KR0174263B1

KR0174263B1 - 수성 액상 효소 제형 및 이를 제조하는 방법

Info

Publication number: KR0174263B1
Application number: KR1019900012715A
Authority: KR
Inventors: 크리스트너 위르겐; 플라이너 헤르만; 라이너 롤란트
Original assignee: 헤틀러 부크; 룀 게엠베하
Priority date: 1989-08-18
Filing date: 1990-08-18
Publication date: 1999-02-01
Also published as: IT1240976B; SE9002623L; BR9004059A; DK197190D0; GB2234973A; DE3927286C2; ES2020889A6; FR2651006A1; US5169771A; GB9018065D0; GB2234973B; IT9067649A1; SE9002623D0; NL9001731A; FR2651006B1; DK197190A; DE3927286A1; CH681809A5; AR243602A1; JP3004327B2

Abstract

내용 없음.

Description

수성 액상 효소 제형 및 이를 제조하는 방법

본 발명은 직접 사용할 수 있는 제제의 형태로 수성 액상 효소 제형을 제조하는 방법 및 이러한 제형, 특히 췌장 복합체와 같은 단백질 분해 활성을 갖는 효소의 제형 및 이를 제조하는 방법에 관한 것이다.

액상 효소 제제는 효소의 이용화에 있어서 확실히 바람직한 위치를 갖는다. 이러한 이용은 효소의 안정에 부분적으로 기인한다[참조 : H. J Rehm G. Reed, ed., Biotechnology, vol. 7a, Enzyme Technology, pp. 722 and 731, Verlag Chemie, Weinheim, New York 1987].

액상 효소 제제는 오염물을 함유하지 않는 확실한 잇점이 있으며, 이는 알레르기 반응의 위험을 감소시킨다. 반면에, 수성 액상 효소 제형은 미생물 오염의 위험이 증가하므로, 일반적으로 미생물 성장에 대한 물 활성을 저하시키는 지지체 또는 방부제를 함유한다.

액상 제제의 추가 실제적 잇점은 선행 기술의 고체 제제 보다 조제하기가 더 쉽다는 것이다.

그러나, 미생물 오염이 시간 경과후 액상 제형중 효소의 열화의 유일한 원인은 아니다. 단백질 분해 효소를 주효소 또는 불순물로서 포함하는 경우 언제나 효소의 자체-분해가 일어나는 것 같다. 통상적으로 빠르게 일어나는 활성의 부수적인 손실은 췌장 프로테아제의 존재하에서 그 빈도가 매우 높고 물의 활성이 매우 낮은 경우에서 조차도 피하기 곤란하다. 한가지 방안은 지지재에 프로테아제를 공유결합시키는 것이다. 그러나, 지지체에 결합된 효소의 높은 비용은 별도로 하더라도, 고정화된 효소의 의도적인 이용은, 예를 들어 가죽 공업에서는 완전히 만족스럽지 않은 조건인, 분해될 기질의 상대 운동성에 근거한다. 한편, 공유결합되지 않고 미세캡슐, 필라멘트 또는 가교 결합된 중합체 젤에 혼입된 효소 혼합물은 에를 들어 가용성 효소와 매우 유사하게 각각 자동분해되거나 프로테아제에 의해 절단된다[참조: Ullmanns Enzyklopadie der technischen Chemie, 4th ed., Vol. 10, p. 544. Verlag Chemie, 1975].

췌장의 처리시 수반하는 문제는, 이들의 동물 유전학적 기원 때문에, 특히 췌장액이 개시될 높은 세균 적재량을 갖는다는 사실에 의해 악화된다.

공지된 바와 같이 상이한 기능을 갖는 효소가 소화계에서 공작용한다. 그러므로, 산업적으로 통상 사용하는 췌장 프로테아제 제제는 트립신(EC 3.4.4.5), 키모트립신(EC 3.4.4.5.), 및 수반하는 효소로서 아밀라제(EC 3.2.1) 및 리파아제(EC 3.1.1.3)을 함유할 수 있는 고체 형태의 다양한 펩티다제(예: EC 3.4.4.7)의 혼합물이다. 이러한 제제는 일반적으로 새로이 분비된 췌장액을 염으로 침전시키거나 인슐린 제조시의 잔여물로부터 제조된다. 모든 선의 매우 온화한 탈수화를 통해, 프로테아제가 비활성 전구체의 형태로 우세하게 존재하고 매우 높은 리파아제 함량을 가진 소위 판크레아틴을 수득한다. 이러한 제제는 사용전에 예를 들어 자동분해 또는 엔테로키나제 또는 산성 진균프로테아제 등의 부가로 활성화시켜야 한다[참조: U11manns Enzyklopadie der technischen Chemie, 4th ed., Vol. 10, pp. 515-537, Verlag Chemie, 1975; Kirk-Othmer, Encyclopedia of Chemical Technology, 3rd ed., Vol. 9, pp. 173-224, Wiley-Interscience, 1980.].

수성 액상 효소 제형이 실질적으로 유용하고 활성의 손실 및 오염과 같은 단점을 가지지 않도록 하려는 바램으로 유기 용매와의 혼합물과 같은 용액[참조: German Patent 18 08 834, Hungarian patent 2,642, GDR Patent 10,058] 또는 비수성 액상 제형을 포함하는 다양한 시도를 하였다. 그러나, 현재까지 이들 시도는 모든 관점에서, 특히 단백질 분해 활성을 가진 효소 및 특히 췌장 효소가 관련되는한 성공적이지 목하다[참조: German Patent 37 04 465 and U.S. Patent 3,741,902]. 유기 매질중의 액상 제형은 건조 형태의 효소의 제제를 거의 제조할 수 없고 가장 적합한 유기 매질, 예를 들어 프로필렌 카보네이트가 너무 비싼 단점이 있다.

따라서, 환경적으로 안전하고 산업적으로, 특히 가죽 공업용으로 너무 비싸지 않은 단백질분해 활성효소 및 특히 췌장 복합체의 충분히 안정한 수성 액상 제형을 제공할 필요가 여전히 있다.

본 발명에 이르러 이러한 목적이 본 발명의 방법에 의해 유리하게 수행될 수 있음을 밝혀내었다.

수성 액상 효소 제형을 제조하기 위한 본 발명의 방법은, 수성 매질 중에 존재하는 효소를 공지된 방법으로 세분 형태로 침전시키고 수성 매질 중에서 밀도를 조절함으로써 침강 내성적이고 미세하게 분산된 상태의 효소를 수득함을 포함한다.

지적한 바와 같이, 본 방법은 프로테아제, 단백질 분해 활성을 가진 효소 복합체, 보조 단백질 분해 활성을 가진 효소(예: 아밀라제, 리파아제 등) 및 특히 췌장 복합체(판크레아틴)의 수성 효소제제와 함께 이용할 수 있다.

단백질 분해 활성을 가진 효소란 우선 엔도펩티다제(프로테아제, EC 3.4)이며, 산업적으로 사용되는 효소가 본 발명의 목적상 주요 관심 대상이다[참조: Kirk-Othmer, 상기 참조, Vol 9; K. Aunstrup, in Industrial Aspects of Biochemistry. B. Spencer, ed., Vol. 30 (Ⅰ), pp. 23-46, North Holland, 1974.].

프로테아제는 하기 그룹으로 분류된다:

(a) 동물-유도된 프로테아제, 예를 들어,

(1) 레닌(EC 3.4.23.4) 및

(2) 췌장 프로테아제, 예를 들어 판크레아틴, 및 특히 트립신 및 키모트립신(최적 pH 범위, 약 7 내지 10), 펩신(EC 3.4.23.1)(최적 pH, 약 1.5 내지 4.0). 카텝신(EC 3.4.23.5)(최적 pH, 약 4.0 내지 5.0);

(b) 식물-유도된 프로테아제, 예를 들어,

(1) 파파인(EC 3.4.22.1)(최적 pH, 약 5.0 내지 8.0),

(2) 피신(EC 3.4.22.3)(최적 pH 범위, 약 4.0 내지 0.9) 및

(3) 브로멜라인(EC 3.4.22.4 및 3.4.22.5)(최적 pH, 약 5.0 내지 7.0) ;

(c) 미생물-유도된 프로테아제[참조: L. Keay in Process Biochemistry 1971, 17-21], 예를 들어

(1) 바실루스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 비.리체니포르미스(B. licheniformis), 비.알칼로필루스(B. alkalophilus), 비.세레우스(B. cereus), 비.나토(B. natto), 비.불가투스(B. vulgatus) 및 비.마이코이데스(B. mycoides)와 같은 바실루스(Bacillus) 종으로부터 수득한 프로테아제,

(2) 스트렙토코쿠스(Streptococcus) 종으로부터 수득한 프로테아제,

(3) 스트렙토마이세스 프라디에(Streptomyces fradiae), 에스.그리세우스(S. griseus) 및 에스.렉투스(S. rectus)와 같은 스트렙토마이세스(Streptomyces) 종으로부터 수득한 프로테아제,

(4) 아스퍼길루스 플라부스-오리재(Aspergillus flavus-oryzae), 에이.니저(A. niger), 에이.사이토리(A. Saitori) 및 에이. 우사미(A. usamii)와 같은 아스퍼길루스(Aspergillus) 종으로부터 수득한 프로테아제,

(5) 무코르 푸실루스(Mucor pusillus) 및 엠.미트레이(M. mietrei)와 같은 무코르(Mucor) 및 리조푸스(Rhizopus) 종으로부터 수득한 프로테아제,

(6) 엔도티아 파라시티카(Endothia parasitica)와 같은 엔도티아(Endothia) 종으로부터 수득한 프로테아제, 및

(7) 트라메테스 산기니아(Trametes sanguinea)와 같은 트라메테스(Trametes) 종으로부터 수득한 프로테아제,

공급원에 의한 분류이외에, 프로테아제를 공격점(엑소 효소 내지 엔도효소) 및 활성부위(세린 프로테아제, DFP에 의해 억제; 설프하이드릴 효소)를 기준으로하여 분류한다.

또한, 효소 활성의 pH 의존성은 실제적으로 매우 중요하다.

그러므로, 실제적인 관점으로부터, 프로테아제를 하기와 같이 분류한다.

(i) 알칼리성 프로테아제(최적 pH 범위 약 pH 7.5 내지 13), 특히 알칼리성 세균 프로테아제(EC 3.4.21)(이의 대부분은 세린 타입이다) 및 알칼리성 진균 프로테아제,

(ii) 중성 프로테아제(최적 pH 범위 pH 6.0 내지 9.0), 특히 중성세균 프로테아제(EC 3.4.24)(이는 금속성 효소에 속한다) 및 진균 프로테아제, 예를 들어 바실루스 프로테아제, 슈도모나스(Pseudomonas) 프로테아제, 스트렙토마이세스 프로테아제 및 아스퍼길루스 프로테아제.

(iii) 산 프로테아제(최적 pH 범위 pH 2.0 내지 5.0)(EC 3.4.23), 특히 예를 들어 리조푸스 종, 아스퍼길루스 종, 페니실루움(Penicillium)종, 무코르 종, 임펙스 락테우스(lmpex lacteus) 및 엔도티아 파라시티카(Endothia parasitica)로부터 수득한 산성 진균 프로테아제.

카제인[참조: 뢸라인-볼하르트(Lohlein-Volhard), 쿠니츠(Kunitz) 및 라스코브스키(Laskowski) 방법], 헤모글로빈[참조: 앤슨(Anson) 방법], 또는 젤라틴(점도측정법)이 시판제품의 분석시 기질로서 사용하기에 적당하다. 단백질분해 활성은 통상적으로 문헌[참조: TEGEWA in Leder, 22, 121-126, (1977)]에 의해 변형된 바와 같이 뢸라인-볼하르트 방법으로 측정한다. 1 뢸라인-볼하르트 단위(LVU)는 시험 조건하(1시간, 37℃)에 카제인 여액 20㎖ 중에서 0.1N NaOH 5.75 x 10∼e∼S0-3∼T∼H∼W㎖의 등가물에 상응하는 가수분해 생성물의 증가량을 생성하는 효소의 양과 같다. 또한, 효소의 단백질분해 활성은 앤슨 헤모글로빈 방법 [참조: M.L. Anson. J. Gen. Physiol., 22, 79 [(1939)]에 따라 종종 측정된다.

프로테아제는 가죽제조, 세제 및 드라이 크리닝, 호반, 치즈 제조, 연육과정, 맥주 안정화시 산업적으로 사용된다.

상기한 바와 같이, 또한 관심을 갖는 것은 단백질분해 활성을 갖는 효소 복합체 및 보조 단백질분해 활성을 갖는 효소이다. 이들은 아밀라제 및 특히 α-아밀라제를 포함하고[참조: Fischer and Stein, in The Enzymes, 2nd ed., P.D. Boyer et al., vol. IV, pp. 313-334, Academic Press], 시판제제와 같이 이는 통상적으로 수반하는 효소로서 프로테아제를 포함한다. 이들 α-아밀라제는 동물, 식물 또는 미생물 기원이다. 예를 들어 췌장 아밀라제, 세균 아밀라제 및 진균 아밀라제가 바람직하다.

여러 공급원으로부터 수득한 α-아밀라제(즉, 아밀로즈 또는 아밀로펙틴 내의 α-1, 4-글루코시드 결합을 절단하는 아밀라제)의 활성 범위는 pH 3.5 내지 pH 9.0에 이른다. 췌장으로부터 유도된 α-아미라제는 5.5 내지 9.0의 pH 범위에 걸쳐서 활성을 나타내고 최적 pH는 약 7.2이며, 세균으로부터 유도한 α-아밀라제는 4.5 내지 8.5의 pH 범위에서 활성을 나타내고 α-아밀라제를 액화시키는 최적 pH는 6.5 내지 7.0이며 α-아밀라제를 당화시키는 최적 pH는 4.8 내지 5.2이다. 진균 α-아밀라제의 활성 범위는 3.5 내지 7.0(최적 pH 5.0)이고 맥아로부터 수득한 α-아밀라제의 활성 범위는 4.5 내지 7.0(최적 pH 4.7)이다[참조: Ulmanns, 상기 참조: vol. 10, p. 507].

바실루스 서브틸리스, 비.메센테리쿠스(B. mesentericus), 비.폴리믹사(B. polymixa), 비.아밀로리쿠에파 시엔스(B. amyloliquefaciens) 및 비.리체니포르미스와 같은 바실루스 종으로부터; 진균, 및 특히 아스퍼길루스 니저, 에이.포에니시스(A. phoenicis), 에이.오리재(A. oryzae) 및 에이. 아와모리(A. awamori)와 같은 아스퍼길루스 종으로부터; 무코르 로우시아누스(M. rouxianus)와 같은 무코르 종으로부터; 리조 푸스 델레마르(R. delemar), 알.오리재 및 알.쟈포니 쿠스(R. Japonicus)와 같은 리조푸스 종으로부터; 및 엔도마이세스 피불 리저(E. fibuliger)와 같은 엔도마이세스 종으로부터 수득한 아밀라제의 생산은 꾸준히 중요성이 증가한다. 아밀라제는 식품 부분[참조: H.J. Rehm G. Reed, ed., Biotechnology, vol. 5, Verlag Chemie, 1983; B. Spencer, ed., Industrial Aspects of Biochemistry, vol. 30, part I, pp. 139-186, 213-260, Elseviers, 1973]. 전분 액화, 맥아 및 에탄올의 제조, 호반, 가죽제조 등에 사용한다. α-아밀라제의 활성은 샌드스테트(Sandstedt), 닌(Kneen) 및 블리쉬(Blish)[참조: Cereal Chem. 16, 172 [1939] and Technical Bulletin No. 1024, U.S. Department of Agriculture]의 방법에 의해 기질로서 전분을 사용하여 측정할 수 있다. 1 아밀라제 단위(=1 SKB 단위)는 30℃에서 다른 특정 반응 조건하에 1시간 동안 가용성 전분 1g을 덱스트린화할 수 있는 효소의 양이다.

빌스테터(Willstatter)의 방법을 또한 사용하여 췌장 아밀라제의 활성을 측정한다[참조: Hoppe-Seylers, Z. physiol. Chem. 126, 143 [1923].]. 1 빌스태터 아밀라제 단위는 특정 시험 조건하에 단핵 반응 상수가 0.01인 속도로 전분을 절단하는 효소의 양의 100배로서 정의된다.

또한, 본 발명의 방법은 보조 단백질 분해 활성을 갖는 리파아제(EC 3.1.1.3)에도 적용된다. 공지된 바와 같이, 리파아제는 수성 유액중 글리세롤의 에세테르를 분리시키는 카복실 에스테라제이다.

리파아제를 하기와 같이 분류할 수 있다.

췌장 리파아제: 이는 에스테라제, 프로테아제 및 아밀라제 이외에 공업적으로 중요한 수반하는 효소로서 췌장 효소 복합체에 포함된다. (올리브유에 대한) 최적 pH는 7 내지 8.5이다: 활성의 범위는 pH 6.5 내지 pH 9.5이다. 리파아제는 일반적으로 특히 수반하는 프로테아제에 의한 단백질 분해에 대해 매우 불안정하다.

미생물 리파아제: 예를 들어, 슈도모나스 프라지(Pseudomonas fragii), 아스퍼길루스 종(예: 에이.루추엔시스(A. luchuensis), 캔디다 실린드라세아(Candida cylindracea), 지오트리춤 캔디둠(Geotrichum candidum), 후미콜라 랑귀노사(Humicola languinosa), 무코르 푸실루스, 페니실리움 종[예: 피. 크리소제움(P. chrysogenum) 및 피.옥살리쿰(P. oxalicum)] 및 리조푸스 종[예: 알. 니게리칸스(R. nigericans) 및 알.오리재]로부터 수득함. 이들 리파아제는 일반적으로 최적 pH가 7.0이상이다.

리파아제의 활성은 통상적으로 기질로서 올리브유를 사용하지만 또한 트리아세틴 및 트리부티린을 사용하여 측정된다[참조: M. Semeriva et al., Biochemistry 10. 2143 [1971]; Pharmaceutical Enzymes, edited by R. Ruyssen and A. Lauwers, 1978[FIP].]

지질분해 활성을 킬로 리파아제 단위(KLCA)로 표시할 경우 트리부티린이 표준 조건(40℃, pH 5.5)하에서 기질로서 사용된다[참조: M. Semeriva, 상기 참조].

리파아제를 폐기물 처리, 가죽 공업 및 식품 부분에서 이의 불안정에 의해 허용되는 범위까지 사용한다.

본 발명의 방법의 특히 바람직한 대상물은 췌장 복합체이다. 췌장에서 트립시노겐은 종 단백질 함량의 약 23중량%이고 키모트립시노겐은 약 10 내지 14중량%이다.

본원에서 특별히 관심을 갖는 췌장 복합체의 효소는 이미 특성화되었다. 리보누클레아제(EC. 2.7.7.16), 데옥시리보누 클레아제(EC 3.1.4.5), 키모트립시노겐 B 및 키모트립시노겐 뿐만 아니라 트립시노겐을 소 췌장으로부터 분리할 수 있다.

췌장 복합체로부터 효소를 분리하는 방법은 문헌[참조: Ullmanns, 상기 참조, vol. 10, pp. 535-537.]에 상세히 기술되어 있다.

본 발명의 방법은 하기와 같다.

(A) 췌장 복합체로부터 분리.

본 발명의 방법은 선행 기술의 분리 방법을 어느 정도 따른다[참조: Ullmans. 상기 참조. vol. 10, pp. 536-537].

1. 추출

주로 돼지(hog) 또는 소(cattle)를 도살한 후 즉시 췌장에서 분리를 시작한다. 도살한 후 즉시 선으로부터 가능한한 많은 지방 및 결합 조직을 떼어내고 이어서 에를 들어 조리용 분쇄기로 선조직을 균질화시켜, 예를 들어 약 100개의 췌장선을 한 배치에서 처리한다. 이를 즉시 5℃에서 18 내지 24시간 동안 0.25N 황산 약 2배 용적(약 60ℓ)으로 유리하게 추출시킨다. 필터 플레이크를 가한 후, 추출물을 필터 압착기, 유리하게는 플레이트 및 프레임 압착기에 통과시킨다. 필터 플레이트는 버릴 수 있다.

2. 처리

실질적으로 무지방 여과시킨 췌장 추출물을 실온에서 많은 황산 나트륨 또는 황산 암모늄(A 염)을 빨리 가하여 침전시킨다. 고체 무수 A염의 첨가량은 유리하게는 액체 추출물의 약 50±2중량%이다.

침전을 예를 들어 톱니 모양의 디스크(toothed-disk) 교반기로 격렬히 교반시켜 보다 세분되게 분쇄시키는 것이 유리할 수 있다. 그러나, 대부분의 경우 A염을 빨리 가함으로써 췌장 효소를 세분형으로 침전시킬 수 있기 때문에 분쇄 과정을 수행하지 않을 수 있다.

필요할 경우, 생성물을 특정 목적하는 활성물로 제형화하고 표준화하기 위해 예를 들어 물 61.7kg 당 A염 38.3kg을 사용하여 A-염 등장용액으로 희석시킨다. 수성 효소제제의 밀도는 고체 A염 또는 물을 가하여 1.22 내지 1.23으로 조절해야 한다. 췌장 복합체를 사용한 실험 결과, 효소 현탁액은 지금까지 수득된 결과를 기준으로하여 1.22 내지 1.23의 좁은 밀도 범위에서만 침강에 대해 실질적으로 내성을 유지하는 것으로 나타났다. 그러므로, 본 발명의 목적을 위해 필수적인 좁은 밀도 범위를 고수해야 한다. 이러한 규칙은 또한 상기한 바와 같이 다른 공급원으로부터의 효소의 조 추출물에 대해서도 적용된다.

3. 추가의 제형화

본 발명에 따른 배양 여액, 특히 췌장 기원 여액의 등장성 표준화는, 수일 내지 수주 기간 동안 요구 조건과 부합하여 대부분의 경우에서 시판 이용화 조건을 만족시키기 위해 따를 수 있는 침강-내성 제형을 제공할 수 있게 해준다. 그러나, 침강내성은 부수적인 밀도 변화 또는 변동을 통해, 담체 액체(물)의 증발 또는 뚜렷한 온도 변화에 의해 감소될 수 있다. 이어서 효소 현탁액이 분해될 수 있다(크림화 또는 침강). 그러나, 엄격한 실제 요구조건은 충분한 침강-내성 및 균질한 효소제제를 필요로 한다.

놀랍게도, 강한 전해질 효소 현탁액(예를 들어 38.3중량%의 A염을 함유)의 적절한 농조화가 단지 하나 이상의 크산탄계 농조화제를 사용함으로써 수행될 수 있다.

사용하기에 적당한 농조화제는 특히 크산탄[(폴리사카 라이드) B-1459, 켈트롤 에프.켈잔(Keltrol F. Kelzan); (참조: Kirk-Othmer, Encyclopedia of Chemical Technology, 3rd ed., vol. 12, pp. 62-66, J. Wiley Sons, 1980; Rees Welch, Angew, Chemie 89, 228-239 (1977)]. 또는 다른 크산탄계 농조화제이다. 예를 들어, 0.1 내지 5%, 및 바람직하게는 0.1 내지 1%의 농도의 특별히 변형된 크산탄 유도체[예: Kelco(San Diego, Calif)에서 제조된 음이온성 헤테로폴리사카라이드인 K1A96]를 사용한 농조화에 의해 38.3중량%의 A-염 용액과 함께 200 내지 100mPa s의 점도를 초래한다.

일반적으로, 38.3중량%의 고체 A염 용액중 크산탄 또는 이의 유도체 0.1 내지 5중량%을 사용한 농조화는, 특히 크산탄을 예를 들어 전단 작용으로 1 내지 5m/초의 주변 속도로 매우 빠르게 처리할 경우 매우 우수한 결과를 가져올 것이다. 이러한 크산탄 용액은 침전에 사용된 A-염 용액과 등장성이어야 한다. 이 용액을 A염으로 침전시킨 여과된 췌장 추출물에 직접 가하여 목적하는 최종 활성의 효소를 수득할 수 있다. 그러나, 비등장성 조건, 예를 들어 1 내지 1.5의 보다 넓은 밀도 범위에서 침강 내성 효소 제형을 수득하기에 충분한 농조화도가 얻어진다는 것이 밝혀졌다. A염으로 침전시킨 췌장 현탁액을 농조화시킨 A-염 등장용액으로 희석시키는 경우 점도가 약 50% 만큼 감소된다는 것이 주목된다. 그러나, 100 내지 500mPa s의 점도로도 충분한 침강-내성 및 활성-안정화된 균질한 효소 제제가 수득된다.

(B) 기타 프로테인아제-함유 조 추출물로부터의 분리

진균 또세균 배양물로부터 액상 추출물을 함유하는 기타 프로테인아제를, 예를 들어 췌장의 액상 추출물 대신 사용할 수 있다(효소에 대한 상기 데이터 참조).

더욱이, 본 발명의 방법을 배합된 진균 프로테인아제/ 췌장 프로테인아제 또는 세균 프로테인아제/췌장 프로테인아제에 적용할 수 있다. 두가지 선택은 하기와 같다:

(a) 다양한 액상 배양 추출물을 5℃ 내지 10℃에서 혼합하고 A염으로 즉시 침전시킨다. 이어서 임의의 공조화된 A-염 용액을 사용한 등장 희석을 통해 목적하는 최종 활성물을 수득한다.

(b) 세균 또는 진균 프로테인아제 제제(A-염 침전)를 췌장 현탁액과 유사하게 각각 제조한다. 이어서 췌장 제제와 등장성인 세균 또는 진균 프로테인아제 제제를 가하고, 필요할 경우 표준화를 위해 등장성으로 희석시키며, 지시되는 경우 농조화된 A-염 등장용액으로 안정화시킨다.

각 경우에 있어서, 침강 내성 및 안정한 활성을 모두 갖는 제형이 수득된다.

이의 높은 전해질 함량 때문에, 이들 효소 현탁액은 통상적으로 미생물 분해에 안정하게 할 필요가 없다. 한편, 통상의 방부제의 부가에 불리한 기술적인 고려가 필요없다.

과거 경험으로 보아, 액상 매질은 침강 내성이 성취될 수 있도록 모든 효소의 경우에 대해 1.22 내지 1.23의 밀도 범위를 가져야 한다. 이는 농조화제를 갖는 최종 제형에도 적용된다.

본 발명을 설명하기 위해 제시된 하기의 특정 실시예를 참조로 하여 본 발명의 보다 충분한 이해 및 이의 많은 잇점이 이해될 수 있다.

밀도는 20℃에서 보정된 눈금 실린더에서 정의된 용적의 중량을 정확히 측량하여 결정된다.

점도는 또한 20℃에서 브룩필드(Brookfield) 점도계로 측정된다.

[실시예]

[실시예 1]

20℃에서 밀도 1.22 내지 1.23g/㎤의 등장용액 제조

수돗물 61.7kg을 교반된 탱크에 도입하고 무수 황산암모늄 38.3kg과 혼합한다. 배치를 모든 염이 용해될 때까지 교반한다. 1.22 내지 1.23g/㎤의 밀도가 되지 않을 경우, 염 또는 물을 가하여 조절할 수 있다.

[실시예 2]

췌장 효소를 포함하는 수성 액상 효소 제형의 제조

췌장의 분쇄, 활성화 및 추출 후 수득한, 활성이 30,100LVU인 액상 추출물 100kg을 교반된 탱크로 도입하고, 황산 암모늄 50kg과 혼합한다. 이어서 췌장 효소를 침전시킨다. 췌장 효소 현탁액(29,600LVU)의 평균 활성은 28,000 내지 32,000 LVU/g(밀도, 1.22 내지 1.23g/㎤)이다. 목적하는 LVU 활성 기준을 실시예 1로부터 제조한 등장성 암모늄 염용액을 가하여 얻을 수 있다. 효소 제제를 더 희석할수록 침전된 효소는 보다 빠르게 침강할 것이다.

1,000 내지 3,000LVU : 수시간 또는 수일 후 침강.

3,000 내지 9,000LVU : 1주 또는 수주후 침강.

약 16,000LVU 이상 : 침강을 실질적으로 내성.

25℃에서 6주후 순수한 수성 췌장 효소 용액의 활성 손실 : 81%.

25℃에서 6주후 췌장으로부터 수득한 침전된 효소 현탁액의 활성 손실 : 8.9%.

[실시예 3]

활성이32,000LVU인 아스퍼길루스 파라시티쿠스로부터 수득한 진균 프로테아제의 투명한 수용액 100kg을 16℃에서 황산 암모늄 50kg과 혼합하여 효소를 침전시킨다. 밀도가 1.22 내지 1.23g/㎤인 효소 현탁액(31,400 LVU)을 실시예 1의 황산 암모늄 등장용액을 사용하여 목적하는 활성으로 희석시킨다. 수일 동안 침강에 내성인 효소 제제를 수득한다.

25℃에서 6주간 정치후 효소현탁액의 활성 손실 : 4.3%

비교 : 25℃에서 6주간 정치후 순수한 수성 진균 프로 테아제(침전없음)의 활성 손실 : 62%

[실시예 4]

활성이 30,100LVU이고, 온도가 10℃인 췌장의 액상 추출물(실시예 2로부터) 50kg 및 홀성이 32,000LVU이고 온도가 10℃인 액상 진균 프로테아제 추출물(실시예 3으로부터) 50kg을 교반된 탱크에서 혼합한다. 혼합한 후 즉시 황산 암모늄 50kg을 교반하면서 빨리 가하여 효소를 침전시킨다. 활성이 61,200LVU인 효소 현탁액을 수득한다. 밀도는 1.22 내지 1.23g/㎤이다. 목적하는 활성물을 실시예 1로부터 황산 암모늄 등장용액으로 희석시켜 수득할 수 있다.

25℃에서 6주후 효소 혼합물(침전없음)의 활성 손실 : 74%.

25℃에서 6주후 효소 현탁액(침전됨)의 활성 손실 : 10.1%.

[실시예 5]

바실루스 리체니포르미스로부터 수득한 수성 액상 세균 프로테아제(43,200LVU, 10℃) 50kg 및 실시예 2로부터 수득한 췌장의 액상 추출물(31,100LVU, 10℃) 50kg을 교반된 탱크에서 혼합하고 이어서 황산 암모늄 50kg과 혼합한다. 이로써 효소가 침전된다. 활성이 35,400LVU인 효소 현탁액이 수득된다. 밀도는 1.22 내지 1.23g/㎤이고, 황산 암모늄 등장 용액(실시예 1)으로 희석시켜 목적하는 활성으로 유도할 수 있다. 25℃에서 6주간 정치시킨 후 활성이 12% 감소되었다. 이와는 대조적으로, 침전되지 않은 효소 혼합물의 활성은 동일한 조건하에서 88% 감소되었다.

[실시예 6]

(a) 췌장 효소 침전물(활성이 29,600LVU인 실시예 2로부터 수득한 분산액) 3kg을 황산 암모늄 등장용액 26.6kg과 혼합한다. 3일간 침강에 내성이 있고 활성이 3,000LVU인 효소 현탁액을 수득한다. 25℃에서 6주간 정치시킨 후 이의 활성은 8.7% 감소되었다.

(b) 진균 프로테아제 침전물(실시예 3으로부터 수득한 분산액) 3kg을 황산 암모늄 등장용액 28.4kg과 혼합한다. 4일간 침강에 내성이 있고 활성이 3,000LVU인 효소 현탁액이 수득된다. 6주간 정시킨후 이의 활성은 5.5% 감소되었다.

활성이 3,000LVU인 실시예 6(a)로부터 수득한 췌장 프로테아제 현탁액 30kg을 활성이 3,000LVU인 실시예 6(b)로부터 수득한 진균 프로테아제 분산액 30kg 과 혼합한다. 혼합물은 3,000LVU의 활성 및 1.22g/㎤의 밀도를 갖는다. 25℃에서 6주간 정치시킨 후 활성이 9.8% 감소되었다. 이와 대조적으로, 동일한 효소의 침전되지 않은 혼합물의 활성은 동일 조건하에서 88% 만큼 감소되었다.

[실시예 7]

충분히 침강내성이 있고 쉽게 이용할 수 있는 자유 유동 수성 효소 제제의 제조

(a) 물 60.7kg을 교반된 탱크에 도입시키고, 크산탄계 농조화제(예: K1A96, Kelco 제품) 1kg을 톱니 모양의 디스크 교반기(주변 속도: 2 내지 3m/sec)를 사용하여 이에 도입시킨다. 용액의 점도가 1,000mPa s이상으로 증가할 때 황산 암모늄 38.3kg을 가한다. 황산 암모늄이 실질적으로 용해될 때까지 용액을 교반시켜 점도를 480mpa s로 감소시킨다.

(b) 실시예 4로부터 수득한 침전된 효소 현탁액(진균 호소, 62,200LVU) 3kg을 실시예 7(a)로부터 수득한 농조화된 황산 암모늄 58.2kg을 가하고 톱니모양의 디스크 교반기로 균질하게 혼합한다. 활성이 3,000LVU이고 점도가 270mPa s인 충분한 침강 내성 효소 현탁액이 수득된다. 침전되지 않은 효소 혼합물은 25℃에서 6주간 정치시킨 후 74%의 활성 손실이 있는 반면, 적당히 농조화시킨 효소 현탁액은 단지 9.2%의 활성 감소를 보였다.

Claims

수성 매질 중에 존재하는 효소를 세분형으로 침전시키고 이어서 동일한 수성 매질에서 밀도를 조절하여 효소가 침강-내성을 갖고 미세하게 분산된 상태가 되도록함을 특징으로 하여, 안정성을 갖는 단백질 분해 효소의 수성 액상 제형을 제조하는 방법.
제1항에 있어서, 단백질 분해 효소가 프로테아제(EC 3.4)인 방법.
제2항에 있어서, 효소가 미생물 기원인 방법.
제1항에 있어서, 효소를 보조 프로테아제 활성을 갖는 아밀라제(EC 3.2.1) 및 리파아제(EC 3.1.1.3) 그룹 중에서 선택하는 방법.
제1항에 있어서, 효소가 췌장 복합체에 속하는 방법.
제1항에 있어서, 효소가 통상의 효소 생성물로 부터의 추출물의 형태로 사용되는 방법.
제1항에 있어서, 상기 효소를 포함하는 수성 매질에 불활성 염을 가하여 효소를 세분형으로 침전시키는 방법.
제7항에 있어서, 침전을 황산 암모늄 또는 황산 나트륨으로 수행하는 방법.
제1항에 있어서, 수성 매질의 밀도를 1.22 내지 1.23으로 조절하는 방법.
제1항에 있어서, 크산탄계 농조화제를 미세하게 분산된 효소 현탁액에 가하여 침강에 대한 내성을 중진시키는 방법.
제10항에 있어서, 크산탄계 농화제를 황산 암모늄 또는 황산 나트륨으로 함유하는 수성 등장 용액 형태로 가하는 방법.
제11항에 있어서, 크산탄계 농조화제의 용액을 전단력을 이용한 교반에 의해 제조하는 방법.
제12항에 있어서, 크산탄계 농조화제가 용액중 0.1 내지 1중량%인 방법.
제1항에 있어서, 상이한 공급원으로부터 수득된 효소의 혼합물을 침전시키고 함께 후처리하는 방법.
제1항에 있어서, 상이한 효소의 현탁액을 별도로 제조한 후 혼합하여 안정한 제형을 제조하는 방법.
제1항에 따른 방법에 의해 제조되며, 액상 효소 추출물 및 고체 염을 2:1의 중량비로 포함하고 1.22g/㎤ 내지 1.23g/㎤의 밀도를 가짐을 특징으로 하는 안정한 수성 액상 효소 제형.
제14항에 따른 방법에 의해 제조되며, 액상 효소 추출물 및 고체 염을 2:1의 중량비로 포함하고 1.22g/㎤ 내지 1.23g/㎤의 밀도를 가짐을 특징으로 하는 안정한 수성 액상 효소 제형.
제15항에 따른 방법에 의해 제조되며, 액상 효소 추출물 및 고체 염을 2:1의 중량비로 포함하고 1.22g/㎤ 내지 1.23g/㎤의 밀도를 가짐을 특징으로 하는 안정한 수성 액상 효소 제형.