamHI-fragmenttia liitetään yhteen 15 yl:ssa liuosta, jossa on 60 mM tris.HCl, pH 7,5, 10 mM MgCl2* 10 raM DTT ja 1 mM ATP, käyttämällä 600 yksikköä Ί*4 DNA-ligaasia (Biolabs) reaktioajan ollessa 16 tuntia 15°C:ssa.
J) 24 transformoitunutta amp -pesäkettä viljellään erikseen LB-alustassa, joka sisältää 100 yg/ml ampisilliinia. Plasmidi-DNA eristetään Holmes et alin menetelmällä (supra) ja analysoidaan suorittamalla Hindlll-EcoRI-kaksoiskatkai-su. Noin 600 emäsparin suuruisen EcoRI-Hindlll-fragmentin löytyminen osoittaa, että klooni sisältää PH05-promoottori-hirudiini-DNA-fragmentin oikeassa suunnassa vektorissa olevien transkriptionlopetussignaalien suhteen. Kuten odotettua, noin 50 %:ssa klooneista on liitännäinen oikeassa . suunnassa. Yksi näistä klooneista nimetään pJDB207R/PHO5- HIRtksi.
e) Saccharomyces Qerevisiae GRF18:n transformointi:
Saccharomyces cerevisiae^kanta GRF 18(a,his3-11, his3-; 15, leu2-3, leu2-112, can ) transformoidaan plasmidiiia pJDB207R/PHO5-HIR noudattamalla Hinnen et al;n menetelmää (supra). Transformoituneiden hiivasolujen valinta suoritetaan agarmaljoissa, joissa on hiivan minimialustaa ilman leusiinia. Yksi transformoitunut hiivapesäke eristetään ja nimetään Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB207R/ PH05-HIR:ksi.
% 87 94773 f) S. cerevisiae GRF18/pJDB207R/PHO5-HIR:n viljely: S. cerevisiae GRF18/pJDB207R/PHO5-HIR-soluja sekoitetaan 20 mlissa hiivan minimialustaa (Difco Yeast Nitrogen Base, ilman aminohappoja ja sisältäen 2 % glukoosia ja 20 mg/1 L-histidiiniä) 30°C:ssa ja kasvatusta jatketaan 7 solutiheyteen 3 x 10 solua/ml. Solut pestään 0,9 %:sessa NaCl:ssä ja sen jälkeen niillä ympätään 50 ml:n viljelmät, jotka kasvatetaan matala-P^-minimialustassa. Matala-P^-minimialusta valmistetaan vastaamaan Difco:n Yeast Nitrogen Base-alustaa (ilman aminohappoja), mutta sisältäen 0,03 g/1 KH2P04, 1 g/1 KC1, (NH4)2S04:n tilalla 10 g/1 L-asparagiinia, 2 % glukoosia ja 1 g/1 L-histidiiniä. Viljelmät ympätään solutiheyteen = 4x10^ solua/ml ja sekoitetaan 30°C:ssa 42 tuntia nopeudella 200 kierr./min.
g) S.cerevisiae GRF18/pJDB207R/PHO5-HIR:n fermentoinnissa syntyneen tuoteseoksen analyysi
Solut (ks. esimerkki 22f) hajotetaan tavalliseen tapaan (ks. esimerkiksi eurooppalainen patenttihakemusjulkaisu no. 100 561). 1,5 %:sella etikkahapolla käsitelty emäliuos sentrifugoidaan ja kirkas liuos kuivataan 2 ml:n erissä "Speed Vac"-konsentraattorissa suurtyhjössä. Näytteet liuotetaan erikseen 100 yl:aan vettä ja niille • suoritetaan HPLC-analyysi (samat olosuhteet kuin esimer kissä 20). Jakeiden kyky inhiboida trombiinia tutkitaan. Jakeessa, jonka retentioaika on 16,5 minuuttia, on trombiinia inhiboivaa aktiivisuutta. Aminohappokoostumuksen perusteella tämä jae sisältää desulfatohirudiinia.
HPLC-analyysin perusteella on tiitteri noin 10 yg/1 vil- * · · : jelmää. Kasvualustasta ei löydy hirudiiniaktiivisuutta.
Taulukossa 3 on esitetty yhteenveto intrasellulaa-risen ja ekstrasellulaarisen hirudiiniaktiivisuuden saannoista hiivakannoilla, joissa on desulfatohirudiinigeeni ilman signaalisekvenssiä tai signaalisekvenssin kanssa.
... Hirudiiniaktiivisuus on mitattu trombiinin inhibointimää- rityksellä.
94773
Taulukko 3 S. cerevisiae PH05 signaali hirudiiniaktiivisuus (yg/i) GRF18/plasmidi sekvenssi kasvualusta solu-uute kaikkiaan FJDB207/ + 6 x 103 <1 x 103 η . 103
PH05-HIR
pJDB207R/ - ei havaittavissa 10 10
FHQ5-HIR
Esimerkki 23: Deleetioiden aikaansaaminen PH05-promootto- riin a) Bal31-hajotus PH05-promoottorin (ks. eurooppalainen patenttihakemus-julkaisu no. 143 081) lähteenä käytetään kuvassa 8 esitettyä yhdistelmäfaagia M13mp9/PH05 Bam-Sal, joka sisältää · PH05:n BamHI-Sall-fragraentin.
20 ug £aagi-DNA:ta (RF = replikoituva muoto) katkaistaan restriktioendonukleaasilla Sali, jolloin saadaan lineaarinen , noin 9 ke:n DNA. Suoritetaan fenoli/kloroformiuut-to ja DNA saostetaan etanolilla. DNA uudelleensuspendoi-daan 10 mM tris-liuokseen pH 8,0 pitoisuuteen 0,5 pg/ml.
:* 16 jjg Sall:llä katkaistua DNA:ta pilkotaan 2 yksiköllä
Bal31-eksonukleaasia (BRL) 100 ulissa liuosta, jossa on 20 mM Tris pH 8,0, 199 mM NaCl, 12 mM MgCl^, 12 mM CaC^ ja 1 mM EDTA. 2 )jg:n erä DNA:ta otetaan reaktioseoksesta 1, 2, 3, 4, 5 ja 6 minuutin inkubointiajan kuluttua inku-bointilämpötilan ollessa 30°C ja kuhunkin otetuista näytteistä sekoitetaan välittömästi 50 μΐ fenolia ja 60 ui au , a.·.. . . . _ 89 94773 TNE-liuosta. Kun on uutettu fenoli/kloroformilla ja saostettu etanolilla, DNA uudelleensuspendoidaan 10 mM Tris-liuokseen pH 8,0 pitoisuuteen 100 yg/ml. Jotta saadaan analysoiduksi kussakin vaiheessa edennyt eksonukleo-lyyttinen Bal31-pilkkoutuminen, 0,5 yg kussakin vaiheessa syntynyttä DNA:ta katkaistaan endonukleaasilla BamHI ja analysoidaan 1,5 %:sessa agaroosigeelissä Tris-boraatti-puskurissa pH 8,3 (90 mM Tris.HCl, pH 8,3, 90 mM boorihappo, 2,5 mM EDTA). Fragmentin kummastakin päästä poistuu keskimäärän 100 emäsparia minuutissa Bal31-pilkkomisen kuluessa.
b) EcoRI-kytkijoiden lisääminen Bal31:llä käsiteltyyn DNA:han
Kaksi Ä2gQ-yksikköä EcoRI-kytkijöitä (5'-GGAATTCC-3*, BRL) uudelleensuspendoidaan 250 yl:aan liuosta, jossa on 10 mM Tris pH 8 ja 1 mM EDTA. 2 yg EcoRI-kytkijöitä kina-soidaan 75 yl:ssa liuosta, jossa on 60 mM Tris pH 7,5, 10 mM MgCl2, 15 mM DTT, 10 yM ATP ja 33 yksikköä T4 poly-nukleotidikinaasia (Boehringer). Kun on inkuboitu 1 tunti 37°C:ssa, seoksen annetaan jäähtyä huoneenlämpötilaan ja sen jälkeen varastoidaan -20°C:ssa.
Emäspariutetut, kaksisäikeiset EcoRI-kytkijät liite-· tään tasaisten päidensä välityksellä DNA-fragmentteihin, jotka on käsitelty Bal31:llä. 0,5 yg Bal31:llä käsiteltyä DNA:ta (ks. esimerkki 23a) inkuboidaan 16 tuntia huoneenlämpötilassa 50-kertaisen ylimäärän kanssa kinasoituja EcoRI-kytkijöitä 20 yl:ssa liuosta, jossa on 60 mM Tris pH 7,5, 10 mM MgCl2/ 10 mM DTT, 4 mM ATP ja 600 yksikköä T4 DNA-*: ligaasia (Biolabs). Kun T4 DNA-ligaasi on inaktivoitu (10 minuuttia 65°C:ssa), ylimääräiset EcoRI-kytkijät katkaistaan 50 yksiköllä EcoRIstä (Boehringer) 50 yl:n tilavuudessa. Suoritetaan fenoli/kloroformiuutto, DNA saoste-taan etanolilla ja uudelleensuspendoidaan liuokseen, jossa on 10 mM Tris ja 1 mM EDTA (=TE). Sitten DNA katkaistaan • i , 5 yksiköllä BamHI:tä (Biolabs) ja saatu seos sijoitetaan * 90 9 4 7 7 3 1,5 %:seen matalalla sulavaan agaroosigeeliin (Sigma), joka on tehty Tris-boraatti-puskuriin (ks. edellä).
Vyöhykkeet värjätään etidiumbromidilla ja tehdään näkyviksi pitkäaaltoisella UV-valolla 366 nm. Leveät diffuusit vyöhykkeet, jotka ovat välillä noin 100 emä qparia - 600 emäsparia, leikataan irti geelistä ja DNA uutetaan seuraavalla tavalla: Agaroosipala nesteytetään 65°C:ssa, pitoisuudeksi säädetään 500 mM NaCl ja inkuboidaan 20 minuuttia 65°C:ssa. Lisätään 1 tilavuus fenolia (tasapainotettu liuoksella, jossa on 10 mM Tris.HCl pH 7,5, 1 mM EDTA ja 500 mM NaCl). Vesifaasi uutetaan uudestaan kahdesti fenolilla ja kerran kloroformilla. DNA seostetaan 2,5 tilavuudella kylmää absoluuttista etanolia ja otetaan talteen sentrifugoimalla. DNA-pelletti pestään kylmällä 80 %:sella etanolilla ja kuivataan sen jälkeen vakuumissa. DNA uudelleensuspendoidaan 10 yl:aan TE-liuos-ta.
c) Liittäminen M13mp9:ään 3 yg M13mp9:n RF-muotoa katkaistaan 15 yksiköllä EcoRI:tä (Biolabs) ja 15 yksiköllä BamHI:tä (Boehringer) 50 yl:n tilavuudessa. Fenoliuuton ja etanolisaostuksen jälkeen DNA uudelleensuspendoidaan 50 yl:aan TE-liuosta.
5 yl leikattua vektori-DNA:ta (noin 200 ng) ja 10 yl edellä saatua näytettä (kukin näyte edustaa DNA-fargment-tia, joka on saatu jossakin esimerkissä 23b) kuvatuista eri Bal31-hajotuksista) ja suoritetaan yhteenliittäminen 20 μΐ:n kokonaistilavuudessa niin, että läsnä on 60 mM Tris.HCl pH 7,5, 6 mM MgCl2, 10 mM DTT, 1 mM ATP ja " 200 yksikköä T4 DNA-ligaasia, reaktioajan ollessa 15 tuntia. Transduktiokelpoisten E. coli JM101-solujen transduktio suoritetaan käsikirjan "M13 cloning and sequencing system" mukaan, julkaisija New England Biolabs. Joukosta valkoisia plakkeja saatuja faageja kasvatetaan ja niiden sisältämien DNA-liitännäisten koko analysoidaan ·· katkaisemalla restriktioentsyymeillä EcoRI ja BamHI.
i« «.Iti I,. « ilt . .
91 94773 d) Bal31-deleetion päättymispisteiden määrittäminen Sangerin sekventointimenetelmällä (deleetiot Sali-kohdasta lähtien)
Sekventointi suoritetaan käyttämällä Sanger et ai:n (Proc. Natl. Acad. Sei USA 74, 5463 (1977)) dideoksisek-ventointisysteemiä edellä mainitussa käsikirjassa kuvatulla tavalla. Deleetioiden päättymispisteet on esitetty seuraavassa taulukossa: klooni PH05-sekvenssin viimeisen nukleotidin asema (ks. kuva 8) A -502 B -471 C -422 D -400 E -392 P -369 G -350 H -328 1 -300 K -283 L -255 M -226 N -211 0 -187 p -111 Q - 88 Γ » - 57 s - 33 e) Bal31-deleetion päättymispisteiden määrittäminen Sangerin sekventointimenetelmällä (deleetiot BamHI- 92 94773 kohdasta)
Suoritetaan samanlainen Bal31-deleetioiden sarja kuin kohdissa a - c on selostettu, mutta nyt M13mp9 PH05 Bam-Sal katkaistaan BamHI:llä. Bal31:llä pilkotut molekyylit katkaistaan EcoRI:llä ja Sall:llä ja syntyneet fragmentit kloonataan EcoRl:llä ja Sällillä katkaistuun H13mp9:ään. Deleetioiden päättymispisteet on esitetty seuraavassa taulukossa: klooni PH05-sekvenssin viimeisen nukleotidin asema (ks. kuva 8) A· -24 B' “35 C* “41 D’ -48 E* -74 F · -89 G' -93 H* -97 I· -124 E' —162 L. -174 M' -262 N' “277 0t -306 p. -332 Q* ~346 :: R. -361 si -382
Ti -393 f) Sisäisten deleetioiden aikaansaaminen PH05-promootto-riin 93 94773
Kohdassa d) kuvattu Bal31-deleetiosarja tuottaa "vasemman käsivarren" PH05-promoottorifragmentin, joka päättyy EcoRI-kohtaan ja kodassa d) kuvattu Bal31-delee-tiosarja tuottaa "oikean käsivarren" PH05-promoottori-fragmentin, joka päättyy EcoRI-kohtaan. Kun "vasemmat käsivarret" ja "oikeat käsivarret" yhdistetään eri asemiin, saadaan aikaan sisäiset deleetiot, joissa on EcoRI-kytkijä poistetun DNA:n paikalla. Yksittäiset sisäiset deleetiot rakennetaan leikkaamalla "vasemmat; käsivarret" ja "oikeat käsivarret" M13mp9-johdannaisista restriktioendonukleaaseilla EcoRI ja BamHI (vasemmat käsivarret) ja. restriktioendonukleaaseilla EcoRI ja Sali (oikeat käsivarret) ja eristämällä vastaavat fragmentit pehmeäagargeelielektroforeesilla, kuten kohdassa b) on kuvattu. Ekvimolaariset määrät "vasempia käsivarsia", "oikeita käsivarsia" ja 200 ng BamHI:llä ja Sällillä katkaistua M13mp9-vektori-DNA:ta liitetään yhteen kohdassa c) kuvatulla tavalla. E. coli JM101:n trasnduktion jälkeen poimitaan valkoiset plakit, tuotetaan RF-muoto ja suoritetaan restriktioanalyysi (BamHI, Sali, EcoRI). Seuraavat käsivarret yhdistetään, jotta saadaan aikaan tietyt sisäiset deleetiot (nukleotidien numeroinnin osalta ks. kuvaa 8): » * • 'Vasen käsi- "oikea kä- deleetio nukleotidista poistuneiden nukleo- varsi" sivarsi" nukleotidiin tidien lukumäärä A Τ' Δ 7 -501 - -394 108 B Τ' Δ 8 -470 - -394 77 C Τ' Δ 9 -421 - -394 28 D S' Δ10 -399 - -383 17 V E R' Δ11 -391 - -362 30 F Q' Δ12 -368 - -347 22 G P1 Δ13 -349 - -333 17 »·« 94 94773 H °' Δ14 -327 . -307 21 1 N’ Δ19 -299 - -278 22 K Δ16 -282 - -263 20 L L' Δ17 -254 - -175 80 M L' Δ1β -225 - -175 51 " L’ Δ19 -210 - -175 36 ° L' Δ2° -186 - -175 12 ° K’ Δ21 -186 - -163 24 ° r Δ22 -186 - -125 62 0 H' Δ23 -186 --98 89 P H‘ Δ24 -no --98 13 P G* Δ25 -110 --94 17 P F' Δ26 -110 --90 21 ° E' Δ” - 87 -- 75 13 “ Δ2« -56--49 8 C Δ29 -56--42 15 ” B’ Δ3° -56- -36 21 - 32 -- 25 8 g) PH05-promoottorin sisäisten deleetioiden in vivo-ana-lyysi »
Esimerkissä 23f) kuvatut eri deleetiot kloonataan plasmidiin pJDB207/PHO5 (R. Haguenauer-Tsapis ja A. Hin- nen, Molecular and Cellular Biology, £, 2668 - 2675 (1984)) korvaamalla villityyppinen PH05 Bam-Sal-fragment- ti poistumaversiolla. S. cerevisiae AH216-hiivakannan .. transformoinnin (ks. eurooppalainen patenttihakemusjul- « 1 kaisu no. 143 081) jälkeen happofosfataasiaktiivisuus määritetään Toh-e et alin menetelmällä (J. Bacteriol.
113, 727 (1973)). Deleetiot Δ11 ja Δ12 osoittavat noin 10-kertaista PH05-aktiivisuuden vähenemistä ja määrittelevät ylävirran alueen ("ylävirran aktivointialue", engl.
** "upstream activation site", UAS), joka on oleellinen 94773 95 PH05:n ilmentymiselle. Samanlainen alentava vaikutus on havaittavissa deleetiollaÄ17 (noin 5-kertainen väheneminen) ja TATA-alueen deleetioilla Δ23 -Δ26 (noin 30-kertainen väheneminen). Kaikki muut deleetiot osoittavat suunnilleen normaalia eli villityyppistä tasoa edustavaa aktiivisuutta. Nämä tulokset viittaavat siihen, että PH05:n ilmentymisen kannalta kolme oleellista informaatioaluetta sijaitsee seuraavissa asemissa: 1. asemien -349 ja -383 välissä (UAS1) 2. asemien -225 ja -263 välissä (UAS2) 3. asemien - 87 ja -125 välissä (TATA-alue) DNA-fragmentit, jotka sisältävät PH05:n UAS1:n tai UAS2:n tai UAS1 + UAS2:n, voidaan saada yhdistelmäfaageista M13mp9/PH05 Bam-Sal (ks. edellä) suorittamalla katkaisut tarvittavilla restriktioendonukleaaseilla. UAS1 sisältyy 268 emäsparin BamHI-Clal-fragmenttiin, jonka kaava on seuraava: gatccgaaagttgtattcaacaagaatgcgcaaatatgtcaacgtatttggaagtcatctt ATGTGCGCTGCTTTAATGTTTTCTCATGTAAGCGGACGTCGTCTATAAACTTCAAACGAAG GTAAAAGGTTCATAGCGCTTTTTCTTTGTCTGCACAAAGAAATATATATTAAATTAGCACGT TTTCGCATAGAACGCAACTGCACAATGCCAAAAAAAGTAAAAGTGATTAAAAGAGTTAA TTGAATAGGCAATCTCTAAATGAAT, UAS2 sisältyy 100 emäsparin Clal-BstEII-fragmenttiin, • · jonka kaava on seuraava:
CGATACAACCTTGGCACTCACACGTGGGACTAGCACAGACTAAATTTATGATTCTGGTCCC TGTTTTCGAAGAG ATCGCACATGCCAAATTATCAAATTG
ja UAS1 sekä UAS2 sisältyvät yhdessä 368 emäsparin BamHI-BstEII-fragmenttiin, jonka kaava on seuraava: j > • a 96 94773
GATCCGAAAGTTGTATTCAACAAGAATGCGCAAATATGTCAACGTATTTGGAAGTCATCTT
ATGTGCGCTGCTTTAATGTTTTCTCATGTAAGCGGACGTCGTCTATAAACTTCAAACGAAGG
TAAAAGGTTCATAGCGCTTTTTCTTTGTCTGCACAAAGAAATATATATTAAATTAGCACGT
TTTCGCATAGAACGCAACTGCACAATGCCAAAAAAAGTAAAAGTGATTAAAAGAGTTAATT
GAATAGGCAATCTCTAAATGAATCGATACAACCTTGGCACTCACACGTGGGACTAGCACAG
ACTAAATTTATGATTCTGGTCCCTGTTTTCGAAGAGATCGCACATGCCAAATTATCAAATTG.
Esimerkki 24: Desulfatohirudiinin ilmentäminen yhdis tetyn PH05-GAPDH-yhdistelmäpromoottorin ohjauksessa
Esimerkin 23 perusteella ovat PH05-geenin aseman -365 /UAS1(PH05)/ ympärillä oleva alue ja aseman -180 /UAS2(PH05)/ ympärillä oleva alue mahdollisia kandidaatteja UAS-alueiksi, joilla on säätelyvaikutus. UAS1(PH05) sisältyy 268 emäsparin BamHI-Clal-fragmenttiin, kun taas UAS1(PH05) ja UAS2(PH05) sisältyvät kumpikin 368 emäsparin BamHI-BstEII-fragmenttiin. Näitä kaksi faagia liitetään yksilöllisesti kahteen eri GAPDH:n alavirran promoottori-elementtiin, jotka sisältävät GAPDHin TATA-alueen ja transkription aloituskohdat.
a) Hiivan geenikirjaston rakentaminen 30 yg molekyylipainoltaan suurta hiivan kokonais-DNA:ta (M.V. Olsen et ai., J. Mol. Biol. 132, 387 (1979)), joka on saatu normaalista eli villityyppisestä Saccha-·· romyces cerevisiae-kannasta S288C, inkuboidaan 30 mi nuuttia 37°C:ssa 2 yksikön kanssa EcoRI-metylaasia (New England Biolabs) 250 yl:ssa EcoRI-metylointipusku-ria valmistajan suositusten mukaan. DNA saostetaan etanolilla, uudelleensuspendoidaan 500 yl:aan liuosta, jossa on 25 mM Tris.HCl pH 8,5 ja 2 mM MgQ^ (EcoRI*-pus-kuri) (H. Meyer, FEBS Lett. 9£), 341 (1979)), ja pilkotaan EcoRI:llä (Boehringer), kunnes DNA-fragmenttien kokojakautuman maksimi on alueella 30 - 50 ke (λ DNA:n pilkkominen XhoI:llä antaa sopivat 33 ke:n ja 17 ke:n markkerit).
Hiivan DNA, joka on pilkottu EcoRI*-olosuhteissa, fraktioidaan koon mukaan sakkaroosigradientissa (5 - 20 % 5, sakkaroosia, liuoksessa, jossa on Id mM Tris.HCl pH 7,5 97 94773 . ja 1 mM EDTA) 6 tunnissa kierrosnopeudella 38 000 1/min SW 40-roottorissa. Gradientin huipusta kerätään kolmekymmentä 0,4 mlsn jaetta. Jae 16 sisältää kooltaan 30 -40 ke:n alueella olevat DNA-fragmentit. Tämän jakeen DNA (3 ug) saostetaan etanolilla ja sitä liitetään 16 tuntia 15°C:ssa 15 μ1:η kokonaistilavuudessa yhteen 1 yg:n kanssa kosmidivektoria pYd (B. Hohn et ai., teoksessa Genetic Engineering, Voi. 2, s. 169, New York, 1980), joka on linearisoitu EcoRIsllä. Yhteenliittäminen suoritetaan 300 yksiköllä T4 DNA-ligaasia (New England Biolabs) käyttämällä valmistajan esittämää puskurisysteemiä. DNA pakataan in vitro bakteriofaagiin λ (B. Hohn, Methods in Enxymology, Voi. 68, s. 299, New York, 1979) ja kootuilla faageilla suoritetaan E. coli-kannan HB101 (r^ , m^ , leu , pro , recA) transduktio. Transduktion tehokkuus on noin 5000 ampisilliinille vastustuskykyistä pesäkettä per yg τ> pYd-vektoria. Poimitaan 3000 amp -pesäkettä ja niitä kasvatetaan erikseen mikrotitrauslevyn koloissa LB-alustassa (10 g Bacto Tryptoneta (Difco), 5 g Bacto Yeast Extracts ia (Difco) ja 10 g NaCl), joka sisältää 100 yg/ml ampisillii-nia.
b) Hiivan GAPDH-geenin eristäminen
Edellä kuvattu geenikirjasto seulotaan synteettisellä oligonukleotidilla (valmistettu fosfotriesterimenetelmällä, K. Itakura et ai., J. Am Chem Soc. 9T_, 7327 (1975); J.F.M.
de Rooij et ai., Red. Trav. Chim. Pays-Bas 98, 537 (1979)), jonka rakenne on seuraava: 5'-GCTCCATCTTCCACCGCCCC-3'.
10 yg oligonukleotidia kinasoidaan käyttämällä 10 yl 32 : : γ- P-ATP:tä (3000 Ci/mmol, 10 yCi/μΙ Amersham) ja entsyy- «·· minä T4 polynukleotidikinaasia (Boehringer) 50 μ1:η kokonaistilavuudessa Maniatis et ai:n menetelmällä (Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Lab., 1982, s. 125). Pesäke-hybridisointi suoritetaan samassa käsikirjassa kuvatulla menetelmällä (s. 312). Positiiviset kloonit havaitaan au-: toradiografiällä käyttämällä Kodakin X-5-röntgenfilmiä.
98 94773
Kun erotetaan plasmidi-DNA, saadaan yhdistelmäklooni, joka sisältää GAPDH:ta koodittavan 2100 ep:n Hindlll-fragmentin (J.P. Holland et ai., J. Biol. Chem. 25.4, 9839 (1979)). Kloonatun DNA:n aitous osoitetaan lopullisesti DNA:n sek-ventoinnilla käyttämällä edellä mainittua oligonukleotidia dideoksisekventointimenetelmässä, jonka G.F. Hong (Bio-science Reports 1 , 243 (1981)) on esittänyt kaksisäikei-selle DNA:lie. Kloonatulla GAPDH-geenillä (ks. kuva 9) on sama sekvenssi kuin pgap491:llä (Holland et ai., J. Biol. Chem. 255, 2596 (1980)).
c) GAPDH:n alavirran promoottorielementtien valmistus (ks. kuva 10) 649 emäsparin Taq-fragmentti, joka sisältää nukleotidit -27 - -675 GAPDH-geenin ATG:stä lukien (ks. kuva 9), eristetään katkaisemalla edellä mainittu yhdistelmäplasmidi Taql:llä (New England Biolabs), erottamalla DNA-fragmentit 1,2 %: sessa pehmeäagaraosigeelissä ja suorittamalla uutto kuumalla fenolilla (ks. esimerkki 23). TaqI-fragmentti kloonataan pBR322:n Clal-kohtaan: 1 yg pBR322:ta katkaistaan 3 yksiköllä Clal:tä (New England Biolabs) valmistajan ohjeiden mukaan. 300 ng katkaistua ja fenyloitua vektoria liitetään yhteen noin 300 ng:n kanssa liitännäis-DNA:ta (649 ep:n Taq-fragmentti) käyttämällä 200 yksikköä T4 DNA-ligaasia 20 yl:n kokonaistilavuudessa (ks. esimerkki 23b).
E. coli HB101 transformoidaan ampisilliinille vastustuskykyiseksi, plasmidi-DNA valmistetaan ja analysoidaan rest-riktioanalyysillä (Taql, Dral). TaqI-fragmentin suunta todetaan käyttämällä restriktioendonukleaasia Dral yhdessä ; plasmidien BamHI-kohdan kanssa ja valitaan plasmidi, jossa • · on aseman -675 TaqI-kohta lähellä pBR322:n Hindlll-kohtaa. Tämä plasmidi, joka on nimetty pBR322/GAPDH:ksi, lineari-soidaan käyttämällä BamHI:tä (New England Biolabs) ja sen jälkeen suoritetaan pilkkominen Bal31:llä esimerkissä 23 kuvatulla tavalla paitsi, että käytetään Bglll-kytkijöi-. tä (5'-CAGATCTG-3', New England Biolabs) ja pilkottu plasmidi 99 94773 saatetaan välittömästi renkaan muotoon pitoisuudessa 5yg/ml 20 ylrn kokonaistilavuudessa. Bal31:llä lyhennetyn Taql-fragmentin koko määritetään restriktioanalyysillä (käyttämällä BglII:ta ja Hindlllra). Valitaan kaksi kloonia, joiden sisältämät DNA-fragmentit ulottuvat vastaavasti 200 ep:n ja 265 ep:n päähän pitkin GAPDH-promootto-ria ATG:stä ylävirtaan. Kumpikin fragmentti sisältää oletetun TATA-alueen noin -140 ep:n kohdalla. Nämä kloonit sisältävät edelleen DNA:n osassa, joka on johdettu pBR322: sta, replikoitumisenaloituskohdan ja kloonit nimetään vastaavasti pGAPDH-F:ksi ja pGAPDH-E:ksi.
d) GAPDH-promoottorin alavirran elementin yhdistäminen PH05:n UAS1(PH05)reen ja desulfatohirudiinin proteiinia koodittavaan alueeseen I) GAPDH-elementti
Jotta GAPDH-promoottorielementti saataisiin jatketuksi kohdassa -27 olevasta TaqI-asemasta välittömästi GAPDH-geeniä edeltävään ATG-kodoniin asti, syntetisoidaan kaksi komplementaarista oligonukleotidia, joiden rakenteet ovat seuraavat: 5' CGAATAAACACACATAAATAAAG 3' .
• < 3' TTATTTGTGTGTATTTATTTCTTAA 5' Nämä oligonukleotidit antavat aidon GAPDH-promoottorisek-venssin asemasta -26 asemaan -5 ja samalla syntyy päähän EcoRI-kohta. 2 yg kutakin esimerkissä 24c Bal31: llä pilkkomisen tuotteena saatua plasmidia (plasmidit » ·« pGAPDH-E ja -F) katkaistaan 6 yksiköllä läqlrtä 50 ylrssa ja saatu seos fenoloidaan, suoritetaan etanolisaostus ja DNA uudelleensuspendoidaan 10 ylraan vettä. Synteettiset oligonukleotidit emäspariutetaan sekoittamalla 2 yl kutakin yksisäikeistä oligonukleotidia keskenään 100 ylrssa liuos-. ta, joka sisältää 10 mM Tris.HCl pH 7,5, 10 mM MgC^ ja 100 94773 50 mM NaCl/ kuumennetaan 3 minuuttia 90°C:ssa ja liuos jäähdytetään huoneenlämpötilaan (3 tunnin kuluessa). 1 yg kutakin Taql:llä katkaistua plasmidia ja noin 20-kertajs-ta ylimäärää emäspariutettuja oligonukleotideja sekoitetaan keskenään 20 μ1:η tilavuudessa käyttämällä yhteen-liittämiseen 800 yksikköä T4 DNA-ligaasia reaktioajan ollessa noin 18 tuntia. Koko seos pilkotaan 3 yksiköllä Bglllsta (New England Biolabs) ja DNA-fragmentit erotetaan 1,5 %:sessa pehmeäagaroosigeelissä. Bglll-EcoRl-fragmentit, joiden koko on vastaavasti noin 200 emäsparia ja 265 emäs-paria, leikataan irti geelistä, suoritetaan uutto ja eta-nolisaostus.
Plasmidi pGAPDH-E katkaistaan BglII:lla ja EcoRI:llä ja suuri fragmentti (noin 3,5 ke) eristetään. Tätä fragmenttia käytetään vektorina, johon kloonataan 265 ep:n ja 200 ep:n Bglll-EcoRI-fragmentti vastaavasti käyttämällä edellä kuvattuja yhteenliittämis-, transformointi- ja plasmidineristysolosuhteita. Näin saadut plasmidit nimetään pGAPDH-EL:ksi ja pGAPDH-FL:ksi. Plasmideihin pGAPDH-EL ja pGAPDH-FL kloonattujen Bglll-EcoRI-fragment-tien DNA-sekvenssit on esitetty kuvassa 11. Fragmenttien tarkat koot ovat 266 ep ja 201 ep vastaavasti.
II) UAS1(PH05)-säätelyelementti 3 yg plasmidia p31/Y (ks. eurooppalainen patenttihakemus julkaisu no. 100 561) katkaistaan 6 yksiköllä Clal:tä (New England Biolabs). Sisentyneet 31-päät täytetään käyttämällä E. coli DNA-polymeraasi I:n Klenow-fragmenttia (Bethesda Research Laboratories) Maniatis:in (supra) mukaan. Bglll-kytkijät (5'-CAGATCTG-3 ') lisätään esimerkissä 23 kuvatulla tavalla. DNA katkaistaan Sällillä ja Bglllilla (New England Biolabs) ja ajetaan 1 %:sessa pehmeäagaroosigeelissä. 548 ep:n fragmentti leikataan irti geelistä ja suoritetaan fenolointi ja etanolisaostus edellä kuvatulla tavalla.
Λ ,01 94773
III) Desulfatohirudiinia koodittava DNA
Plasmidin pJDB207/PHO5(Eco)-HIR (ks. kuva 12) rakentaminen. Jotta UAS(PH05)-GAPDH-yhdistelmäpromoottoriele-mentit olisi helppo liittää PH05-signaalisekvenssin sisältävään desulfatohirudiinia koodittavaan alueeseen (kuten plasmidissa pJDB207/PHO5-HIR), sijoitetaan EcoRI-katkaisu-kohta 5'-pään luetuksi tulemattomaan alueeseen mRNA:n alkukohdan ja koodittavan alueen ATG:n väliin.
15 yg plasmidia pJDB207/PH05-HIR (ks. esimerkki 16d) katkaistaan restriktioendonukleaasilla Dral (Boehringer). Saadut 4 fragmenttia erotetaan 0,8 %:sessa agaroosigeelis-sä tris-boraatti-EDTA-puskurissa pH 8,3. 4,2 kein DNA-fragmentti otetaan talteen geelistä, elektroelu-oidaan ja saostetaan etanolilla. DNA uudelleensuspendoi-daan veteen pitoisuuteen 0,6 mg/ml.
Kaksi synteettistä oligonukleotidia, joiden kaavat ovat 5'- AATTCGATTACCAATGTTT -3' 3 *- GCTAATGGTTACAAA -5' (2,3 yg ja 2,9 yg vastaavasti) kinasoidaan erikseen 20 yl: ssa liuosta, jossa on 60 mM Tris pH 7,5, 10 mM MgCl2r 5 mM ·’ DTT, 0,5 mM ATP ja 20 yksikköä T4 polynukleotidikinaasia (Boehringer). Kun on inkuboitu 45 minuuttia 37°C:ssa nämä kaksi reaktioseosta yhdistetään, saatua seosta kuumennetaan 10 minuuttia 75°C:ssa ja annetaan jäähtyä huoneenlämpötilaan. Emäspariutettua kytkijäoligonukleotidia säilytetään -20°C;ssa.
i.i 6,5 yg (2,3 pmol) 4,2 ke:n Dral-DNA-fragmenttia inku- boidaan 16 tuntia 15°C:ssa 70-kertaisen ylimäärän kanssa kinasoitua ja emäspariutettua kytkijäoligonukleotidia 50 Pl:ssa liuosta, jossa on 60 mM Tris.HCl pH 7,5, 10 mg MgCl2» 5 mM DTT, 3,5 mM ATP ja 800 yksikköä T4 DNA-ligaa-sia (Biolabs). T4 DNA-ligaasi inaktivoidaan kuumentamalla J, 10 minuuttia 85°C:ssa ja sen jälkeen kytkijäylimäärä pois- 102 94773 tetaan seostamalla DNA siten, että läsnä on 10 mM EDTA, 300 mM natriumasetaattia pH 6,0 ja 0,54 tilavuutta isopropanolia. DNA katkaistaan EcoRI:llä ja HindIII:lla.
Saadut fragmentit erotetaan 1 %:sessa agaroosigeelissä Tris-boraatti-EDTA-puskurissa pH 8,3. 643 emäsparin fragmentti otetaan talteen geelistä elektroeluutiolla ja etanolisaostuksella. DNA uudelleensuspendoidaan pitoisuuteen 0,1 pmol/y1. EcoRI-Hindlll-fragmentti sisältää PH05-signaalisekvenssin, desulfatohirudiinia koodittavan sekvenssin ja PH05:n transkription lopettajan.
543 emäsparin PH05-promoottorifragmentti eristetään plasmidista p31/R (eurooppalainen patenttihakemusjulkaisu no. 100 561).
10 Vig p31/R:ää katkaistaan restriktioendonukleaaseil-la EcoRI ja BamHI. Syntyneet 3 fragmenttia erotetaan 0,6 %:sessa matalalla sulavassa agaroosigeelissä Tris-boraatti-EDTA-puskurissa pH 8,3. 534 emäsparin BamHI-
EcoRI-fragmentti, joka sisältää PH05-promoottorin, mRNA:n aloituskohdat mukaanlukien, eristetään.
Vektorifragmentti eristetään plasmidista pJDB207/ PH05-HIR (ks. esimerkki 16d). 6 yg tätä plasmidia kat kaistaan BamHIsllä ja Hindllltlla. Suuri 6,5 ke:n BamHI-Hindlll-fragmentti erotetaan pienestä fragmentista 0,6 %: sessa matalalla sulavassa agaroosigeelissä Tris-boraatti- • t EDTA-puskurissa pH 8,3.
Edellä kuvatut kolme DNA-fragmenttia, joissa on tarvittavat tarttuvat päät, liitetään yhteen seuraavassa reaktiossa: 0,2 pmol (70 ng) 534 ep:n BamHI-EcoRI PH05-pro- moottorifragmenttia, 0,2 pmol (85 ng) 643 ep:n EcoRI-Hindlll-fragmenttia (hirudiinia koodittava sekvenssi) ja 1 · V. 0,1 pmol (0,4 yg) 6,5 ke:n BamHI-Hindlll-vektorifragment- tis liitetään yhteen 10 yl:ssa liuosta, jossa on 60 mM Tris pH 7,5, 10 mM MgCl2, 5 mM DTT, 1 mM ATP ja 400 yksikköä T4 DNA-ligaasia, reaktioajan ollessa 6 tuntia 15°C:ssa.
1 yl:n erä yhteenliittämisseosta lisätään 100 yl:aan kalsiumilla käsiteltyjä, transformointikelpoisia E. coli HB101- « 103 94773 soluja.
g 12 transformoitunutta, amp -pesäkettä kasvatetaan erikseen LB-alustassa, joka sisältää 100 yg/ml ampisillii-nia. Plasmidi-DNA valmisteaan Holmes et al:n menetelmällä (Anal. Biochem. 114 (1981) 193) ja analysoidaan katkaisemalla EcoRI:llä ja BamHIsllä. Yksi klooni, jossa on halutut restriktiofragmentit, eristetään ja nimetään pJDB207/ PH05(Eco)-HIRiksi.
IV) UAS1(PH05)-GAPDH-yhdistelmäpromoottorien liittämimen desulfatohirudiinin proteiinia koodittavaan alueeseen 15 yg plasmidia pJDB207/PHO5(Eco)-HIR (ks. esimerkki 24 dill) katkaistaan EcoRI:llä ja HindIII:lla. DNA-frag-mentit erotetaan 1 %:sessa agaroosigeelissä Tris-boraatti-EDTA-puskurissa pH 8,3. 643 ep:n fragmentti eristetään geelistä, elektroeluoidaan ja saostetaan etanolilla. DNA uudelleensuspendoidaan veteen pitoisuuteen 0,1 pmol/vil.
6 yg plasmidia p«3DB207/PHO5-HIR katkaistaan täysin restriktioendonukleaaseilla Hindlll ja Sali. Suuri 6,3 ke:n fragmentti (vektoriosa) eristetään pehmeäagaroosi-geelielektroforeesilla, suoritetaan fenoliuutto ja etano-lisaostus. Vektori-DNA-fragmentti uudelleensuspendoidaan veteen pitoisuuteen 0,05 prool/yl.
10 yg plasmidia pGAPDH-EL (ks. esimerkki 24dl) katkaistaan Bglllilla ja EcoRI:llä. 266 ep:n Bglll-EcoRI-fragmentti erotetaan 1,2 %:sessa agaroosigeelissä Tris -boraatti-EDTA-puskurissa pH 8,3, elektroeluoidaan geelistä ja saostetaan etanolilla. DNA uudelleensuspendoidaan veteen pitoisuuteen 0,3 pmol/yl.
j/; 0,3 pmol 548 ep:n Sall-Bglll-fragmenttia, joka sisäl tää UAS1(PH05):n (esimerkki 24dII), 0,3 pmol 266 ep:n Bglll-EcoRI-fragmenttia, joka on saatu pGAPDH-EL:stä,
0,3 pmol 643 ep:n EcoRI-Hindlll-fragmenttia, joka on saatu pJDB207/PHO5(Eco)-HIR:stä, ja 0,12 pmol 6,3 ke:n Sall-Hindlll-vektorifragmenttia liitetään yhteen 20 yl:ssa \> liuosta, jossa on 60 mM Tris pH 7,5,' 10 mM MgC^/ 5 mM
1 o4 94773 DTT, 1 mM ATP ja 400 yksikköä T4 DNA-ligaasia (Biolabs), reaktioajan ollessa 6 tuntia 15°C:ssa. 1 yl:n ja 3 yl:n erä yhteenliittämisseosta lisätään 100 yl:aan kalsiumilla käsiteltyjä E. coli HB101-soluja. Plasmidin eristäminen p amp -pesäkkeistä ja restriktioanalyysit Sällillä, Bglll: 11a, EcoRI:llä ja HindIII:lla suoritetaan edellä kuvatulla tavalla (ks. esimerkki 24dIII). Valitaan yksi positiivinen klooni, joka nimetään pJDB207/PAPEL-HIR(UAS1):ksi.
Vastaava rakentaminen tehdään pGAPDH-FL:stä eristetyllä 201 ep:n Bglll-EcoRI-fragmentilla. Yksi valituista plasmideista nimetään pJDB207/PAPFL-HIR(UAS1):ksi.
V) UAS1(PH05)-UAS2(PH05)-GAPDH-yhdistelmäpromoottorien liittäminen desulfatohirudiinin proteiinia koodittavaan alueeseen (ks. kuva 13) 3 yg kutakin plasmidia pJDB207/PAPEL-HIR(UAS1) ja pJDB207/PAPFL-HIR(UASD katkaistaan Bglllilla. Feno-liuuton ja etanolisaostuksen jälkeen lyhemmiksi jääneet DNA:n 3'-päät täytetään reaktiolla E. colin DNA-polyme-raasin (Klenow-fargmentti, Bethesda Research Laboratories) kanssa Maniatis et ai:n (supra) kuvaamalla tavalla. Entsyymi inaktivoidaan kuumentamalla 10 minuuttia 70°C:ssa.
DNA:t katkaistaan vielä Sällillä ja suuret 7,2 ke:n fragmentit eristetään pehmeäagaroosigeelielektroforeesilla, suoritetaan fenoliuutto ja etanolisaostus. Kukin fragmentti uudelleensuspendoidaan veteen pitoisuuksiin 0,05 pmol/yl. Fragmentit sisältävät hirudiinia koodittavan alueen, suurimman osan vektorisekvensseistä ja jomman kumman kyseisistä kahdesta eri GAPDH-promoottorielementistä, jotka . on eristetty joko pGAPDH-EL:stä tai pGAPDH-FL:stä.
··
Plasmidi p31/Y (eurooppalainen patenttihakemusjulkaisu no. 100 561) katkaistaan BstEII:lla, inkuboidaan E. colin DNA-polymeraasin (Klenow-fragmentti) kanssa kuten edellä on kuvattu ja katkaistaan Sällillä. 649 emäsparin fragmentti erotetaan pehmeäagaroosigeelissä ja otetaan , talteen fenoliuutolla ja etanolisaostuksella.
! ! iti i i:iii Iitaa 105 94773 0,3 pmol p31/Y:n 649 ep:n fragmenttia, joka sisältää UAS1-UAS2(PH05)-promoottorielementin ja 0,15 pmol jompaa kumpaa 7,2 ke:n fragmenttia liitetään yhteen ja suoritetaan E. colin HB101 transformointi edellä kuvatul- £ la tavalla. Amp -pesäkkeistä valmistetaan plasmidit ja ne analysoidaan restriktiokatkaisuilla. Valitaan kustakin lajista yksi klooni ja niiden plasmidi-DNA:t nimetään vastaavasti PJDB207/PAPEL—HIR(UAS1+UAS2):ksi ja pJDB2 0 7/PAPFL-HIR(UAS1+UAS2):ksi.
Esimerkki 25: GAPDH-promoottorielementtien liittäminen desulfatohirudiinin proteiinia koodattavaan sekvenssiin
Desulfatohirudiinin proteiinia koodittavaan alueeseen, joka sisältää myös PH05-signaalisekvenssin, liitettiin jompi kumpi eripituisista GAPDH-promoottorielementeistä (ks. esimerkki 24 dl).
Nämä kaksi elementtiä (266 ep ja 201 ep vastaavasti) sisältävät GAPDH:n TATA-alueen, mRNAtn aloituskohdat ja AT-rikkaan, luetuksi tulemattoman 5'-pään alueen. Näiden molempien elementtien nukleotidisekvenssit on esitetty kuvassa 11 .
Kummankin elementin 3'-pää on asemassa -5 GAPDH-gee-.. nin ATG:stä lukien ja näitä 3'-päitä seuraa EcoRIsn tunnis- tuskohta (ks. esimerkissä 24dl liitetty kytkijäoligonukleo-tidi) ja 5'-päät ovat vastaavasti asemissa -198 ja -263 ATG:stä lukien niin, että näihin asemiin on lisätty Bglll-kytkijä.
Jompi kumpi Bglll-EcoRI-promoottorifragmentti liiteri tään EcoRI-Hindlll-fragmenttiin, joka sisältää desulfatohi- rudiinia ja PH05-signaalisekvenssiä koodittavan sekvenssin, ja Hindlll-BamHI-vektorifragmenttiin.
6 yg plasmidia pJDB207/PHO5-HIR katkaistaan täysin restriktioendonukleaasilla Hindlll ja BamHI. Suuri 6,5 ke:n fragmentti (vektoriosa) erotetaan 0,8 %:sessa agaroosigee-·' Iissä Tris-boraatti-EDTA-puskurissa pH 8,3, elektroeluoidaan 106 94773 geelistä, suoritetaan fenoliuutto ja etanolisaostus. Vek-tori-DNA-fragmentti uudelleensuspendoidaan veteen pitoisuuteen 0,05 pmol/μΐ.
0,3 pmol 266 ep:n Bglll-EcoRI-fragmenttia, 30^3 011 saa_ tu pGÄPCH-EL:stä (esimerkki 24 dIV) , 0,3 pmol EcoRI-Hindlll-fragmenttia, joka on saatu pJDB207/PHO5(Eco)-HIR:stä (esimerkki 24 dill), ja 0,1 pmol 6,5 ke:n Hindlll-BamHI-vektori-fragmenttia liitetään yhteen 10 yl:ssa liuosta, joka sisältää 60 mM Tris pH 7,5, 10 mM MgCl2, 5 mM DTT, 1 mM ATP ja 400 yksikköä T4 DNA-ligaasia (Biolabs), reaktioajan ollessa 6 tuntia 15°C:ssa. 1 μΐ yhteenliittämisseosta lisätään 100 yl:aan kalsiumilla käsiteltyjä E. coli HBlOO-soluja.
£
Plasmidi eristetään amp -pesäkkeistä ja suoritetaan rest-riktioanalyysi esimerkissä 24 dill kuvatulla tavalla. Valitaan yksi positiivinen klooni. Sen plasmidi-DNA nimetään pJDB2 0 7/GAPEL-HIR:ksi.
Vastaavanlainen rakentaminen suoritetaan 201 ep:n Bglll-EcoRI-fragmentilla, joka eristetään pGAPDH-FL:stä. Valitaan yksi klooni, jonka plasmidi-DNA nimetään pJDB207/ GAPFL-HIR:ksi.
Esimerkki 26: Sellaisten ilmentämisplasmidien rakentaminen, joissa on erittyvää desulfatohirudiinia koodittavia sekvenssejä peräjälkeen sijoitettuina (ks. kuva 14) ·*
Seuraavat rakenteet sisältävät saman DNA-fragmentin kahdesti peräjälkeen pää ja häntä vastakkain ryhmiteltyinä. Kaksinkertainen fragmentti sisältää GAPDH-promoottorin tai PH05-GAPDH-yhdistelmäpromoottorin (kuten esimerkeissä 24 ja 25 on selostettu vastaavasti), PH05-signaalisekvenssiä ·. koodittavan sekvenssin, desulfatohirudiinia koodittavan sek venssin ja PH05-transkriptionlopettajan.
7 pg plasmidia pJDB2 07/GAP EL-HIR katkaistaan restrik-tioendonukeaasilla Hindlll. Sisentyneet 3'-päät täytetään reaktiolla E. coli DNA-polymeraasi I:n kanssa (Klenow-frag-mentti; Bethesda Research Laboratory) Maniatis:in menetel-: mällä (supra). 1,85 vg Sali-kytkijää (5'-GGTCGACC-3·) il i» i Hiili I i 1 ILI .
107 94773 (Biolabs) kinasoidaan 50 yl:ssa liuosta, jossa on 60 mM Tris pH 7,5, 10 mM MgCl2, 5 mM DTT, 0,5 mM ATP ja 50 yksikköä T4 polynukleotidikinaasia (Boehringer). Kun on inkuboitu 45 minuuttia 37°C:ssa, seosta kuumennetaan 10 minuuttia 75°C:ssa ja sen jälkeen annetaan jäähtyä huoneenlämpötilaan. 7 yg (1,5 pmol) linearisoitua plasmidia pJDB207/GAPEL-HIR, jonka Hindlll-päät on muunnettu tasaisiksi (ks. edellä), inkuboidaan 16 tuntia 15°C:ssa 80-ker-taisen ylimäärän kanssa kinasoitua ja emäspariutettua Sali-kytki jää 30 yl:ssa liuosta, jossa on 60 mM Tris pH 7,5, 10 mM MgCl2, 5 mM DTT, 3,5 mM ATP ja 800 yksikköä T4 DNA-ligaasia (Biolabs). Kun T4 DNA-ligaasi on inaktivoitu kuumentamalla 10 minuuttia 75°C:ssa, kytkijäylimäärä poistetaan saostamalla DNA siten, että läsnä on 10 mM EDTA, 300 mM natriumasetaattia pH 6,0 ja 0,54 tilavuutta isopropanolia. DNA katkaistaan Sall:llä. Saadut fragmentit eristetään 1 %:sessa agaroosigeelissä Tris-boraatti-EDTA-pus-kurissa pH 8,3. 1,1 ke:n fragmentti otetaan talteen geelis tä elektroeluutiolla, fenoliuutolla ja etanolisaostuksella. DNA uudelleensuspendoidaan pitoisuuteen 0,1 pmol/yl.
5 yg plasmidia pJDB207/GAPEL-HIR katkaistaan täysin Sällillä. Fenoliuuton ja etanolisaostuksen jälkeen DNA uudelleensuspendoidaan 100 yIraan 50 mM Tris-liuosta pH
8,0. Lisätään 4,6 yksikköä vasikan suolen emäsfos- «* _ fataasia (Boehringer). Kun on inkuboitu 1 tunti 37°C:ssa, fosfataasi inaktivoidaan kuumentamalla 15 minuuttia 68°C: ssa niin, että läsnä on 100 mM NaCl, 5 mM EDTA ja 0,5 %
SDS. DNA-liuos sijoitetaan 100 yL:n tilavuuteen DE52 (Whatman ) anioninvaihdinta, joka on tasapainotettu liuoksella, jossa on 10 mM Tris pH 7,5, 150 mM NaCl ja 1 mM
» « -- EDTA. Kun pylväs on pesty samalla puskurilla, DNA eluoi- daan 400 yl:lla liuosta, jossa on 1,5 M NaCl, 10 mM Tris pH 7,5 ja 1 mM EDTA, ja saostetaan etanolilla. Lineari-soitunut plasmidi erotetaan katkeamattomasta DNA:sta 0,6 %:sessa agaroosigeelissä Tris-asetaattipuskurissa. Lineaarinen 7,3 ke:n DNA-fragmentti otetaan talteen geelistä, 1„„ 94773 elektroeluoidaan, suoritetaan fenoliuutto ja etanoli-saostus ja DNA uudelleensuspendoidaan pitoisuuteen 0,1 pmol/Pl.
0,2 pmol 1,1 ke:n Sali-fragmenttia ja 0,1 pmol line-arisoitua vektoria liitetään yhteen 10 yl:ssa liuosta, joka sisältää 60 mM Tris pH 7,5, 10 mM MgCl2, 5 mM DTT, 1 mM ATP ja 200 yksikköä T4 DNA-ligaasia, reaktioajan ollessa 16 tuntia 15°C:ssa. 1 μΐ yhteenliittämisseosta lisätään 100 yl:aan kalsiumilla käsiteltyjä, transformointikelpoi-sia E. coli HB101-soluja.
£ 24 transformoitunutta amp -pesäkettä kasvatetaan erikseen LB-alustassa, joka sisältää 100 yg/ml ampisillii-nia. Plasmidi-DNA valmistetaan Holmes et al:n menetelmällä (Anal. Biochem. 114 (1981) 193)) ja analysoidaan EcoRI-restriktiokatkaisulla. Yksi klooni, jossa on halutut restriktiofragmentit, eristetään ja nimetään pJDB207/ /GAPEL-HIR/D:ksi.
Vastaavat rakentamiset suoritetaan plasmideille pJDB207/GAPFL-HIR ja pJDB207/PAPFL/HIR(UAS1 + UAS2).
Kustakin valitaan yksi klooni ja sen plasmidi-DNA nimetään vastaavasti pJDB207//GAPFL-HIR/D:ksi ja pJDB207/ (PAPFL-HIR(UAS1 + UAS2)D:ksi.
Esimerkki 27: Sellaisen ilmentämisplasmidin rakentaminen, johon on liitettynä neljä erittyvää desulfatohirudiinia koodattavaa sekvenssiä
Neljä kappaletta DNA-fragmenttia, joka sisältää GAPDH-promoottorin, PH05-sginaalisekvenssiä koodittavan sekvenssin, desulfatohirudiinia koodittavan sekvenssin ja PH05:n transkription lopettajan, sijoitetaan hiivan ilmentämisvektoriin peräjälkeen pää häntää vasten järjestyksessä.
10 Ug plasmidia pJDB207//GAPFL-HIR/D (ks. esimerkki 26) katkaistaan Sällillä. Saadun lineaarisen fragmentin kohesiiviset päät täytetään suorittamalla reaktio E. colin s DNA-polymeraasilla I (Klenow-fragmentti, BRL) Maniatis et •I · - iftit uin mu ,09 9 4 7 7 3 al:n menetelmällä (supra). 0,94 yg Hindlll-kytkijää (5'-CAAGCTTG-3', Biolabs) kinasoidaan, emäspariutetaan itsensä kanssa ja liitetään linearisoituun plasmidiin pJDB207//GAPFL-HIR/D, jonka Sali-kohdat on muutettu ta-sapäisiksi (ks. edellä). Kytkijän liittäminen ja isopro-panolisaostus suoritetaan esimerkissä 26 kuvatulla tavalla. DNA katkaistaan sen jälkeen HindIII:lla ja saatu 2,2 kein fragmentti eristetään elektroeluutiolla, fe-noliuutolla ja etanolisaostuksessa. DNA uudelleensuspen-doidaan pitoisuuteen 0,1 pmol/yl.
5 yg plasmidia pJDB207//GAPFL-HIR/D katkaistaan täysin HindIII:lla. DNA defosforyloidaan vasikan suolen emäsfosfataasilla (Boehringer), puhdistetaan DE52-ioninvaihtokromatografisesti ja eristetään 0,6 %:sessa agaroosigeelissä elektroeluutiolla kuten esimerkissä 26 on kuvattu.
0,2 pmol 2,2 ke:n Hindlll-fragmenttia ja 0,1 pmol linearisoitua vektoria liitetään yhteen (supra). 1 yl yhteenliittämisseosta lisätään 100 yl:aan kalsiumilla käsiteltyjä, transformointikelpoisia E. coli HB101-soluja.
12 transformoitunutta amp -pesäkettä kasvatetaan erikseen LB-alustassa, joka sisältää 100 yg/miampisilliinia. Plasmidi-DNA valmistetaan ja analysoidaan Sall+Xbal-kaksoishajo-tuksella, Aval+Xbal-kaksoishajotuksella ja BamHI-hajotuksella. 1,1 ke:n BamHI-liitosfragmentti osoittaa, että liitännäinen on läsnä pää häntää vasten järjestyksessä suhteessa niihin kahteen liitännäiseen, jotka ovat jo ennestään plasmidissa. Yhdelle kloonille, jossa liitännäinen on tässä suunnassa, annetaan nimeksi pJDB207/ /GAPFL-HIR/T.
t < » · »*·
Esimerkki 28: Hiivan ilmentämisvektorin rakentaminen, joka sisältää PH05-promoottorin, invertaasin signaalisekvens-siä koodittavan alueen ja desulfatohirudiinia koodittavan alueen . A) Oligodeoksiribonukleotidien synteesi invertaasin sig- 110 94773 naalisekvenssiä varten:
Neljä oligodeoksiribonukleotidia, 1-1, 1-2, 1-3, 1-4, syntetisoidaan DNA-syntetisaattorissa (malli 380B Applied Biosystems). Suojauksen poiston jälkeen synteettiset fragmentit puhdistetaan 12 Itsessä polyakryyliamidi-geelissä, joka sisältää 8 M ureaa. Suolattomat, puhtaat oligodeoksinukleotidit saadaan käyttämällä Sep Pak:ia (Waters Associates). Näistä fragmenteista rakentuu kaR-denne, joka koodittaa hiivan invertaasin signaalisekvens-siä, ja joka.sisältää usein käytetyt hiivan kodonit.
Hindlll
EcoRI MetLeuLeuGlnAlaPheLeuPheLeuLeu 1-1 51AATTCATGCTTTTGCAAGCTTTCCTTTTCCTTTT 3' 1-2 3'GTACGAAAACGTTCGAAAGGAAAAGGAAAACCGAC 5'
AlaGlyPheAlaAlaLysIleSerAla 1-3 5'GGCTGGTTTTGCAGCCAAAATATCTGCATCTTAGCGTC 3' 1-4 31CAAAACGTCGGTTTTATAGACGTAGAATCGCAGAGCT 5'
Hgal_
XhoI
B) Invertaasin signaalisekvenssiä koodittavan geenin ala-kloonaus a) Vektorin valmistus 1,5 vg p31R/SS-TPAA2:ta (eurooppalainen patenttihakemus julkaisu no. 143 081) katkaistaan 10 yksiköllä EcoRI: tä (Boehringer) 50 yl:ssa liuosta, jossa on 10 mM Tris.HCl pH 7,5, 6 mM MgCl2, 100 mM NaCl ja 6 mM merkaptoetanolia, reaktioajan ollessa 1 tunti 37°C:ssa. Lisätään 1 Ui 2,5 M NaCl ja sen jälkeen 10 yksikköä XhoI:tä (Boehringer) ja saatua seosta inkuboidaan 1 tunti 37°C:ssa. 4,2 ke:n vek tori eristetään 0,8 %:sessa preparatiivisessa agaroosigee-lissä. Geelipala siirretään Micro Colloidor-putkeen (Sartorius GmbH), peitetään 200 yl:lla TE:tä ja elektro-eluoidaan (elektroforesoidaan 90 mA:n virralla 50 minuut-
• I
il · atf-r liiti rt * rt m 94773 tia). TE-liuos otetaan talteen ja saostetaan 2,5 tilavuudella absoluuttista etanolia sen jälkeen kun on ensin lisätty 0,1 tilavuutta 1OxTNE-liuosta. DNA-pelletti pestään kylmällä 80 %:sella etanolilla ja kuivataan va-kuumissa. DNA uudelleensuspendoidaan 6 yl:aan TE-liuosta (40 pmol/yl).
b) Oligodeoksiribonukleotidien (1-1, 1-2, 1-3, 1-4) emäs-pariuttaminen, ..kinasointi ja liittäminen vektoriin
Liuosta, joka sisältää 10 pmol kutakin neljää deoksi-ribonukleotidia 10 yl:ssa 0,5 M Tris.HCl-liuosta pH 8, in-kuboidaan 5 minuuttia 95°C:ssa vesihauteella. Vesihaude jäähdytetään hitaasti 5 tunnin kuluessa 30°C:een. Tähän emäspariutettuun seokseen lisätään liuoksia (2 yl kutakin), joissa on 0,1 M MgCl2, 0,1 M NaCl, 30 mM DTT ja 4 mM ATP, sekä 8 yksikköä (1 yl) polynukleotidikinaasia (Boehringer). Kinasointi suoritetaan inkuboimalla 1 tunti 37°C;ssa. Emäspariutetut, kinasoidut oligodeoksinukleotidit ja 60 pmol EcoRI-XhoI-katkaistua vektoria (1,5 yl) liitetään· yhteen käyttämällä 400 yksikköä (1 yl) T4 DNA-ligaasia (Biolabs) reaktioajan ollessa 17 tuntia 14°C:ssa. Reaktio pysäytetään inkuboimalla 10 minuuttia 65°C:ssa. 10 yl tätä yhteenliittämisseosta käytetään E. coli HB101 Ca++-- solujen transformointiin (M. Dagert ja S.D. Ehrlich, Gene 56, 23-28 (1979)). Poimitaan 20 ampR-pesäkettä. DNA valmistetaan nopealla eristysmenetelmällä.(D.S. Holmes ja M. Quigley, Abal. Biochem. 114, 193-197 (1981)). DNA katkaistaan EcoRIsllä ja Xholrllä, leimataan radioak-tiivisesti EcoRI-päästä ja analysoidaan 6 %:sessa pölyni akryyliamidigeelissä, joka sisältää 8 M ureaa, käyttä mällä radioaktiivisesti leimattua HaeIII:lla katkaistua pBR322:ta DNA-merkkiaineena. Kaikista 20 kloonista saaduilla DNA-laaduilla havaitaan oikeaa kokoa edustava vyöhyke. Yhtä kloonia kasvatetaan 100 ml:ssa LB-alus-taa, joka sisältää 100 yg/ml ampisilliinia. Plasmidi-DNA eristetään ja nimetään p31RIT-12:ksi.
112 94773 C) GAPFL-promoottorielementin liittäminen invertaasin signaalisekvenssiä koodittavaan sekvenssiin 5 yg plasmidia p31RIT-12 katkaistaan täysin Sällillä ja EcoRI:llä. Suuri 3,3 kein Sall-EcoRI-fragmentti eristetään 0,6 %isessa agaroosigeelissä Tris-asetaattipuskuris-sa pH 8,2. DNA elektroeluoidaan geelistä ja suoritetaan fenoliuutto ja etanolisaostus. 10 pg plasmidia pJDB207/ GAPFL-HIR (ks. esimerkki 25) katkaistaan Sällillä ja EcoRIi llä. 477 epin Sall-EcoRI-fragmentti eristetään 0,8 %isessa agaroosigeelissä Tris-boraatti-EDTA-puskurissa pH 8,3. DNA elektroeluoidaan ja suoritetaan fenoliuutto ja etanolisaostus. Molemmat eristetyt DNA-fragmentit liitetään yhteen. Erällä yhteenliittämisseosta transformoidaan trans- p formointikelpoiset E. coli HB101-solut. Amp -pesäkkeitä kasvatetaan ja plasmidi-DNA analysoidaan Hindlll+Sall-kaksoiskatkaisulla. Plasmidi, jossa on oikea liitännäinen, nimetään p31/GAPFL-ITiksi.
D) Plasmidin pJDB207/GAPFL-I-HIR rakentaminen (ks. kuva 15) 25 yg plasmidia p31/GAPFL-IT katkaistaan täysin PstI: llä ja Sällillä. Saatu 676 epin fragmentti eristetään 10 %isessa preparatiivisella agaroosigeelillä Tris-boraatti-EDTA-puskurissa pH 8,3. DNA elektroeluoidaan, puhdiste-" taan DE52-ioninvaihtopylväässä, saostetaan etanolilla ja uudelleensuspendoidaan pitoisuuteen 0,1 yg/yl Hgal-katkaisu-puskuriin. Sall-Pstl-DNA-fragmentti katkaistaan osittain Hgalillä käyttämällä 0,5 yksikköä entsyymiä per yg DNAita reaktioajan ollessa 60 minuuttia 37°C:ssa. Reaktio pysäytetään lisäämällä EDTAita lopulliseen pitoisuuteen 10 mM.
r 4 -·'· 534 epin Sall-Hgal-fragmentti eristetään 1 %isessa prepa- ratiivisessa agaroosigeelissä. DNA elektroeluoidaan geelistä, puhdistetaan DE52-kromatografiällä, saostetaan etanolilla ja uudelleensuspendoidaan veteen pitosuuteen 0,1 pmol/yl.
10 yg plasmidia pJDB207/PHO5-HIR (ks. esimerkki 16) : katkaistaan Ball:llä ja Hindllltlla. Syntynyt 587 epin 94773
Ball-Hindll-fragmentti eristetään preparatiivisessa 1 %: sessa agaroosigeelissä. DNA elektroeluoidaan, saostetaan etanolilla ja katkaistaan vielä Hinflsllä.
1,3 yg (160 pmol) kutakin seuraavista oligodeoksinuk-leotideista 5'-CTGCAGTTGTTTACACCGACTGCACCG-3' 3'-CAACAAATGTGGCTGACGTGGCTTA-5' kinasoidaan ja emäspariutetaan esimerkissä 24dIII kuvatulla tavalla. 0,6 yg (1,6 pmol) Hinflillä katkaistua Ball-Hindlll-fragmenttia (ks. edellä) ja 160 pmol kinasoitua, emäspariutettua kytkijää liitetään yhteen 16 tuntia 15 °C:ssa 83 yl:ssa liuosta, joka sisältää 10 mM Tris.HCl pH 7,5, 10 mM MgCl2, 5 mM DTT, 3,5 mM ATP ja 400 yksikköä T4 DNA-ligaasia. Kun on inkuboitu 10 minuuttia 85°C:ssa, kytkijäylimäärä poistetaan saostamalla DNA isopropanolilla (ks. esimerkki 24dIII). 584 ep:n Hgal-Hindlll-fragmentti eristetään 1 %:sessa preparatiivisessa agaroosigeelissä. Elektroeluoitu, puhdistettu ja etanolilla saostettu DNA uudelleensuspendoidaan veteen pitoisuuteen 0,1 pmol/yl.
5 yg pJDB207/PHO5-HIR:ää katkaistaan HindIII:lla ja Sall:llä ja suuri 6,2 ke:n fragmentti eristetään.
0,2 pmol 534 ep:n Sall-Hgal-fragmenttia, 0,2 pmol • · ·· 584 ep:n Hga-HindIII-fragmenttia ja 0,1 pmol 6,2 ke:n
Sall-Hindlll-vektorifragmenttia liitetään yhteen 5 tuntia 15°C:ssa 10 yl:ssa liuosta, joka sisältää 10 mM Tris.HCl pH 7,5, 10 mM MgCl2, 5 mM DTT, 1 mM ATP ja 400 yksikköä T4 DNA-ligaasia. 1 yl:n erällä yhteenliittämisseosta transformoidaan transfromointikelpoiset E. coli HB101-. solut.
24 transformoitunutta ampisilliinille vastustuskykyistä pesäkettä kasvatetaan erikseen LB-alustassa, joka sisältää 100 yg/ml ampisilliinia. Valmistetaan plasmidi-DNA ja se analysoidaan Hindlll+Sall-kaksoiskatkaisulla. Eristetään yksi klooni, jossa on oikea restriktiokuvio, m 94773 ja tämä klooni nimetään pJDB207/GAPFL-I-HIR:ksi. Invertaa-sisignaalisekvenssiä koodittavan alueen identiteetti ja sen oikea liittyminen hirudiinia koodittavaan sekvenssiin varmistetaan nukleotidisekvenssin määrityksellä.
Esimerkki 29: Saccharomyces cerevisiae GRF 18-kannan trans- formointi:
Saccharomyces cerevisiae-kanta GRF18 (a, his3-11, his3-15, leu2-3, leu2-112f can ) transformoidaan seuraavil-la. plasmideilla pJDB207/PAPEL-HIR(0ASl), pJDB207/PAPFL-HIR(UAS1), pJDB207/PAPEL-HIR(UAS1 + UAS2), pJDB207/PAPFL-HIR(UASl + UAS2), pJDB207/GAPEL-HIR, pJDB207/GAPFL-HXR, pJDB207/[GAPEL-HIR] D, PJDB207/[GAPFL-HIR]D, pJDB207/[PAPFL-HIR(UAS1 + UAS2)]D,
PJDB207/[GAPFL-HIR]T, pJDB207/GAPFL-I-HIR
käyttämällä Hinnen et al:n kuvaamaa transformointimenetel-mää (Proc. Natl. Acad. Sei. USA 75, 1929 (1978)). Transformoituneet hiivasolut valitaan hiivan minimiravinnealus^ taa sisältävissä maljoissa, jossa alustassaei ole leusii-nia. Kustakin transformoituneesta hiivapesäkelaadusta eristetään yksi pesäke ja ne nimetään seuraavasti: •
Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB207/PAPEL-HIR(UASl), Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB207/PAPFL-HIR(UASl), Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB207/PAPEL-HIR(UASl+UAS2), Saccharomyces cerevisiae GRFl8/pJDB207/PAPFL-HIR(UASl+UAS2), ♦· Saccharomyces cerevisiae GRF18/'pJDB207/GAPEL-HIR, il . . *11.i. 1.11; |.»-!.«· . . .
ns 94773
Saccharomyces cerevisiae GRFl8/pJDB207/GAPFL-HIR,
Saccharomyces cerevisiae GRFl8/pJDB207/'' [GAPEL-HIRJ D, Saccharomyces cerevisiae GRFl8/pJDB207/[GAPFL-HIR]D, Saccharomyces cerevisiae GRFl8/pJDB207/[PAPFL-HIR(UASl+UAS2) ]D, Saccharomyces cerevisiae GRFl8/pJDB207/[GAPFL-HIR]T, Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB207/GAPFL-I-HIR.
b) Transformanttien fermentointi
Kutakin S. cerevisiae GRF18-transformanttia kasvatetaan erikseen 10 ml:ssa hiivan minimiravinnealustaa (Difco Yeast Nitrogen Base ilman aminohappoja, johon on lisätty 2 % glukoosia ja 20 mg/1 L-histidiiniä) 50 ml:n Erlenmeyer-pulloissa ravistelukasvatuksina 24 tuntia 30°C:ssa niin, että solutiheydeksi tulee 3 x 10^ solua/ml. Hiivatrans-formantit, joissa on PH05-GAPDH-yhdistelmäpromoottorin sisältävä plasmidi, vaativat promoottorin kytkemistä toimintaan, jotta desulfatohirudiini ilmentyisi. Solut pestään 0,9 %:sella NaCl-liuoksella ja niille ympätään 50 ml matala-P^-minimialustaa, joka on valmistettu Difco Yeast Nitrogen Base-ravinnealustan reseptillä (ilman aminohappoja, mutta joka sisältää 0,03 g/1 KH2P04, 10 g/1 L-aspa-ragiinia (NH4)2S04:n tilalla, 2 % glukoosia ja 1 g/1 L-histidiiniä. Viljelmät ympätään ' solutiheyteen korkeintaan 4x10^ solua/ml ja viljelmiä sekoitetaan 30°C:ssa nopeudella 200 1/min = 24 h. Lopullisiksi solutiheyksiksi
Q
saadaan 1 x 10 solua/ml.
Hiivatransformantit, joissa on GAPDH-promoottorin sisältävä plasmidi, ilmentävät desulfatohirudiinia rakenteellisesti eli konstitutiivisesti. Soluja kasvatetaan moni- . puolisia ravinteita sisältävässä alustassa, jonka koostu- • < mus on seuraava (g/1): peptoni (5), hiivauute (10), glu koosi (20), sakkaroosi (40), ammoniumsulfaatti (3), KH2P04 (2), MgS04 (0,5), NaCl (0,1), CaCl2 (0,1) ja bio-tiini (10 yg/1). Soluja saadaan noin 1 x 109 kpl/ml, kun inkuboidaan 48 tuntia 30°C:ssa nopeudella 200 1/min.
Seuraavassa taulukossa on esitetty yhteenveto « eräiden transformoituneiden hiivasolujen erittämistä de- 116 94773 sulfatohirudiinimääristä (määritetty trombiinin inhibointi-menetelmällä).
Kanta erittynyt talteenot-
Saccharomyces cerevisiae GRF18/ ^rudiini toajankoh- -1--(mg/1) “ (h) pJDB207/PAPFL-HIR(UASl) 7 24 pJDB207/PAPFL-HIR(UASl + UAS2) 8 24 PJDB207/GAPFL-HIR 41 48 pJDB207/GAPEL-HIR 35 48 pJDB207/[GAPFL-HIR]D 39 48 pJDB207/[GAPEL-HIR]D 31 48
Edelleen määritysten mukaan vähintään 90 % hiiva-transformanttien ilmentämistä desulfatohirudiiniyhdisteis-tä erittyy viljelyliemeen. Jotta saataisiin selville desulfatohirudiinimäärän jakautuminen viljelyliemen ja solujen sisuksen välille talteenottoajankohdan funktio- ·· na, suoritetaan fermentointi 3 litran MBR-bioreaktorissa * · .
(MBR Bioreactor, Wetzikon, Sveitsi). Saccharomyces cere-visiae-kanta GRF18/pJDB207/GAPFL-HIR siirrostetaan 3 litraan monipuolista ravinnealustaa (ks. edellä) ja in-kuboidaan 30°C:ssa sekoitusnopeudella 500 1/min ja ilmas-tusnopeudella 200 1/h. Lopulliseksi solutiheydeksi saa-
Q
, vutetaan 5 x 10 solua/ml. Otetaan näyte 18, 24 ja 42 tunnin kohdalla ja desulfatohirudiinipitoisuus mitataan viljelyliemestä ja solujen sisältä (kun solut on ensin rikottu, ks. esimerkki 22) trombiinininhibointime-netelmällä ja HPLC-analyysillä.
I lii i [III; i ; l iti i ♦ 117 94773 desulfatohirudiini (mg/1) a-iV-i (^) tratfoiinin inhibointi
HPLC
viljely liemi 18 60 78 solun sisus 18 7 <1 viljelyliemi 24 70 70 solun sisus 24 9 viljelylleni 42 110 105 solun sisus 42 9 <1 _____ __ . ______
Esimerkki 30: Transformanttien viljely 300 litran mitta kaavassa a) Ymppäyssykli
Joukko agarvinopintoja ympätään syväjäädytetystä ampullista, joka sisältää Saccharomyces cerevisiae-kannan GRF18/pJDB207/GAPFL-HIR-soluja. Yhtä tai useampia agarvinopintoja inkuboidaan 3-5 vrk 28 - 30°C:ssa. Yhden agarvinopinnan sisällöllä siirrostetaan steriilisti aina yksi 500 ml sn Erlenmeyer-kolvi, jossa ei ole ohjauslevyä, ja joka sisältää 100 ml esiviljelyalustaa. Kolveja ravistellaan pyöritysravistelulaitteessa, jossa on 50 mm:n heitto, nopeudella 250 1/min inkubointilämpötilan ollessa 28°C. 48 tunnin kuluttua 2 tilavuus-%:11a tällaisen kol vin viljelmää (1. esiviljelmä) ympätään steriilisti 600 ml esiviljelyalustaa, joka on 2 litran Erlenmeyer-kolvis-, sa. Näin ympättyjä kolveja (2. esiviljelmä) ravistellaan 48 tuntia 28°C:ssa pyöritysravistelulaitteessa nopeudella 120 1/min 50 mm:n heitolla. Yhdellä 2. esiviljelmäkolvin sisällöllä (2 tilavuus-% seuraavan ravinnealustan tilavuudesta) ympätään steriilisti 30 litraa esiviljelyalustaa ’ (tehdasmittakaavainen esiviljelyalusta) 50 litran fermen- torissa, jonka materiaali on ruostumatonta terästä. Teh- "8 94773 dasmittakaavaisen esiferraentoinnin olosuhteet ovat seuraa-vati sekoitusnopeus 600 1/min (yksi kuusilapainen tur-biinisekoittaja halkaisija 115 mm), 4 ohjauslevyä; hydrostaattinen paine 0,3 bar; ilmastus 1 litra ilmaa per litra alustaa minuutissa; lämpötila 28°C, viljelyaika 48 tuntia.
Agarravinnealusta ja esiviljelyalusta ovat koostumukseltaan samanlaiset agaria lukuunottamatta. Samaa esi-viljelyalustaa käytettiin kaikissa esiviljelyvaiheissa. Esiviljelyalustan koostumus oli seuraava (g/1): yeast nitrogen base (Difco) 8,4 L-asparagiini.H20 11,6 L-histidiini 1,0 glukoosi (steriloidaan erikseen) 2,0
Agaralustan koostumus: Sama kuin esiviljelyalusta plus 20 g agaria/1.
b) Tuotantofermentointi (300 litran mittakaava) 5 tilavuus-%:11a (15 litraa) tehdasmittakaavaista esiviljelmää ympätään steriilisti 600 litran fermentori, joka sisältää 300 1 steriiliä tuotantoalustaa. Tuotanto-alustan (300 1) fermentoinnissa käytetyt olosuhteet ovat seuraavat: sekoitusnopeus 450 1/min (yksi kuusilapainen sekoittaja, halkaisija 230 mm); 4 ohjauslevyä; hydrostaattinen paine 0,3 bar; ilman läpikulkuaika: 0-9 tuntia? 0,25 litraa ilmaa per litra alustaa minuutissa, 9 tunnin talteenotto: 1 1 ilmaa per litra alustaa minuutissa; lämpötila 28°C, kestoaika 24 - 48 tuntia. OD6qo 15”20· :: Saanto: 15-25 mg/1 (analyysimenetelmät: HPLC ja trom- biinikoe).
Tuotantoalustan koostumus (g/1): peptoni 5 hiivauute 10 sakkaroosi 40 (NH4)2S04 6 119 . 94773
MgS04.7H20 1
NaCl 0,1 KH-PO- 2 2 4
CaCl2.2H20 0,013 pH ennen sterilointia n. 6,0 vaahdonestoaine: UCON LB 625 tarvittaessa
Esimerkki 31i Desulfatohirudiinin eristäminen 300 litran viljelyliemestä
Viljelyliemi (ks. esimerkki 30), jonka pH on 3,3, jäähdytetään 17°C:een. Solut erotetaan Westfalia SA-14-lietteenpoistolaitteella (400 - 600 1/h). Paksu liete heitetään pois. Hieman samea supernatantti suodatetaan Skan-suodatinkääröjen läpi (ensimmäinen: huokoshalkaisija 5 ym; toinen: huokoshalkaisija 1 ym; kolmas: huokoshalkaisi ja 0,22 ym), pH säädetään natriumhydroksidillä arvoon 7,5 ja liuos sijoitetaan DEAE-anioninvaihtopylvääseen.
Pylväs pestään natriumasetaatilla (20 mM, pH 4,5) ja elu-oidaan natriumasetaatilla (20 mM, pH 3,1). Liuoksen (15 1) pH säädetään natriumhydroksidilla arvoon 7,5 ja väkevöi-dään lopulliseen tilavuuteen 1,8 1 kiertohaihduttimessa.
1 litran erä sijoitetaan Sephadex G-25-pylvääseen (pakatun kolonnin tilavuus 8 1; pylväs on tasapainotettu vedellä). Desulfatohirudiinia sisältävät jakeet tunnistetaan HPLC: llä. Desulfatohirudiinijae (2,5 1) väkevöidään kiertohaihduttimessa (rotavap) suurtyhjössä 200 ml:n lopulliseen tilavuuteen ja lyofilisoidaan.
Erä (2 g) epäpuhdasta materiaalia liuotetaan 50 ml:aan vettä, pH säädetään natriumhydroksidilla arvoon 7,5 ja : sijoitetaan Q Sepharose-nopeavirtauskolonniin (pakatun ko lonnin tilavuus 200 ml). Kolonni pestään ammoniumformi-aatilla (100 mM, pH 3,9). Otetaan 25 ml:n jakeet ja niistä tutkitaan desulfatohirudiinin läsnäolo HPLC:llä. Desulfatohirudiinia sisältävät jakeet (1- 65) yhdistetään (125 ml) ja väkevöidään kiertohaihduttimessa (rotavap) suurtyhjössä 10 ml:n lopulliseen tilavuuteen. Väkevöity liuos sijoite- 120 94773 taan Sephadex G-25-pylvääseen (Amicon, pylväs on tasapainotettu vedellä) suolanpoistoa varten. Saatu kirkas liuos (25 ml) lyofilisoidaan. Näin saatu kiinteä aine on puhdasta desulfatohirudiinia.
Esimerkki 32: Plasmidin pJDB207/PHO5-EGL rakentaminen
Egliini C:tä, joka on verijuotikkaasta saatu 70 aminohapon polypeptidi, koodittava nukleotidisekvenssi on syntetisoitu in vitro, alakloonattu ja ilmennetty E. colis-sa, kuten eurooppalaisessa patenttihakemusjulkaisussa no.
146 785 on selostettu. Egliiniä koodittavan sekvenssin tarkka liittäminen lukuvaiheistukseen PH05-signaalipeptidiä koodittavan sekvenssin kanssa suoritetaan tarkalleen samalla tavalla, kuin hirudiinin osalta on selostettu esimerkeissä 15 ja 16. Yksi klooni, jossa liitännäinen on oikeassa suunnassa vektorissa nimetään pJDB207/PH05-EGL:ksi. Saccharomyces cerevisiae-kanta GRF18 transformoidaan tavalliseen tapaan. Valitaan transformantit ja niitä viljellään esimerkissä 29 kuvatulla tavalla. Viljelyliemestä ei löydetä egliini C:tä.
ti
4 I
/ «
4 «I
: : IM . liiti | I I iti 4

Claims (6)

121 94773
1. Menetelmä desulfatohirudiinin tuottamiseksi, tunnettu siitä, että sopivissa ravinneolosuhteissa viljellään hiivaisäntäsoluja, jotka on transformoitu yhdistel-mävektorilla, jossa on yksi tai useampia liitettyjä DNA-jaksoja, joista kukin sisältää hiivan ilmentymisenohjaus-sekvenssin, DNA-jakson, joka koostuu ensimmäisestä DNA-sekvenssistä, joka koodittaa hiivan PH05- tai invertaasi-signaalipeptidiä ja on ylävirrassa ja lukuvaiheistuksessa toisen DNA-sekvenssin suhteen, joka koodittaa kypsää de-sulfatohirudiinia, joka mainittu DNA-jakso on mainitun ilmentymisenohjaussekvenssin transkriptionaalisessa ohjauksessa, ja hiivan transkriptionlopetussignaalit sisältävän DNA-sekvenssin, ja viljelyalustasta eristetään de-sulfatohirudiini.
2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että käytetään hiivaa, joka on transformoitu yhdistelmävektorilla, jossa on yksi tai useampia liitettyjä DNA-jaksoja, joista kukin sisältää PH05-promootto-rin, DNA-jakson, joka koostuu PH05:n signaalisekvenssis-tä, joka on ylävirrassa ja lukuvaiheistuksessa kypsää desulfatohirudiinia koodittavan DNA-sekvenssin suhteen, joka mainittu DNA-jakso on PH05-promoottorin transkriptionaalisessa ohjauksessa, ja PH05-aeenin 3'-reunasek- ** venssin; tai käytetään hiivaa, joka on transformoitu yhdistelmävektorilla, jossa on yksi tai useampia liitettyjä DNA-jaksoja, joista kukin sisältää GAPPH-promoottorin. DNA-jakson, joka koostuu PH05:n signaalisekvenssistä, joka on ylävirrassa ja lukuvaiheistuksessa kypsää desulfatohirudiinia ·. koodittavan DNA-sekvenssin suhteen, ja joka DNA-jakso on GAPDH-promoottorin transkriptionaalisessa ohjauksessa, ja PH05-aeenin 3‘-reunasekvenssin; tai käytetään hiivaa, joka on transformoitu yhdistelmävektorilla, jossa on yksi tai useampia liitettyjä DNA-jakso-ja, joista kukin sisältää PH05-promoottorin, DNA-jakson, ·· 94773 joka koostuu invertaasin signaalisekvenssistä, joka on ylävirrassa ja lukuvaiheistuksessa kypsää desulfatohiru-diinia koodittavan DNA-sekvenssin suhteen, ja joka mainittu DNA-jakso on 2H05-promoottorin transkriptionaali-sessa ohjauksessa, ja PH05-geenin 3'-reunasekvenssin.
3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmistetaan des-(Leu64, Gin45)-desulfato-hirudiinivariantti HV1, jonka kaava on seuraava Vai Vai Tyr Thr Asp Cys Thr Glu Ser Gly Gin Asn Leu Cys Leu Cys Glu Gly Ser Asn Vai Cys Gly Gin Gly Asn Lys Cys Ile Leu Gly Ser Asp Gly Glu Lys Asn Gin Cys Vai Thr Gly Glu Gly Thr Pro Lys Pro Gin Ser His Asn Asp Gly Asp Phe Glu Glu Ile Pro Glu Glu Tyr, tai des-(GlnM)-desulfatohirudiinivariantti HV1, jonka kaava on seuraava Vai Vai Tyr Thr Asp Cys Thr Glu Ser Gly Gin Asn Leu Cys Leu Cys Glu Gly Ser Asn Vai Cys Gly Gin Gly Asn Lys Cys Ile Leu Gly Ser Asp Gly Glu Lys Asn Gin Cys Vai Thr Gly Glu Gly Thr Pro Lys Pro Gin Ser His Asn Asp Gly Asp Phe Glu Glu Ile Pro Glu Glu Tyr Leu, tai desulfatohirudiinivariantti HV1, jonka kaava on seuraava Vai Vai Tyr Thr Asp Cys Thr Glu Ser Gly Gin Asn Leu Cys Leu Cys Glu Gly Ser Asn Vai Cys Gly Gin Gly Asn Lys Cys Ile Leu Gly Ser Asp Gly Glu Lys Asn Gin Cys Vai Thr Gly Glu Gly Thr Pro Lys Pro Gin Ser His Asn Asp Gly Asp Phe Glu Glu Ile Pro Glu Glu Tyr Leu Gin.
4. DNA-rakenne, tunnettu siitä, että se sisältää hiivan ilmentymisenohjaussekvenssin, DNA-jakson, joka koostuu ensimmäisestä hiivan PH05- tai invertaasi-signaa-lipeptidiä koodittavasta DNA-sekvenssistä, joka on ylä- • ♦ :l ; III I 1'lli I I I UI 94773 virrassa ja lukuvaiheistuksessa toisen DNA-sekvenssin suhteen, joka koodittaa kypsää desulfatohirudiinia, ja joka DNA-jakso on mainitun ilmentymisenohjaussekvenssin transkriptionaalisessa ohjauksessa, sekä DNA-sekvenssin, joka sisältää hiivan transkriptionlopetussignaalit.
5. Yhdistelmävektori, tunnettu siitä, että se sisältää yhden tai useampia liitettyjä DNA-jaksoja, joista kukin sisältää hiivan ilmentymisenohjaussekvenssin, DNA-jakson, joka koostuu ensimmäisestä DNA-sekvenssistä, joka koodittaa hiivan PH05- tai invertaasi-signaalipeptidiä ja on ylävirrassa ja lukuvaiheistuksessa toisen DNA-sekvenssin suhteen, joka koodittaa kypsää desulfatohirudiinia, ja mainittu DNA-jakso on mainitun ilmentymisenohjaussekvenssin transkriptionaalisessa ohjauksessa, ja hiivan transkriptionlopetussignaalit sisältävän DNA-sekvenssin.
6. Hiivaisäntäsolu, tunnettu siitä, että se on transformoitu yhdistelmävektorilla, jossa on yksi tai useampia DNA-liitännäisiä, joista kukin sisältää hiivan ilmentymisenohjaussekvenssin, DNA-jakson, joka koostuu ensimmäisestä DNA-sekvenssistä, joka koodittaa hiivan PH05- tai invertaasi-signaalipeptidiä ja on ylävirrassa ja lukuvaiheistuksessa toisen DNA-sekvenssin suhteen, joka koodittaa kypsää desulfatohirudiinia, joka mainittu DNA-jakso on mainitun ilmentymisenohjaussekvenssin transkriptionaalisessa ohjauksessa, ja hiivan transkription- ·* lopetussignaalit sisältävän DNA-sekvenssin.
FI865003A 1985-12-12 1986-12-08 Menetelmä trombiini-inhibiittorien tuottamiseksi FI94773C (fi)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GB858530631A GB8530631D0 (en) 1985-12-12 1985-12-12 Thrombin inhibitors
GB868613088A GB8613088D0 (en) 1985-12-12 1986-05-29 Thrombin inhibitors
GB8530631 1986-05-29
GB8613088 1986-05-29

Publications (4)

Publication Number Publication Date
FI865003A0 FI865003A0 (fi) 1986-12-08
FI865003A FI865003A (fi) 1987-06-13
FI94773B FI94773B (fi) 1995-07-14
FI94773C true FI94773C (fi) 1995-10-25

Family

ID=26290108

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
FI865003A FI94773C (fi) 1985-12-12 1986-12-08 Menetelmä trombiini-inhibiittorien tuottamiseksi

Country Status (17)

Country Link
EP (1) EP0225633B1 (fi)
JP (2) JPH0650990B2 (fi)
AT (1) ATE79403T1 (fi)
AU (1) AU615413B2 (fi)
CA (1) CA1341496C (fi)
DE (1) DE3686399T2 (fi)
DK (1) DK175492B1 (fi)
ES (1) ES2051688T3 (fi)
FI (1) FI94773C (fi)
GR (1) GR3006248T3 (fi)
HU (1) HU209146B (fi)
IE (1) IE57859B1 (fi)
IL (1) IL80932A (fi)
MY (1) MY101203A (fi)
NO (1) NO178035C (fi)
PH (1) PH31277A (fi)
PT (1) PT83898B (fi)

Families Citing this family (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE3583361D1 (de) * 1984-06-14 1991-08-08 Ucp Gen Pharma Ag Verfahren zur herstellung von thrombin-inhibitoren.
MC1834A1 (fr) * 1986-07-10 1988-06-03 Transgene Sa Bloc fonctionnel d'adn et plasmide codant pour l'hirudine,levure transformee,procede de preparation de l'hirudine,hirudine obtenue et son utilisation
GB8620926D0 (en) * 1986-08-29 1986-10-08 Delta Biotechnology Ltd Yeast promoter
CA1341032C (en) * 1987-01-23 2000-06-20 John L. Krstenansky Anticoagulant peptides
US6005071A (en) * 1987-01-23 1999-12-21 Merrell Pharmaceuticals Inc. Anticoagulant peptides
US5789540A (en) * 1987-01-23 1998-08-04 Merrell Pharmaceuticals Inc. Anticoagulant peptides
US5256559A (en) * 1988-03-04 1993-10-26 Biogen, Inc. Methods and compositions for inhibiting platelet aggregation
GB8809860D0 (en) * 1988-04-26 1988-06-02 Ciba Geigy Ag Process for production of polypeptides
GB8907110D0 (en) * 1988-05-04 1989-05-10 Ciba Geigy Ag Improvements in the production of polypeptides
US5268296A (en) * 1988-06-11 1993-12-07 Ciba-Geigy Corporation DNA vector and recombinant host cell for production of hirullin P6 and P18
US5112615A (en) * 1988-08-03 1992-05-12 New England Deaconess Hospital Corporation Soluble hirudin conjugates
US5167960A (en) * 1988-08-03 1992-12-01 New England Deaconess Hospital Corporation Hirudin-coated biocompatible substance
GB8826428D0 (en) * 1988-11-11 1988-12-14 Biopharm Ltd Antithrombin
FR2646437B1 (fr) * 1989-04-28 1991-08-30 Transgene Sa Nouvelles sequences d'adn, leur application en tant que sequence codant pour un peptide signal pour la secretion de proteines matures par des levures recombinantes, cassettes d'expression, levures transformees et procede de preparation de proteines correspondant
US5179196A (en) * 1989-05-04 1993-01-12 Sri International Purification of proteins employing ctap-iii fusions
DE4009268A1 (de) * 1990-03-22 1991-09-26 Consortium Elektrochem Ind Sekretion von hirudinderivaten
US6514730B1 (en) 1991-03-21 2003-02-04 Consortium für elektrochemische Industrie GmbH Secretion of hirudin derivatives
ATE196927T1 (de) * 1992-09-04 2000-10-15 Novartis Ag Verfahren zur herstellung von proteaseinhibitoren
DE69616276T2 (de) 1995-02-09 2002-12-12 Aventis Pharma Deutschland Gmbh Verfahren zur produktion von proteinen
US7795205B2 (en) 2004-04-12 2010-09-14 Canyon Pharmaceuticals, Inc. Methods for effecting regression of tumor mass and size in a metastasized pancreatic tumor
JP7284955B2 (ja) * 2020-07-20 2023-06-01 フォーデイズ株式会社 神経幹細胞の増殖促進剤及びそれを用いた神経幹細胞の増殖促進方法

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS60501140A (ja) * 1983-04-22 1985-07-25 アムジエン 酵母による外因性ポリペプチドの分泌
EP0138111B1 (en) * 1983-10-03 1991-11-21 Chiron Corporation Superoxide dismutase cloning and expression in microorganisms
PT79518B (pt) * 1983-11-21 1986-12-12 Ciba Geigy Ag 54). 5 ^ig do plasmídeo pBR 322 /PHO5 Bam Rsa 637 são digeridos com a endonuclease de restrição Xbal. Apos digestão completa o DNA ê extraído com fenol/clorofórmio e precipitado com etanol. 0 DNA ê redissolvido em Tris.HCl 50mM pH8,0 numa concentração de 50 p-g/nd. e ê digerido com 11 unidades de fosfatase alcalina do intestino de vitela (Boehringer), durante 1 hora a 379C. - 97 fORHjf y| A enzima ê inativada a 65 9C durante 1 hora. 0 DNA ê purificado por cromatografia de troca iõnica em DE 52 ( Whatman) e precipitação com etanol como descrito no Exemplo 9Aa. Dois oligodeoxinucleotídeos sintéticos com a formula 5’-CTAGAAGGGGTATCTTTGGATAAGA - 3' 3’- TTCCCCATAGAAACCTATTCTCTAG -5' são fosforilados individualmente nas suas extremidades 5' como descrito no Exemplo 9Ab. Os oligodeoxinacleotídeos fosforilados são misturados em quantidades equimolares . A mistura ê aquecida durante 10 min. a 759C, depois deixada arrefecer lentamente atê à temperatura ambiente e guardada a -209C. Este adaptador ê designado por adaptador C. 1 ^ig (120 pmoles) do adaptador C emparelhado e fosforilado e 5 pg (1,5 pmoles) de pBR322/ /PH05 Bam-Rsa 637 desfosforilado e cortado com Xba I são ligados em 40^1 de Tris.HCl 60mM pH 7,5, MgCl2 lOmM, DTT 5mM, ATP lmM, 1600 unidades da ligase de DNA do T4 a 159C durante 20 horas. A ligase de DNA ê inactivada durante 10 min. a 859C e o excesso de adaptadores ê removido por precipitação com isopropanol. 0 DNA ê redissolvido em H20 numa concentração de 0,25 mg/ml. Os múltiplos de adaptadores são removidos por digestão com a endonuclease de restrição BglII. 0 DNA ê precipitado com etanol, redissolvido e depois digerido com Bam HI. Os fragmentos de restrição são separados num gel de 0,6¾ de agarose de baixo ponto de fusão em Tris-borato-EDTA pH8,3. 0 fragmento Bam HI-BglII de 662 pb (derivado de fragmento Bam HI-Rsa I de 637 pb) ê localizado e removido do gel. c) Isolamento de um fragmento de vector contendo a sequência codificadora do TPA maduro ( fig. 23) 5 yig do plasmídeo p31R/SS-TPA /\ 2, são digeridos com as endonucleases de restrição Bam HI e BglII. Após digestão completo de DNA e precipitado com etanol e ressuspenso em Tris.HCl 50mM pH 8,0 numa concentração de 75 jxg /ml. Os fragmentos de DNA sao desforilados nas suas extremidades 5' por digestão com 1 unidade de fosfatase alcalina de intestino de vitela ( Boehringer) em 60 de Tris.HCl 50mM pH 8,0 durante 1 hora a 379 C. A fosfatase ê inactivada por incubação a 659C durante 1,5 horas. 0 DNA é purificado por cromatografia de troca iónica em DE-52 (Whatman) como descrito no Exemplo 9Aa. 0 DNA ê precipitado com etanol, redissolvido em Tris-HCl lOmM, pH8,0 e aplicada num gel de 0,6 °'o de agarose de ponto de fusão baixo. 0 fragmento maior Bam HI -BglII de 5,2 kb ê removido do gel. d) Ligação dos fragmentos de DNA isolados e transformação de E.coli HB 101 (cf. figs 23 e 24 ). Dois blocos de gel de agarose de ponto de fusão baixo contendo 0,1 pmoles do fragmento Bam HIBglII de 5,2 kb de p31R/SS-TPA/\ 2 e 0,2 pmoles do fragmen to BamHI -BglII de 662 pb de pBR322/PHO5 Bam-Rsa 637, respectivamente, são misturados, liquefeitos a 659C e diluídos para baixar a concentração de agarose para 0,3¾. A ligação ê feita em 150^1 de Tris.HCl 60mM, pH 7,5; MgCl^ lOmM, 99 jr £ DTT 5mM, ATP ImM e 800 unidades de ligase de DNA do T4 (Biolabs) a 159C durante 16 horas. Amostras de 10 ^il e 30 yjl são misturadas com 100 p.1 de células E.coliHB 101 competentes para a transformação como descrito no Exemplo 4a. - R 6 colonias transformadas amp são crescidas individualmente em meio LB contendo 100 ^g/ml de ampicilina. 0 DNA de plasmídeo ê analisado quanto ao tamanho e orientação da invenção por corte com a endonuclease de restrição Bam Hl. Um único clone com a orientação correcta da inserção é designado por p31/PHO5 637-TPA (cf. fig. 23). 0 plasmídeo pBR 322/PHO5 Bam-Rsa 637 pode também ser substituído por pBR 322/PHO5 Bam-Rsa 595, pBR 322/PHO5 Bam-Rsa 811 e pBR 322/PHO5 Bam-Rsa 1312 . Seguindo o processo descrito atras são isolados clones únicos com inserções do tamanho e orientação esperados e designados por p31/PHO5 595C-TPA, p51/PHO5 811C-TPA e p31/PHO5 1312 C-TPA. 0 adaptador C pode também ser substituído pelo adaptador B com a seguinte férmula 5' -CTAGATAAGAGATCTGC -3’ 3’ TATTCTCTAGACG -5' o qual codifica Lis -Arg na construção final (fig. 24). A fosforilação dos oligodeoxinucleotídeos sintéticos e emparelhamento são como descrito para o adaptador C. Para a adição do adaptador 5 de pBR 322/PHO5 Bam-Rsa 637 cortado com Xba I são digeridos com 2 unidades de nuclease (Sigma) em 50 yjl de acetato de sédio 30mM pH 4,6, NaCI 200mM e ZnSO^ ImM durante 40 min. a 379C para criar extremidades cerses (ver fig.23). Apos extração com fenol clorofórmio o DNA ê precipitado com etanol e redissolvido em H^O numa concentração de 0,25 mg/ml. 0,4 ^g (120 pmoles) de adaptador A fosforilado e emparelhado e 5 ^ig (1,5 pmoles) de pBR 322/PHO5 Bam -Rsa 637 cortado com Xba I /S^ são ligados através das extremidades cerses como descrito para o adaptador C exceptuando a utilização de ATP 3,5 mM. As outras construções são como descrito atras. Os clones resultantes são identificado pela letra A e referidos como p31/PHO5 595A-TPA, p31/PHO5 637A-TPA, p31/PHO5 811A-TPA e p31/PHO5 1312 A-TPA. Exemplo 16: Subclonagem de construção genética no vector de levedura de elevado numero de copias pJDB2O7 e transformação de S. cerevisiae GRF18 As construções descritas nos Exemplos 13-19 contêm o promotor de PH05 com ou sem extensões para a região codificadora do gene de PH05 . A região codificadora do TPA com ou sem prepo-sequência e os sinais de terminação da transcrição de PH05 num arranjo tendem, tudo inserido num vector derivado do pBR 322. Os fragmentos Bam HI-HIND III contendo todo o arranjo são ligados ao fragmento Bam Hl -Hind III de 6,4 kb do pJDB 207 como descrito para uma reacção analoga no Exemplo 10. Células E.coli HB101 competentes são transformadas e vãrias colonias amp^ de cada experiência são crescidas individualmente em meio LB com 100 ^ig/ml de ampicilina. 0 DNA de plasmídio é analisado por corte com as endonucleases de restrição Hind III, Bam Hl e Pst I. Partindo dos plasmídeos p31/PHO5-TPA 18, ρ31 /PHO5-TPA 42, p31R/SS-TPA /\ 2, p31R/SS-TPA/\ 3, Ρ31/ΡΗΟ5 595C-TPA, p31/PHO5 637C-TPA,’ p31/PHO5 811C-TPA, P31/PHO5 1312C-TPA, p31/PHO5 595B-TPA, p31/PHO5 637-TPA, P31/PHO5 811 B-TPA, p31/PHO5 1312 B-TPA, p31/PHO5 595 A-TPA P31/PHO5 637-TPA, p31/PHO5 811-A-TPA e p31/PHO5 1312A-TPA obtem-se os clones que se seguem com as inserções correctas PJDB2O7/PHO5-TPA18 PJDB2O7/PHO5-TPA42 PJDB2O7R/PHO5-SS-TPA Λ 2 PJDB2O7R/PHO5-SS-TPA Λ 3 PJDB2O7/PHO5 595C-TPA PJDB2O7/PHO5 637C-TPA PJDB2O7/PHO5 811C-TPA PJDB2O7/PHO5 1312C-TPA PJDB2O7/PHO5 595B-TPA PJDB207/PH05 637B-TPA pJDB2O7/PHO5 811B-TPA PJDB2O7/PHO5 1312B-TPA pJDB2O7/PHO5 595A-TPA PJDB2O7/PHO5 637A-TPA PJDB2O7/PHO5 811A-TPA PJDB2O7/PHO5 1312A-TPA . Estes plasmídeos são introduzidos individualmente em Saccharomyces cerevisiae estirpe GRF 18 como descrito no Exemplo 11. Uma única colónia de levedura de cada uma das transformações de levedura ê picked. Os clones obtidos são designados por . Saccharomyces cerevisíae GRF18/pJDB2Ò7/PHO5-TPA18 Saccharomyces cerevisíae GRF18/pJDB2O7/PHO5-TPA42 Saccharomyces cerevisíae GRF18/pJDB2O7R/PHO5-SS-TPA/\ 2 Sacchãtúiuycea cerevisíae GRFi8/pJD32O7R/?HO5~SS-TPA /\ 3 Saccharomyces cerevisíae GRF18/pJDB2O7/PHO5 595C-TPA Saccharomyces cerevisíae GRF18/pJDB2O7/PHO5 637C-TPA Saccharomyces cerevisíae GRF18/pJDB2O7/PHO5 811C-TPA Saccharomyces cerevisíae GRF18/pJDB2O7/PHO5 1312C-TPA Saccharomyces cerevisíae GRF18/pJDB2O7/PHO5 595B-TPA Saccharomyces cerevisíae GRF18/pJDB2O7/PHO5 637B-TPA Saccharomyces cerevisíae GRF18/pJDB2O7/PHO5 811B-TPA Saccharomyces cerevisíae GRF18/pJDB2O7/PHO5 1312B-TPA As células de levedura são crescidas colhidas e extraídas como descrito nos Exemplos 11 e 12. A actividade de TPA nos extractos celulares é testado como descrito no Exemplo 12. Os resultados estão apresen tados na tabela 3. Tabela 3: Actividade de TPA da estirpe de levedura Saccharomyces cerevisiae GRF18 transformada com diferentes plasmídeos e testada em condições de desrepressão (Pi baixo) : plasmídeo Actividade de TPA(unidades/l de cultura de células de levedura/ OD^qq) PJDB2O7/PHO5-TPA18 750 PJDB2O7/PHO5-TPA42 700 PJDB2O7R/PHO5-SS-TPA_A 2 600 PJDB2O7R/PHO5-SS-TPA 3 650 PJDB2O7/PHO5 595C-TPA 900 Exemplo 17: Substituição cromossómica do gene de PHO5 pelo gene do TPA (ver fig.25) A região codificadora da proteína TPA ê colocada no cromossoma II de levedura na posição da região codificadora da proteína PH05 . Experimentálmente isto ê con seguido por cotransformação. Saccharomyces cerevisiae estirpe GRF 18 ê cotransformada com 25 ^ig do plasmídeo p31/PHO5 -TPA 18, linearizado com BnmHI e Hind III, e 3 ^xg do plasmídeo de levedura Yepl3 (51). De 24 colónias Leu obtidas, uma ê Pho5 e ao mesmo tempo produz aproximadamente 35 unidades de TPA/1 de cultura de células de levedura /0D600. Por crescimento deste transformante num meio contendo leucina (YPD, 10g/l de Bacto Yeast Extract, 20g/l de Bacto Peptone, 20 g/l de glucose) durante 10 gerações, segregantes Leu~são obtidos com uma frequência de 10-20¾ os quais provavelmente perderam o plasmideo Yep31. Por análise ou Southern do DNA total de levedura isolado dos segregantes Leu (52) verifica-se que no nível de DNA que as sequências codificadoras da proteína TPA substituem as sequências codificadores da proteína PH05 deixando inal. teradas as sequências ladeantes do cromossoma II. Seleccionou-se uma estirpe que se designou por Saccharomyces cerevisiae GRF 18 (pho-5-ΤΡΑ)♦ Exemplo 18: Melhoramento de estirpe por mutação A estirpe Saccharomyces cerevisiae GRF18 /pJDB2O7/PHO5-TPA (IA) é ainda desenvolvida para produção de TPA por mutação e selecção de baixa actividade de fosfatase ácida. Saccharomyces cerevisiae H2 4 3/pJDB 20 7/ /PH05 -TPA (IA) um mutante termo-sensível de Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB2O7/PHO5 TPA (IA) ê obtido por irra_2 diação com UV (0,08 yiWcm , 15 segundos, 99,2¾ de morte). As colónias são crescidas em meio YPD osmc ticamente estabilizado contendo sorbitol 1,2M (10 g/l de Bacto Yeast Extract, 20 g/l de Bacto Peptone, 20g/l de glucose, 20 g/l de agar Bacto) e transferidas para meio YPD sem sorbitol. Saccharomyces cerevisiae H243 ê isolada como colónia de crescimento lento. Cerca de 10$ células de Saccharomyces cerevisiae H243/pJDB2O7/PHO5 -TPA (IA) são semeadas em agar YNB (6,8 1 de yeast Nitrogen Base sem aminoãcidos ; 20 g/1 de glucose, 20 g/1 de agar Bacto, suplementado com 20 mg/1 de histidina) e são irradiadas directamente com UV (0,08 -2 uWcm durante 12 segundos). A morte e de 98¾. As colonias obtidas a partir das células sobreviventes são transferidas para meio de Pi baixo e dois dias depois coradas para a actividade de fosfatase acida por um teste de sobrecamada de agar mole (48). Os mutantes negativos para a fosfatase _4 acida são obtidos com uma frequência de mutaçao de 3,2x10 . A estirpe com o título de TPA mais elevado é seleccionado e referido como Saccharomyces cerevisiae H423/pJDB2O7/PHO5-TPA (IA). As actividades de TPA de tres estirpes diferentes de levedura transformadas com pJDB2O7/PHO5-TPA (IA) estão apresentadas na Tabela 4. Tabela 4: Actividade de TPA de diferentes estirpes de Saccharomyces cerevisiae transformadas em condi ções de desrepressão (Pi baixo) Actividade de TPA (unidades/1 de cultura de células de levedura /OD^qq) GRF18/pJDB2O7/PHO5-TPA(lA) 625 H243/pJDB2O7/PHO5 -TPA(IA) 1560 H423/pJDB2O7/PHO5 -TPA(IA) 7200 • 1 Exemplo 19 : Produção de TPA por uma estirpe recombinante da levedura Saccharomyces cerevisiae numa escala de 30 1. Saccharomyces cerevisiae estirpe GRF 18/pJDB2O7/PHO5-TPA(lA) possui um plasmídeo que inclui uma marca para leucina permitindo manutenção selectiva do plasmídeo no organismo hospedeiro, um gene estrutural para o TPA humano e o promotor da fosfatase acida PH05 que permite a expressão do gene do TPA em meios com quantidades limitativas de fosfato inorgânico (condições de desrepressão). A estirpe ê mantida em culturas de agar inclinado preparadas com um meio definido sem o aminoãcido leucina para assegurar a retenção do plasmídeo. Agar recentemente inoculado e incubado durante 24 horas a 30?C. A cultura â superfície de um dos agares inclinados ê ressuspensa em 3ml de meio de pre-cultura o qual ê então transferido para o primeiro balão de pre-cultura com agitação. 0 balão de 500 ml tem uma unica saída e contem 100 ml de meio I de pre-cultura tendo o seguinte composição ( valoreq em g/1). L-asparagina, 2,0; L-histidina, 0,02 glucose, 10 ; Kt^PO^, 1,0 ; MgSO4· 7H2O, 0,5 ; NaCl 0,1 ; CaCl2~2H2O, 0,1 ; solução de vitaminas 5 jil/1 e solução de micronutriantes 5 ml/1. 0 meio e ajustado a pH7,2 usando NaOH antes da esterilização . A glucose, vitaminas e micronutrientes são esterilizados à parte e adicionados ao meio. As soluções &quot;stock” de vitaminas e micronutrientes têm as seguintes composições (em g/1): Vitaminas - biotina, 0,0002; D-pantotenato de cãlcio , 0,04 ; acido fõlico, 0,0002; acido micotínico, 0,04 ; acido p-aminobenzõico, 0,02 ; hidrocloreto de piridoxina, 0,04; riboflãvina, 0,02 ; hidrocloreto de tiamina, 0,04; e inositol 0,2 em 1 1 de agua desionizada ; micronutrientes - acido bórico 0,05 ; CuSO &quot;^H 0, 0,004 ; Kl, 0,01; FeCl^.óH^O, 0,02 ; MnSO^, 0,04 ; NaMoO^. 2^0, 0,02 e ZnSO^.71^0, 0,04 em 1 1 de agua desionizada. 0 meio ê preparado usando agua desionizada. A primeira pré-cultura é incubada durante 24 horas a 309C num agitador orbitol com 5cm de excentricidade a uma velocidade de 250 rev/min. Os balões com a primeira pré-cultura constituem o inoculo para os balões da segunda pré-cultura. Estes balões recebem um inoculo de 1¾ (v/v). Eles contem 100 ml de meio II de pré-cultura tendo a seguinte composição (mg/1): Extracto de levedura (Difco), 10,0 ; L-asparagina, 6,6; Κ^ΡΟ^ 1.0 ; MgSO^.7H2O, 1,0 ; L-histidina, 0,02 e D-glucose (mono-hidrato) , 33,0. 0 meio que ê preparado usando agua desionizada tem um pH de aproximadamente 6,0. A glucose é esterilizada separadamente. As condições de incubação são idênticas âs da primeira pré-cultura. 0 caldo de cultura de 3 balões ê combinado para dar um inoculo a 1¾ v/v para o fermentador principal de produção. 0 fermentador de produção tem um volume total de aproximadamente 45 1, contem 4 saliências e um agitador de turbina de disco de seis lâminas com um diâmetro de 115 mm. A velocidade de agitação é de 600 rev/min, a sobrepressão de 0,3 bar e uma velocidade de arejamento de 0,5 vol/vol/min. * ,· Η Ο fermentador contem 30 1 de um meio com as composições seguintes: (valores em g/1): L-asparagina, 2,0 ; L-histidina, 0,02 ; Kí^PO^, 0,03; MgSO^. 71^0, 0,5; NaCl, 0,1, CaCl2.2H2O, 0,1 ; KC1, ip ; D-glucose (mono -hidrato) , 20,0 ; solução de vitaminas 5 ml/1 e solução micronutrientes, 5ml/l. 0 meio ê ajustado pH 7,2 usando NaOH antes da esterilização. A glucose, vitaminas e micronutrientes são esterilizados separadamente e adicionados ao meio. As soluções &quot;stock&quot; de vitaminas e micronutrientes têm composição idêntica às descritas para o meio I de prê-cultura. A temperatura de fermentação ê de 309C. 0 pH desce para 5,0 onde ê controlado usando NaOH. Apos fermentação durante cerca de 20 horas atinge-se a produção máxima de TPA. A densidade óptica que atinge 2-3 unidades e a actividade de fosfatase ácida dão indicações uteis àcer ca do progresso da fermentação. 0 calor de fermentação ê arrefecido para 109C antes da colheita das células de levedura. Exemplo 20: Recuperação e purificação do TPA e pro-TPA por cromatografia com anticorpos monoclonais anti-TPA a) Preparação de extractos celulares 0 líquido de cultura (pH4) dos 30 1 de fermentação (cf.Exemplo 19) é arrefecido atê 109C e centrifugado usando uma centrífuga Alfa-Laval BRPX-207. As células separadas são ressuspensas em 21 de tampão de lise A ( NaH2P04 20mM, f^HPO^ 80mM, NaCl 150 mM, 0,01¾ de Tween, Benzamidina lOmM e EDTA lOmM). • 1 ί »» A solução é arrefecida atê 59C e passa da através de um moinho Dyno (tipo KDL-Pilot) com uma velocidade de alimentação de 101/h. 0 moinho estã equipado com 500 ml de pérolas de vidro de 0,5 -0,75 m de diâmetro e ê ligado a 3000 rev/min. Antes da adição das pérolas de vidro às células em suspensão aquelas são lavadas com 300 ml de tampão de lise A contendo 30 mg de BSA. A suspensão de células ê centrifugada ( rotor Sorvall 653, 40 min. 9000 rpm) e o sedimento rejeitado. b) Digestão do DNA^e fraccionamento com sulfato de amonio Adiciona-se 5 mg de DNAse a 2 1 da suspensão clarificada e a mistura ê agitada durante 30 min. a 49C. Subsequentemente a solução é levada a 35¾ de saturação com (NH^^SO^ (p/v) e ê agitada durante 1 hora a 49C. A solução ê centrifugada como descrito atrãs e o sedimento contendo toda a actividade de TPA ê ressuspensa em 1 1 de tampão H contendo 1¾ de Tween e 0,1¾ de SDS. A suspensão ê agitada durante pelo menos 1 hora a 49C. c) Cromatografia de imunoafinidade I) Purificação do anticorpo anti-TPA 5 ml de soro de coelho, anti -TPA (oferecido pelo Dr. E. Reich, Friedrich -Miescher-Institut Basel) são passados por uma coluna de sefarose com lisina para renovar o plasminogenio de soro. A coluna ê lavada com 1-2 volumes de PB5 pH 7,4 contendo NaCl 100 mM, KCI 2,7 mM, Na2HP04 8,lmM e KH2PO4 1,5 mM. $ rf* « « Ο líquido da coluna e de lavagens são juntos. 0 anti-soro sem plasminogênio é precipitado pela adição de (NH^)2SO^ sólido para uma concentração final de 50¾ (p/v). A solução ê mantida durante a noite a 4?C e em seguida centrifugada ( rotor Sorvall GSA,1200 rpm, 20 min.) . 0 precipitado e dissolvido num peque no volume de PB5 e dializado contra PBS contendo 0,1 ¾ de NaNj. A IgG desta solução dializada e purificada numa coluna de proteína A -sefarose (55). II) Preparação de uma coluna com anticorpo anti-TPA 13 mg de anticorpo anti-TPA purificado são dializados contra MOPS 0,1 M pH7,0. 0 anticorpo e ligado a 5 ml de Affigel 10 activado ( Biorad ) segundo as instruções do fabricante. A matrix do gel ó equilibrada com PBS contendo 1¾ de Tween 80, 0,1¾ de SDS, NaCl 0,2M, Benzamidin lOmM e 0,1¾ de NaN^. A matrix e aplicada numa coluna de 5 ml. III) Purificação de TPA por cromatografia de imunoafinidade. 0 sedimento redissolvido do fraccionamento com sulfato de amónio ê centrifugado para remover o material insolúvel ( rotor Sorvall GSA, 30 min. 12000rpm) e subsequentemente aplicado â coluna de afinidade a uma ve locidade de fluxo de cerca de lOml/hr a 49C. Depois de todo o volume ter passado através da coluna esta ê lavada com 10 volumes da coluna de PBS contendo 0,05¾. de Tween 80. A coluna ê eluída usando glicina-ΗΟΙΟ,ΙΜ pH2,5 contendo 0,1 ¾ de Tween. São colhidas fracções de 2 ml e testados para a actividade de TPA segundo o método de Rânby (49). Como substracto usa-se D-Val-Leu-Lis -pNA (Kabi -S-2251). As fracções com actividades mais elevadas são reunidas, neutralizadas usando Tris IM e concentradas por ultrafiltração usando uma membrana Amicon YM10. 0 TPA assim obtido apresenta cerca de 90¾ de pureza e estã predominantemente em forma de cadeia unica ( pro-TPA) como evidenciado por SDS-PAGE em condições de redução. 0 peso molecular aparente em condições não redutoras ê de cerca de 60 000 por SDS -PAGE (ver figura A). Figuras A e B : electroforese em gel de poliacrilamida-SDS do produto do gene TPA em levedura (Figura A) e a sua actividade enzimãtica num gel de actividade (placas com caseína) ( figura B). B:gel de actividade A:gel com SDS ad figura A (SDS-PAGE): Faixas 1 e 4 : proteínas padrão (marcadores de peso molecular) Faixas 2 e 5 : TPA de melanoma Faixas 3 e 6 : TPA de levedura Faixas 1 - 3 : em condições de redução Faixas 4 - 6 : em condições de não-redução As amostras correram num gel de 12,5¾ que se corou para proteínas usando azul Coomassie brilhante. ad. figura B (gel de actividade, cf. Exemplo 23): Faixa 1 : TPA de melanoma Faixa 2 : TPA de levedura Sobre-camada para plasminogénio de agar com caseira (referência 56) . Exemplo 21: Recuperação e purificação de TPA e pro-TPA por cromatografia de afinidade com DE-3 a. Preparação de uma coluna de DE-3 Sepharosé 26 mg do inibidor DE-3 purificado a partir de Erythrina latíssima (16) são acoplados a 5 ml de Sepharose 4b ® activada com brometo de cianogênio (Pharmacia) segundo as instruções do fabricante. A matrix ê equilibrada com tampão fosfato salino (&quot;PBS&quot;) pH 7,4 contendo NaCl 0,4M, 0,1¾ de Triton X-100R e 0,02¾ de azida de sódio. A matrix ê então acamada numa coluna de 5 ml. b. Purificação de TPA e pro-TPA por cromatografia em DE-3 R Sepharose 4b Os extractos celulares (cf. Exemplo 20a) são tornados 0,4 M relativamente a NaCl e 0,1¾ para Triton X-lOCr^ e filtrados através de uma membrana de 0,45 ^im (Millipore). A solução ê então aplicada à coluna de DE-3 Sepharose (ver atras) a uma velocidade de fluxo de 45ml/hr â temperatura ambiente e o efluente ê rejeitado. Depois do volume total do extracto ter passado através da coluna esta ê lavada com cerca de 50 ml de PB5 contendo NaCl 0,4 M e 0,1 ¾ de Triton X-lOO*' sendo colhidos fracções de 2 ml a 49C. 0 conteúdo protêico de cada fracção ê determinado por medição da absorvância de UV a 280nm. A proteína adsorvida verificou-se ser eluída como um pico bem definido. As fracções contendo os valores mais elevados de absorvância de UV e de activida125 de fibrinolítica determinada pelo teste da I fibrina (47) são reunidas dando 8 ml de solução que se guardou a -209 C. Isto representa aproximadamente 70-80¾ da actividade total aplicada à coluna. As fracções com as actividades »· mais baixas são reunidas separadamente. A recuperação total de actividade em ambos os conjuntos de fracções monta os 90-100¾. c). Purificação de pro-TPA por cromatografia em DE-3 Sepharose 4b® na presença de um inibidor de proteíases. A cromatografia dos extractos de células de levedura ê feita de modo semelhante ao descrito no Exemplo 21b exceptuando a inclusão neste caso do inibidor de tripsina pancreãtica bãsica (BPTI) a 0,1 KlU/ml usando o teste fluorimétrico como Cbz-Gly-Gly-Arg-AMC como substracto (37) determinou-se o conteúdo em TPA e pro-TPA da solução purificada. 90¾ do TPA estã na forma de pro-enzima e 10¾ na forma activa. Assim, a conversão de pro-TPA em TPA durante o processo de purificação é inibido pelo BPTI. Exemplo 22: Separação de pro-TPA do TPA A solução de TPA e pro-TPA obtida como descrito no Exemplo 21c e ajustada a pH8,0 com Tris.HCl O,1M contendo 0,1¾ de Triton X-lOcP e tornado lmM relativamente ao diisopropilfluorofosfato. Apos incubação a 37?C durante 4 horas, a mistura ê passada através de uma coluna de 5 ml de DE-3 Sepharose® (cf. Exemplo 21a). 0 efluente contendo o TPA irreversivelmente inibido é rejeitado. A coluna e lavada com 6 volumes de coluna de PBS contendo NaCl 0,4 M e 0,1¾ de Triton X-IOC^ e subsequentemente eluída com PB5 contendo K SCN 1,6M, NaCl 0,4M e 0,1¾ de Triton X-10C^ como descrito no Exemplo 21b . As fracções apresentando as absorvân. 1 s· P0RWI « ? » ... Ή , - - - , __. «τ'. cias de UV mais elevadas são reunidas. 0 conjunto de fracções contem pro-TPA numa forma substancialmente pura uma vez que não se detecta actividade amidolítica no teste fluorimêtrico usando Cbz-Gli-Gli-Arg-AMC (37) como substrato. A actividade amidolítica assim como a fibrinolítica pode ser restabelecida por tratamento com plasmina a qual converte pro-TPA em enzima activa. Exemplo 23: Propriedades do produto do gene TPA em levedura a. Propriedades enzimãticas 0 produto do gene TPA em levedura obtido segundo o Exemplo 19 e purificado por eromatografia de afinidade em DE-3 (cf. Exemplo 21b) ê enzimãticamente activo como se mostra por clivagem de plasminogênio zimogênio em plasmina na ausência e na presença de fibrina. A actividade enzimãtica pode ser verificada pelos testes colorimêtricos descritos por Ranby (49) (cf. Exemplo 12) e por Verheijen et al. (60) , em placas de caseína e de fibrina (56) e num teste de fase solida com 12 9 I - fibrinogenio ( 47). A actividade enzimãtica em placas de caseína ê mostrada na figura B ( cf. Exemplo 20 c III). A actividade enzimãtica do TPA obtido ê grandemente estimulada pela fibrina. 0 TPA parcialmente purificado por eromatografia de afinidade em DE-3 ê testado num teste de velocidade parabólica (cf. Ranby (49)). Tomando a velocidade reacção Δ E versus Δ t^ entre e 5 minutos como uma medida da actividade enzimãtica a estimulação por concentração óptimas de fibrina ê de 10-20 vezes ( ca. 100 yig /ml) . 0 efeito pode ser observado com fragmentos de fibrina obtidos por digestão com CnBr
DE3342139A1 (de) * 1983-11-22 1985-05-30 Ciba-Geigy Ag, Basel Desulfatohirudine, verfahren zu ihrer herstellung und pharmazeutische mittel
CA1341414C (fr) * 1984-03-27 2002-12-31 Paul Tolstoshev Vecteurs d'expression de l'hirudine, cellules transformees et procede de preparation de l'hirudine
DE3583361D1 (de) * 1984-06-14 1991-08-08 Ucp Gen Pharma Ag Verfahren zur herstellung von thrombin-inhibitoren.
FR2568891B1 (fr) * 1984-08-09 1988-05-27 Transgene Sa Procede de preparation d'une souche, notamment de levure, transformee par un vecteur d'expression, qui peut etre cultivee sur un milieu complet sans pression de selection et souche ainsi obtenue
DE3429430A1 (de) * 1984-08-10 1986-02-20 Hoechst Ag, 6230 Frankfurt Gentechnologisches verfahren zur herstellung von hirudin und mittel zur durchfuehrung dieses verfahrens
FR2593518B1 (fr) * 1985-05-02 1989-09-08 Transgene Sa Vecteurs d'expression et de secretion de l'hirudine par les levures transformees
GB8521496D0 (en) * 1985-08-29 1985-10-02 Ciba Geigy Ag Repressible yeast promoters
MC1834A1 (fr) * 1986-07-10 1988-06-03 Transgene Sa Bloc fonctionnel d'adn et plasmide codant pour l'hirudine,levure transformee,procede de preparation de l'hirudine,hirudine obtenue et son utilisation

Also Published As

Publication number Publication date
CA1341496C (en) 2006-02-14
NO865007D0 (no) 1986-12-11
JPS62208296A (ja) 1987-09-12
EP0225633A2 (en) 1987-06-16
FI865003A (fi) 1987-06-13
IL80932A0 (en) 1987-03-31
AU615413B2 (en) 1991-10-03
EP0225633B1 (en) 1992-08-12
JPH06197766A (ja) 1994-07-19
IL80932A (en) 1998-02-22
ATE79403T1 (de) 1992-08-15
GR3006248T3 (fi) 1993-06-21
EP0225633A3 (en) 1988-11-30
JPH0787791B2 (ja) 1995-09-27
AU6650486A (en) 1987-06-18
FI865003A0 (fi) 1986-12-08
ES2051688T3 (es) 1994-07-01
HUT42523A (en) 1987-07-28
NO178035C (no) 1996-01-10
NO865007L (no) 1987-06-15
NO178035B (no) 1995-10-02
PH31277A (en) 1998-07-06
MY101203A (en) 1991-08-17
DK595286D0 (da) 1986-12-11
HU209146B (en) 1994-03-28
DK175492B1 (da) 2004-11-08
DE3686399T2 (de) 1993-01-14
DE3686399D1 (de) 1992-09-17
IE863244L (en) 1987-06-12
PT83898B (pt) 1989-06-30
FI94773B (fi) 1995-07-14
DK595286A (da) 1987-06-13
IE57859B1 (en) 1993-04-21
JPH0650990B2 (ja) 1994-07-06
PT83898A (en) 1987-01-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
FI94773C (fi) Menetelmä trombiini-inhibiittorien tuottamiseksi
FI80720B (fi) Saccharmyces cerevisiae-hybridvektorer och deras anvaendning foer framstaellning av plypeptider.
FI90787C (fi) Menetelmä desulfatohirudiinin valmistamiseksi
US5102789A (en) Production of epideramal growth factor in pichia pastoris yeast cells
FI91280B (fi) Repressoituvat hiivapromoottorit
Miyajima et al. Secretion of mature mouse interleukin-2 by Saccharomyces cerevisiae: use of a general secretion vector containing promoter and leader sequences of the mating pheromone α-factor
CZ284251B6 (cs) Způsob výroby heterologního proteinu v transformované buňce
FI105482B (fi) Menetelmä heterologisen proteiinin valmistamiseksi eukaryoottisessa isäntäsolussa
US20020142414A1 (en) Process for the preparation of protease inhibitors
JPH0213377A (ja) デスルファトヒルジン化合物の製造方法
WO1992001048A1 (en) Production of aprotinin in methylotrophic yeast cells
US6410272B1 (en) Production of thrombin inhibitors
US6342373B1 (en) Process for preparing recombinant eglin, protease inhibitor
EP0662514A1 (en) Hirustasin, an antistasin type serine proteinase inhibitor from Hiruda
US5861377A (en) Antistasin type serine protease inhibitors
KR940011534B1 (ko) 억제성 효모 프로모터의 제조방법
JPH07241196A (ja) アルブミンおよびヒトアポリポプロテインｅ様遺伝子を有する融合遺伝子、それを挿入したプラスミド並びにその用途
IE881129L (en) Process for the production of proteins

Legal Events

Date Code Title Description
BB Publication of examined application
PC Transfer of assignment of patent

Owner name: NOVARTIS AG

FG Patent granted

Owner name: UCP GEN-PHARMA AG

MA Patent expired