DE2234412B2

DE2234412B2 - Verfahren zur Stabilisierung und Fällung konzentrierter Protease-Lösungen

Info

Publication number: DE2234412B2
Application number: DE2234412A
Authority: DE
Inventors: Wolfgang Dipl.-Chem. Dr. 5605 Hochdahl-Willbeck Schreiber
Original assignee: Henkel AG and Co KGaA
Current assignee: Henkel AG and Co KGaA
Priority date: 1972-07-13
Filing date: 1972-07-13
Publication date: 1980-07-03
Also published as: NL7309196A; DK131346B; FR2193029B1; DE2234412A1; IT1001518B; FR2193029A1; ES416813A1; DK131346C

Description

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Fällung konzentrierter Protease-Lösungen, bei dem zur Vermeidung von Aktivitätsverlusten eine Stabilisierung der Protease durch den Zusatz von Lactalbumin und/oder Trockenmagermilchpulver erfolgt.

Unter den vielen bekannten Methoden zur Reinigung von Proteasen hat sich diejenige über einen Ionenaustaucher am besten bewährt. Hierzu wird die durch Feststoffe und andere Beimengungen verunreinigte Lösung, zum Beispiel eine proteasehaltige Fermenterbrühe, unter Zusatz üblicher Hilfsmittel klar filtriert, verdünnt und an einem Ionenaustauscher adsoibiert. Nach dem Waschen des Austauschers und Elution der Protease mit einer Salz- oder Pufferlösung wird eine weitgehend reine konzentrierte Enzymlösung erhalten. Diese konzentrierte Proteaselösung ist instabil und wird beim Stehen, aber vor allem bei der üblichen technischen Fällung mit Natriumsulfat in erheblichem Maße inaktiviert. Es stellte sich daher die Aufgabe, diese im Zuge der Aufarbeitung eintretende Inaktivierung nach Möglichkeit vollständig oder doch zumindest weitgehend zu unterbinden.

Es sind bereits Verfahren beschrieben worden, um Protease in wäßrigen Lösungen mit niedrigem Enzymgehalt zu stabilisieren. So wird gemäß der amerikanischen Patentschrift 3296094 ein hydrolysiertes und löslich gemachtes Kollagen und Glyerin zur Stabilisierung wäßriger Lösungen von proteolytischen Enzymen eingesetzt. Nach diesem Verfahren sind jedoch so große Mengen Glycerin erforderlich, daß es allein aus diesem Grunde für eine Stabilisierung der zu fallenden Proteaselösungen ausscheidet. Has gleiche gilt für den in der amerikanischen Patentschrift

3095358 gebrachten Vorschlag, die Stabilisierung mittels Sorbit vorzunehmen. Weiterhin ist bereits zur Stabilisierung verdünnter proteolytischer Enzymlösungen der Zusatz von Propylenglykol, DiäthylenglykoljPolyäthylenglykol, niederen Alkoholen, niederen Ätheralkoholen, Dialkylfonnamiden, Tetrahydrofuran, Dioxan und Aceton vorgeschlagen worden.

Versuche mit den bereits beschriebenen Stabilisierungsmitteln für verdünnte proteolytische Enzymlösungen haben gezeigt, daß diese für die Stabilisierung einer durch Reinigung über Ionenaustauscher gewonnenen konzentrierten Proteaselösung, die on Anschluß an die Reinigung gefällt werden soll, nicht geeignet sind. Von den bekannten Stabilisierungsmitteln zeigte nur Däthylenglykol eine brauchbare Stabilisierungswirkung, jedoch bereitet es bei dem Einsatz in zur Stabilisierung ausreichenden Mengen ,Schwierigkeiten bei der Fällung des Enzyms. Bei der üblichen Fällung der Protease aus dem konzentrierten Eluat mittels Natriumsulfat ergeben sich bei Gegenwart von Diäthyienglykoi gallertartige, praktisch nicht mehr filtrierbare Niederschläge. Danach konnten die bekannten Verfahren zur Stabilisierung verdünnter proteolytischer Enzymlösungen zur Lösung des vorliegenden Problems, der Stabilisierung konzentrierter Proteaselösungen während der Aufarbeitung, nicht beitragen.

Ein spezielles Verfahren zur Fällung von Enzymen aus Gärbrühen ist aus DE-OS 2046596 bekannt. Hierbei wird von einer gegebenenfalls durch Zusatz eines Flockungsmittels vorgereinigten Gärbrühe ausgegangen, aus der das Enzym durch Natriumsulfat gefällt und die so gebildete Ausflockung über ein Filter mit Anschwemmschicht angesaugt wird unter Verwendung von Calciumsulfat-dihydrat als Filterhilfsmittel. Man gewinnt ein Enzympufver mit einem hohen Gehalt an Natriumsulfat und gegebenenfalls Calciumsulfat. Eine Inaktivierung des Enzyms in der Gärbrühe wird hierbei jedoch nicht verhindert, so daß die Fällung und Aufarbeitung ohne Verzögerung erfolgen muß.

Es wurde nun gefunden, daß sich die Stabilisierung und Fällung von konzentrierten wäßrigen Proteaselösungen mit sehr guten Ergebnissen durchführen läßt, wenn man den Lösungen als Stabilisierungsmittel Lactalbumin und/oder Trockenmagermilchpulver zusetzt und das Enzym bei erhöhter Temperatur durch Salzzusatz, insbesondere Natriumsulfatzusatz, fällt.

Proteasen, auf die das erfindungsge->.iäße Verfahren angewendet werden kann, leiten sich im allgemeinen vor. °ilzen und Bakterien ab. Eine Anwendung des vorliegenden Verfahrens auf andere proteolytische Enzyme, die aus pflanzlichen und tierischen Quellen stammen, ist grundsäztlich möglich, bedarf jedoch durch die unterschiedlichen Eigenschaften und das andere Verhalten solcher Produkte spezieller Modifikationen. Proteolytische Enzyme relativ hoher Aktivitäten, die dem Verfahren zugänglich sind, lassen sich durch Züchtung von Mikroorganismen verschiedener Gattungen, z, B. Stämmen der Gattung Fusarium, Giberella, Streptomyces, Aspergillus, Penicillium, Cytophage, Arthrobacter, Serratia, Pseudomonas und Bacillus gewinnen. Besondere Bedeutung kommt dem Verfahren zur Stabilisierung und Fällung alkalischer Proteasen, wie z. B. Aminopeptidase, Carboxypcptidase, Keratinase, Elastase, Aspergillopeptidase, Subtilisin und ähnlichen zu. Der bevorzugte Anwendungsbereich vorliegenden Verfahrens ist jedoch die

20

25

30

Stabilisierung und Fällung alkalischer Proteaselösungen, die aus über Ionenaustauscher gereinigten und aufkonzentrierten Fennenterlösungen von Züchtungen der Spezies Bacillus subitilis und Bacillus licheniforrois stammen·

Im Zuge der Aufarbeitung solcher Fermenterlösungen aus Züchtungen von Bacillus subitilis oder Bacillus licheniforrais wird die Protease aus der filtrierten oder zentrifugierten Lösung, die noch durch Farbstoffe und andere Beimengungen verunreinigt ist, an Ionenaustauscher adsorbiert. Hierfür lassen sich verschiedene Kationenaustauscher, z. B. auf Basis von Acrylatharzen, Methacrylatharzen, durch Sulfonsäuregruppen abgewandelten Polymerisaten, wie z, B. Polystyrol, besonders behandelter Carboxymethylcellulose usw. einsetzen. Die nach dem Auswaschen des Austauschen durch Elution mittels einer Salzoder Pufferlösung gewonnene konzentrierte Proteaselösung wird mit Lactalbumin und/oder Trockenmagermilch versetzt Die zu verwendende Menge an Stabilisierungsmittel bewegt sich in den Grenzen von 2 bis 20 Gew.-%, vorzugsweise 5 bis 15 Gew.-%, bezogen auf die zu stabilisierende konzentrierte Proteaselösung. Die Fällung der Protease aus diesen stabilisierten Lösungen wird in der Praxis durch Aussalzen mit z. B. Natriumchlorid, Ammoniurnsulfat, Calciumchlorid, insbesondere aber mit Natriumsulfat bei erhöhter Temperatur um 35-40 ^e C vorgenommen. Bei dieser Art der Fällung verbleibt in den Mutterlaugen in der Regel unter 0,5% der Aktivität, so daß der starke Aktivitätsabf <#, der bei der Fällung nicht stabilisierter Proteaselösungen zu beobachten ist, auf die Inaktivierung des Enzyms während der Aufbewahrung in konzentrierter Lösung im Zuge der Aufbereitung und durch den Fällungsvorgang zurückzuführen ist.

Während in nichtstablisierten und mit bisher üblichen Stabilisierungsmitteln versetzten Proteaselösungen ein Rückgang der Aktivität in der Lösung und ein Rückgang an gefälltem aktivem Enzym um etwa V₃ bis zur Hälfte der Ausgangsaktivität zu verzeichnen ist, läßt sich die Aktivität durch den erfindungsgemäßen Zusatz an Stabilisierungsmittel!! fast in voller Höhe erhalten, und auch unter ungünstigen Verhält* nissen beträgt der Rückgang weniger als 10%.

Die nachfolgenden Beispiele sollen den Gegenstand der Erfindung näher erläutern, ohne ihn jedoch hierauf zu beschränken.

Beispiele

Eine filtrierte und verdünnte, durch Züchtung einer Spezies Bacillus subtilis erhaltene Protease-Kulturlösung wurde an einem vernetzten Carboxymethylcelluloseaustauschef bei einem pH-Wert von 6,0 (Phosphatpuffer) adsorbiert und mit einem 0,1 molaren ·-,·-> Natriumphosphatpuffer bei pH 7,0 eluiert. Die erhaltene konzentrierte Proteaselösung mit einer Aktivität von 33,5 Mio. Protease-Einheiten pro Liter wurde in mehreren Proben ohne und mit Zusatz verschiedener Stabilisierungsmittel 20 Stunden bei einer Tempera- m> tür von 37° C aufbewahrt. Nach dieser Zeit wurde in den einzelnen Proben die Restaktivität gemessen und in prozentuale Beziehung zur Ausgangsaktivität gebracht. Die dabei erhaltenen Werte sind nachstehender Tabelle zu entnehmen. Die Zusatzmengen der *-, einzelnen Stabilisierungsmittel sind dabei in Gew.-%, bezogen auf die konzentrierte Protease-Lösung angeeeben.

Tabelle 1

Zugesetztes Stabilisierungs	5	Kontrollversuch ohne Zusatz	Restaktivität
mittel		jo 0,2% Casein Hammersten	nach 20 Stunden
	1% Gelatine alba	Stehen bei 37° C
10% Natriumacetat	in % der Aus
10% Diäthylenglykol	gangsaktivität
20% Diäthylenglykol	54
5 10% D-Glucose	50
5% Lactalbumin	52
10% Trockenmagermilchpulver	58
66
90
56
92
100

40

)0 Der Tabelle ist eindeutig die überragende Stabilisierwirkung von Trockenmagermilch und Lactalbumin zu entnehmen, die nur von hohen Einsatzmengen an Diäthylenglykol annähernd erreicht wird.

Für die Brauchbarkeit eines Stabilisierungszusatzes ist aber nicht nur die Wirksamkeit in der Lösung von Bedeutung, sondern wesentliche Faktoren stellen die Beeinflussung der Enzymfällung sowohl hinsichtlich des eintretenden Akuvitätsverlustes als auch der Vollständigkeit der Fällung und der Filtrierbarkeit des anfallenden Niederschlages dar. Um das Verhalten der verschiedenen Stabilisierungsmittel unter Fällungsbedingungen zu prüfen, wurden Proben der vorgenannten konzentrierten Protease-Lösungen einer Ausgangsaktivität von 33,5 Mio. Protease-Einheiten pro Liter ohne und mit Zusatz verschiedener Stabilisierungsmittel bei ca. 37-40' C unter Rühren mit 25 Gew.-% wasserfreien Natriumsulfats, bezogen auf die konzentrierte Protease-Lösung, versetzt und nach 20-30 Minuten wurde der gebildete Niederschlag abfiltriert. Die erhaltene feste Protease ν, urde durch Gefriertrocknung vom Wasser befreit. Zur Kontrolle der Vollständigkeit der Fällung wurde die in den Mutterlaugen verbliebene Aktivität gemessen. Um die Aktivitätsverluste bei der Fällung beurteilen zu können, wurden die Mengen und Aktivitäten der erhaltenen festen Protease bestimmt und in prozentuale Beziehung zur jeweiligen Ausgangsaktivität der gefällten Lösung gesetzt. Hierbei wurden die in nachfolgender Tabelle angegebenen Werte erhalten. Die Zusatzmengen der einzelnen Stabilisierungsmittel sind dabei wiederum in Gewichtsprozent, bezogen auf die konzentrierte Protease-Lösung angegeben. Die in den Mutterlaugen gefundene Aktivität, die ein Maß für die Vollständigkeit der Fällung bildet, ist als Prozentzahl der Ausgangsaktivität dargestellt.

Tabelle 2

Zugesetztes	Aktivität	Ausbeute an ge
Stabilisierungs	der Mut	fälltem, trockenem
mittel	terlauge	Enzym in % der
	in % des	Aktivitätsmenge
	Eluats	im konzentrierten
		Eluat
Kontrollversuch
ohne Zusatz	0,5	65
10% Diäthylen	10	68, schlechte Fil
glykol		tration

Zugesetztes	Aktivität	Ausbeute an ge
Stabilisierungs	der Mut	fälltem, trockenem
mittel	terlauge	Enzym in % der
	in % des	Aktivitätsmenge
	Eluats	im konzentrierten
		Eluat
20% Diäthylen-	_	gelartiger, unfil-
glykol		trierbarer Nieder
		schlag
10% D-Glukose	0,8	62
5% Lactalbumin	0,3	93
10% Trocken	0,4	98
magermilchpulver

Zugesetztes Stabili	Restaktivität nach 20
sierungsmittel	Stunden Stehen bei 37° C
	in % der Ausgangs
	aktivität
Kontrollversuch ohne
Zusatz	60
10% Diäthylenglykol	65
20% Diäthylenglykol	87
10% D-Glukose	62
5% Lactalbumin	97
10% Trockenmager
milchpulver	100

Die mit der durch Züchtung von Bacillus licheniformis, Stamm P 300, erhaltenen Protease-Lösung durchgeführten Fällungsversuche ergaben die in nachstehender Tabelle 4 aufgeführten Werte.

Tabelle 4

Zugesetztes Stabilisierungs	Aktivität	Ausbeute an ge
mittel	der Mut	fälltem, trockenem
	terlauge	Enzym in % der
	in % des	Aktivitätsmenge
	Eluats	im konzentrierten
Kontrollversucb		Eluat
ohne Zusatz
10% Diäthylen-	0,6	62
glykol
7	74

Zugesetztes	Aktivität	Ausbeute an ge
Stabilisierungs	der Mut	fälltem, trockensro
mittel	terlauge	Enzym in % der
	in %des	Aktivitätsmenge
	Eluats	im konzentrierten
		Eluat
20% Diäthylen	—	gelartig, nicht
glykol	—	filtrierbar
10% D-Glukose	1,5	65
5% Lactalbumin	0,5	94
10% Trocken
magermilchpulver	0,4	96

Die, Tabelle zeigt, daß beim Fällungsprozeß die stabilisierende Wirkung von Lactalbumin und Trockenmagermilch derjenigen von Diäthylenglykol überlegen ist, und daß aus fällungstechnischen Gründen die Stabilisierung mit Diäthylenglykol ausscheidet.

Entsprechende Versuche wie mit der durch Züchtung einer Spezies Bacillus subitilis gewonnenen Proteaselösung wurden mit einer Proteasekulturlösung durchgeführt, die durch Züchtung einer Varietät des Bacillus ücheniformis, Stamm P 300 (deutsche'Patentanmeldung P 2063988.7) und entsprechende Aufbereitung, erhalten wurde. Die konzentrierte Proteaselösung hatte eine Anfangsaktivität von 36 Mio. Protease-Einheiten pro Liter. Die Bedeutung der Werte in der nachfolgenden Tabelle 3 entspricht denen der Tabelle 1.

Tabelle 3

Die mit der Protease-Lösung aus Züchtungen des Stammes P 300 vorgenommenen Versuche bestätigten die überlegene Wirksamkeit von Lactalbumin und Trockenmagermilchpulver bei der Stabilisierung von alkalischen Protease-Lösungen während der Lage-

rung und bei der Fällung der Hnzyme.

Die Bestimmung der proteolytk ;hen Aktivität der Proteasen in der konzentrierten Lösung, in der gefällten Trockensubstanz sowie die Messung der Restaktivitäten erfolgte nach einem in den Laboratorien der Henkel & Cie GmbH, Düsseldorf, entwickelten Verfahren, das in der Zeitschrift »Tenside«, 7. Jahrg., Heft 3 (1970), Seite 125-132, in allen Einzelheiten beschrieben ist. Das Arbeitsprinzip der Bestimmungsmethode ist kurz folgendes:

Man läßt das Enzym oder enzymhaltige Produkt in Wasser von 15 ' deutscher Härte und in Gegenwart von Natriumtripolyphosphat unter festgelegten Bedingungen auf Standardcasein einwirken. Durch Zugabe von Trichloressigsäure unterbricht man die Reaktion und fällt das unabgebaute Casein. Nach Filtration wird die Extinktion des Filirates gegen eine Blindprobe bestimmt, bei der ein enzymatischer Abbau durch Vorlage einer genügenden M^nge Trichloressigsäure verhindert wurde. Die gemessene von

den aromatischen Anteilen (besonders Tyrosin) der »n verdünnter Trichloressigsäure löslichen Abbauprodukte herrührende Extinktion dient als Maß für die Enzymaktivität. Praktisch wird so vorgegangen, daß man die Extinktion des Filtrats der Probe im Maximum bei 275 μπι gegen das der Blindprobe mit einer Schichtdicke von 1 cm mißt. Von der gefundenen Extinktion wird der bei 300 um gemessene Wert abgezogen. Die Differenz ΔΕ dient in der Formel zur Berechnung der Aktivität in Proteaseeinheiten (PE) pro

so Gramm Enzympräparat. Dieser Untergrundabzug soll den eventuellen Einfluß unterschiedlicher Trübung von Probe und Blmdprobe so gut wie möglich eliminieren. Die Aktivität in Protease-Einheiten pro Gramm Enzympräparat ergibt sich dann: PE/

g = ΔΕ ■ Verdunnungsfaktor/Schichtdkke (cm) · 20, wobei der Verdünnungsfaktor = Volumen der angesetzten Enzytnlösung (ml)/Einwaage (g) ist. Als Definition für die Enzymaktivitätseinheit ergibt sich, daß eine Enzympraparation eine Proteasen-Aktitivät von 1000 Einheiten besitzt, wenn eine Lösung von 1 g Enzympräparation in 100 ml eine Extinktic.isdifferenz von 0,500 liefert.

Der Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht vorwiegend darin, daß es mit seiner Hilfe gelingt, aus den konzentrierten, proteasehaltigen Ionenaustauschereluaten durch Fällung eine weitgehend gereinigte Protease hoher Aktivität mit sehr guter Ausbeute herzustellen.

Claims

Patentansprüche;

1. Verfahren zur Stabilisierung und Fällung von konzentrierten wäßrigen Protease-Lösungen, dadurch gekennzeichnet, daß man den Lösungen als Stabilisierungsmittel Lactalbumin und/ oder Trockenmagermilchpulver zusetzt und das Enzym bei erhöhter Temperatur durch Salzzusatz, insbesondere Natriumsulfatzusatz, fällt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Stabilisierungsmittel in einer Menge von 2—20 Gew.-%, insbesondere 5-15 Gew.-%, bezogen auf die zu stabilisierende konzentrierte Proteaselösung eingesetzt wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß Lösungen alkalischer Protease stabilisiert und gefällt werden.

4. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß als Protease-Lösungen über Ionenaustauscher gereinigte und konzentrierte Fennenterlösungen von Bacillus subtilis eingesetzt werden.

5. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß als Proteaselösungen über Ionenaustauscher gereinigte und konzentrierte Fermenterlösungen von Bacillus licheniformis eingesetzt werden.