NL9001731A - Werkwijze voor het bereiden van stabiele enzymdispersies. - Google Patents

Description

Werkwijze voor het bereiden van stabiele enzymdispersies.

De onderhavige uitvinding heeft betrekking op waterige vloeibare enzymsamenstellingen in de vorm van onmiddellijk toepasbare preparaten in het bijzonder van enzymen met proteolytische werking zoals bijvoorbeeld het pancreascomplex.

Vloeibare enzympreparaten hebben een zekere voorkeursplaats in de praktische toepassing van enzymen verworven. Een belangrijk gezichtspunt werd daarbij gevormd door de veiligheid (vgl. H.J. Rehm & G. Reed uitgever Biotechnology, vol., Ja "Enzyme Technology", blz. J22, 731> VCH

1987).

Vloeibare enzympreparaten bezitten het onmiskenbare voordeel dat zij stofvrij zijn en derhalve het gevaar van allergische reacties verkleinen. Aan de andere kant groeit het risico van microbiële verontreiniging zodat waterige vloeibare enzymsamenstellingen in de regel voorzien zijn van een conserveringsmiddel of een drager bevatten die de "wateractiviteit" voor microbiologische groei verlaagt.

Een verder voordeel op het gebied van de toepassing wordt gevonden in de betere doseerbaarheid van vloeibare preparaten in vergelijking met de vaste preparaten volgens de stand van de techniek.

De microbiologische besmetting is echter niet de enige oorzaak voor de verslechtering van de kwaliteit van enzymen in vloeibare samenstellingen na verloop van tijd. Zodra er proteolytische enzymen in het spel zijn, hetzij als hoofd-enzym hetzij als verontreiniging, dient rekening te worden gehouden met eigen afbraak van de enzymen. Het daarmee samenhangende, meestal snelle activiteitsverlies is bij aanwezigheid van pancreasproteasen bijzonder hoog en zelfs met zeer lage wateractiviteit nauwelijks te vermijden. Een uitweg wordt geboden in de vorm van covalente fixering van proteasen op dragers. Afgezien van de hoge prijs van aan drager gebonden enzymen vereist een zinvolle toepassing van geïmmobiliseerde enzymen de relatieve beweeglijkheid van de af te breken substraten waarvan bijvoorbeeld bij de toepassing op het gebied van leer slechts in onvoldoende mate sprake is.

Daarentegen worden enzymmengsels die niet covalent gebonden zijn of in microcapsules, vezels en verknoopte polymeergelen ingesloten zijn op vergelijkbare wijze autolytisch afgebroken respectievelijk door proteasen gesplitst als de oplosbare enzymen. (Vgl. Ullmanns Encyklopadie der techn. Chemie, 4de druk, vol. 10, blz. 544, Verlag Chemie 1975).

De problemen bij de opwerking van de pancreas worden nog ver- scherpt doordat juist pancreassappen vanwege hun zoögene oorsprong reeds van tevoren een hoge besmetting met kiemen hebben.

Bij het verteringssysteem spelen zoals bekend enzymen van diverse werkingsrichtingen samen een rol.

De algemeen technisch toegepaste pancreasproteasepreparaten blijken derhalve mengsels van trypsine (E.C.3.4.21.4.), chymotrypsine (E.C.3.4.4.5.) en diverse peptidasen (b.v. E.C.3.4.4.7) in vaste vorm te zijn die als begeleidende enzymen amylase (E.C.3.2.1) en lipase (E.C.3.I.I.3) kunnen bevatten. Dergelijke preparaten worden meestal door zoutprecipitatie van perssap uit verse pancreasklieren of uit residuen van insulinewinning bereid. Door uiterst voorzichtige dehydratering van de complete klieren wordt het zogenaamde pancreatine gewonnen, waarbij de proteasen overwegend in de vorm van inactieve voorstadia aanwezig zijn en een bijzonder groot aandeel van lipasen vertoont. Dergelijke preparaten moeten voor toepassing eerst geactiveerd worden bijvoorbeeld door autolyse, door toevoeging van enterokinase of zure schimmelprotea-sen onder andere (vgl. Ullmanns Encyklopadie der teehn. Chemie, 4de druk, vol. 10, blz. 515-537, Verlag Chemie 1975; Kirk-Othmer, Encyclopedia of Chekical Technology 3de uitgave, vol. 9. blz. 173“224, Wiley-Interscience 1980).

De wens om waterige vloeibare enzymsamenstellingen ter beschikking te hebben met de aanzienlijke voordelen daarvan en zonder de nadelen zoals activiteitsverliezen en contaminatie heeft tot diverse pogingen tot oplossingen geleid, bijvoorbeeld tot het verdunnen met organische oplosmiddelen (DE-A-1.808.834, HU-octrooischrift 2.642, DDR-octrooi-schrift IO.O58) respectievelijk tot niet-waterige vloeibare samenstellingen.

Tot dusverre heeft men nog geen succes kunnen boeken dat in elk opzicht overtuigend was met name bij enzymen met proteolytische werking en in het bijzonder bij pancreas-enzymen. (Vgl. DE-A-3.704.465, US-A-3.74l.902). De nadelen van vloeibare samenstellingen in organisch medium zijn gelegen in het feit dat men het ontstaan van enzymen in droge vorm nauwelijks kan vermijden en dat de meest geschikte organische media, zoals bijvoorbeeld propyleencarbonaat, buitensporig duur zijn.

Het probleem bestond derhalve nog steeds om waterige vloeibare samenstellingen van proteolytisch werkzame enzymen met voldoende stabiliteit, in het bijzonder van het pancreascomplex ter beschikking te stellen. Daarbij moest enerzijds ook op de milieuproblematiek gelet worden, anderzijds mochten daaruit, bijvoorbeeld met betrekking tot de industriële toepassing in het bijzonder in de lederindustrie, geen al te hoge kosten voortvloeien.

Er werd nu gevonden dat het bestaande probleem door de werkwijze volgens de uitvinding opgelost kan worden.

De werkwijze ter bereiding van waterige vloeibare enzymsamenstellingen volgens de uitvinding bestaat uit het neerslaan van de in waterig milieu aanwezige enzymen in op zich bekende wijze in een fijne verdeling en het door aanpassing van de dichtheid in waterig milieu verkrijgen van een fijne dispersie van de enzymen die in die zin stabiel is dat geen neerslag ontstaat.

Zoals reeds aangevoerd leent deze werkwijze zich voor toepassing bij waterige enzympreparaten van proteasen, van enzymcomplexen met proteolytische werking en van enzymen zoals amylasen, lipasen enz. met bijkomende proteolytische activiteit. In het bijzonder wordt het pancreascomplex (pancreatine) genoemd.

De enzymen

Onder enzymen met proteolytische activiteit worden de endopeptida-sen ("proteasen" E.C.3.4.) begrepen waarbij in verband met de onderhavige uitvinding in het bijzonder de technisch toegepaste enzymen van belang zijn. (Kirk-Othmer, loc.cit. vol. 9» K. Aunstrup in B. Spencer uitgever, Industrial Aspects of Biochemistry, vol. 30 (I). blz. 23-46, North Holland 1974).

Men onderscheidt: Proteasen a) van dierlijke oorsprong, zoals bijvoorbeeld a) rennine (E.C.3-4.23-4) β) pancreas-proteasen pancreatine, in het bijzonder trypsine, chymotrypsine (actief pH-gebied ca. 7_10) pepsine (E.C.3.4.23.1) (actief pH-gebied ca. 1,5-4,0) kathepsine (E.C.3·4.23·5) (actief pH-gebied ca.

4,0-5,0).

b) van plantaardige oorsprong a) papaïne (E.C.3*4.22.1) actief pH-gebied ca. 5,0-8,0 β) ficine (E.C.3.4.22.3) actief pH-gebied ca. 4,0-9,0 ƒ) bromelaïne (E.C.3-4.22.4 en 3*4.22.5) actief pH-gebied ca.

5,0-7,0).

c) van microbiële oorsprong (vgl. L. Keay in "Process Biochemistry", 1971, 17-21.

a) uit Bacillus-soorten zoals B. subtilis, B. Licheniformis, B.

alkalophilus, B. cereus, B. natto, B. vulgatus, B. mycoides. β) uit Streptococcus-soorten /) uit Streptomyces-soorten zoals Streptomyces fradiae, S. griseus, S. rectus 6) uit Aspergillus-soorten zoals Aspergillus flavus-oryzae, A. niger, A. saitori, A. usamii e) uit Mucor- en Rhizopus-soorten zoals Mucor pusillus, M. mietrei ^) Endothia-soorten zoals Endothia parasitica rj) uit Trametes-soorten zoals Trametes sanguinea.

Buiten het onderscheid naar oorsprong wordt ook onderscheid gemaakt naar aangrijpingsplaats (exo- tegen endo-enzymen) en op grond van de "Active Site" van de proteasen (serine-proteasen, die door DFP geremd worden, sulfhydryl-enzymen).

Verder is de pH-afhankelijkheid van de enzymwerking van grote praktische betekenis.

Men onderscheidt derhalve in het bijzonder vanuit praktische gezichtspunten.

i) Alkalische proteasen met een werkingsoptimum ongeveer in het gebied van pH 7,5 tot 13, in het bijzonder alkalische bacterieproteasen (E.C.3.4.21.) (die meestal tot het serine-type behoren) en alkalische schimmelprotea-sen.

ii) Neutrale proteasen met een werkingsoptimum in het gebied van pH

6,0-9,0, in het bijzonder neutrale bacterieproteasen (E.C.3.4.24) (die tot de metallo-enzymen behoren) en schimmelproteasen, bijvoorbeeld Bacillus-proteasen, Pseudomonas-proteasen, Streptomyces-proteasen, Aspergillus-proteasen.

iii) Zure proteasen met een werkingsoptimum in het gebied van pH

2,0-5,0 (E.c.3.4.23), in het bijzonder zure schimmelproteasen, bijvoorbeeld uit Rhizopus spp., Aspergillus spp., Penicillium spp., Mucor spp. en Impex lacteus en Endothitia parasitica.

Voor de analyse van technische produkten zijn caseïne (werkwijze volgens LÖHLEIN-VOLHARD, KUNITZ, LASKOWSKI, zie hieronder) of hemoglobine (methode volgens ANSON, zie hieronder) of gelatine (viscosimetrische werkwijze) geschikt als substraat.

Gewoonlijk wordt de proteolytische werking volgens de Löhlein-Volhard-werkwijze (gemodificeerd volgens TEGEWA in "Leder", 22, 121-126 (1971)) bepaald. Daarbij komt een Löhlein-Volhard-eenheid (LVE) onder de testomstandigheden (1 uur, 37°C) overeen met een enzymhoeveelheid die in 20 ml caseïnefiltraat een stijging aan hydrolyseprodukt overeenkomstig een equivalent van 5.75 x 10“3 ml 0,1 n NaOH teweegbrengt.

Verder is de bepaling van de proteolytische activiteit van enzymen volgens de Anson-hemoglobine-werkwijze (M.L. Anson, J. Gen. Physiol., 22, 79 (1939)) gangbaar.

Proteasen vinden industriële toepassing onder andere bij de bereiding van leer, in wasmiddelen en bij reiniging, in de ontvetting, bij kaasbereiding, bij afbraak van vlees en bij stabilisatie van bier.

Verder zijn zoals reeds vermeld enzymcomplexen met proteolytische werking en enzymen met proteolytische nevenactiviteit van belang.

Daartoe behoren onder andere amylasen, in het bijzonder a-amylasen (vgl. Fischer en Stein in "The Enzymes", 2de druk, P.D. Boyer et al., vol. IV, blz. 313-3^, Academie Press), die als technische preparaten in de regel proteasen als begeleidende enzymen bevatten. De α-amylasen zijn van dierlijke, plantaardige of microbiologische oorsprong. Bronnen met een voorkeur zijn voorbeeld pancreas-amylasen, bacterie- en schimmel-amylasen.

Het actieve pH-gebied van α-amylasen van diverse oorsprong (te weten amylasen die de a-1,4-glycosidebinding binnen amylose resp. amylopectine splitsen) in het gebied 3.5-9.0 ligt.

Het α-amylase dat uit pancreas gewonnen wordt bezit een actief pH-gebied van 5.5_9.0 (pH-optimum ca. 7.2), het amylase dat uit bacteriën gewonnen wordt bezit een actief gebied van 4,5 tot 8,5 (waarbij het pH-optimum voor het vloeibaar makende α-amylase bij 6,5~7.0 en voor de versuikerende bij 4,8-5,2 ligt), dat dat uit schimmels wordt bereid bezit een activiteitsgebied van 3.5-7.0 (pH-optimum 5,0) dat dat uit mout wordt bereid heeft een gebied van 4,5 tot 7,0 (pH-optimum 4,7) (vgl. Ullmann, loc.cit. vol. 10, blz. 507).

De bereiding uit Bacillus-soorten, zoals B. subtilis, B. mesente-ricus, B. Polymixa, B. amyloliquefaciens, B. licheniformis, verder uit schimmels, in het bijzonder Aspergillus-soorten, zoals A. niger, A. phoenicis, A. oryzae, A. awamori, Mucor-soorten, zoals M. rouxianus, Rhizopus-soorten, zoals R. delemar, R. oryzae, R. japonicus en Endo-myces-soorten, zoals E. fibuliger heeft gestaag aan betekenis gewonnen.

Amylasen vinden onder andere toepassing in de voedingssector [vgl. H.-J. Rehm & G. Reed uitgevers, "Biotechnology" vol. 5, Verlag Chemie 1983; B. Spencer, uitgever Industrial Aspects of Biochemistry; vol. 30, deel I, blz. 139~186, 213-260, Elseviers (1973)] bij het vloeibaar maken van zetmeel, bij het winnen van mout, bij het winnen van ethanol, bij het ontvetten, bij de bereiding van leer en andere. De activiteit van amylasen met zetmeel als substraat kan volgens de werkwijze van

Sandstedt, Kneen & Blish (Cereal Chem. 16, 172 (1939) en Technical Bulletin nr. 1024, U.S. Dept. of Agriculture) worden bepaald. Daarbij is 1 amylase-eenheid (= 1 SKB-eenheid) die enzymhoeveelheid, die bij 30°C onder de voor het overige gegeven reactieomstandigheden 1 g oplosbaar zetmeel in verloop van 1 uur kan dextrineren.

Verder wordt de werkwijze van WillstStter ter bepaling van de activiteit van pancreas-amylase vermeld (Hoppe-Seylers, Z. physiol. Chem. 126, 143 (1923))· Daarbij wordt een Willst&tter-amylase-eenheid gedefinieerd als het honderdvoudige van die enzymhoeveelheid die onder de gegeven testomstandigheden zetmeel met een zodanige snelheid splitst, dat de monomoleculaire reactieconstante gelijk is aan 0,01.

Verder hoort de toepassing op lipasen (E.C.3-1.1.3) met proteoly-tische begeleidende activiteit tot de werkwijze volgens de uitvinding. Carboxylesterasen die glycerine-ester in waterige emulsie splitsen worden zoals bekend als lipasen aangeduid.

Men onderscheidt daarbij:

Pancreas-lipasen die naast esterasen, proteasen en amylasen als technisch belangrijke begeleidende enzymen aanwezig zijn in het pancreas-enzymcomplex. Het pH-optimum (tegenover olijfolie) ligt in het gebied 7“8,5t het actieve gebied ligt tussen pH 6,5"9*5·

Lipasen gelden in het algemeen als zeer instabiel, in het bijzonder ten opzichte van proteolytische afbraak door begeleidende proteasen.

Verder:

Microbiologische lipasen, bijvoorbeeld uit Pseudomonas fragii, Aspergillus sp. (bijvoorbeeld A. luchuensis), Candida cylindracea, Geotrichum candidum, Humicola languinosa, Mucor pusillus, Penicillium sp. (bijvoorbeeld P. chrysogenum, P. oxalicum), Rhizopus sp. (R. nigericans, R. oryzae).

Deze lipasen vertonen in de regel een pH-optimum bij pH >7,0.

De activiteitsbepaling van lipasen wordt op gebruikelijke wijze met olijfolie als substraat uitgevoerd, verder met triacetine en tributyrine. [Vgl. M. Sémériva et al. Biochemistry 10, 2143 (1971)» Pharmaceutical Enzymes, uitgegeven door R. Ruyssen en A. Lauwers 1978, (FIP)].

Voorzover de vetsplitsende activiteit in kilo-lipase-eenheden (eenheid = KLCA) wordt uitgedrukt, wordt onder de standaardomstandigheden: 40°C, pH = 5,5 met tributyrine als substraat gewerkt. (Vgl. M. Sémériva, boven geciteerde literatuurplaats). Lipasen vinden, voorzover de instabiliteit ervan dit toelaat, toepassing in onder andere de afvalverwijdering, de leerindustrie en de voedingsbranche.

Het pancreascomplex is een onderwerp van de werkwijze volgens de uitvinding met bijzondere voorkeur. In de pancreasklier maakt het gehalte aan trypsinogeen ongeveer 23 gew.#, het gehalte aan chymotrypsi-ne ongeveer 10-14# van het totale proteïnegehalte uit.

De bijzonder interessante enzymen van het pancreascomplex werden reeds hiervoor gekarakteriseerd. Uit de runderpancreas kunnen verder de enzymen ribonuclease (E.C.2.7.7.16), deoxyribonuclease (E.C.3.1.4.5), chymotrypsinogeen B en -chymotrypsinogeen als trypsinogeen worden geïsoleerd.

De isolatie van enzymen uit het pancreascomplex is in de literatuur gedetailleerd beschreven (vgl. bijvoorbeeld Ullmann, vol. 10, loc.cit., blz. 535-537)·

De werkwijze A. Isolatie uit het pancreascomplex

De werkwijze volgens de uitvinding sluit gedeeltelijk aan bij de isolatiewerkwijze volgens de stand van de techniek (vgl. Ullmann, vol. 10, loc.cit., blz. 536-537).

1. Extractie

De isolatie geschiedt met voordeel uit pancreasklieren onmiddellijk na de slachting van meestal varkens of runderen.

Men kan bijvoorbeeld ongeveer 100 pancreasklieren in een keer verwerken, wanneer men onmiddellijk na de slachting vet en bindweefsel zo goed mogelijk van de klieren verwijdert, en dan het klierweefsel homogeniseert, bijvoorbeeld door middel van een vleeswolf.

Onmiddellijk daarna wordt doelmatig met ongeveer het dubbele volume (ca. 60 1) 0,25 n zwavelzuur bij 5°C gedurende 18-24 uur geëxtraheerd. Na toevoeging van filtervlokken wordt met voordeel door middel van een pakmiddelpers geperst. De persplaten kunnen weggegooid worden.

2. De werkwijze

Hoofdzakelijk vetvrij perssap uit pancreasklieren wordt met voordeel door snelle toevoeging van een grote hoeveelheid natriumsulfaat of ammoniumsulfaat ("A-zout") bij kamertemperatuur neergeslagen. De toe te voegen hoeveelheid bij vast watervrij A-zout ligt met voordeel bij ca. 50 ± 2 gevi.% betrokken op het perssap.

Het kan voordelig zijn door sterk roeren (bijvoorbeeld door middel van roerinrichtingen met schijven voorzien van tanden) het neergeslagen goed tot een fijnere verdelingsgraad kapot te maken. In vele gevallen is deze maatregel echter overbodig daar tengevolge van het snelle toevoegen van het A-zout de precipitatie van pancreas-enzymen zonder meer in fijnverdeelde vorm geschiedt.

Ter confectionering/standaardisering van het produkt op een bepaalde gewenste activiteit wordt indien nodig met isotone A-zoutoplos-sing (bijvoorbeeld 38,3 kg A-zout op 6l,7 kg water) verdund. Door toevoeging van vast A-zout resp. water zal een dichtheid van waterig enzympreparaat van 1,22 tot 1,23 worden ingesteld. De ervaring met pancreascomplex leert dat de enzymsuspensie slechts in een smal dichtheidsgebied, volgens alle verkregen resultaten het dichtheidsgebied 1,22 tot 1,23, zeer stabiel tegen afzetting blijft.

Het in acht nemen van het vereiste smalle dichtheidsgebied is derhalve belangrijk voor de onderhavige uitvinding. Deze regel geldt ook voor ruwe extracten van enzymen van andere herkomst zoals hierboven weergegeven is.

3. Verdere confectionering

Door de isotone instelling van de cultuurfiltraten volgens de uitvinding, in het bijzonder van pancreas-oorsprong, lukt het stabiele samenstellingen te verkrijgen, die gedurende dagen tot weken betrouwbaar zijn, zodat in vele gevallen de voorwaarden voor technische toepassing vervuld zijn. Daarentegen kan beïnvloeding van de neerslagstabiliteit optreden door verdunning van de dragervloeistof (water) respectievelijk sterke temperatuursveranderingen door de daarmee samenhangende veranderingen van dichtheid. Het kan dan komen tot breking (schifting resp. neerslag) van de enzymsuspensie. De verdere vereisten van de praktijk zijn echter gericht op volledig stabiele en homogene enzympreparaten.

Verrassenderwijs lukt het slechts door toepassing van ten minste een verdikkingsmiddel op basis van xanthaan om een voldoende verdikking van de sterk elektrolyt bevattende enzymsuspensies (met bijvoorbeeld 38.3 gew.$ A-zout-gehalte) te bereiken.

In het bijzonder blijken xanthaan [polysaccharide B-1459. Keltrol F. Kelzan; vgl. Kirk-Othmer, Encyclopedia of Chemical Technology, 3de uitgave, vol. 12, blz. 62-66, J. Wiley & Sons 1980, Rees & Welch, Angew. Chemie 89, 228-239 (1977)] respectievelijk andere verdikkingsmiddelen op xanthaanbasis geschikt. De verdikking met een bijzonder gemodificeerd xanthaanderivaat (bijvoorbeeld KIA96, anionisch heteropolysaccharide van de Fa. Kelco, San Diego, USA) geeft viscositeiten van 200 tot 1000 mPa.s bij een concentratie van 0,1 tot 5%, bij voorkeur 0,1 tot 1% bij een 38.3 gew.^'s A-zoutoplossing.

In de regel levert verdikking met een 0,1 tot 5 (gew.)#'s oplossing van xanthaan respectievelijk derivaten daarvan in een oplossing van 38,3 gew.# vast A-zout zeer goede resultaten, in het bijzonder wanneer xanthaan onder afschuiving, bijvoorbeeld zeer snel (bijvoorbeeld met omtreksnelheden van 1-5 m/sec) wordt verwerkt. Deze xanthaanoplossing is doelmatig isotoon met de ter precipitatie toegepaste A-zoutoplossing. Zij kan direct aan het met A-zout neergeslagen pancreas-perssap worden toegevoegd om daardoor de gewenste uiteindelijke enzymactiviteit in te stellen. Er werd daarentegen zelfs bij niet-isotone omstandigheden, bijvoorbeeld in het uitgebreidere dichtheidsge-bied 1-1,5 gevonden dat de bereikte verdikking voldoet om stabiele enzymsamenstellingen te verkrijgen. Er wordt opgemerkt dat bij het met de verdikte isotonische A-zoutoplossing verdunnen van een pancreassuspensie die neergeslagen is met A-zout een viscositeitsvermindering van ca. 50# optreedt. De restviscositeit van 100-500 mPa.s voldoet om volledig homogene stabiele enzympreparaten die stabiele activiteit vertonen te verkrijgen.

B. Isolatie uit andere proteïnase bevattende ruwe extracten

In plaats van het pancreas-perssap kunnen andere proteïnase bevattende cultuursappen, bijvoorbeeld uit schimmel- of bacterieculturen worden toegepast (vgl. de hiervoor gemelde informatie met betrekking tot het voorkomen van de enzymen).

Verder is de toepassing van de werkwijze volgens de uitvinding op de combinatie van schimmelproteïnase/pancreasproteïnase respectievelijk bacterieproteïnase/pancreasproteïnase mogelijk. Hier zijn er bijvoorbeeld twee mogelijkheden: a) Men mengt de diverse cultuursappen bij 5 tot 10° C en voert onmiddellijk een precipitatie met A-zout uit. Daarop aansluitend wordt door isotone verdunning eventueel met verdikte A-zoutoplossing de gewenste eindactiviteit ingesteld.

b) Het bacterie- respectievelijk schimmelproteïnasepreparaat (A-zoutprecipitatie) wordt analoog aan de pancreassuspensie echter gescheiden bereid. Daarop aansluitend wordt het isotone schimmel-respectievelijk bacterieproteïnasepreparaat aan het pancreaspreparaat toegevoegd; eventueel wordt ter standaardisering isotoon verdund en eventueel wordt met verdikte isotone A-zoutoplossing gestabiliseerd.

In beide gevallen verkrijgt men samenstellingen die neerslagsta-biel zijn alsmede samenstellingen die stabiele activiteit bezitten.

Bij alle enzymsuspensies is op grond van het hoge gehalte aan elektrolyt in het algemeen geen microbiologische stabilisatie noodzakelijk. Aan de andere kant staan er geen technische faktoren de toevoeging van gebruikelijke conserveringsmiddelen (zie stand van de techniek) in de weg.

Voor alle enzymen geldt volgens de tot dusver opgedane ervaring dat het vloeibare medium bij voorkeur een dichtheid in het gebied van 1.22 tot 1,23 dient te bezitten om neerslagstabiliteit te bereiken.

Dit geldt eveneens voor de eindconfectionering met verdikkende middelen.

De volgende voorbeelden dienen ter illustratie van de werkwijze volgens de uitvinding.

De bepaling van de dichtheid wordt door exact afwegen van een gedefinieerd volume in een geijkte maatcilinder bij 20°C uitgevoerd.

De bepaling van de viscositeit wordt met een Brookfield-viscosime-ter eveneens bij 20°C uitgevoerd.

Voorbeelden Voorbeeld 1

Bereiding van de isotone oplossing met dichtheid 1,22 tot 1,23 g/cm^; 20 °C

6l,7 kg leidingwater wordt in een roervat gebracht en hieraan wordt 38.3 kg watervrij ammoniumsulfaat toegevoegd. Men roert totdat de totale hoeveelheid zout opgelost is. Wanneer de dichtheid van 1,22 tot 1.23 g/cm3 niet bereikt wordt kan deze door toevoeging van zout of water worden ingesteld.

Voorbeeld 2

Bereiding van een vloeibare waterige enzymsamenstelling op basis van pancreas-enzym 100 kg perssap met een activiteit van 30.100 LVE zoals verkregen na het malen, activeren en extraheren van de pancreasklieren, wordt in een roervat gebracht en hieraan wordt 50 kg ammoniumsulfaat toegevoegd. De pancreas-enzymen precipiteren. De pancreas-enzymsuspensie (29.600 LVE) bezit een gemiddelde activiteit van 28.000-32.000 LVE/g (dichtheid 1,22-1,23 g/cm^). Door toevoeging van de isotone ammoniumzoutoplossing uit voorbeeld 1 kan iedere gewenste LVE-activiteit worden ingesteld. Hoe meer het enzympreparaat verdund is des te sneller een sedimentatie van het geprecipiteerde enzym geschiedt.

1000-3000 LVE: sedimentatie na enkele uren resp. dagen, 3000-9000 LVE: sedimentatie na enkele weken resp. meerdere weken, vanaf ca. 16.000 LVE: vergaand sedimentatie-stabiel.

Activiteitsverlies van zuivere waterige pancreas-enzymoplossing na 6 weken bij 25°C: 81%.

Activiteitsverlies van geprecipiteerde enzymsuspensie uit pancreas na 6 weken bij 25°C: 8,9%.

Voorbeeld 3 100 kg van een waterige heldere oplossing van een schimmelprotease verkregen uit Aspergillus parasiticus met een activiteit van 32.000 LVE wordt bij l6°C vermengd met 50 kg ammoniumsulfaat en hierdoor worden de enzymen geprecipiteerd. De enzymsuspensie (31.400 LVE) met een dichtheid van 1,22 tot 1,23 g/cm^ wordt met de isotone ammoniumsulfaatoplossing uit voorbeeld 1 verdund tot de gewenste activiteit. Men verkrijgt enzympreparaten die enkele dagen stabiel zijn.

Activiteitsverlies van de enzymsuspensie na 6 weken staan bij 25 °C: 4,3^·

In vergelijking:

Activiteitsverlies van schimmelprotease in zuiver water (zonder precipitatie) na 6 weken staan bij 25°C: 62¾.

Voorbeeld 4 50 kg vloeibaar pancreassap (uit voorbeeld 2) met een activiteit van 30*100 LVE en een temperatuur van 10°C en 50 kg vloeibaar schimmel-proteasesap (uit voorbeeld 3) met een activiteit van 32.000 LVE en een temperatuur van 10°C worden in een roerketel gemengd. Onmiddellijk na het mengen wordt snel 50 kg ammoniumsulfaat onder roeren toegevoegd en hierdoor worden enzymen geprecipiteerd. Men verkrijgt een enzymsuspensie met een activiteit van 61.200 LVE. De dichtheid ligt tussen 1,22 en 1,23 g/cm3. Door verdunning met isotone ammoniumsulfaatoplossing uit voorbeeld 1 kan de gewenste activiteit worden ingesteld. Activiteitsverlies van het enzymmengsel (zonder precipitatie) na 6 weken bij 25°C: 74¾.

Activiteitsverlies van de enzymsuspensie (geprecipiteerd) na 6 weken bij 25°C: 10,1¾.

Voorbeeld 5 50 kg vloeibare waterige bacterieprotease (43-200 LVE, 10°C) uit Bacillus licheniformis en 50 kg vloeibaar pancreasperssap uit voorbeeld 2 (31.100 LVE, 10°C) worden in een roerketel gemengd en met 50 kg ammoniumsulfaat gemengd. Hierdoor worden de enzymen geprecipiteerd. Men verkrijgt een enzymsuspensie met een activiteit van 35.400 LVE. Deze bezit een dichtheid van 1,22-1,23 g/cw? en kan door verdunning met isotone ammoniumsulfaatoplossing (voorbeeld 1) op de gewenste activiteit worden ingesteld. Na 6 weken staan bij 25°C is de activiteit met 12¾ afgenomen. In tegenstelling daartoe is de activiteit van een niet geprecipiteerd enzymmengsel onder dezelfde omstandigheden met 88¾ verminderd.

Voorbeeld 6 a) 3 kg pancreas-enzymprecipitaat (dispersie uit voorbeeld 2 met de activiteit van 29.600 LVE/g) wordt gemengd met 26,6 kg isotone ammoniumsulfaatoplossing. Men verkrijgt een enzymsuspensie met een activiteit van 3000 LVE die 3 dagen neerslag-stabiel is. Het produkt verliest na 6 weken staan bij 25°C 8,7# activiteit.

b) 3 kg schimmelproteaseprecipitaat (dispersie uit voorbeeld 3 met activiteit van 31-400 LVE/g) wordt met 28,4 kg isotone ammoniumsulfaatoplossing gemengd. Men verkrijgt een enzymsuspensie met een activiteit van 3000 LVE die gedurende 4 dagen neerslag-stabiel is. Deze heeft na 6 weken staan 5.5# activiteit verloren.

30 kg pancreasproteasesuspensie uit voorbeeld 6a met een activiteit van 3000 LVE wordt met eveneens 30 kg schimmelproteasedispersie uit voorbeeld 6b met een activiteit van 3000 LVE gemengd. Het mengsel bezit een activiteit van 3000 LVE en een dichtheid van 1,22 g/cm^. Na 6 weken staan bij 25°C is de activiteit met 9.8# verminderd. In vergelijking daarmee verliest een niet geprecipiteerd mengsel van dezelfde enzymen onder overeenkomstige omstandigheden 88# activiteit.

Voorbeeld 7

Bereiding van een volledig neerslag-stabiel onmiddellijk te gebruiken goed stromend waterig enzympreparaat a) In een roerketel wordt 60,7 kg water gebracht en met een roer-inrichting van schijven voorzien van tanden (omtreksnelheid 2-3 m/sec) wordt 1 kg van een verdikkingsmiddel op xanthaanbasis verwerkt (bijvoorbeeld K1A96, Fa. Kelco). Wanneer de viscositeit van de oplossing tot >1000 mPa.s gestegen is, wordt 38,3 kg ammoniumsulfaat toegevoegd. Men roert totdat het ammoniumsulfaat vergaand opgelost is. De viscositeit daalt daarbij tot 480 mPa.s.

b) 3 kg van de geprecipiteerde enzymsuspensie uit voorbeeld 4 (61.200 LVE; schimmel-enzym) wordt nu aan 58,2 kg van de verdikte ammoniumsulfaatoplossing uit voorbeeld 7a) toegevoegd en met de roerinrichting van schijven voorzien van tanden homogeen gemengd. Men verkrijgt een volledig neerslag-stabiele enzymsuspensie met een activiteit van 3000 LVE en een viscositeit van 270 mPa.s. Wanneer men bij een niet geprecipiteerd enzymmengsel na 6 weken staan bij 25°C een activiteitsvermindering van 74# waarneemt, vertoont de overeenkomstige verdikte enzymsuspensie slechts 9,2# activiteitsverlies.

Claims (15)

1. Werkwijze ter bereiding van stabiele waterige samenstellingen van proteolytisch werkzame enzymen, met het kenmerk, dat de in een waterig milieu aanwezige enzymen in fijne verdeling geprecipiteerd worden waarna door aanpassing van de dichtheid in het waterige milieu stabiele fijndisperse verdeling van de enzymen wordt bereid.

2. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat de in waterig milieu voorkomende enzymen hoofdzakelijk proteasen (E.C.3·^) zijn.

3· Werkwijze volgens conclusie 2, met het kenmerk, dat de enzymen van microbiologische oorsprong zijn.

4. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat de in waterig milieu aanwezige enzymen hydrolasen uit de groep van amylasen (E.C.3.2.1) en lipasen (E.C.3.1.1.3) met bijkomende proteolytische activiteit zijn.

5. Werkwijze volgens conclusie 1 of 4, met het kenmerk, dat de in waterig milieu aanwezige enzymen behoren tot het pancreascomplex.

6. Werkwijze volgens de conclusies 1 t/m 5. met het kenmerk, dat de in waterig milieu aanwezige enzymen in de vorm van extracten uit de gebruikelijke enzymwinning worden toegepast.

7· Werkwijze volgens de conclusies 1 t/m 6, met het kenmerk, dat de tot de fijne verdeling leidende precipitatie door toevoeging van inert zout bewerkstelligd wordt.

8. Werkwijze volgens conclusie 7. met het kenmerk, dat de precipitatie met ammoniumsulfaat of natriumsulfaat bewerkstelligd wordt.

9. Werkwijze volgens de conclusies 1 t/m 8, met het kenmerk, dat de door aanpassing verkregen dichtheid van het waterig milieu in het gebied van 1,22 tot 1,23 g/cm3 ligt.

10. Werkwijze volgens de conclusies 1 t/m 9. met het kenmerk, dat voor verdere stabilisatie van de fijnverdeelde enzymsuspensie verdikkingsmiddelen op xanthaanbasis worden toegevoegd.

11. Werkwijze volgens conclusie 10, met het kenmerk, dat de verdikkingsmiddelen op xanthaanbasis in de vorm van een waterige, isotone ammoniumsulfaat of natriumsulfaat bevattende oplossing worden toegevoegd.

12. Werkwijze volgens conclusie 11, met het kenmerk, dat de oplossing die verdikkingsmiddelen op xanthaanbasis bevat door inroeren of inwerking van afschuifkrachten bereid wordt.

13. Werkwijze volgens conclusie 12, met het kenmerk, dat de verdikkingsmiddelen op xanthaanbasis 0,1 tot 1 gew./ί van de oplossing uitmaken.

14. Werkwijze volgens de conclusies 1 t/m 13, met het kenmerk, dat mengsels van enzymen van diverse herkomst samen geprecipiteerd en opgewerkt worden.

15. Werkwijze volgens de conclusies 1 t/m 14, met het kenmerk, dat afzonderlijk bereide enzymsuspensies tot stabiele samenstellingen gemengd worden.