IT9067649A1 - Procedimento di produzione di formulazioni enzimatiche acquose - Google Patents
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Description
DESCRIZIONE dell'invenzione industriale dal titolo: "Procedimento di produzione di formulazioni enzimatiche acquose"
D E S C R IZ IO N E
Campo dell'invenzione
La presente invenzione concerne formulazioni enzimatiche acquose sotto forma di preparati direttamente atti all'uso, in particolare di enzimi con attività proteolitica come ad esempio il complesso pancreatico.
Livello della tecnica
Preparati enzimatici liquidi hanno conseguito nella pratica dell'impiego di enzimi una certa posizione di preferenza. Un punto di vista importante era quivi la sicurezza (cfr. H.J. Rehm & G.Reed Ed. Biotechnology, Voi., 7a "Enzyme Technology", pagg. 722, 731, VCH 1?87).
Preparazioni enzimatiche liquide hanno il vantaggio indiscu tibile, di essere esenti da polvere e perciò di ridurre il peri colo di reazioni allergiche. Dall'altra parte cresce il rischio della contaminazione microbica, di modo che le formulazioni enzi matiche ài nonna sono provviste di un agente conservante o con tengono un supporto che riduce la "attività dell 'acqua" per crescita microbiologica.
Un ulteriore vantaggio tecnico d'applicazione sta nella migliore dosabilità di preparazioni liquide confrontate con le preparazioni solide del livello della tecnica.
La contaminazione microbiologica non ó tuttavia l 'unica causa per il peggioramento della qualità di enzimi in formulazioni liquide per qualche tempo. Non appena sono in gioco enzi mi proteolitici, sia esso come enzima principale o come impurez za, occorre tener conto dell 'autodigestione degli enzimi. La perdita di attività perlopiù rapida con essa connessa e particolarmente elevata per presenza di proteasi del pancreas ed é punto evitabile anche con attività dell 'acqua molto bassa. Una via d'uscita si presenta nella fissazione covalente di proteasi su supporti. Astrazion fatta dal prezzo elevato di enzimi legati a supporto un impiego sensato di enzimi immobilizzati pre suppone la relativa mobilità dei substrati da decomporre, che ad esempio nell 'applicazione al campo del cuoio esiste solo in misura insufficiente. All 'opposto miscele di enzimi non legati in modo covalente, eventualmente incorporati in microcapsule, fili e gel di polimero reticolati vengono disgregati in modo analogo autolit'icamente come gli enzimi solubili ovvero scissi da proteasi. (Cfr. Ullmanns Encyklopàdie der techn. Chemie, 4. Edizione, Voi. 10, pag. 544» Verlag Chemie 1975) ·
I problemi nell’elaborazione di pancreas vengono ancora aggravati dal fatto che appunto succhi di pancreas causa della loro origine an imale sono fin da principio carichi di germi.
Nel sistema digestivo cooperano, come noto, enzimi di differen ti modi d’azione.
I preparati di proteasi del pancreas impiegati tecnicamente comunemente costituiscono perciò miscele di tripsina (E.C.3.4.
21.4» )J chimotripsina (E.C.3.4.5·) e diverse peptidasi (ad es.
E.C.3.4.4.7) in forma solida, che come enzimi secondari possono contenere amilasi (E.C.3.2.1) e lipasi (E.C.3.1.1.3)· Preparati di tale genere vengono preparati perlopiù mediante precipitazione di sale da succo di pressatura di ghiandole del pancreas 0 da residui dell'estrazione di insulina. Mediante di sidratazione straordinariamente riguardosa delle intere ghiandole viene ricavata la cosiddetta pancreatina, in cui le protea si sono presenti prera lentemente sotto forma di prestadi inatti vi e che presenta una porzione di lipasi particolarmente eleva ta. Tali preparati devono anzitutto essere attivati prima dello impiego. Ad esempio mediante autolisi, mediante aggiunta di enterochinasi o proteinasi di funghi acida tra altre (cfr. Ullmanns Elicyklop&die der techn. Chemie, 4. Edizione, Voi. IO, pagg. 515-537» Verlag Chemie 1975» Kirk-Othmer, Encyclopedia of Chemical Technology 3. Ed. Voi. 9» pagg. 173 - 224» Wiley-Interscience 1980) Il desiderio di avere a disposizione formulazioni enzimati che acquose con loro considerevoli vantaggi evitando contempo rancamente gli inconvenienti come perdite di attività e di contaminazione, ha condotto a diverse prove di soluzione, ad esempio al taglio con solventi organici (DE-A 1808834» HU-FS 2 642 , DDR-PS 10058), ovvero a formulazioni liquide non acquo se. Finora in ogni aspetto non é stato da registrare un succes so convincente specialmente in enzimi con attività proteoliti ca ed in particolare in enzimi pancreatici. (Cfr. DE-A 3704 46p, US-A 3741 902). C-li inconvenienti in formulazioni liqui de in mezzi organici risiedono nel fatto che non si può evita re la preparazione degli enzimi in forma secca e che i mezzi organici i più adatti come ad esempio propilencarbonato sono sproporzinatamente cari.
Compito e soluzione
Esisteva come sempre il compito di porre a disposizione formulazioni acquose con stabilità sufficiente di enzimi prote oliticamente attivi , in particolare del complesso pancreatico. Ivi era da un lato anche da rispettare l'innocuità ambientale, d'altronde.non doveva ,ad esempio in vista dell'impiego industria le, in particolare nell'industria del cuoio, derivare da ciò alcun elevato onere di costi.
Venne ora trovato che il compito esistente può venire risolto in modo molto conveniente mediante il procedimento secondo la presente invenzione.
Il procedimento secondo la presente invenzione per la preparazione cLi formulazioni enzimatiche acquose consiste nel fatto che gli enzimi presenti nel mezzo acquoso vengono precipitati in modo per sé noto in distribuzione fine e mediante adeguamen to in mezzo acquoso della densità viene realizzato uno stato degli enzimi stabile al deposito, finemente disperso.
Come già esposto, si raccomanda il procedimento per l'impiego in preparazioni acquose di enzimi di proteasi, di comples si enzimatici con azione proteolitica come amilasi, lipasi e così via con attività proteolitica associata. Sia particolarmente citato il complesso pancreatico (Panereatina).
Gli enzimi
Per enzimi con attività proteolitica siano intesi anzitutto le Endopeptidasi ("Proteasi" E.C.3.4·)» in relazione alla presente invenzione essendo in particolare di interesse gli en zimi utilizzati tecnicamente.
(Kirk-Othmer, loc.cit. Voi. 9» K. Aunstrup in B. Spencer Ed. Industriai Aspects of Biochemistry, Voi. 30 (i), pagg. 23 - 46, North Holland 1974.)
Si distingue: Proteasi
a) di origina animale, come ad esempio
) Rennina (E.C.3.4.23.4)
) Proteasi del pancreas
Pancreatina, in particolare Tripsina, Cliimotripsina (campo di pH d'attività circa 7 - 10)
Pepsina (Ε.0.3·4·23·ΐ) (Campo di pH d'attività circa 1,5 - 4,0) Katepsina (E.C.3.4«23«5) (Campo di pH d'attività circa 4,0 - 5,0 ).
b) Di origine vegetale
Papaina (E.C.3.4.22.1) Campo di pH d'attività circa 5,0 8,0
Ficina (E.C.3«4«22.3) Campo di pH d'attività circa 4,0 - 9,0
Bromelaina (Ξ.0,3·4·22·4 e 3·4·22.5) Campo di pH di attività circa 5,0 a 7,0)
c) Di origina microbica (cfr. L. Keay in "Process Biochemistry" , 1971, 17 - 21.
da tipi di Bacillus come B. subtilis, B. licheniformis, B. alkalophilus, B. cereus, B.natto, B. vulgatus, B. mycoides .
da tipi di Streptococcus
da tipi di Streptomyces
come Streptomyces fradiae, S. Griseus, S. rectus da Tipi Aspergillus
come -Aspergillus flavus-oryzae, A. niger, A. saitori, A. usamii
da tipi Mucor e Rhizopus
come tfiicor pusillus, Vi. mietrei
Tipi Endothia
come Endothia parasitica
da tipi Trametes
come Trametes sanguinea
Oltre la distinzione secondo l'origine trova anche impiego la distinzione secondo il luogo di attacco (Exo—versus—Endo—Enzyme) e in base al "Active Site" delle proteasi (Proteasi-serina, che vengono inibite da DFP, Sulfhydril-Enzyme).
Inoltre é di importanza pratica notevole la dipendenza di pH dell'attività degli enzimi.
Si distingue perciò soprattutto dai punti di vista pratici. i) Proteasi alcalina, con optimum d'attività circa nell'inter vallo di pH 7,5 a 13*
in particolare proteasi di batteri alcaline (E.C.3.4.21.) (che per lo più appartengono al tipo serina) e proteasi di funghi alcal.
ii) Proteasi neutre, con optimum d'attività nell'intervallo di pH 6,0 - 9,0
in particolare proteasi di batteri neutre (Ε.0.3.4·24·) (che appartengono ai metalloenzimi) e proteasi di funghi, ad esempio Bacillus-proteasi, Pséudòmònas-proteasi, Strepto— myces—proteasi, Aspergillus-Proteasi.
iii) Proteasi acide con optimum d'attività nell’intervallo di pH 2,0 - 5,0 (E.C.3.4.23)
in particolare proteasi di funghi acide, ad esempio da Rhizopus spp., Aspergillus spp., Penicillium spp. Kucor spp. e Impex lacteus e Endothitia parasitica.
Per l’analisi di prodotti tecnici é adatta caseina come substrato (Metodo secondo
vedasi seguito) o emoglobina (Metodo secondo ANSON, vedasi se guito) o gelatina (Metodo viscosimetrico).
Usualmente viene determinata l'attività proteolitica secondo il metodo Ldhlein-Volhard (modificato secondo TEGEVJA in "Leder", 22, 121 - 126 (1971) ). Quivi una unità LtJhìein-Volhard (LVE) nelle condizioni di prova (l ora, 37 gradi C) corrisponde ad una quantità d'enzima, che in 20 mi di filtrato di caseina prò voca un aumento di prodotto d'idrolisi corrispondente ad un equivalente di 5,75 x 10 ^ mi NaOH 0,1 n.
Inoltre é comune la determinazione dell'attività proteolitica degli enzimi secondo il metodo di emoglobina Anson (tl.L.Anson, J. Gen. Physiol., 22, 79 (1939) )·
Proteasi trovano impiego industriale tra l'altro nella prò duzione del cuoio, in detersivi e nella pulizia, nella disappret tatura, nella fabbricazione di formaggio, nella degradazione della carne e nella stabilizzazione di birra.
Inoltre sono di interesse, come già menzionato, complessi enzimatici con attività proteolitica ed enzimi con attività proteolitica associata.
Appartengono a questi tra altri amilasi, in particolare — amilasi (cfr. Fischer e Stein in "The Enzymes", 2. Ed., P.D.
Boyer e al., Voi. IV, pagg. 313 - 34» Academic Press), che che come preparati tecnici contengono di norma proteasi come enzimi associati. Leΰ(.-amilasi sono di origine animale, vegetale o microbiologica. Ponti preferite sono ad esempio amila si del pancreas, amilasi di batteri e funghi.
l campo d’attività di pH di (Pi -amilasi di diversa provenienza (cioè amilasi, che scindono il legame glicosidico -1,4 entro l'amilosio ovvero l’amilopectina) é nell’intervallo 3,5 “ 9,0. L' -amilasi ricavata dal pancreas ha un intervallo di attività di pii di 5,5 - 9,0 (optimum di pH circa 7,2), quella ricava te da batteri ha un intervallo d'attività di 4,5 a-8,5 (il pH optimum per 1' &i-amilasi fluidificante essendo a 6,5 - 7,0, per quella di trasformazione in zucchero a 4,8 - 5,2), quelle preparate da funghi un campo d'attività di 3,5 “ 7,0 (pH-opti mum 5,0) quelle preparate da malto un intervallo di 4,5 a 7,0 (optimum di pH 4,7) (cfr. Ullmann, loc.cit. Voi. 10, pag.507).
Ha costantemente acquistato importanza la preparazione da tipi di bacilli, come ad esempio B. subtilis, B. mesentericus, B. polymixa, B. amyloliquefacien3, B, licheniformis, inoltre da funghi, in particolare generi Aspergillus come A. niger, A, phoe nicis, A. oryzae, A. awamori, generi Mucor come H. rouxianus,tipi Rhizopus come R. delemar, R. oryzae, R. Japonicus, e generi Endo njyces come E. fibuliger. Amilasi trovano tra l'altro impiego nel settore dell'alimentazione f~Cfr. H·—J. Rehm & G. Reed Ed., "Biotechnology" Voi. 5, Verlag Chemie 1983» 3» Spencer, Ed. Industriai Aspects of Biochemistry; Voi. 30» parte I, pagg. 139 - 186, 213 - 260, Elseviers (1973)7 nella fluidificazio ne dell’amido, estrazione del malto, nella produzione di etano lo, disapprettatura, nella pruzione di cuoio tra altri. L'atti vita di -amilasi per impiego di amido come substrato può ve nire determinata secondo il metodo di Sandstedt, Kneen & Blish (Cereal Chem. 16, 172 (1939) e Technical Bulletin No. 1024, U.S. Dept. of Agriculture). Quivi 1 unità di amilasi (= 1 unità SKB) é quella quantità d'enzima, che a 30 gradi C e le altre condizioni di reazione date é in grado di destrinizzare 1 g di amido solubile nel corso di 1 ora.
Inoltre viene impiegato il metodo di Willstàtter per la de terminazione dell'attività dell'amilasi del pancreas (Hoppe-Seylers, Z. physiol. Chem. 126, 143 (1923)· Quivi una unità di amilasi Willstiltter viene definita come la quantità centupla di quella quantità di enzima, che nelle condizioni di prova in dicate scinde l’amido con una velocità tale che la costante di reazione monomolecolare é uguale a 0,01.
Inoltre fa parte del campo del procedimento secondo la pre sente invenzione l'applicazione a Lipasi (E.C.3.1.1.3) con atti vità proteolitica associata. Come lipasi vengono notoriamente designate carbossilesterasi, che scindono estere di glicerina in emulsione acquosa.
Si distinguGnq..qui:
Lipasi del pancreas, che sono contenute nel complesso enzimati co pancreatico, accanto-a esterasi, proteasi ed amilasi come enzimi associati tecnicamente importanti. L'optimum di pH (ri guardo a olio d'oliva) é nell'intervallo 7 - 8,5, il campo di attività é a pH 6,5 - 9,5·
Le lipasi sono ritenute in generale molto instatili, in particolare nei confronti di degradazione proteolitica da parte di proteasi associate.
Inoltre
Lipasi microbiologiche, ad esempio da Pseudomonas fragii, Asper gilluB sp. (ad esempio À. luchuensis) Candida cylindracea, Geotrichum candidum, Humicola languinosa, Mucor pusillus, Penicillium sp. (ad esempio P.chrysogenum, P. oxalicum,) Rhizopus sp. (R. nigericans, R.oryzae).
Queste lipasi presentano di norma un optimum di pH a pH > 7,0.
In modo tradizionale la determinazione dell'attività di lipasi viene effettuata con olio d'oliva come substrato, inoltre con triacetina e tributirina, / Cfr. M. Sémériva e al. Biochemistry 10, 2143 (1971) ; Pharmaceutical Qizymes, edito da R. Ruyssen e A. Lauwers 1978, (FIP)7·
In quanto l'attività di scissione di grassi viene espressa in unità Chilo-lipasi (Unità = KLCA), si opera nelle condizio ni standard: 40 gradi C, pH = 5>5 con tributirina come substra to. (cfr. M. Sémériva, passo di letteratura citato in quanto precede). Lipasi trovano impiego, per quanto la loro instabilità lo permette, tra l'altro nell’eliminazione dei rifiuti dell'industria del cuoio e nel settore alimentare.
Il procedimento
A, Isolamento dal complesso pancreatico
Il procedimento secondo la presente invenzione può agire conformemente in parte al procedimento di isolamento del livel lo della tecnica (cfr. Ullman, Voi. 10, loc.cit. pagg. 536 -537).
1. Estrazione
L'isolamento prende le mosse convenientemente da ghiando le del pancreas direttamente dopo la macellazione, prevalentemente del maiale o del bue.
Si possono ad esempio elaborare circa 100 ghiandole del pancreas in una carica, asportando subito dopo la macellazione grasso e tessuto connettivo meglio possibile dalle ghiandole e quindi omogeneizzando il tessuto delle ghiandole, ad esempio mediante un tritacarne).
Direttamente dopo ciò si estrae opportunamente con circa il volu me doppio (circa 60 l) di acido solforico 0,25 n a 5 gradi C 18 - 24 ore. Dopo aggiunta ài fiocchi filtranti, si pressa convenientemente su.una pressa per mezzi d'impacco. Le lastre di pressatura possono venire gettate.
2. Il procedimento
Succo ài pressatura ampiamente esente da grasso da ghian dole di pancreas viene precipitato con una elevata quantità di solfato di sodio o solfato d'ammonio ("Sale-A") conveniente mente mediante rapida aggiunta e a temperatura ambiente. La quantità d'aggiunta di Sale-A solido, anidro é convenientemente circa 50 - 2 % in peso riferita al succo di pressatura.
Può essere conveniente , mediante energica agitazione (ad esempio mediante un agitatore a dischi dentati) sminuzzare il prodotto precipitato fino ad un grado di ripartizione più fine. In molti casi qhesto provvedimento é tuttavia non indispensahi le, poiché a causa della rapida aggiunta del Sale-A la precipi tazione degli enzimi pancreatici avviene egualmente in forma finemente suddivisa.
Per il coniezionamento/standardizzazione del prodotto ad una determinata attività desiderata si diluisce all'occorrenza con soluzione—A di sale isotonica (ad esempio 38,3 kg di sale-A su 6l ,7 kg di acqua). Mediante aggiunta di sale-A solido ovvero di acqua deve essere regolata una densità della preparazione acquo sa di enzima di 1,22 a 1,23· Le esperienze con il complesso pancreatico indicano che solo in uno stretto campo di secondo tutti i risultati esistenti appunto nell'intervallo di densità 1,22 a 1,23, la sospensione di enzima rimane ampiamente stabile da sedimento. L'osservanza dell'intervallo di den sita stretto, necessario é quindi costituzionale per la presen te invenzione. Questa norma vale anche per estratti grezzi di enzimi di altra provenienza, come vennero presentati in quanto precede.
3. Ulteriore confezionamento
Mediante la regolazione isotonica dei filtrati di coltura secondo la presente invenzione, in particolare di origina pancreatica, si riesce a mettere a disposizione formulazioni stabili al deposito, che soddisfano le esigenze per uno spazio di tempo di giorni a settimane in modo fidato, di modo che in molti casi sono soddisfatte le premesse per l'applicabilità tecni ca. Un pregiudizio della stabilità al deposito può prodursi però per evaporazione del liquido di supporto (acqua) ovvero forti variazioni di temperatura mediante le variazioni didensità ovvero fluttuazioni di densità con esse connesse. Si può giungere alla rottura (ispessimento ovvero deposito) della sospensione di enzima. Le esigenze progressive della pratica tendono tuttavia a preparazioni di enzimi totalmente stabili al deposito ed omogenee.
Sorprendentemente riesce solo mediante impiego di almeno un agen te ispessente a base di xantano a conseguire un ispessimento sufficiente della sospensione di enzima fortemente contenente elettroliti (con ad esempio 3S,3 % in peso di tenore di sale-A). Buoni risultati ha dato in particolare xantano / Polisaccaridi-B-1459i Keltrol P. Kelzan; cfr. Kirk-Othmer, Encyclopedia of Chemical Technology, 3· Ed. Voi. 12, pagg. 62 — 66, J. VJiley & Sons 1°80, Rees ù.Uelch, Angew.Chemie 6°, 22δ - 239 (19TT) 7 ovvero altri agenti ispessenti a "base di xantano. Ad esempio l’ispessimento con mi derivato di xantano modificato in modo speciale (ad esempio X1AJ6, eteropolisaccaride anion. d. Ditta Kelco, San Diego, USA) ad una concentrazione da 0,1 a 5 ifcj pre feribilmente 0,1 a 1 fi in una soluzione di sale-A al 3813 fi in peso fornisce viscosità di 200 a 1000 mPa s.
Di norma l’ispessimento con lina soluzione dal 0,1 al 5 fi (in peso) di xantano ovvero di suoi derivati in una soluzione di 3S,3 fi in peso di Sale-A solido da risultati molto buoni, in particolare se lo xantano sotto taglio, ad esempio viene in corporato molto rapidamente (ad esempio con velocità periferiche di 1 - 5 m/sec). Questa soluzione di xantano é opportunamente isotonica con la soluzione di sale—A impiegata per la pre cipitazione. Essa può venire aggiunta direttamente al succo di spremitura di pancreas precipitato con sale-A per regolare così l’attività finale dell'enzima desiderata. Venne però trovato che anche in condizioni non—isotoniche, ad esempio nell'ulterio re intervallo di densità 1 - 1,5 l’ispessimento conseguito é sufficiente per ottenere formulazioni di enzima stabili al depo sito. Sia osservato che per diluizione di una sospensione di di pancreas precipitata con sale—A con la soluzione di sale—A ispessita, isotonica si verifica una riduzione di viscosità di circa 50 E' sufficiente la viscosità residua di 100 - 500 mPa.s, che vengono ottenute preparazioni di enzima omogenee, totalmente stabili al deposito a attività.
B. Isolamento da altri estratti grezzi contenenti proteinasi
In luogo del succo di spremitura di pancreas possono ve nire impiegati altri succhi di coltura contenenti proteinasi, ad esempio da colture di funghi o di batteri (cfr. i dati pre cedenti per la presenza di enzimi).
Inoltre é possibile l'applicazione del procedimento secondo la presente invenzione alla combinazione proteinasi di funghi/proteinasi di pancreas ovvero proteasi di batteri/pro teinasi di pancreas. Quivi vi sono ad esempio due possibilità:
a). Si mescolano i diversi succhi di coltura da 5 a 10 gradi C e si effettua subito una precipitazione con sale-A. Quindi mediante diluizione isotonica eventualmente con soluzione di sale-A ispessita si regola l'attività fina le desiderata.
b) La preparazione di batteti ovvero di proteinasi di funghi (precipitazione sale-A) viene viene prodotta analogamente alla sospensione di pancreas ma separatamente. Quindi la preparazione isotonica di proteinasi di funghi ovvero di batteri per la preparazione di pancreas viene aggiunta eventualmente diluita isotonicamente per la stadardizzazione ed eventualmente stabilizzata con soluzione di sa— le-A ispessita.
In entrambi i casi si ottengono formulazioni sia stabili al deposito nonché stabili di attività.
In tutte le sospensioni di enzima a causa dell'elevato tenore di elettroliti non é in generale necessaria alcuna stabilizzazione microbiologicamente efficace. D'altra parte all'aggiunta di agenti conservanti usuali (vedasi livello della tecnica) non si oppone alcun motivo tecnico.
Per tutti gli enzimi secondo le esperienze finora esistenti, e valido che il mezzo liquido deve possedere un intervallo di densità di 1,22 a 1,23, per conseguire stabilità al deposito. Ciò vale anche per il confezionamento finale con agente ispessente.
Gli Esempi che seguono servono all'illustrazione del proce dimento secondo la presente invenzione.
La determinazione della densità viene eseguita mediante esatta pesata di una quantità in volume definita in cilindro graduato tarato a 20 °C.
La determinazione della viscosità viene effettuata con il visco simetro Brookfield parimenti a 20 gradi C.
ESEMPI
Esempio 1
Preparazione della soluzione isotonica con la densità 1,22 a 1)23 g/ciri^; 20 gradi C
In un recipiente di agitazione vengono introdotti 61,7 kg di acqua di rubinetto e trattati con 38,3 kg di solfato d'ammonio anidro. Si agita fintantoché l'intera quantità di sale si é àisciolta. Se non viene conseguita la densità di 1,22 a 1,23 g/cm^, questa può essere regolata mediante aggiunta di sale o di acqua.
Esempio 2
Preparazione di una formulazione liquida acquosa di enzima a base di enzima di pancreas
100 kg di succo di spremitura, con l'attività 30100 LVE, come risulta dopo la triturazione, attivazione ed estrazione di ghian dole di pancreas, vengono introdotti in un recipiente di agita zione e trattati con 50 kg di solfato d’ammonio. Aw iéne la pre cipitazione degli enzimi del pancreas. La sospensione di enzima del pancreas (29600 LVE), possiede un'attività media di 28000 -32000 LVE/g (densità 1,22 - 1,23 g/cm^). Mediante aggiunta della soluzione isotonica di sale d’ammonio di Esempio 1 può venire regolata ogni attività LVE desiderata. Tanto più diluita é la preparazione di enzima, tanto più rapidamente avviene una sedi mentazione dell'enzima nrecipitato.
1000 - 3000 LVE : Sedimentazione dopo alcune ore ovvero giorni
3000 - 9000 LVE : Sedimentazione dopo alcune settimane ovvero più settimane
da circa 16000 LVE: ampiamente stabile alla sedimentazione - Perdita di attività della soluzione di enzima di pancreas puramente acquosa dopo 6 settimane a 25 gradi C : 81 % - Perdita di attività della sospensione di enzima precipitata di pancreas dopo 6 settimane a 25 gradi C : 8,9 %
Esempio 3
100 kg di una soluzione acquosa limpida di una proteasi di fun go di Aspergillus parasiticus con l'attività di 32000 LVE, viene trattata a 16 gradi con 50 kg di solfato d'ammonio e in tal modo l'enzima precipita. La sospensione di enzima (31400 LVE), con la densità l,22a 1,23 g/cm , viene diluita con la so'.. luzione isotonica di solfato d'ammonio di Esempio 1 alla attività desiderata. Si ottengono preparazioni di enzima, che sono stabili alla sedimentazione per parecchi giorni.
Perdita di attività della sospensione di enzima dopo 6 settima ne di permanenza a 25 gradi C: 4I3 %·
in confronto:
Pèrdita di attività della proteasi di fungo puramente acquosa (senza precipitazione) dopo 6 settimane di tempo di riposo a 25 gradi C: 62 c/o
Esempio 4
50 kg di succo di pancreas liquido (da Esempio 2), con l'attività 30100 LVE ed una temperatura di 10 gradi C, e 50 kg di succo di proteasi di fungo liquido (da Esempio 3) con l'attivi tà 32000 LVE ed una temperatura di 10 gradi C, vengono miscela ti in un recipiente di miscelazione. Direttamente dopo la miscelazione vengono aggiunti senza interruzione 50 kg di solfato d'ammonio sotto agitazione ed in tal modo l'enzima precipita. 51 ottiene una sospensione di enzima con l'attività 61200 LVE. La densità sta tra 1,22 e 1,23 g/cm^. Mediante diluizione con soluzione isotonica di solfato d'allonio di Esempio 1, può veni re regolata l'attività desiderata.
Perdita d'attività della miscela di enzima (senza precipitazio ne dopo 6 settimane a 2.5 gradi C : 74
Perdita d'attività della sospensione di enzima (precipitata) dopo 6 settimane a 25 gradi C : 10,1 °/om
Esempio 5
50 kg di proteasi di datteri acquosa liquida (43200 LVE, 10 gradi C) da Bacillus licheniformis e 50 kg di succo di spremitura di pancreas di Esempio 2 (31100 LVE, 10 gradi C)., vengono miscelati in un recipiente di miscelazione e trattati con 50 kg di solfato d'ammonio. In tal modo gli enzimi vengono precipitati. Si ottie ne una sospensione di enzima con una attività di 35400 LVE.
Questa ha una densità di 1,22 1,23 g/< e può mediante di luizione con soluzione di solfato d'ammonio (Esempio l) venire regolata all'attività desiderata. Dopo riposo di 6 settimane a 25 gradi C, l'attività é diminuita di 12 Contrariamente a ciò, l'attività di una miscela di enzima non precipitata nelle stesse condizioni é diminuita di 88
ESempio 6
a) 3 kg di precipitazione di enzima di pancreas (Dispersione di Esempio 2 con l'attività 29600 LVE/g) viene miscelata con 26,6 kg di soluzioneisotonica di solfato d'ammonio.
Si ottiene una sospensione di enzima stabile per 3 giorni alla sedimentazione con l'attività 3000 LVE, Il prodotto perde dopo 6 settimane di riposo a 25 gradi C 8,7 di atti vità,
b) 3 kg di precipitazione di proteasi di fungo (dispersione di Esempio 3 con l'attività 31400 LVE/g) viene miscelata con 28,4 kg di soluzione isotonica di solfato d'ammonio. Si ottiene una sospensione di enzima stabile alla sediraen tazione per 4 giorni con l’attività 3000 LVE. Questa dopo 6 settimane di tempo di riposo ha pèrduto 5,5 % di attività.
30 kg di sospensione di pancreas di Esempio 6a, con l'attività 3000 LVE, vengono trattati egualmente con 30 kg di dispersione di proteasi di fungo di Esempio 6b, con l'attività 3000 LVE.
La miscela possiede un'attività di 3000 LVE ed una densità di 1,22 g/cm^. Dopo riposo di 6 settimane a 25 gradi C, l'attivi tà é diminuita del 9,8 >. In confronto a ciò una miscela non precipitata dello stesso enzima nelle stesse condizioni perde 88 % di attività.
Esempio 7
Preparazione di una preparazione di enzima acquosa ben scorrevo le completamente stabile al;deposito, subito pronta all'uso
a) In un recipiente di miscelazione 60,7 kg di acqua vengono introdotti e con un agitatore a disco dentato (velocità periferica 2 - 3 m/sec) 1 kg di un agente addensante a base di xantano viene incorporato (ad esempio K1A96, Ditta Kelco). Se la viscosità della soluzione é salita p·1000 mPas, vengono aggiunti 38,3 kg di solfato d'ammonio.
Si rimescola fintantoché il solfato d'ammonio si é ampiamente disciolto. La viscosità diminuisce a 480 mPas.
b) 3 kg della sospensione di enzima precipitata di Esempio 4 (61200 LVE; enzima di fungo) vengono.,ora aggiunti a 58,2 'kg della soluzione di solfato d'ammonio addensata di Esem pio 7a) e miscelata omogeneamente con l'agitatore a disco dentato. Si ottiene una sospensione di enzima completamen te stabile al deposito con l'attività 3000 LVE ed una vi scosità di 270 mPas. Si osserva in una miscela di enzima non precipitata dopo 6 settimane di riposo a 25 gradi C una diminuzione di attività di 74 %, la corrispondente so spensionedi enzima addensata corrispondente mostra unica mente una perdita di attività di 9,2 %.
Claims (3)
- R IVEN D I CA Z ION I Procedimento per la produzioni di formulazioni acquose di enzimi proteoliticamente attivi con sufficiente stabilità, caratterizzato dal fatto che gli enzimi presentì in mezzo acquo so vengono precipitati in fine distribuzione, dopo di che mediante adattamento della densità nello stesso mezzo acquoso viene preparato uno stato di distribuzione finemente disperso stabile al deposito dell'enzima.
- 2 Procedimento secondo rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che gli enzimi presenti in ambiente acquoso rappresentano sostanzialmente proteasi (E.C.3.4)· Procedimento secondo rivendicazione 2, caratterizzato dal fatto che gli enzimi sono di origine microbiologica 4 Procedimento secondo rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che gli enzimi presenti in ambiente acquoso rappresentano idrolasi dal gruppo delle amilasi (E.C.3.2.1) e lipasi (E.c.3.1.1.3) con attività proteolitica associata. Procedimento secondo rivendicazione 1 e 4i caratterizzato ύ dal fatto che gli enzimi presenti in ambiente acquoso appartengono al complesso pancreatico. Procedimento secondo le rivendicazioni 1 a 5» caratterizzato dal fatto che gli enzimi presenti in ambiente acquoso vengo no impiegati sotto forma di estratti dall'usuale estrazione di enzimi. Procedimento secondo le rivendicazioni 1 a 6, caratterizzato dal fatto che la precipitazione che conduce alla distribu zione fine viene provocata mediante aggiunta di sale inerte. 8. , Procedimento secondo rivendicazione 7, caratterizzato dal fatto che la precipitazione viene provocata con solfato d'ammonio o solfato di sodio. 9., Procedimento secondo le rivendicazioni 1 a 8, caratterizzato dal fatto che la densità conseguita mediante adattamento dell'ambiente acquoso sta nell'intervallo 1,22 a 1,23. ìoy Procedimento secondo le rivendicazioni 1 a J, caratterizzato dal fatto che per l'ulteriore stabilizzazione da deposito della sospensione di enzima finemente suddivisa vengono aggiun ti addensanti a base di xantano. 1j Procedimento secondo rivendicazione 10, caratterizzato dal fatto che agenti addensanti a base di xantano vengono ag giunti sotto forma di una soluzione isotonica contenente solfato d'ammonio o solfato di sodio. L2y Procedimento secondo rivendicazione 11, caratterizzato dal fatto che la soluzione contenente gli agenti addensanti a base di xantano venne preparata mediante miscelazione per azione di forze di taglio}
- 3.J Procedimento secondo rivendicazione 12, caratterizzato dal fatto che gli agenti addensanti a "base di xantano ammonta no da 0,1 a 1 % in peso della soluzione. L4»| Procedimento secondo le rivendicazioni 1 - 13, caratte rizzato dal fatto che miscele di enzimi di differente prove nienza vengono precipitate insieme ed elaborate. 13J Procedimento secondo le rivendicazioni 1 - 14, caratte rizzato dal fatto che sospensioni di enzima preparate separata mente vengono mescolate a formulazioni stabili. "Si attesta la perfetta conformità del testo che precede"
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