DE3147947A1 - "verfahren zur herstellung halbsynthetischer enzyme" - Google Patents

Description

1. Gebiet, in das die Erfindung fällt:

Proteine sind biologisch synthetisierte Makromoleküle, die verschiedene Funktionen in lebenden Systemen haben. Enzyme sind eine besondere Art biologisch aktiver Proteine, die bestimmte Reaktionen katalysieren. Derzeitig findet die
Enzymtechnologie in vielen Bereichen in Industrie und
Forschung Anwendung; als Beispiele seien genannt die medizinische Forschung, Nahrungsmittel-Behandlung und
-Konservierung, Herstellung fermentierter Getränke, Herstellung von Arzneimitteln und Bestimmung der Konzentration verschiedener Metabolite und Nahrungsmittelbestandteile mittels enzymatischer Analysen.

Enzyme sind in ihrer biologischen Aktivität hochspezifisch und katalysieren im allgemeinen eine bestimmte Reaktion in einem sehr hohen Grade im Vergleich zu der entsprechenden bei Raumtemperatur ohne biologische Katalyse ablaufenden Reaktion. Ein Enzym kann katalytische Aktivität mit Bezug auf eine Anzahl von Substraten, auf die es wirken kann,
zeigen. Demgemäß kann ein gegebenes Enzym die Synthese
oder den Abbau von mehr als einem Substrat katalysieren. Einige Proteine, die nicht als klassische Enzyme angesehen werden, wie Rinderserum-Albumin, zeigen sehr begrenzte katalytische Aktivität mit Bezug auf ein oder mehrere Substrate.

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Viele Enzyme werden in der Natur in.sehr kleinen Mengen gefunden. Ihre Isolierung, Reinigung und Verwendung ist daher im Hinblick auf die Kosten und die Zeit, die zu ihrer Isolierung in verwendbarer Form erforderlich ist, auf Arbeiten in kleinem Maßstab beschränkt.

Einige Enzyme kommen in der Natur in relativ großen Mengen vor und sind verhältnismäßig leicht zu isolieren,zu reinigen und zu verwenden. Leider können aber die Enzyme, die in großen Mengen zur Verfugung stehen, wegen ihres bestimmten katalytischen Verhaltens nur bestimmte ausgewählte Reaktionen katalysieren.

In letzter Zeit sind viele Anstrengungen unternommen worden, synthetische biologische Katalysatoren zu synthetisieren, welche gleiches enzymatisches Verhalten zeigen wie die natürlichen Enzyme, die entweder selten sind oder deren Isolierung teuer ist. Ferner sind einige Versuche unternommen worden, native Enzyme zu modifizieren derart, daß sich ihre enzymatischo Spezifität ändert, so daß sie eine Reaktion katalysieren können, die sie vorher nicht katalysieren konnten.

2. Würdigung des Standes der Technik;

Eine bekannte Technik, um enzymatisches Verhalten zur Katalysierung einer bestimmten gewünschten Reaktion zu er-

halten, ist die Synthese der sogenannten Enzym-Modell-Moleküle. Z.B. können Verbindungen niedrigen Molekulargewichts koviilent an funkti.onelle Gruppen gebunden werden, welche die Aktivität des AktivitätsZentrum eines EnzyrtB zeigen. Beispiele für solche Synthesen sind in den nachstehenden Veröffentlichungen beschrieben: Breslow R., Advances In Chemistry Series, R. F. Gould, Ed., American Chemical Society, Washington, D.C, 21-43 (1971) und Tang, CC; Davalian, D.; Haung, P. und Breslow, R., J. Amer. Chem. Soc, 100, 3227(1978).

Eine andere Methode schließt die Verwendung einer Matrix aus einem synthetischen Polymeren ein, welches entlang seiner Hauptkette modifiziert ist, um die funktionellen Gruppen, welche die Funktion des AktivitätsZentrums eines gegebenen Enzyms aufweisen, bereitzustellen. Beispiele für die Methode sind folgenden Artikeln zu entnehmen: Wulff, G. und Schulza, I., Isreal J. Chem., 17, 291 (1978) und Suh, H. und Klotz, I. M., Bioorganic, 6, 165 (1977).

Eine weitere Technik umfaßt das Anhängen eines chemischen Teil an ein natives Enzym in der Nähe seines Aktivitätszentrums um zu versuchen zu verursachen, daß solch ein Enzym mit einer anderen katalytischen Aktivität reagiert. Ein Beispiel dafür ist die Umwandlung von Papain, einem

proteoIytischen Enzym in ein Enzym vom Typ einer Oxidase durch die kovalente Bindung eines Flavins nahe dem Aktivitätszentrum des nativen Papainenzyms, wie in folgehden-Artikeln beschrieben: Levine, H. L. und Kaiser, E. T., J. Amer. Chem. Soc, 100_f 7670 (1978) und Otsuki, T., Nakagawa, Y. und Kaiser, E. T., J.C.S. Chem. Comm., 11, 457 (1978) . Andere Beispiele für solche enzymatische lio-i difizierung können dem Artikel von: Wilson, M. E. und Whitesides, G. M., J. Amer. Chem. Soc, 100, 306 (1978), entnommen werden.

Noch ein anderer Versuch, die Enzymspezifität zu ändern, ist die Ruhigstellung eines nativen Enzyms in einer Gel-Matrix. So ist z.B. das Enzym Trypsin in Polyacrylamid-GeI.ruhiggestellt worden. Das Polyacrylamid-Gel gestattet Aminosäureestern durch die Gel-Matrix hindurchzudifr fundieren um mit dem Enzym zu reagieren, gestattet aber größeren Proteinen das Hindurchdiffundieren nicht. So wird die Enzymspezifität durch Eliminieren des Zutritts eines· der Substratmoleküle zu dem Enzym geändert. Beispiele für solche Speζifitatsänderungen sind beschrieben in Kirk-Othmer Encyclopedia of Chemical Technology, 3 Ed., 9/ 148 (1980) herausgegeben von Wiley und Son, Inc.

Es ist auch bekannt, daß eine native Lysin-Monooxygenase derart umgesetzt werden kann, daß die SuIfhydry!gruppen auf dem Enzym blockiert sind. Wenn das bestimmte Enzym

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Lysin-Monooxygenase so behandelt wird, zeigt es eine neue katalytische Aktivität gegenüber Aminosäuren und katalysiert oxidativ Desaminierung anstatt, wie das natürliche Enzym oxygenativ Decarboxylierung. Die Autoren können jedoch nicht über das modifizierte Verhalten berichten. Siehe den Artikel von Yamauchi, T.; Yamamoto, S. und Hayaiski, 0. , in The Journal of Biological Chemistry, 248, 10, 3750-3752 (1973). Es ist auch mitgeteilt worden, daß durch Umsetzen eines nativen Enzyms, z.B. Trypsin, mit seinem natürlichen Inhibitor und anschließender Vernetzung die Aktivität des Enzyms mit Bezug auf seine natürlichen Substrate modifiziert werden kann. Siehe den Artikel von Beaven, G. H. und Gratzer, W, B. in Int. J. Peptide Res., 5, 215-18 (1973).

Obwohl diese Verfahren für viele Anwendungszwecke geeignet sind, führen sie allgemein zu modifizierten natürlichen Enzymen oder vollständig synthetisierten Enzym-Analogons, die keine hohe katalytische Aktivität haben.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein einfaches und wirtschaftliches Verfahren zur chemischen Modifizierung eines billigen, im Handel erhältlichen nativen Enzyms zu schaffen, bei welchem ein halbsynthetisches Enzym erzeugt wird, das eine Aktivität mit Bezug auf eine gewünschte chemische Reaktion zeigt, die bisher durch das native

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Enzym katalysiert, keine industriell geeignete Reaktion war. Die neue Reaktion soll in systematischer Art und Weise voraussehbar sein. Während bei den bekannten, vorstehend beschriebenen Verfahren ein Enzym einfach einem Satz von Bedingungen unterworfen wurde und versucht wurde, sein Verhalten aufzuklären, soll "ein systematisches Verfahren zum Modifizieren von Protein- und Enzym-Verhalten geschaffen werden.

Die Aufgabe wird gelöst durch das Verfahren nach Ansprucin oder 10. Bevorzugte Ausführungsformen sind in den Unteransprüchen angegeben.

Zusammenfassung der Erfindung

Erfindungsgemäß wird ein halbsynthetisches Enzym dadurch erhalten, daß ein natives Protein, typischerweise ein enzymatisch aktives Protein, zur teilweisen Denaturierung einem Denaturierungsmitte1 ausgesetzt wird, um die konformationale Struktur des Proteins teilweise auszubreiten. Danach wird das teilweise denaturierte Protein mit einem Inhibitor eines Modellenzyms in Kontakt gebracht. Anschließend wird das Protein vernetzt, um eine neue Konformation oder ein halbsynthetisches Enzym zu bilden, daß durch den Inhibitor festgelegt wird. Dann werden der Inhibitor und überschüssiges Vernetzungsmittel von dem neugebildeten halbsynthetischen Enzym entfernt, um ein funktionelies Analogon zu

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dem Modellenzym zu erhalten. Das so hergestellte halbsynthetische Enzym besitzt die Aktivitätscharakteristik des Modellsystems.

Beschreibung der bevorzugten Ausführungsform der Erfindung: Es ist gefunden worden, daß ein Protein von seiner nativen Konformation nach dem erfindungsgemäßen Verfahren zu einer halbsynthetischen Konformation modifiziert werden kann. Der neue konformationale Zustand bestimmt die Gestalt eines halbsynthetischen Enzyms, das katalytische Aktivität zeigt. Das Wort "Enzym", wie es hierin gebrau cht wird, ist definiert als ein Protein, welches gut bekannte katalytische Aktivität gegenüber spezifischen Substraten hat. Der Ausdruck "Protein", wie er hierin gebraucht wird, ist definiert, wie allgemein in der einschlägigen Technik akzeptiert, als ein Polypeptid, das aus Aminosäuren gebildet ist und ein biologisches Molekül darstellt.

Die Erfindung schließt ein ein Verfahren zur Modifizierung eines Proteins von einer Konformation in eine zweite Konformation, wodurch eine neue enzymatische Aktivität des ausgewählten Proteins erzeugt wird oder eine an der untersten Grenze liegende enzymatische Aktivität des nativen Proteins auf eine industriell geeignete Stärke erhöht wird.

Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren wird ein natives Protein, typischerweise ein Enzym, Bedingungen und/oder Rea-

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genzien unterworfen, die die Struktur des Proteins, gewöhnlich reversibel, teilweise denaturieren. Dann wird ein Inhibitor des Modellenzyms mit dem nativen Protein, das sich in dem teilweise denaturierten Zustand befindet, in Kontakt gebracht. Ohne sich an eine Theorie binden zu wollen, wird angenommen, daß es die teilweise Denaturierung dem Protein gestattet einen Inhibitor des Enzyms, das durch das Verfahren nachgebildet werden soll, zu binden, um ein AktivitätsZentrum zu bilden, das dem Aktivitätszentrum des Modellenzyms sehr ähnlich ist. Es wird angenommen, ,daß die Inhibitorbindung die neue Konformation, welche mindestens ein AktivitätsZentrum einschließt, das in der Lage ist, die katalytische Funktion des Modellenzyms auszuführen, schützt und festlegt, bis die neue Konformation vernetzt werden kann. Nachdem Inhibitor und das teilweise denaturierte Protein in Kontakt gebracht worden sind, wird die Vernetzung ausgeführt, um die neue::Konformation des Proteins chemisch zu stabilisieren. So wird ein neues halbsynthetisches Enzym nach einem Modellprotein hergestellt.

"Teilweise Denaturierung" bedeutet hierin eine Änderung der Konformation eines Proteins, so daß die Gestalt oder Konformation des Proteins gestört wird ohne e.ine irreversible starke Denaturierung des Proteins zu verursachen. "Konformation" ist definiert, wie allgemein in der einschlägigen Technik .akzeptiert, als die Kombination von

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Sekundär- und Tertiär-Struktur eines Proteins, das in vivo biologische Aktivität besitzt. Die teilweise Denaturierung von Proteinen ist gut bekannt und ins einzelne gehend in folgenden Veröffentlichungen besprochen: dem Buch Biochemistry, von A. L. Lehninger, Worth Publishers, Inc., N.Y., 1970, S. 58; den Artikeln von P.L. Privalöw "Stability of Proteins" in Advances in Protein Chemistry, Vol. 33, S. 167-192; C. Sanford "Protein Denaturation, Part C" in Advances in Protein Chemistry, Vol. 24, S. 2-97; F.R.N. Gurd, et al "Motions in Proteins" in Advances in Protein Chemistry, Vol. 33, S. 74-166; O. Jardetzky in BBA, Vol. 621, S. 227-232; R. Huber in TJBS, Dec. 1979, S. 271, und D. S. Markovich, et al in Molekulyarnaya Biologiya, Vol. 8, No. 6, S. 857-862.

"Denaturierungsmittel" bezieht sich hierin, d.h. in dieser Beschreibung und den Ansprüchen, auf Verfahrensbedingungen oder Reagenzien, welche die teilweise Denaturierung eines Proteins verursachen. Die teilweise Denaturierung eines Proteins kann z.B. mittels Durchtränken des Proteins in einer wäßrigen Lösung bei erhöhten Temperaturen, z.B. im Bereich von 25° C bis 60° C, durchgeführt werden. Bei den meisten Proteinen wird die Struktur durch Temperaturen von 25 bis 60° C so gestört, daß eine teilweise Denaturierung resultiert. Wie bekannt, sind jedoch einige Proteine, die von thermophilen bakteriellen Quellen stammen, noch nahe dem Kochpunkt des Wassers stabil und würden höhere

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Temporatüren erforderlich machen als die vorstehend allgemein offenbarten. Die teilweise Denaturierung kann auch durch Durchtränken des Proteins mit einer wäßrigen Lösung, die ein anorganisches Salz, eine anorganische oder organische Säure oder ein mit Wasser mischbares Lösungsmittel enthält, erfolgen.

Geeignete anorganische Salze, die zur Destabilisierung der Proteinstruktur dienen, schließen ein: NaF, (NH₄)-SO., (CfI₃J₄NCl, (CH₃J₄NBr, KCH₃COO, NH₄Cl, RbCl, KCl, NaCl, CsCl, LiCl, KBr, NaBr, KNO₃, MgCl₃, NaNO₃, CaCl₂, KSCN, NaSCN, BaCl₂, NaJ, und LiJ.

Geeignete anorganische Säuren schließen ein: Salzsäure, Salpetersäure, Schwefelsäure, Phosphorsäure und ähnliche Protonen abgebende starke anorganische Säure.

Geeignete organische Säuren schließen ein: Essigsäure, Ameisensäure, Propionsäure und Zitronensäure.

Geeignete mit Wasser mischbare Lösungsmittel, von denen angenommen wird, daß sie hydrophobe Gruppen am Protein solubilisieren und dadurch ihre Struktur destabilisieren, schließen ein: tert-Butanol, Acetonitril, Dioxan, Aceton, Methanol, Ethanol und Dimethylsülfoxid.

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-■15 -* * *"

Der Ausdruck "Inhibitor" bedeutet hierin irgendeine Verbindung mit ausreichender struktureller Ähnlichkeit mit dem natürlichen Substrat eines halbsynthetischen Proteins, um als eine Schablone für das Aktivitätszentrum des halbsynthetischen Enzyms zu dienen. Inhibitoren werden im allgemeinen durch das Enzym nicht abgebaut v/ie die Substrate. Ein Beispiel für die strukturelle Ähnlichkeit eines Enzyminhibitors und des natürlichen Substrats eines Enzyms ist der Fall der Glukose-Oxidase. Glucose ist das natürliche Substrat der Glukose-Oxidase, während D-Glukal der Inhibitor der Glukose-Oxidase ist. Glukose und D-Glukal sind strukturell sehr ähnlich.

Der Ausdruck "Vernetzung" bedeutet hierin die Bildung kovalenter Bindungen, entweder intermolekulare oder intramolekulare, zwischen reaktiven Zentren an einem Protein. Für die intramolekulare Vernetzung wird das Verfahren unter Verwendung von multifunktionellen Reagenzien, wie Glutaraldehyd ausgeführt. Weitere Beispiele für geeignete Vernetzungsreagenzien, die eine Vernetzung eines Proteins bewirken sind: 2-Amino-4,6-dichlor-s-triazin- ; Diazoniumsalze; N-Hydroxysuccinamid; p-Benzoylazid und Reagenzien, die in folgenden Veröffentlichungen offenbart sind: WoId, F., Methods Enzymol, 11, HIRS, C.H.W, ed.. Academic Press, 1967, 617; Fasold, H. et al, Augen. Chem. Int. Ed. Eng!., 10, 795, 197, und Keyes, M. H., Kirk-Othmer: Encyclopedia of Chemical Technology, 9, 3d ed., 1980, J. Wiley and Sons, Inc., 148-172. .

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Viele natürlich vorkommende Enzyme dürften der Formgebung nach dem erfindungsgemäßen Verfahren zur Herstellung ihrer halbsynthetischen Analogen zugänglich sein, wie z.B. hydrolytische Enzyme, Redoxenzyme und Transferasen. Z.B.: Die erste Gruppe, die hydrolytischen Enzyme, schließen proteolytische Enzyme, welche Proteine hydrolysieren ein; z.B. Papain,Ficin, Pepsin, Trypsin, Chymotrypsin, Bromelin, Keratinase, Carbohydrasen, welche Kohlenwasserstoffe'hydrolysieren, z.B. Cellulase, Amylase, Maltase, Pektinase, Chitanase; Esterasen, welche Ester hydrolysieren, z.B. Lipase, Cholinesterase, Lecithinase, alkalische und saure Phosphatasen; Nucleasen, weiche Nucleinsäure hydrolysieren, z.B. Ribonuclease, Desoxyribonuclease; und Amidasen, welche Amine hydrolysieren, z.B. Arginase, Asparaginase, Glutaminase, Histidase und Urease. Die zweite Gruppe sind Redox-Enzyme, die Oxidations- oder Reduktionsreaktionen katalysieren. Sie schließen ein Glukose-Oxidase, Xanthin-Oxidase, Catalase, Peroxidase, Lipoxidass und Cytochröm-Reduktase. In der dritten Gruppe sind Transferase-Enzyme, die Gruppen von einem Molekül auf ein anderes übertragen. Beispiele dafür sind Glutaminpyruvin-Transaminase, GIutamin-Oxalsäure-Transaminase, Transmethyläse, Phosphorpyruvin-Transphosphorylase. '

In der Praxis wählt man ein Modell oder erste Protein, typischerweise ein Enzym. Dann wählt man ein zweites Pro-

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tein, das nach dem ersten Protein geformt werden soll, um ein halbsynthetisches Enzym zu erhalten. Bei der praktischen Durchführung der Erfindung kann man das zweite Protein auf ein davon verschiedenes halbsynthetisches Protein, welches gewünscht wird, maßschneidern. Dies gibt einen erheblichen Vorteil bei vielen klinischen und industriellen Situationen, bei denen das Enzym, das man zu verwenden wünscht, schwer erhältlich, sehr teuer oder schwer zu reinigen ist.

So kann ein natives Protein oder Enzym, das in großen Mengen erhältlich und/oder billig ist durch das erfindungsgemäße Verfahren umgeformt oder modifiziert werden. Das leicht erhältliche Protein oder Enzym wird in ein weniger leicht erhältiches und/oder teureres halbsynthetisches Enzym umgewandelt, welches die katalytische Aktivität des gewünschten nativen Enzyms zeigt. Es gibt viele Anwendungsgebiete für solche enzymatisch umgewandelten Produkte, wie z.B. viele Verwendungszwecke in Industrie und Forschung, insbesondere für Forschungszwecke auf dem Gebiet der Gärung, der Arzneimittel und der Medizin sowie der Nahrungsmittelverarbeitung.

Bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens wird ein natives Protein gereinigt und in einer geeigneten Pufferlösung gelöst. Danach wird die Lösung mit einem Denaturierungsmittel vermischt, um die teilweise Denaturierung des

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darin gelösten Proteins zu bewirken. So wird z.B. das Protein teilweise denaturiert durch Änderung der Ionenstärke der Lösung, durch Zugabe eines anorganischen Salzes, durch Modifizierung des pH-Wertes der Lösung mit einer anorganischen odor organischen Protonen abgebenden Säure, oder durch Modifizierung der Lösung durch Einführung eines mit Wasser mischbaren organischen LösungsmitteIs.Die Kontaktzeit des Denaturierungsmittels und des Proteins kann 15 Minuten bis einige Tage betragen. Auch kann die. Temperatur der Lösung erhöht werden als eine Verfahrensbedingungsmodifikation, durch welche ein Protein teilweise denaturiert wird, wie in den weiter oben gebrachten Literaturstellen offenbart, z.B. dem Artikel von Privalov; In manchen Fällen, in denen das zu behandelnde Protein viele Disulfidbrücken hat, z.B. Rinderserum-Albumin oder Urease, kann die teilweise Denaturierung durch Spaltung der Disulfidbrücken in dem Protein erfolgen, wozu man das Protein Mercapto-Ethanol aussetzt.

Es wird angenommen, daß das teilweise Denaturieren des des Proteins in einer Auflockerung der Proteinstruktur resultiert, so daß es den Inhibitor, der anschließend mit der das teilweise denaturierte Protein enthaltenden Lösung vermischt wird, aufnimmt und bindet. ·

Nachdem das Protein teilweise denaturiert worden ist, wird

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es mit einem Inhibitor des Modellenzyms vermischt und der Kontakt zwischen Protein und Inhibitor bei einer Temperatur und für eine Zeit aufrechterhalten, die ausreichen, eine Population von Komplexen von Inhibitor und teilweise denaturiertem Enzym zu bilden. Im Fall der Umwandlung des nativen Enzyms Trypsin in ein halbsynthetisches Enzym, welches die Aktivität des nativen Enzyms Chymotrypsin nachbildet, wird das native Enzym Trypsin mit einem ChymotrypsinInhibitor, z.B. Indol ode-r Benzoesäure, in Kontakt gebrachL. Das Inkontaktbringen findet entweder in einer wäßrigen Lösung statt oder in einer wäßrigen Lösung, welcher organisches Lösungsmittel in genügender Menge zugesetzt worden ist, daß die Solubilisierung des Inhibitors unterstützt wird.

Nachdem der Inhibitor mit dem teilweise denatuderten Enzym in Kontakt gebracht worden ist, wird die neue Gestalt des halbsynthetischen Enzyms durch weitgehende Vernetzung der Proteinstruktur stabilisiert. Typischerweise wird das Vernetzen mit Glutaraldehyd als Vernetzungsmittel vorgenommen, da es verhältnismäßig billig und leicht erhältlich ist; aber es kann auch irgendein anderes der weiter oben angegebenen Vernetzungsmittel mit Erfolg verwendet werden.

Nach der Vernetzung des Proteins in die neue Struktur unter Bildung des halbsynthetischen Enzyms werden Inhibitor

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und irgendwelches überschüssiges Vernetzungsmittel von dem neugebildeten halbsynthetischen Enzym nach irgendeiner göeigneten Methode entfernt. Geeignete Methoden sind Flüssigkeits-Chromatographie und erschöpfende Dialyse. Das neugebildete halbsynthetische Enzym wird z.B. durch Gelsäulenchromatographie gereinigt und die Proteinfraktion mit der stärksten Aktivität aus dem Eluant gesammelt, um das am stärksten aktive halbsynthetische Enzym zu erhalten»

Alle in der Beschreibung zitierten Patent- und Druckschriften sind durch ihre Nennung in diese Offenbarung aufgenommen.

Die nun folgenden Beispiele sollen das Verfahren nach der Erfindung veranschaulichen.

-Beispiel 1

•Teil A
Reinigung des Enzyms

Gereinigtes Trypsin aus Rihderpankreas, zweimal kristallisiert, salzfrei undlyophil gemacht, wurde nach dem Verfahren von Kostka und Carpenter getestet (Kostka, V. und Carpenter, B". II., The Journal of Biological Chemistry, 239, 6, 1979 (1964)). Es wurde keine Verunreinigung durch natives Chymotrypsin festgestellt. Die Äusgangsuntersuchung auf Trypsin-Substrat-Spezifität wurde nach einer potentiometrischen pH-Stat-Methode nach Walsh und Wilcox durchgeführt

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(Walsh, K. A. und Wilcox, P. E., Methods in Enzymology, edited by G. E. Perlmann und L. Lorand, Academic Press, 31-41 (1970)), Das Trypsin wurde in 0,001 M HCl bei pH 3,0 bereitgestellt. Die Extinktion wurde bei 280 nm bestimmt und eine Extinktioiyvon 14,3 für eine 1 %ige Lösung wurde zur Festlegung der Konzentration in mg/ml benutzt.

Vier potentionstatische pH-Stat-Untersuchungen wurden durchgeführt um die U/mg Aktivität für jedes Substrat des nativen Trypsins zu bestimmen. Die verwendeten Substrate waren:

1. Acetyl-Tyrosin-Ethylester (ATEE) (0,01 M)

2. Benzoyl-Arginin-Ethylester (BAEE) (0,01 M)

3. Aeetyl-Tryptophan-Ethylester (ATrEE) (0,01 M)

4. Acetyl-Phenylalanin-Ethylester (APEE) (0,01 M)

Teil B

Denaturierung des Enzyms

Ausreichend gereinigtes Trypsin des Teils A wurde in 100 ml einer 0,001 M HCl bei einem pH-Wert von 3 und 25° C gelöst, um eine Extinktion von 0,98 bei 280 nm zu erhalten. Das Trypsin wurde 3 0 Minuten zur teilweisen Denaturierung .stehengelassen.

Teil C

Zugabe des Inhibitors .

Zu 40 ml der Lösung des denaturierten Enzym lösung aus Teil B

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wurden 30 mg gereinigtes trockenes Indolpulver gegeben und die Mischung 1 Stunde schwach geschüttelt. Nach einer Stünde wurde der Trypsin-Chymotrypsin-Inhibitor-Komplex untersucht, um Inhibierung und damit Bindung des Inhibitors an das Enzym sicherzustellen.

Teil D
Vernetzung

Zu der Lösung von Teil C wurden 100 jil 8 %igen Glutaraldehyds als Vernetzungsmittel gegeben. Die resultierende Lösung wurde 1 Stunde bei 0 bis 5° C und einem pH-Wert von 3 geschüttelt. Nach einer Stunde wurde der pH-Wert der Lösung durch Zusatz von 0,01 M NaOH auf 5 erhöht.

Teil E
Reinigung

5 ml der Lösung von Teil D wurden chromatographiert und zwar in einer Sephadex brand G-10 Gel-FiItrationssäule unter Verwendung von 0,001 M HCl, 0,001 M in CaCl₂ als Eluant. Die Abtrennung des Indols und des überschüssigen Glutaraldehyds wurde in etwa einer Stunde ausgeführt unter Verwendung einer 30,48 χ 2,54 cm Säule und einer Eluant-Strömungsgeschwindigkeit von 60 ml/h. Der Protein-Peak wurde bei 245 nm nachgewiesen und gesammelt und untersucht, wie weiter unten beschrieben. ·

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~ 23 -·

31A7947

Teil F Ergebnisse

Der nachstehend angegebene Anstieg der Aktivität mit Bezug auf Substrat für Chymotrypsin ist an Proben aus Teil E des halbsynthetischen Chymotrypsins, hergestellt nach der Erfindung, erhalten worden.

Substrat

	1	ATEE	(U/ml)	BAEE	UJ/ml)
Ausgangsaktivität	5	/21	55	/3
Endaktivität Untersuchungsmethode	8	/37	30	,21

Änderung in Prozent

+160

-4 6

Die Ergebnisse zeigen, daß das halbsynthetische Chymotrypsin erhöhte Aktivität mit Bezug auf Chymotrypsinsubstrat (ATEE) und verminderte Aktivität mit Bezug auf Trypsinsubstrat (BAIiE) aufweist.

Dieses Beispiel zeigt ferner, daß bei Anwendung des Verfahrens nach der Erfindung die Aktivität mit Bezug auf ein Substrat ansteigt, sowie die Aktivität einer Art von Peptidyl-Peptid-Hydrolase, nämlich Tryps in, gegenüber dem Substrat einer anderen Peptidyl-Peptid-Hydrolase, nämlich Chymotrypsin, ansteigt,

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Beispiel 2 Teil A

Reinigung des Enzyms ■

Ribonuclease-Enzym wurde in gereinigter Form als salzfreie Protease-freieRinderpankreas~-Ribonuclease (Type H-A von Sigma Chemical"Co.) gekauft.

Teil B

Denaturisxerung des Enzyms

60 ml der gereinigten Ribonuclase aus Teil A wurden in 100 ml entionisiertem destilliertem Wasser gelöst und einer Extinktion von 0,3 9 bei 280 nm ausgesetzt. Der Lösung wurden 3 00 μΐ von 0,2 M Mercaptoethanol als Denaturierungsmitte1 zugesetzt. Der pH-Wert der Lösung wurde auf 7 erhöht und 2 Stunden gehalten, wobei langsam bei 25° C gerührt und tropfenweise 0,01 M NaOH zugegeben wurde.

Teil C

Zugabe des Inhibitors

Zu 100 ml Lösung aus Teil B wurden 40 mg trockenes pulverisiertes Indol als Inhibitor zugegeben. Die Lösung wurde bei 25° C gerührt und der pH-Wert durch tropfenweise Zugabe von 0,01 M NaOH .innerhalb von 1 bis 1,5 Stunden auf 7 gehalten-, bis das ganze Indol in Lösung war.

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Teil D
Vernetzung

Die Lösung von Teil C wurde bei 25° auf einen pH-Wert von 9,45 durch tropfenweise Zugabe von 0/1 M NaOH gebracht und 3 Stunden langsam gerührt. Dann wurde die Lösung auf 0 bis 5 C in einem Kaltwasserbad gekühlt. Als die Lösung 5° C erreicht hatte, wofür gewöhnlich etwa 3 0 Minuten benötigt werden, wurden 400 ül eines. 8 %igen Glutaraldehyds als Vernetzungsmittel zugegeben und die Lösung 17 Stunden schwach geschüttelt.

Teil E
Reinigung

5 ml der Lösung von Teil D. wurde chromatographiert und zwar an einer Sephadex Brand G-15 Säule unter Verwendung von 0,001 M HCl als Eluant. Die Abtrennung des Indols und des überschüssigen Glutaraldehyds wurde in einer 30,48 χ 2,54 cm Säule durchgeführt. Die Proteinfraktion wurde durch Überwachung bei 206 nm gesammelt.

Teil F

Ergebnisse

Der nachstehend angegebene Anstieg der Aktivität mit Bezug auf Substrat für Esterase ist an Proben aus Teil E der halbsynthetischen Esterase, hergestellt nach der Erfindung, er-

halten worden.

Substrat

■■*- BAEE (U/mg) Anfangsaktivität 0_f00

Endaktivität

üntersuchungsmethode 1 0,3

•üntersuchungsmethode 2 0,4

Änderung in % " N/A ,

Die Ergebnisse zeigen, daß die halbsynthetische Esterase eine enzymatische Aktivität gegenüber· dem Esterasesubstrat zeigt, wo keine Aktivität in der nativen Ribonucleose festgestellt^ worden war. Dies zeigt die Umwandlung einer Enzymgattung, einer Nuclease, in eine andere Enzymgattung, eine Esterase. . _

Beispiel 3 . .. *

Teil A

Reinigung des Enzyms

Gereinigtes Trypsin'aus Rinderpankreas, zweimal kristallisiert, salzfrei und lyophil gemacht, wurde nach dem Verfahren von Kostka und Carpenter (Kostka, V^ und Carpenter, F. H., The Journal, of Biological Chemistry, 239, 6, 1799 (1964)) getestet und keine Verunreinigung durch natives Chymotrypsin festgestellt. Die Ausgangsuntersuchung auf

Trypsin-Substrat-Spezifität wurde nach einer potentiometrischen pH-Stat-Methode nach' Walsh und Wilcox (Methods in Enzymology, edited by G. E. Perlmann und L. Lorand, Academic Press, 31-41 (1970)). durchgeführt. Das Trypsin wurde in 0,001 M HCl bei pH 3,0 aufbereitet. Die Extinktion wurde bei 280 nm bestimmt und eine Extinktion von 14,3 für eine 1 %ige Lösung zur Bestimmung der Konzentration in mg/ml benutzt.

4 Ausgangs-potentiostatische pH-Stat-Untersuchungen wurden durchgeführt, um die U/mg Aktivität für jedes Substrat des nativen Trypsins zu bestimmen. Die verwendeten Substrate waren:

1. Acetyl-Tyrosin-Ethylester (ATEE) (0,01 M)

2. Benzoyl-Arginin-Ethylester (BAEE) (0,01 M)

3. Acetyl-Tryptophan-Ethylester (ATrEE) (0,01 M)

4. Acetyl-Phenylalanin-Ethylester (APEE) (0,01 M).

Teil B

Denaturierung des Enzyms

Eine ausreichende Mange gereinigten Trypsins von Teil A wurde in 100 ml einer 0,001 M HCl bei pH 3 und 25° C gelöst, um eine Extinktion von 1,4 bei 280 nm zu erhalten. Das Trypsin wurde 30 Minuten zur teilweisen Denaturierung stehengelassen.

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Toil C , ' . "■":■

Zugabe des Inhibitors .

Zu 40 ml der Lösung des denaturierten Enzyms von Teil B wurden 2 ml einer 1 %igen Indollösung (in 0,001 M HCIi gegeben und die Lösung 2 Stunden schwach geschüttelt. Nach zwei Stunden wurde der Trypsin-Chymotrypsin-Inhibitor-Komplex .untersucht,um Inhibierung und damit die Bindung des Inhibitors an das Enzym sicherzustellen. ..

Teil D
Vernetzung

Zu der Lösung aus Teil C wurden 300 jul 8 %igen Glutaraldehyds als Vernetzungsmittel zugegeben. Die resultierende Lösung wurde 17 Stunden bei 0 bis 5 C und einem pH-Wert von 3 geschüttelt. Nach 17 Stunden wurde der pH-Wert der Lösung durch Zugabe von 0,01 M NaOH auf 5 erhöht.

Teil E
Reinigung

5 ml der Lösung von Teil D wurden in einer Sephadex G-10 Gel-Filtrationssäule Chromatographiert unter Verwendung von 0,001 M HCl, 0,001 M in CaCl, als Eluant. Die Abtrennung des Indols und des überschüssigen Glütaraldehyds wurde in etwa 1 Stunde unter Verwendung einer 30,48 χ 2,54 cm Säule und einer Eluant-Strömungsgeschwindigkeit von 60 ml/h durchgeführt. Der Protein-Peak wurde bei 254 nm nachgewiesen

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und das Protein gesammelt und wie weiter unten beschrieben untersucht.

Teil F Ergebnisse

Der nachstehend aufgezeigte Anstieg der Aktivität mit Bezug ■auf Substrat für Chymotrypsin ist an Proben von dem halbsynthetischen Chymotrypsin aus Teil E, hergestellt nach der Erfindung, aufgezeichnet worden:

Substrat

Anfangsaktivität

Endaktivität Untersuchungsmethode 1

Änderung in %

ATEE (U/ml)	BAEE (U/ml)
3,2	52,0
12,85	4 5,75
+401	-14

Die Ergebnisse zeigen, daß das halbsynthetische Chymotrypsin erhöhte Aktivität mit Bezug auf Chymotrypsin-Substrat (ATEE) und reduzierte Aktivität mit Bezug auf Trypsin-Substrat (BAEE) besitzt.

Dieses Beispiel veranschaulicht auch einen wesentlichen Aktivitätsanstieg mit Bezug auf ein Substrat, wena das Verfahren nach der Erfindung angewendet wird. Es zeigt ferner den Anstieg in der Aktivität einer Spezies von Peptidyl-Peptid-Hydrolase, nämlich Trypsin, gegenüber dem Substrat einer

.../30

anderen Peptidyl-Peptid-Hydrolase,, nämlich Chymotrypsin, wenn erfindungsgemäß vorgegangen wird. -...·-

'■■'-- Beispiel 4

Teil "A"' -"■'■'■ ' .

Reinigung des Proteins

Rinderserum-Albumin (BSA)-Protein in gereinigter Form als kristallines lyophiles Prote.in mit 1 bis 3 % Globulinen wurde gekauft (von Sigma Chemical Co.,.lot'A4378).

Teil B * - ·

Denaturierung des Enzyms

100 mg dos gereinigten BSA aus Teil A wurden in 100 ml entionisiertem destilliertem Wasser gelöst und zeigten eine Extinktion von 0,58 bei 280 nm. Der pH-Wert der Lösung wurde 2 Stunden unter schwachem Rühren bei 25 C durch tropfenweise Zugabe von 0,01 M HCl bei 3 gehalten.

Teil C

Zugabe des Inhibitors '

Zu den 100 ml der Lösung aus Teil S wurden 40 mg trockenes pulverförmiges Indol als Inhibitor zugegeben, pie Lösung wurde bei 25° C gerührt und der pH-Wert durch tropfenweise Zugabe von 0,01 M HCl 1 bis 1,5 Stunden auf 3 gehalten, bis das -ganze Indol in Lösung war.

.../31

3U79.47

Teil D
Vernetzung

Der pH-Wert der Lösung von Teil C wurde bei 25° C durch tropfenweise Zugabe von 0,1 M NaOH auf 7 erhöht und 3 Stunden langsam gerührt. Dann wurde die Lösung auf 0 bis 5° C in einem Kaltwasserbad gekühlt. Als die Lösung die Temperatur von 5° C erreicht hatte, was gewöhnlich in 3 0 Minuten der Fall ist, wurden 400 μΐ 8%igen Glutaraldehyds als Vernetzungsmittel zugegeben und die Lösung 17 Stunden schwach geschüttelt.

Teil E
Reinigung

5 ml der Lösung von Teil D wurde,chromatographiert und zwar unter Verwendung einer Sephadex G-15 Gel-Säule und 0,001 M HCl als Eluant. Die Abtrennung des Indols und des überschüssigen Glutaraldehyds wurde unter Verwendung einer 30,48 χ 2,54 cm Säule durchgeführt. Die Proteinfraktion wurde durch überwachung bei 206 nm gesammelt.

Teil F
Ergebnisse

Der nachstehend aufgeführte Anstieg in der Aktivität mit Bezug auf Substrat für Esterase ist an Proben von der halbsynthetischen Esterase, hergestellt nach der Erfindung, aus Teil E aufgezeichnet worden.

.../32

	1 2	- 32 -	«HM « It fet ^ « * ■« U «»Bbv *·»· U · »9 u
		,Substrat
		BASE (U/mg)
Anfangsaktivität Endaktivität Untersuehungsmethöde Unte rsuchungsme thode		0,00 0,06 0,022

3U7947

Xnderung in % N/A

Die Ergebnisse zeigen, daß die halbsynthetische Esterase eine enzymatische Aktivität gegenüber dem Esterasesubstrat zeigt, wo keine Aktivität in der nativen BSA festgestellt war. Dies veranschaulicht die Umwandlung einer Gattung nicht enzymatisehen Proteins, eines Albumins in eine andere Proteingattung, eine enzymatisch aktive Esterase.

Beispiel 5

Teil JL. ,

Reinigung des Enzyms

Gereinigtes Trypsin von Rinderpankreas, zweimal kristallisiert, salzfrei und lyophil gemacht, wurde nach dem Verfahren von Kostka und carpenter (Kostka, V· und Carpenter, F. H., The Journal of Biological Chemistry, 239, β, 1799 (1964)) getestet und keine Verunreinigung durcjh natives chymotrypsin festgestellt, Die Ausgangsuntersuchung auf Trypsinsubstrat-Spezifität wurde nach einer potentiometric

• i i

/33

- 33 - """··" "·— "-' -^: 3H7947

sehen pH-Stat Methode nach Walsh und Wilcox (Walsh, K. A. und Wilcox, P. E., Methods in Enzymology, edited by G. E. Perlmann und L.Lorand, Acedemic Press, 31-41 (1970)) durchgeführt. Das Trypsin wurde in 0,001 M HCl bei pH 3,0 aufbereitet. Die Extinktion wurde bei 280 nm bestimmt und eine Extinktion von 14,3. für eine 1 %ige Lösung zur Festlegung der Konzentration in mg/ml benutzt.

Vier potentiostatische pH-Stat-Untersuchungen wurden durchgeführt, um die U/mg-Aktivität für jedes Substrat des nativen Trypsins zu bestimmen. Die verwendeten Substrate waren:

1. Acetyl-Tyrosin-EthylGSter (ATEE) (0,01M)

2. Benzoyl-Arginin-Ethylcster (BAEE) (0,01 M)

3. Acetyl-Tryptophan-Ethylester (ATrEE) (0,01 M)

4. Acetyl-Phenylalanin-Ethylester (APEE) (0,01 M).

Teil B

Denaturierung des Enzyms

Ausreichend gereinigtes Trypsin von Teil A wurde in 100 ml einer 0,001 M HCl bei pH 3 und 25° C gelöst, um eine Extinktion von 0,98 bei 280 nm zu geben. Das Trypsin wurde 30 Minuten für die teilweise Denaturierung stehengelassen.

Teil C

Zugabe des Inhibitors

Zu 40 ml der Lösung des denaturierten Enzyms von Teil B

.../34

wurden 2 ml cinor ].%igen Indollösung (in 0,001 M HCl) gegeben und die Lösung eine Stunde schwach geschüttelt.

Teil D
Vernetzung

Zu der Lösung von Teil C wurden 100 ul 8%igen Glutaraldehyds als Vernetzungsmittel gegeben. Die resultierende Lösung wurde 20 Stunden bei 0 bis 5 C und einem pH-Wert von 3 geschüttelt. Nach 20 Stunden würde der pH-Wert der Lösung durch Zugabe von 0,01 M NaOH auf 5 erhöht.

Teil E
Reinigung

5 ml der Lösung von Teil D wurde an einer Sephadex G-10 Gel-Filtrationssäule unter Verwendung von 0,001 M HCl, 0,001 M in CaCl„ als Eluant chromatographiert. Die Abtrennung des Indols und des überschüssigen Glutaraldehyds wurde in einer Stunde unter Verwendung einer 30,48 χ 2,54 cm Säule und einer Eluant-Strömungsgeschwindigkeit von 60 ml/h durchgeführt. Der Protein-Peak wurde bei 254 nnv nachgewiesen und das Protein gesammelt und wie weiter unten beschrieben, untersucht.

Teil F
Ergebnisse.

Der nachstehend aufgezeigte Anstieg in der Aktivität mit Bezug auf Substrat für Chymotrypsin ist an Proben aus" Teil E

../35

des halbsynthetischen Chymotrypsin,hergestellt nach der Erfindung, erhalten worden.

Substrat

	ATEE (U/ml)	BAEE (U/ml)
Anfangsaktivität	3,2	52,0
Endaktivität
Untersuchungsmethode 1	8,45	48,0
Änderung in %	+264	-8

Diese Ergebnisse zeigen, daß das halbsynthetische Chymotrypsin erhöhte Aktivität mit Bezug auf Chymotrypsinsubstrat (ATEE) besitzt und reduzierte Aktivität mit Bezug auf Trypsinsubstrat (BAEE).

Dieses Beispiel zeigt auch einen erheblichen Anstieg in der Aktivität mit Bezug auf ein Substrat, wenn das Verfahren nach der Erfindung angewendet wird. Dieses Beispiel veranschaulicht ferner den Anstieg der Aktivität einer Spezies von Peptidyl-Peptid-Hydrolase, nämlich Trypsin gegenüber dem Substrat einer anderen Peptidyl-Peptid-Hydrolase, nämlich Chymotrypsin, wenn es nach der Erfindung behandelt worden ist.

Beispiel 6

Teil A

Reinigung des Enzyms

..,/36

<· φ β « « 4

Gereinigtes Trypsin von Rinderpankreas, zweimal kristallisiert, salzfrei und lyophil gemacht, wurde nach dem Verfahren von Kostka und Carpenter getestet (Kostka V. und Carpenter, F. H., The Journal of Biological Chemistry, 239, 6, 1799 (1964)) und keine Verunreinigung durch natives Chymotrypsin festgestellt.. Die Ausgangsuntersuchung auf Trypsinsubstrat-Spezifität wurde nach einer potentiometrischen pH-Stat Methode nach Walsh und Wilcox (Walsh, K. A. und Wilcox, Ρ.Έ., Methods in Enzymology, edited by G. E. Perlmann and L. Lorand, Academic Press, 31-41 (1970) .vorgenommen. Das Trypsin wurde in 0,001 M HCl bei pH 3,0 aufbereitet. Die Extinktion wurde bei 280 nm bestimmt und eine Extinktion von 14,3 für eine l%ige Lösung zur Festlegung der Konzentration in mg/ml verwendet.

Vier potentiostatische pH-Stat-Ausgangsuntersuchungen wurden durchgeführt, um die U/mg-Aktivität für jedes Substrat des nativen Trypsins zu bestimmen. Die verwendeten Substrate waren:

1. Acetyl-Tyrosin-Ethy!ester (ATEE) (0,01 M)

2. Benzoyi-Arginin-Ethy!ester (BAEE) (0,01 M)

3. Acetyl-Tryptophan-Ethylester (ATrEE) (0,01 M)

4. Acetyl-Phenylalanin-Ethy!ester (APEE) (0,01 M)

.../37

Teil B

Denaturierung des Enzyms

Genügend gereinigtes Trypsin von Teil A wurde in 100 ml 0,001 M HCl bei pH 3 und 25° C gelöst, um eine Extinktion von 1^35 bei 280 nm zu geben.Das Trypsin wurde 3 0 Minuten zur teilweisen Denaturierung stehengelassen.

Teil C

Zugabe des Inhibitors

Su 10 ml der Lösung des denaturierten Enzyms aus Teil B wurden 5 ml l%iger Benzoesäure in Wasser gegeben und die Lösung 1 Stunde schwach geschüttelt. Nach einer Stunde wurde der Trypsin-Chymotrypsin-Inhibitor-Komplex untersucht ,- um Inhibierung und damit die Bindung des Inhibitors an das Enzym sicherzustellen.

Teil D
Vernetzung

Zu der Lösung aus Teil C wurden 100 ^l 8%igen Glutaraldehyds als Vernetzungsmittel zugegeben. Die resultierende Lösung wurde 17 Stunden bei 0 bis 5° C und einem pH-Wert von 3 geschüttelt. Nach 17 Stunden wurde der pH-Wert der Lösung durch Zugabe von 0,01 M NaOH auf 5 erhöht.

Teil E
Reinigung

5 ml der Lösung aus Teil D wurde an einer Sephadex G-10

.../38

Gel-Filtrationssäule unter Verwendung von 0,001 M HCl, 0,001 M in CaCl₂ als Eluant chromatographiert. Die Abtrennung der Benzoesäure und des überschüssigen Glutaraldehyds wurde in etwa 1 Stunde unter Verwendung einer 30,48 χ 2,54 cm Säule und einer Eluant-Strömungsgeschwindigkeit von 60 ml/h durchgeführt. Der Protein-Peak wurde bei 254 mn nachgewiesen und das Protein gesammelt und wie weiter unten beschrieben untersucht.

Teil F
Ergebnisse

Der nachstehend aufgezeigte Anstieg in der Aktivität mit Bezug auf Substrat für Chymotrypsin ist an Proben aus Teil E des halbsynthetischen Chymotrypsins, hergestellt nach der Erfindung, aufgezeichnet worden.

Substrat

	ATrEE (U/ml)
Anfangsaktivität	1,66
Endaktivität
Untersuchungsmethode 1	6,35
Änderung in %	+382

Die Ergebnisse zeigen, daß das halbsynthetische Chymotrypsin erhöhte Aktivität mit Bezug auf Chymotrypsin-Substrat (ATEE) und verminderte Aktivität mit Bezug auf

.../39

:. 3U7947

Trypsinsufastrat (BAEE) besitzt.

Dieses Beispiel veranschaulicht einen erheblichen Anstieg in der Aktivität mit Bezug auf ein Substrat, wenn das Verfahren nach der Erfindung angewendet wird. Das Beispiel zeigt ferner den Anstieg in der Aktivität einer Spezies von Peptidyl-Peptid-Hydrolase, nämlich Trypsin, gegenüber dem Substrat einer anderen Peptidyl-Peptid-Hydrolase, nämlich Chymotrypsin, wenn nach der Erfindung verfahren wird.

Beispiel 7

Teil A

Reinigung des Enzyms

Ribonuctaseenzym in gereinigter Form, als salzfreie proteasefreie Rinderpankreas-Ribonuclease wurde gekauft (Type H-A der Sigma Chemical Co.) .

Teil B

Denaturierung des Enzyms

60 mg gereinigter Ribonuclease aus Teil A wurden in 100 ml entionisiertem destilliertem Wasser gelöst; es zeigte eine Extinktion von 0,411 bei 280 nm. Der pH-Wert der Lösung sank auf 3 und wurde auf diesem Wert durch tropfenweise Zugabe von 0,01 M HCl. innerhalb von 2 Stunden bei langsamem Rühren und 25° C aufrechterhalten. j

• .../40

• *

β ·

Toil C .

Zugabe des Inhibitors

Zu 100 ml der Lösung aus Teil B wurden 40 mg trockenes pulverförmiges Indol als Inhibitor zugegeben. Die Lösung wurde bei 25 C gerührt und der pH-Wert durch tropfenweise Zugabe von 0,01 M HCl in 1~bls 1,5'Stunden auf 3 gehalten bis das ganze Indol in Lösung war.

Teil D
Vernetzung

Der pH-Wert der Lösung aus Teil C wurde bei 25° C durch . tropfenweise Zugabe von 0,1 M NaOH auf 7 erhöht und langsam 3 Stunden gerührt. Dann wurde die Lösung in einem Kältwasserbad auf 0 bis 5 C abgekühlt. Nachdem die Lösung 5° C erreicht hatte, was gewöhnlich innerhalb von 3 0 Minuten der Fall ist, wurden 400 μΐ einer 8%igen Glutaraldehydlösung als Vernetzungsmittel zugegeben und die Lösung 3 0 Stunden schwach geschüttelt.

Toil E
Reinigung

Die Lösung aus Teil D wurde gegen einen 0,01 M Tris-Puffer bei pH 7 unter Verwendung einer Spectrapore-Röhre, die einen Molekulargewichts-Wegschnitt von etwa 3500 hatte, 20 Stunden bei 0 bis 5 C dialysiert.

.../41

* Λ a ·

•••',Γ*· 3U7947

- 41 - ο

Teil F
Ergebnisse

Der nachstehend aufgezeigte Aktivitätsanstieg mit Bezug auf -Substrat für Esterase ist an Proben aus Teil E der halbsynthetischen Estcrase, hergestellt nach der Erfindung, nachgewiesen. Der Puffer, der bei der Untersuchungsmethode 2
beschrieben wird, wurde mit 0,01 M HCl auf den geeigneten
Wert eingestellt.

Substrat

	PH	BAEE	9	(U/mg)
Anfangsaktivität	pH	0	8	,00
Endaktivität	pH		7
Untersuchungsmethode 1	pH	6	0,089
	pH	5	0,15
	0,29
	0,79
	0,41

Änderung in Prozent N/A

Die Ergebnisse zeigen, daß die halbsynthetische Esterase
enzymatische Aktivität gegenüber dem Esterasesubstrat zeigt, wo keine Aktivität in der nativen Ribonuclease festgestellt war. Dies veranschaulicht die Umwandlung einer Enzymgattung, einer Nuclease, in eine andere Enzymgattung, eine Esterase.

.../42

Beispiel 8

Teil A

Reinigung des Enzyms

Gereinigtes Trypsin aus Rinderpankreas, zweimal kristallisiert, salzfrei und lyophil gemacht, wurde nach dem Verfahren von Kostka und Carpenter (Kostka, V. und Carpenter, F. H., The Journal of Biological Chemistry, 239, 6, 1799 (1964) getestet; es wurde keine Verunreinigung durch natives Chymotrypsin festgestellt. Die Anfangsuntersuchung auf Trypsinsubstrat-Spezifität wurde durch eine potentiometrische pH-Stat-Methode nach Walsh und Wilcox (Walsh, K. A,"" und Wilcox, P. E., Methods in Enzymology, edited by G. E. Perlmann und L. Lorand, Acedemic Press, 31r41 (1970)I durchgeführt. Das Trypsin wurde in einer 0,001 M HCl bei pH 3,0 aufbereitet. Die Extinktion wurde bei 280 hm ermittelt und eine Extinktion von 14,3 für eine" 1%ige Lösung zur Festlegung der Konzentration in mg/ml verwendet.

Vier potentiostatische pH-Stat-Anfangsuntersuchungen wurden durchgeführt, um die U/mg-Aktivität für jedes Substrat des nativen Trypsins festzustellen. Die verwendeten Substrate waren:

1. Acetyl-Tyrosin-Ethylester (ATEE) (0,01 M)

2. Benzoyl-Arginin-Ethylester (BAEE) (0,01 M)

3. Acetyl-Tryptophan-Ethylester (ATrEE) (0,01 M)

4. Acetyl-Phenyialanin-Ethy!ester (APEE) (0,01 M)

.../43

— 4 ^ —*

3H7947

Teil B Denaturierung des Enzyms

Ausreichend gereinigtes Trypsin aus Teil A wurde in 100 ml 0,001 M HCl bei pH 3 und 25° C gelöst, um eine Extinktion von 1,56 bei 280 nm zu geben. Man ließ das Trypsin 3 0 Minuten zur teilweisen Denaturierung stehen.

Teil C Zugabe eines Inhibitors

Zu 40 ml der Lösung des denaturierten Enzyms aus Teil B wurden 2 ml rohes Phenylacetat gegeben und die Lösung mit verdünnter HCl auf pH 3 wieder eingestellt. Dann wurde die Lösung auf 40° C erwärm-tyund 2 Stunden gerührt, um alles Phenylacetat zu lösen.

Teil D Vernetzung

Zur Lösung aus Teil C wurden 600 jul 8%igen Glutaraldehyds als Vernetzungsmittel zugegeben. Die resultierende Lösung wurde 20 Stunden bei 0 bis 5° C und einem pH-Wert von geschüttelt.

Teil E Reinigung

5 ml der Lösung von Teil D wurde an einer Sephadex G--10 Gel-Filtrationssäule unter Verwendung von 0,001 M HCl,

.../44

0,001 M in CaCl₂ als Eluant Chromatographiert. Die Abtrennung des Phenylacetats und des überschüssigen Glutaraldehyds wurde in etwa 1 Stunde unter Verwendung einer 30,48 x 2,54 cm Säule und einer Eluant-Strömungsgeschwindigkeit von 60 ml/h durchgeführt. Der Protein-Peak wurde bei 245 nm festgestellt und das Protein gesammelt und wie weiter unten beschrieben untersucht.

Teil F ..

Ergebnisse

Der nachstehend aufgezeigte Anstieg in der Aktivität mit Bezug auf Substrat für Chymotrypsin ist an Proben des halbsynthetischen Chymotrypsins aus Teil E, hergestellt nach der Erfindung, ermittelt worden.

Substrat

	ATEE (Ü/ml)	BAEE (U/ml)
Anfangsaktivität	3,2	54
Endaktivität
Untersuchungsmethode 1	6,23	32,6
Änderung in Prozent	+195	. -22

Die Ergebnisse zeigen, daß das halbsynthetische Chymotrypsin erhöhte Aktivität mit Bezug auf Chymotrypsinsubstrat (ATEE) und reduzierte Aktivität mit Bezug auf Trypsinsubstrat (BAEE) besitzt. '

.../45

■·""··* ·»"·· *··* •••3U7947

Dieses Beispiel zeigt auch einen wesentlichen Anstieg in der Aktivität mit Bezug auf ein Substrat, wenn das Verfahren nach der Erfindung angewendet wird. Das Beispiel veranschaulicht ferner den Anstieg in der Aktivität einer Spezies von Peptidyl-Peptid-Hydrolase, nämlich Trypsin, gegenüber dem Substrat einer anderen Peptidyl-Peptid-IIydroläse, nämlich Chymotrypsin, wenn erfindungsgemäß verfahren wird.

Beispiel 9

Teil A

Reinigung des Enzyms

Alpha-Amylase von Bakterien wurde als gereinigtes' Enzym, viermal kristallisiertes Material, isoliert von Bazillus Subtilis, gekauft (Type H-A von Sigma Chemical Co.).

Ein Gramm der gereinigten Bakterien-Alpha-Amylase wurde in 100 ml entionisiertem destilliertem Wasser gelöst und gegen 1 mM Phosphat-Puffer bei pH 7 und 0 bis 5° C 24 Stunden dialysiert. Dann wurde das Präparat bis zu seiner Verwendung gefroren.

Teil B

Denaturierung des Enzyms

10 ml der gefrorenen l%igen Alpha-Amylase aus Teil A wurde auf Raumtemperatur gebracht und durch ein Filter einer Poron-

.../46

größe von 0,20 jum filtriert. Die Konzentration nach der Lagerung wurde mit 0,67 % festgestellt. Dann wurden 6,5 ml der Alpha-Amyläse lösung mit 0,01 M NaOH auf einem pH-Wert von 10,7 titriert und 10 Minuten langsam gerührt.

Teil C * " ■

Zugabe des Inhibitors

Die Lösung aus Teil B wurde mit 0,017 g Cellobiose als Inhibitor vermischt und 45 Minuten bei 25° C gerührt.

Teil D
Vernetzung

Die Lösung aus Teil C wurde bei 25° C mit 10 jul Glutaraldehyd als Vernetzungsmittel vermischt und 15 Minuten gerührt. Nach dem Zusatz des Glutaraldehyds fiel der pH-Wert auf 9,9 und die klare Lösung wurde gelb. Der pH-Wert wurde durch tropfenweise Zugabe von 0,01 M HCl auf 9 eingestellt und es wurden weitere 15 Minuten gerührt. Dann wurde der pH-Wert langsam durch Zugabe von 0,01 M HCl auf 7 eingestellt und für eine weitere Stunde gerührt.

Teil E

Reinigung ..'.-..

5 ml der Lösung von Teil D wurde an einer Sephadex G-10 Gel-Filtrationssäule, 1,25 χ 47 cm chromatographiert; es wurden 0,01 M Trispuffer eines pH-Wertes von 7 benutzt

.../47

und die Strömungsgeschwindigkeit war 1 ml/min. Der Protein-Peak wurde bei 206 niu nachgewiesen und das Protein gesammelt.

Teil F
Ergebnisse

Der nachstehend aufgeführte Anstieg der Aktivität mit Bezug auf das Substrat für Glycosid-Hydrolase ist an Proben der halbsynthetischen Glycosid-Hydrolase aus Teil E, hergestellt nach der Erfindung, aufgezeichnet worden. Die Substrate für Glycosid-Hydrolase, die verwendet worden sind, waren:

p-Nitrophenyl-ß-D-galacto-pyranosid (pNßGA) und p-Nitrophenyl-<t-D-Glucosid

	3 4	Substrat	pNd.GL(U/ml)
	pNßGA (U/ml)	0,00 1,5 χ 10"3
Anfangsaktivität Endaktivität Untersuchungsmethode Untersuchungsmethode	0,00 1,8 χ ίο":? 3 χ 10"J

Die Ergebnisse zeigen, daß die halbsynthetische Glycosid-Hydrolase enzymatische Aktivität gegenüber dem Glycosid-Hydrolase-Substrat aufweist, wo keine Aktivität an der nativen, von Bakterien stammenden Alpha-Amylase, die selbst eine Spezies von Glycosid-Hydrolase ist, festgestellt worden ist. Dies veranschaulicht die Umwandlung einer Glycosid-Hydrolase in eine andere Glycosid-Hydrolase.

.../48

Beispiel 10

Teil A ■

Reinigung des Enzyms

Es wurde Alpha-Amylase von Bakterien als gereinigtes Enzym, viermal kristallisiertes Material/ isoliert aus Bacillus Subtilis, gekauft (Type H-A von Sigma Chemical Co.).

Fünfzehn hundertetel eines Gramms der gereinigten von Bakterien stammenden Alpha-Amylase wurden in 15 ml entionisiertem destilliertem Wasser gelöst und gegen 1 mM Phosphatpuffer bei pH 7 und 0 bis 5° -C 24 Stunden dialysiert.

Teil B " -

Denaturierung des Enzyms

10 ml der l%igen Alpha-Amylaselösung aus Teil A wurde auf Raumtemperatur gebracht und 20 Minuten zentrifugiert bei 196.600 m/s (20.000 gravity force's). Die Konzentration wurde mit 0,65 % bestimmt. Dann wurden 10 ml der Alpha-Amylaselösung mit 0,01 M NaOH bis zu einem pH-von 10,6 tritriert und langsam 10 Minuten gerührt.

Teil C

Zugabe des Inhibitors

Die Lösung aus Teil B wurde mit 0,051 g Cellobiose als Inhibitor vermischt und 45 Minuten bei 25° C gerührt.

.../49

-ν, -3H7947

Teil D
Vernetzung

Die Lösung aus Teil C wurde bei 25° C mit 86 /ul Glutaraldehyd als Vernetzungsmittel vermischt. Unmittelbar darauf wurde eine 0,1 M Lösung von Na„CO₃ und NaHCO-,, pH 10,0, zugesetzt bis der pH-Wert 10 15 Minuten aufrcchtPrhaHoti blieb. Es wurden etwa 0,7 ml der Carbonatlösung zugefügt.

Teil E
Reinigung

1 ml der Lösung aus Teil D wurde an einer Sephadex G-IO Gelr-Filtrations-Säule, 1,25 χ 47 cm, chromatographiert, wobei ein Tris-Puffer, 0,01 M und pH 7, benutzt und eine Strömungsgeschwindigkeit von 0,34 ml/min angewandt wurde. Der Protein-Peak wurde bei 254 nm festgestellt und das Protein gesammelt.

Teil F
Ergebnisse

Der nachstehend aufgezeigte Aktivitätsanstieg mit Bezug auf das Substrat für Glycosid-Hydrolase wurde an Proben der halbsynthetischen Glycosid-Hydrolase aus Teil E, hergestellt nach der Erfindung, aufgezeichnet. Die Substrate für Glycosid-Hydrolase, die verwendet wurden, waren:

.../50

-3U7947

p-Nitrophenyl-ß-D-Glucosid (pNßGL) und p-Ntriophenyl-dL-D-Glucosid (pNdGL)

Anfangsaktivität

Endaktivität Untersuchungsmethode 5

Substrat

pNßGL (U/mg) ptfeLGL (U/mg) 0,00 0,00

3,1 x 10

-4

1,4 χ 10

-4

Die Ergebnisse zeigen, daß die halbsynthetische Glycosid-Hydrolase enzymatische Aktivität gegenüber dem Glycosid-Hydrolasesubstrat besitzt, wo keine Aktivität bei der nativen Alpha-Amylase, die selbst eine Spezies von Glycosid-Hydrolase ist, nachgewiesen worden war. Dies veranschaulicht die Umwandlung einer Glycosid-Hydrolase in eine andere Glycosid-Hydroiase.

Beispiel 11

Teil A

Reinigung des Enzyms

Alpha-Amylase von Bakterien wurde als gereinigtes Enzym, viermal kristallisiertes Material, isoliert vom Bacillus Subtilis,· gekauft (Type II-A· von Sigma Chemical Co.).

Fünfzehn hunderfstel eines Grammes gereinigter ,von Bakterien stammender Alpha-Amylase wurde in 15 ml entionisiertem destil-

.../51

liertem Wasser gelöst und gegen 1 mM Phosphat-Puffer bei pH 7 und 0 bis 5° C 24 Stunden dialysiert.

Teil B

Denaturierung des Enzyms

10 ml der l%igen Amylase aus Teil A wurde auf Raumtemperatur gebracht und mit 196.600 m/s (20.000 gravity forces) 20 Minuten zentrifugiert. Die Konzentration wurde mit 0,57 festgestellt. Dann wurden 10 ml der Alpha-Amylase-Lösung mit 0,01 N NaOH auf einen pH-Wert von 10,6 titriert und 10 Minuten langsam gerührt.

Teil C

Zugabe des Inhibitors

Die Lösung aus Teil B wurde mit 0,051 g Cellobiose als Inhibitor vermischt und 45 Minuten bei 25 C gerührt.

Teil D
Vernetzung

Die Lösung aus Teil C wurde bei 25° C mit 72 μΐ Glutaraldehyd als Vernetzungsmittel vermischt. Unmittelbar danach wurde eine 0,1 M Na₃CO₃ - NaHCO₃-Lösung, pH 10,0, zugefügt, bis der pH-Wert von 10,0 15 Minuten aufrechterhalten blieb. Vier Zehntel ml der Carbonatlösung wurde benötigt.

.../52

Toil E
Reinigung

1 ml der Lösung aus Teil D wurde an einer Sephadex G-IO Gel-Filtrations-Säule, 1,25 χ 47 cm, chromatographiert, wobei 0,01 M Tris-Puffer, pH,-Wert 7, benutzt und eine Strömungsgeschwindigkeit von 0,34 ml/min angewandt wurde. Der Protein-Peak wurde bei 254-¹nm festgestellt und das Protein gesammelt.

Toil F
Ergebnisse

Der nachstehend aufgezeigte Anstieg in der Aktivität mit Bezug auf das Substrat für Glycose-Hydrolase wurde an Proben der halbsynthetischen Glycosid-Hydrolase von Teil E, hergestellt nach der Erfindung, aufgezeichnet. Das Substrat für Glycose-Hydrolase, das verwendet wurde, war .

p-Nitrophenyl-ß-D-Glucosid (pNßGL)

Substrat

pNßGl (U/mg) Anfangsaktivität 0,00

Endaktivität -4

Untersuchungsmethode 5 2,8 χ 10

Die Ergebnisse zeigen, daß die halbsynthetische Glycosid-Hydrolase enzymatische Aktivität gegenüber dem Glycosid-Hydrolasesubstrat zeigt, wo keine Aktivität bei der nativen

.../53

3U7947

Alpha-AmyLäse festgestellt wurde, welche selbst eine Spezies von Glycosid-Hydrolase ist. Dies veranschaulicht die Umwandlung einer Glycosid-Hydrolase in eine andere Glycosid-Hydrolase.

Untersuchungsmethoden

Die in den Beispielen 1 bis 8 entnommenen Proben wurden nach zwei Methoden untersucht. Bei der Untersuchungsmethode 1 werden die vom reagierenden Substrat freigesetzten Protonen gemessen. Bei Untersuchungsmethode 2 werden spectrale Änderungen, die von Änderungen in der elektronischen Struktur herrühren und durch Hydrolyse des Substrats herbeigeführt werden, gemessen. In allen Fällen der Beispiele 1 bis 8 ergab jede Probe eine positive Aktivitätsänderung hinsichtlich der Aktivität, die nachzubilden war, womit die Tatsache der Schaffung von Aktivität, wo vorher keine vorhanden war, durch zwei unabhängige Meßtechniken bestätigt worden ist.

Beispiel für die Untersuchungsmethode 1

Reagenzien: 0,1 M KCl, 0,05 M CaCl₃, 0,01 M Tris-Puffer bei pH 7,75.

Substrat: Lösung von 343 mg Alpha-N-Benzoyl-L-Argininethylester.HCl (BAEE) in 100 ml 'Puffer.

Durchführung: Verwende ein Sargent-Welch-pH-Stat, Modell pIIR, fülle die Titrationbürette mit 0,1 M NaOH. Stelle die 5 ml Substratlösung in dem pH-Stat-

.../54

Becher auf starkes Rühren. Stelle den Titrator auf Erhöhen des pH-Wertes auf 7,8* Lege eine starke Basis linie fest. Füge 2 ml Enzymlösung zu. Der Recorder zeichnet das Volumen verbrauchter Base pro Zeiteinheit als direktes Maß für die pro Minute verbrauchten Mikromoleküle Substrat auf.

Beispiel für üntersuchungsme'thode 2

Reagenzien:; 0,1 M KCl, 0,05 M CaCl₂, 0,5 M Tris-Puffer bei pH 8,0.

Substrat: Lose 34,3 mg Alpha-N-Benzoyl-L-Arginin-Ethylester-HCl (BAEE) in 100 ml Puffer.

Durchführung: Benutze ein Beckman ACTA-Spectrophotometer und stelle den Wellenlängertjustierer auf 255 nra bei einer Schlitzbreite von 1,25 nm. Korrigiere den Zero-Puffer in der Vergleichs- oder Blindprobe und der Probe. Leere die Probekammer und wasche die Küvette mit Aceton und dann mit Wasser. Füge 2,5 ml BAEE-Substratlösung zu undeine 1 Minuten Bas is linie. Füge 0,5 ml der Enzymlösung zu und zeichne die Rate des Anstiegs in der Extinktion auf, wenn BAEE zu Alpha-N-Benzoyl-L-Arginin hydrolisiert wird. Trage mindestens 5 Minuten die Extinktion gegen die Zeit auf (Delta A/min).

.../55

Bei Delta Absorptionsvermögen Substrat-Produkt

—1 —1

808 M cm ist eine Einheit gleich der Hydrolyse eines Mikromols BAEE pro Minute bei 25° C und pH 8,0.

Schwert, G. W, und Takenake, T., Bdochemica et Biophsica ACTA, 16, 570, 1955.

Beispiel für die Untersuchungsmethode 3

Die bei Beispiel 9 entnommenen Proben können nach der nachstehend beschriebenen Methode untersucht werden.

Reagenzien: Natriumcitrat-Puffer 0,05 M bei pH 4,6. 0,2 M Natriumcarbonat.

Substrat: p-Nitrophenyl-flt-D-Glucosid,'25 mM Lösung in 0,05 M Natriumeitratpuffer bei pH 4,6. p-Nitrophenyl-ft-D-Galacto-Pyranosid, 25 mM Lösung in 0,05 M Natriumeitratpuffer bei pH 4,6.

Durchführung: Eine 100 ^uI Probe einer 25 mM Lösung von jedem Substrat in 0,05 mM Natriumeitratpuffer bei pH 4,6 wurden bei 30° C mit 350 /il des gleichen Puffers 5 Minuten bebrütet. Fünf solcher Lösungen wurden hergestellt. Nach der Zugabe von 50 ul des Enzyms zu drei der Lösungen und 50 jil Citratpuffer zu den beiden übrigen Kontrollösungen wurden die Lösungen

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bei 30 C bebrütet. Nach 15 Minuten wurde eine Enzym enthaltende und eine Kontroilösung ausgewählt. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 700 yul 0,2 M Natriumcarbonat gestoppt. Die Extinktion wurde bei 420 nm gemessen. Nach 30 Minuten würde eine weitere Enzymlösung analysiert und nach 60 Minuten die letzte . und die übrige Kontrollösung.

Siehe Methods in Enzymology, Vol. 28, pg. 720-21.

Die Aktivitäten werden unter Verwendung eines Absorptionsvermögens von 1,83 χ 10 M cm berechnet.

J. Biol. Cheiu., 233, 1113 (1958).

Die Extinktion von 25,2 bei 280 nm einer l%igen Alpha-Amyläselösung wird zur Berechnung der vorhandenen Enzymmenge benutzt.

Beispiel für Untersuchungsmethode 4

Hochdruckflüssigkeitschromatographie-Untersuchung " ^r Die .bei"Beispiel 9 entnommenen Proben können nach folgender Methode untersucht werden.
Reagenzien: Galactose, 0,1 %ige Lösung

Galactose, 1,0 %ige Lösung

p-Nitrophenyl-ß-D-Galacto-Pyranosid (pNßGL),

12 mM-Lösung.

.../57

. 57 -"-·"·■* ·^:-·^:- '-" -3U7947

p~Nitrop1henol, 0,5 %ige Lösung Glucosidase, 0,5 %ige Lösung

Micro-Pak-Säule 30 χ 4 cm (Varian Associates) Extinktions-Detektor auf 206 mM einstellen Wassereluant 25 C

Strömungsgeschwindigkeit 2,5 ml/min bei 141 bax. (2.000 psi) .

Durchführung: Ein Gemisch von der halbsynthetischen Glycosid-Hydrolase und pNßGL wurden bebrütet und anschließend auf die Säule gegeben. Nach 18 Stunden wurde ein Peak in der Position, die für Galactose festgelegt ist, registriert. Dann wurden Peakhöhe und Konzentration von Standardgalactoselösungen bestimmt. Die Aktivität des halbsynthetischen Enzyms errechnete sich auf 3 χ 10"³ U/ml.

Beispiel zur Untersuchungsmethode 5

Die bei den Beispielen 10 und 11 entnommenen Proben können nach nachstehender Methode untersucht werden.

Reagenzien: Natriumcitratpuffer, 0,05 M bei pH 5,0.

0,2 M Natriumcarbonat.
Substrat: p-Nitropheny1-ß-D-Glucopyranosid.

25 mM Lösung in entionisiertem destilliertem

Wasser.

p-Nitropheny l-<*--D-G lucopyranos id.

2"5 mM Lösung in entionisiertem destilliertem

Wasser gelöst.

.../58

Durchführung: 700 /il Natriumcitratpuffer, pH 5/ wurden jeweils in fünf Röhrchen gegeben, von denen zwei Kontrollröhrchen waren. 100 ^uI halbsynthetisches Enzym wurden drei solcher Röhrchen zugegeben, während 100 jul Citratpuffer, pH 5, den Kontro llröhrchen zugegeben wurden. Diese Röhrchen wurden 10 Minuten in einem 3 0° C warmen Becher bebrütet. Nach diesen 10 Minuten wurden 200 μΐ des verwendeten Substrats zu allen fünf Röhrchen gegeben und im 30 C Becher bebrütet. Nach 15 Minuten Bebrütung wurden ein Kontrollröhrchen und 1 Enzym enthaltendes Röhrchen herausgenommen. Die Lösung in dem Kontro11röhrchen wurde sofort mit 1,4 ml 0,2 M Na₂CO- vermischt. Das Enzym enthaltende Röhrchen wurde 2 Minuten zentrifugiert. Nach diesen 2 Minuten wurde die Flüssig-. keit in ein markiertes Röhrchen gegossen und der Niederschlag verworfen. Dann wurden 500 Ul der Lösung in ein anderes markiertes Röhrchen pipettiert und 700 μΐ 0,2 M Na₂CO₃ Puffer zugegeben, um die Reaktion zu stoppen. Die Extinktion wurde bei 420 im gemessen. Nach 30 Minuten wurde ein Röhrchen, das Enzym enthielt, herausgenommen und etwa 2 Minuten zentrifugiert. Die Flüssigkeit wxirde in ein markiertes Röhrchen gegossen und 500 μΐ der Lösung in ein anderes markiertes Röhrchen pipet-

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tiert. Diesem Röhrchen wurden 700 μΐ der 0,2 M Na_?CO_-Lösung zugegeben, um die Reaktion zu stoppen. Nach 45 Minuten wurden die beiden letzten Röhrchen (ein Enzym enthaltendes und ein Kontrollröhrchen) herausgenommen und damit wie vorstehend verfahren. U/mg wurde unter Benutzung des Absorptions-

4 —1 —1 Vermögens von 1,38 χ 10 M con für p-Nitrophenol bei 420 nm berechnet. Die Extinktion (A ⁶) von 25,2 für<& -Amyleise wurde auch bei Berechnung dor Kns5yiniiu.Mnjo lx> i dieser Untersuchung benutzt.

./60

Claims (18)

1. 3 0 73 2-21

   P AT JiN VA NWÄ 1 /IH*

   3H7947

   HH.-ΙΝα. M. ^JI'X;iCiV

   HAUGK, SCHMITZ, ΟΚ'ΛαΠκκ,

   IIAMIIUHU MÜNC'IIl'iN

   PATENTANWÄLTE · NEUKR WAU/ 41 · 2000 F[AMF)UHG 30

   Owens-Illinois, Inc.
   Toledo, Ohio 43 601/üSA

   Dipl-Phys. W. SCHMITZ - DIpL-Intf. R- GIlAALFS Neuer Wall 41 · 2000 Humburj; Telefon + Telecopier (04O) 36 07 55 Telex 02 Π 769 input d

   DlpL-Ιηκ. H. 1IAUCK - Dipl.-Inj,'."W. WIiHNICHT Mosartstraße 23 · 8OOO München Telefon + Telooopior (O8f>) SiHiIIiHl Telex 05 216 553 pomu d

   I5r.-Inß. W^. DÖIUNG

   K.-Wilhelm-Binfi 41 · 40OO Düsseldorf

   Telefon (02 11) 57 50 27

   ZUSTraWAJNGSANBCIIHUT / l'lJSASlS HKPLY TO:

   hambuhc;. 2. Dezember 1981

   Verfahren zur Herstellung halbsynthetischer Enzyme

   Patentansprüche

   1, Verfahren zur chemischen Veränderung der Substratspezifität eines Proteins zur Erzeugung eines vorbestimmten halbsynthetischen Proteins, dadurch gekennzeichnet, daß das Protein

   , teilweise denaturiert und das teilweise denaturierte Protein in situ in Gegenwart eines Inhibitors für das vorbestimmte halbsynthetische Protein vernetzt wird.
2. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeicnnet, daß zur teilweisen Denaturierung eine wäßrige Lösung des Proteins hergestellt und diese Lösung bei einer zur teilweisen Denaturierung ausreichenden Temperatur und Zeit gehalten wird.

   ...12

   European lament AitornoyB Zu^olaHnone Vertreter boim KuroxiAiridnin I'Miontfwiu

   Deutsche Bonk AO Hamburg, Nr. Ο5/28 4Ο7 (BLZ 2ΟΟ7ΟΟΟΟ) · I'oKtHohook Hamburg 2B42-200

   Dresdner Bank AO Hamburg, Nr. O33 8O3G (BLZ 200 800 0O)

   3Η7947
3. 3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die wäßrige Lösung des Proteins etwa 15 Minuten bis 24 Stunden bei einer Temperatur von etwa 25 bis 60° C gehalten wird.
4. 4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Protein durch Mischen mit Wasser unter Bildung einer wäßrigen Lösung und Vermischen dor resultierenden Lösung mit einem Denaturierungsmitte1 teilweise denaturiert wird.
5. 5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß das Denaturierungsmitte1 eine anorganische Säure ist.
6. 6. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß das Denaturxerungsmittel eine organische Säure ist.
7. 7. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß das Denaturxerungsmittel ein mit Wasser mischbares organisches Lösungsmittel ist.
8. 8. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß das Denaturxerungsmittel ein anorganisches Salz ist.
9. 9. Produkt, erhalten nach dem Verfahren des Anspruches 1.
10. 10. Verfahren zur Herstellung eines halbsynthetischen Enzyms,
    dadurch gekennzeichnet, daß ein enzymatisches Protein,

    J-./-' λ.:'.'. Ό 1 3H7947

    das nachgebildet werden soll, ausgewählt wird; ein zweites Protein, das modifiziert werden soll, so daß es eine Nachbildung des enzymatischen Proteins ist, ausgewählt wird; das zweite Protein mit einem Denaturierungsmitte1 bei einer zur teilweisen Denaturierung ausreichenden Temperatur eine ausreichende Zeit vermischt wird und das zweite Protein in situ in Gegenwart eines Inhibitors für das' enzymatische Protein vernetzt wird.
11. 11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß zur teilweisen Denaturierung des zweiten Proteins eine wäßrige Lösung desselben hergestellt und diese Lösung bei einer zur teilweisen Denaturierung ausreichenden Temperatur und Zeit gehalten wird.
12. 12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß die wäßrige Lösung des zweiten Proteins etwa 15 Minuten bis 24 Stunden bei einer Temperatur von etwa 25 bis 60 C gehalten wird.
13. 13. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß das zweite Protein durch Vermischen mit Wasser und Vermischen der resultierenden Lösung mit einem Depaturierungsmittel teilweise denaturiert wird.

    .¹^ 1.::.'O .!. 3U7947
14. 14. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß als Denaturierungsmittel eine anorganische Säure eingesetzt wird.
15. 15. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß als Denaturierungsmittel eine organische Säure eingesetzt wird.
16. 16. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß als Denaturierungsmittel ein mit Wasser mischbares organisches Lösungsmittel eingesetzt wird.
17. 17. Verfahren nach Anspruch 13; dadurch gekennzeichnet, daß als Denaturierungsmittel ein anorganisches Salz eingesetzt wird.
18. 18. Produkt, erhalten nach dem Verfahren des Anspruches 10.