KR0135034B1 - 신규한 2-클로로-3-아릴아미노-1,4-나프토퀴논 유도체, 그의 제조방법 및 그의 혈소판 응집억제제로서의 용도 - Google Patents

신규한 2-클로로-3-아릴아미노-1,4-나프토퀴논 유도체, 그의 제조방법 및 그의 혈소판 응집억제제로서의 용도

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Abstract

본 발명은 강력한 혈소판 응집억제작용을 갖는 하기 일반식(Ⅰ)의 신규한 2-클로로-3-아릴아미노-1,4-나프토퀴논 유도체에 관한 것이다.
상기식에서 X는 질소(N) 또는 탄소(C)원자를 나타내며, R은 시아노를 나타내거나, X가 질소(N)원자를 나타내는 경우에 R은 또한 알킬, 카복실 또는 아실 그룹을 나타낼 수도 있다.
본 발명은 또한 상기 일반식(Ⅰ) 화합물의 제조방법 및 활성성분으로서 상기 일반식(Ⅰ)의 화합물을 함유하는 혈액응고억제제 조성물에 관한 것이다.

Description

신규한 2-클로로-3-아릴아미노-1,4-나프토퀴논 유도체, 그의 제조방법 및 그의 혈소판 응집억제제로서의 용도
제1도는 트롬빈으로 활성화된 혈소판의 응집능에 대한 본 발명 화합물(NQ-Y15)의 억제효과를 나타내는 그래프이다.
제2도는 콜라겐으로 활성화된 혈소판의 응집능에 대한 본 발명 화합물(NQ-Y15)의 억제효과를 나타내는 그래프이다.
제3도는 A23187로 활성화된 혈소판의 응집능에 대한 본 발명 화합물(NQ-Y15)의 억제효과를 나타내는 그래프이다.
제4도는 트롬빈으로 유도되는 과립내 세로토닌 분비에 대한 본 발명 화합물(NQ-Y15)의 억제효과를 나타내는 그래프이다.
제5도는 콜라겐으로 유도되는 과립내 세로토닌 분비에 대한 본 발명 화합물(NQ-Y15)의 억제효과를 나타내는 그래프이다.
본 발명은 혈소판 응집 억제작용을 갖는 신규한 1,4-나프토퀴논 유도체에 관한 것이다. 더욱 구체적으로 본 발명은 혈소판 응집 억제작용을 가지고 있어 혈액응고 억제제 및 혈전증 치료제로 사용할 수 있는 다음 일반식(Ⅰ)의 신규한 2-클로로-3-아릴아미노-1,4-나프토퀴논 유도체에 관한 것이다.
상기식에서 X는 질소(N) 또는 탄소(C)원자를 나타내고, R은 시아노를 나타내거나, X가 질소(N)원자를 나타내는 경우에 R은 또한 알킬, 카복실 또는 아실 그룹을 나타낼 수도 있다.
혈소판은 혈액 구성세포들 중에서 가장 적은 부분을 차지하지만 미세한 자극에 대해서도 쉽게 반응을 나타내어 혈액응고 작용등 체내항상성 유지에 중요한 기능을 담당하고 있다. 또한 혈소판의 기능 변화에 의해 유발되는 혈소판 응집능의 이상은 혈액유동학에서 주요한 음성적 요인(negative factor)의 하나로서 지혈기전 이상을 일으키거나 미소순환장애를 일으키게 된다. 특히 현대사회에서 급격히 발병이 증가되고 있는 고혈압, 동맥경화 등의 성인병과 당뇨병 등의 대사성 질환에서 빈번히 나타나는 혈행장애 역시 그 주된 요인은 혈소판 응집능의 이상적 항진에 의한 것으로 보고되고 있어 혈소판 기능을 정상화시킴으로써 이러한 관련 질환을 치료 및 예방할 수 있을 것으로 예상되고 있다.
1,4-나프토퀴논 유도체는 일반적으로 항균작용, 항진균 작용, 항암작용, 항응고 작용 등의 다양한 약리학적 작용을 가지고 있어 항암제, 항균제 등과 같은 신의약품의 개발을 위한 중요한 물질로 활용되고 있다. 여러 연구자들의 연구결과에 따르면 1,4-나프토퀴논 유도체인 비타민 K3(메나디온)가 인간 혈소판의 응집작용을 억제하는 효과가 있다고 보고되었으나, 그 작용기전은 아직 명확하지 않다(참조:Blackwell, G. J., Radomski, M. and Moncada, S. Inhibition of human platelet aggregation by vitamin K. Thromb. Res. 37, 103-114, 1985). 한편, 2-클로로-3-메틸-1,4-나프토퀴논(CMN)이 토끼의 혈소판 응집반응을 억제시키는 것으로도 밝혀졌는데, 이는 다양한 혈소판 활성화물질(agonist)들에 의한 인지질의 대사과정을 2-클로로-3-메틸-1,4-나프토퀴논이 억제시키기 때문에 나타나는 것으로 보고되었다(참조 : Ko, F. N.,Sheu, S. J., Liu, Y. M, Huang, T. F. and Teng, C.M. Inhibition of rabbit platelet aggregation by 1,4-naphthoquinones. Thromb. Res. 57, 453-463, 1990).
이에 본 발명자는 1,4-나프토퀴논의 다양한 유도체를 합성하여 그의 혈소판 응집 억제효과를 시험하여 보았으며, 그 결과 지금까지 알려져 있던 1,4-나프토퀴논 유도체와는 다른 구조를 갖는 특정한 신규의 1,4-나프토퀴논 유도체가 강력한 혈소판 응집억제 효과를 나타냄을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명은 다음 일반식(Ⅰ)로 표시되는 신규한 2-클로로-3-아릴아미노-1,4-나프토퀴논 유도체에 관한 것이다.
상기식에서 X는 질소(N) 또는 탄소(C)원자를 나타내고, R은 시아노를 나타내거나, X가 질소(N)원자를 나타내는 경우에 R은 또한 알킬, 카복실 또는 아실 그룹을 나타낼 수도 있다.
본 발명에 따른 일반식(Ⅰ)의 화합물에서 바람직한 화합물은 X가 질소 또는 탄소원자를 나타내며, R은 시아노를 나타내거나, X가 질소원자를 나타내고, R은 탄소수 1 내지 6의 저급알킬, 카복실 또는 지방족 아실 그룹, 예를들면 알킬부분의 탄소수가 1 내지 6인 알킬카보닐 그룹을 나타내는 화합물이다.
본 발명에 따른 일반식(Ⅰ)의 화합물중에서 더욱 바람직한 화합물은 X가 질소 또는 탄소원자를 나타내며, R이 시아노를 나타내거나, X가 질소원자를 나타내고 R은 메틸, 카복실 또는 아세틸 그룹을 나타내는 일반식(Ⅰ)의 화합물이다.
본 발명에 따르는 일반식(Ⅰ)의 화합물의 특히 바람직한 예로는 다음과 같은 화합물이 언급될 수 있다 : 2-클로로-3-[(4-시아노페닐)-아미노]-1,4-나프토퀴논, 및 2-클로로-3-[(5-메틸피리딘-2-일)-아미노]-1,4-나프토퀴논.
본 발명에 따르면 또한 일반식(Ⅰ)의 신규한 2-클로로-3-아릴아미노-1,4-나프토퀴논 유도체의 제조 방법도 제공된다. 본 발명의 제조방법에 따르면, 일반식(Ⅰ)의 2-클로로-3-아릴아미노-1,4-나프토퀴논 유도체는 구조식(Ⅱ)의 2,3-디클로로-1,4-나프토퀴논을 일반식(Ⅲ)의 아릴아민과 반응시킴으로써 제조될 수 있다.
본 발명의 제조방법은 다음과 같은 반응도식으로 나타낼 수 있다.
상기 반응도식에서, X 및 R은 상기에서 정의한 바와 같은 의미를 갖는다.
본 발명의 방법에서 출발물질로 사용된 구조식(Ⅱ)의 2,3-디클로로-1,4-나프토퀴논(DNQ)는 당해 기술분야에서 공지된 화합물이며, 1,4-나프토퀴논을 염소(Cl2)가스와 반응시킴으로써 편리하게 제조될 수 있다.
본 발명의 방법에 따르면, 구조식(Ⅱ)의 DNQ를 알콜 용매중에서 일반식(Ⅲ)의 아릴아민 유도체와 반응시킴으로써 일반식(Ⅰ)의 화합물을 제조한다. 본 반응에 사용되는 알콜 용매로는 메탄올, 에탄올, 프로판올, 이소프로판올, 부탄올 등과 같은 탄소수 1 내지 6의 저급 알칸올 용매가 바람직할 수 있으며, 특히 바람직하게는 에탄올을 사용한다.
본 반응은 일반적으로 실온 내지 100℃의 온도, 바람직하게는 사용된 용매의 비점에서 환류하에 수행할 수 있다. 반응시간은 일반적으로 2 내지 6시간, 바람직하게는 3 내지 5시간이다.
반응이 완결된 후에 수득된 일반식(Ⅰ)의 화합물은 필요에 따라 통상적인 후처리 방법, 예를들면 재결정화, 크로마토그라피 등의 방법에 의해 분리 및 정제할 수 있다.
본 발명에 따른 일반식(Ⅰ)의 화합물은 강력한 혈소판 응집억제 작용을 가지고 있어 임상적으로 유용한 혈액응고 억제제 및 혈전증 치료제로 사용할 수 있다. 혈소판 응집능은 혈소판 과립으로부터의 분비능, 혈소판내의 아라키돈산 유리 및 대사 등의 과정에 의하여 크게 영향을 받는 것으로 알려져 있다. 즉 혈소판은 다른 세포에 비하여 밀집과립(dense granule), 알파과립(α-granule), 라이소좀(lysosome) 및 퍼옥시좀(peroxisome) 등과 같은 많은 과립을 함유하고 있으며, 각각의 과립에는 생리학적으로 매우 유용한 물질들이 저장되어 있다. 어떤 자극에 의해 혈소판이 활성화되면 과립에 저장된 물질들은 세포의 배출현상(exocytosis)을 통해 세포밖으로 분비된다. 특히 밀집과립에는 ADP, ATP 등의 아데닌 뉴클레오타이드, 칼슘 및 세로토닌 등이 저장되어 있어 혈소판이 응집될 때 유리되어 비가역적인 2차 응집작용을 유발하게 된다. 즉, ADP, 트롬빈 등으로 응집을 유도한 경우의 비가역적인 2차 응집반응이 이러한 과립 분비로 인한 결과라고 할 수 있다. 이하의 실험예에 의해 입증되는 바와 같이 본 발명에 따르는 화합물은 상기 언급한 생리활성물질의 혈소판 응집능 및 과립방출을 억제함으로써 혈소판 응집억제 효과를 나타낸다.
한편, 활성화된 혈소판에서 활성이 증가하는 PLA2(phospholipase A2)는 혈소판막의 포스파티딜콜린, 포스파티딜에탄올아민, 포스파티딜이노시톨 등의 인지질로부터 아라키돈산을 유리시키게 된다. 유리된 아라키돈산은 사이클로옥시게나제에 의해 극히 짧은 시간 동안만 존재하는 프로스타글란딘 엔도퍼옥사이드 중간체로서 프로스타글란딘 G2와 프로스타글란딘 H2를 생성한다. 이 엔도퍼옥사이드들은 강력한 혈소판 응집작용이 있지만 극히 불안정한 물질로서 트롬복산 합성요소의 작용을 받아 가장 강력한 혈소판 응집능이 있는 트롬복산 A2(TXA2)를 생성한다. 트롬복산 A2는 극히 낮은 농도(0.1μM 이하)에서도 혈소판 부착능 증가, 혈소판의 형태변화 유발, 아데닐레이트 사이클라제 억제를 통한 사이클릭 아데노신 모노포스페이트(cAMP) 생성의 감소, 혈소판내 칼슘 농도의 증가, 피브리노겐 수용체의 노출확대 등을 통한 혈소판 활성화를 통하여 비가역적인 대규모 응집을 유발시킨다. 이하의 실험예에 의해 입증되는 바와 같이 본 발명에 따른 화합물은 이와 같이 활성화된 혈소판에서 나타나는 트롬복산 A2의 합성능을 억제하는 기전을 경유하여 혈소판 응집 억제에 기여하는 것으로 확인되었다.
상기에서 언급한 바와 같이 본 발명에 따르는 일반식(Ⅰ)에서 목적화합물은 강력한 혈소판 응집억제 작용을 나타내며, 따라서 임상적으로 유용한 혈액응고 억제제 및 혈전증 치료제로 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 화합물(Ⅰ)을 임상적으로 이용하고자 하는 경우에, 이 활성화합물은 약제학적으로 허용되는 담체를 이용하여 통상적인 방법에 따라 약제학적인 분야에서 통상적인 제제, 예를들면 정제, 캅셀제, 트로치제, 액제, 현탁제 등의 경구투여용 제제, 주사용 용액 또는 현탁액, 또는 주사시에 주사용 증류수로 재조제하여 사용할 수 있도록 되어 있는 즉시사용형의 주사용 건조분말 등의 형태인 주사제, 연고제, 크림제, 액제 등의 국소적용형 제제 등의 다양한 제제로 제형화시켜 사용할 수 있다.
이러한 목적을 위해 사용되는 담체는 약제학적 분야에서 통상적인 것으로, 예를들면 경구투여용 제제의 경우에는 결합제, 활탁제, 붕해제, 부형제, 가용화제, 분산제, 안정화제, 현탁화제, 색소, 향료 등이 있으며, 주사제의 경우에는 보존제, 무통화제, 가용화제, 안정화제 등이 있고, 국소투여용 제제의 경우에는 기제, 부형제, 윤활제, 보존제 등이 있다. 이렇게 제조된 약제학적 제제는 경구적으로 투여하거나, 비경구적으로, 예를들면 정맥내, 피하, 복강내 투여 또는 국소 적용할 수 있다. 또한 경구투여시에 약제가 위산에 의해 분해되는 것을 방지하기 위하여 제산제를 병용하거나, 정제 등의 경구투여용 제제를 장용피가 피복된 제제로 제형화하는 것이 바람직할 수도 있다.
본 발명에 따른 일반식(Ⅰ)의 목적하는 2-클로로-3-아릴아미노-1,4-나프토퀴논 유도체의 인체에 대한 투여량은 체내에서의 활성성분의 흡수도, 불활성화율 및 배설속도, 환자의 연령, 성별 및 상태, 치료되어야 하는 질병의 상태 중증도에 따라 적절히 선택되나 일반적으로는 1일에 5mg 내지 35mg, 바람직하게는 10mg 내지 25mg의 양이 투여되도록 한다. 물론 환자 개개인의 상태나 질병의 상태 및 합병증등을 고려하여 전문가의 판단과 개인의 요구에 따라 전문화된 투약법을 사용하여 투여량을 적절히 증감시킬 수 있다. 활성성분의 1일 유효량은 1일 1회 투여하거나 일정시간 간격으로 수회, 바람직하게는 3 내지 6회에 걸쳐 분할투여할 수도 있다.
본 발명은 이하의 실시예 및 실험예에 의해 더욱 구체적으로 설명되나, 본 발명이 이들에 의해 어떤 식으로든 제한되는 것은 아니다.
[실시예 1]
2-클로로-3-[(4-시아노페닐)-아미노]-1,4-나프토퀴논의 제조
(1) 1,4-나프토퀴논 20g을 아세트산 200ml에 용해시키고, 생성된 용액에 염소(Cl2)가스 약 10g을 도입시킨 후에 실온에서 4시간 동안 진탕시켰다. 그후 반응혼합물을 얼음 500g에 붓고 생성된 침전을 여과하여 공기중에서 건조시켰다. 침전물을 에탄올에 현탁시킨 후에 30분 동안 수욕중에서 가열하고 실온에서 방치하여 목적하는 2,3-디클로로-1,4-나프토퀴논 28.6g(수율 90%)을 수득하였다.
(2) 200ml 환저 플라스크중에서 상기 (1)에서 수득한 2,3-디클로로-1,4-나프토퀴논 1g을 95% 에탄올 수용액 50ml에 용해시키고, 여기에 4-시아노아닐린 0.70g을 가하였다. 이 반응혼합물을 3시간 동안 가열하여 환류시켜 반응시켰다. 박층크로마토그라피에 의해 반응의 종결을 확인한 후에 반응액을 냉각시켜 석출된 결정을 여과하고 에탄올로부터 재결정화시켜 정제하여 적황색 플레이트상 물질로서 목적하는 표제 화합물 0.84g(수율 62%)을 수득하였다.
융점 : 188-189℃
[실시예 2]
2-클로로-3-[(5-메틸피리딘-2-일)아미노]-1,4-나프토퀴논의 제조
4-시아노-아닐린 대신에 2-아미노-5-메틸피리딘 0.5g을 사용하여 5시간 동안 반응시키는 것을 제외하고는 실시예 1-(2)와 동일한 방법에 따라 반응을 수행하여 적황색 플레이트상 물질로서 목적하는 표제화합물 0.99g(수율 76%)을 수득하였다.
융점 : 260-261℃
본 발명에 따르는 일반식(Ⅰ)의 2-클로로-3-아릴아미노-1,4-나프토퀴논 유도체의 혈소판 응집억제 효과는 이하의 실험예에 의해 명백히 입증되었다. 이하의 실험예에서 본 발명에 따른 화합물로는 실시예 1에서 제조된 2-클로로-3-[(4-시아노페닐)-아미노]-1,4-나프토퀴논(이하에서는 NQ0-Y15라 약칭함)을 사용하였다.
[실험예 1]
혈소판 활성화물질의 혈소판 응집능에 대한 억제효과의 측정
(1) 혈소판을 다량 함유하는 혈장과 세정 혈소판의 조제 :
나트륨시트레이트(최종농도 0.38%)를 미리 넣어 둔 주사기를 이용하여 랫트의 복대동맥으로부터 채혈하여 얻은 혈액을 상온에서 160xg으로 15분 동안 원심분리시켜 상등액으로서 혈소판을 다량 함유하는 혈장을 수득하였다. 혈소판을 다량 함유하는 혈장을 1500xg으로 15분 동안 다시 원심분리시켜 얻은 침전을 2mM 에틸렌디아민 테트라아세트산을 포함하는 세척용 완충액(129mM 염화나트륨, 0.8mM 제이인산칼륨, 8.9mM 탄산나트륨, 2.8mM 염화칼륨, 0.8mM 염화마그네슘, 5.6mM 글루코즈, 10mM N-[2-하이드록시에틸]-피페라진-N'-[2-에탄설폰산]. 완충액의 산도 pH 7.4)으로 3회 세척하여 혈장내의 단백질, 칼슘 등을 제거한 후에 0.35% 소혈청 알부민(bovine serum albumin)이 함유된 변형된 타이로드 완충액(129mM 염화나트륨, 0.8mM 제이인산칼륨, 8.9mM 탄산나트륨, 2.8mM 염화칼륨, 0.8mM 염화마그네슘, 5.6mM 글루코즈, 10mM N-[2-하이드록시에틸]-피페라진-N'-[2-에탄설폰산]. 완충액의 산도 pH 7.4)에 조심스럽게 재현탁시켜 세정 혈소판을 조제하였다.
(2) 혈소판 응집능의 측정 :
본 실험에서 혈소판 응집능은 본(Born) 등의 방법(참조 : Born, G. V. R., Nature, 194, 927, 1962)에 따라 혈소판 응집능 측정기(Chronolog사 ; 펜실바니아 하버타운 소재)를 이용하여 탁도의 변화에 따른 빛의 통과 정도의 변화를 측정함으로써 판정하였다. 혈소판이 거의 없는 혈장의 경우에 나타나는 빛의 통과 정도를 대조로 하여 상기 (1)에서 조제된 혈소판을 다량 함유하는 혈장 495μl를 표면이 실리콘으로 처리된 응집 검출계(aggregometer)용 큐벳에 넣고 이 큐벳을 37℃로 온도가 유지되고 있는 큐벳용 채널에 꽂아 30초 동안 유지시킴으로써 전처리한 후에 디메틸설폭사이드에 용해시킨 본 발명에 따른 화합물 NQ-Y15 2.5μl(최종농도 10-4M)를 가하고 다시 37℃에서 8분 동안 반응시킨 후에 트롬빈 2.5μl(최종농도 0.5U/ml)를 첨가하여 나타나는 빛의 통과정도의 변화를 30분 동안 측정하였다. 또한 타이로드 완충액의 경우에 나타나는 빛의 통과정도를 대조로 하여 상기 (1)에서 조제된 세정 혈소판 495μl를 37℃에서 30초 동안 상기에서와 동일한 방법으로 전처리한 후에 디메틸설폭사이드에 용해시킨 본 발명에 따른 화합물인 NQ-Y15 2.5μl를 가하고 다시 37℃에서 8분 동안 반응시킨 후에 2.5μl의 혈소판 활성화물질들(트롬빈 0.1U/ml, 콜라겐 10μg/ml, 또는 하기 구조식으로 표시되는 칼슘이오노포어 A23187 2μM)을 가하여 혈소판의 응집을 유발시키고 10분 동안 나타나는 빛의 통과 정도의 변화를 측정하였다.
실험결과는 혈소판 활성화물질만을 처리한 경우에 나타나는 빛의 통과 정도를 응집이 100% 나타난 것으로 하여 각 경우의 빛의 통과정도를 상대적인 비율로 계산함으로써 판단하였다.
상기 실험의 결과는 제1도 내지 제3도에 나타내었다. 제1도 내지 제3도에 도시된 결과로부터 알 수 있는 바와 같이, 혈소판 활성화물질인 트롬빈, 콜라겐, A23187에 의한 세정 혈소판의 응집능에 대한 본 발명 화합물 NQ-Y15의 효과는 각각의 경우에 농도 의존적으로 나타났는데, 즉 각각의 혈소판 활성화물질에 의한 혈소판의 응집능을 50% 감소시키는 NQ-Y15의 농도는 트롬빈(0.1U/ml)의 경우에 약 38μM(제1도), 콜라겐(10μg/ml)의 경우에 약 7μM(제2도), A23187(2μM)의 경우에 약 100μM(제4도)인 것으로 나타났다. 따라서, 본 발명 화합물은 다양한 혈소판 활성화물질들에 의한 혈소판의 응집능을 농도 의존적으로 억제시키는 것으로 확인되었다.
[실험예 2]
5-[14C]-세로토닌 분비억제 효과의 측정
혈소판은 다른 세포들에 비해 밀집과립, 알파과립, 라이소좀 등과 같은 많은 과립을 함유하고 있으며, 각각의 과립에는 생리학적으로 매우 유용한 물질들이 저장되어 있다. 어떤 자극에 의해 혈소판이 활성화되면 과립에 저장된 물질들은 세포외유출 현상에 의해 세포밖으로 분비된다. 특히 밀집과립에는 아데노신 디포스페이트(ADP), 아데노신트리포스페이트(ATP) 등의 아데닌 뉴클레오타이드, 칼슘 및 세로토닌 등이 저장되어 있어, 혈소판이 응집될 때 유리되어 비가역적인 2차 응집작용을 유발하게 된다. 즉, ADP, 트롬빈 등으로 응집을 유도한 경우의 비가역적인 2차 응집반응이 이러한 과립분비로 인한 결과라고 할 수 있다. 따라서, 과립으로부터 이러한 생리활성물질중의 하나인 세로토닌의 분비에 미치는 본 발명 화합물의 영향을 측정함으로써 본 발명 화합물의 혈소판 응집억제 효과를 확인하기 위하여 다음과 같은 실험을 수행하였다.
후저(Huzoor) 등의 방법(참조 : Huzoor-Akbar, Patel, S., Kokrady, S., Witiak, D.T., Newman, H.A.I. and Feller, D.R., Biochem. Pharmacol. 30, 2013-2020, 1981)에 따라 [14C]-세로토닌이 부하된 혈소판을 이용하여 본 발명 화합물의 세로토닌 분비억제 효과를 측정하였다. 즉, 세정혈소판에 5-[14C]-세로토닌을 가하여 37℃에서 30분 동안 배양한 후에 세척용 완충액(129mM 염화나트륨, 0.8mM 제이인산칼륨, 8.9mM 탄산나트륨, 2.8mM 염화칼륨, 0.8mM 염화마그네슘, 5.6mM 글루코즈, 10mM N-[2-하이드록시에틸]-피페라진-N'-[2-에탄설폰산], 완충액의 산도 pH 7.4)을 이용하여 세척하고 0.35% 소혈청 알부민이 함유된 변형된 타이로드 완충액(129mM 염화나트륨, 0.8mM 제이인산칼륨, 8.9mM 탄산나트륨, 2.8mM 염화칼륨, 0.8mM 염화마그네슘, 5.6mM 글루코즈, 10mM N-[2-하이드록시에틸]-피페라진-N'-[2-에탄설폰산], 산도 pH 7.4)에 재현탁시켜 세포수를 조정하였다. 2μM 이미프라민을 가하여 분비된 세로토닌의 재흡수를 차단시키고 본 발명 화합물인 NQ-Y15를 가한 후에 37℃에서 8분 동안 반응시키고 혈소판 활성화 물질들(트롬빈 또는 콜라겐)을 가하였다. 4mM 에틸렌디아민테트라아세트산, 10mM 포름알데히드를 가하여 반응을 정지시킨 후에 상온에서 12,000xg으로 2분 동안 원심분리시키고, 상등액을 취하여 분비된 5-[14C]-세로토닌의 방사선량을 측정하였다. 측정된 결과는 제4도 및 제5도에 나타내었다.
제4도 및 제5도에 도시된 결과로부터 알 수 있는 바와 같이, 제1도 및 제2도에서 확인된 것으로서 혈소판 활성화물질들에 의해 유도되는 혈소판 응집능을 억제하는 농도범위에서 본 발명 화합물인 NQ-Y15는 트롬빈(제4도) 및 콜라겐(제5도)에 의해 증가되는 세로토닌 분비를 억제하였다. 따라서, 본 발명에 따르는 화합물은 활성화된 혈소판에서 응집능을 증폭시키는 효과가 있는 물질들이 밀집과립으로부터 유리되는 것을 억제시키는 기전을 통하여 혈소판의 응집능을 저하시키는데 기여하는 것으로 판단된다.
[실험예 3]
트롬복산 A2생성능에 대한 억제효과의 측정
문헌[Ko, F. N.,Sheu, S. J., Liu, Y. M. Huang, T. F, and Teng, C.M., Inhibition of rabbit platelet aggregation by 1,4-naphthoquinones. Thromb. Res. 57, 453-463, 1990]에 기술된 방법에 따라 다음과 같이 트롬복산 A2의 생성능을 측정하였다. 0.5ml의 세정 혈소판(3×108혈소판/ml)이 담긴 플라스틱 큐벳에서 37℃를 유지시키면서 실험을 수행하였다. 먼저 세정 혈소판을 본 발명 화합물인 NQ-Y15로 8분간 전처리한 후에 콜라겐을 가하였다. 5분 동안 배양한 후에 2mM 에틸렌디아민테트라아세트산과 50μM 인도메타신을 가하여 반응을 정지시켰다. 상온에서 12,000xg으로 2분 동안 원심분리시킨 후에 상등액을 취하여 -20℃에서 보관하였다. 트롬복산 A2는 불안정한 구조를 가지고 있기 때문에 곧바로 안정된 형태인 트롬복산 B2로 변하므로, 트롬복산 B2의 생성을 트롬복산 A2생성의 지표로 하여 방사면역검정법으로 측정했다. 측정된 결과는 다음 표 1에 나타내었다.
상기 표 1에 기재된 결과로부터 알 수 있는 바와 같이 콜라겐 처리에 의해 현저히 증가되는 트롬복산 A2가 본 발명에 따르는 NQ-Y15를 50μM, 30μM 농도로 전처리한 경우에 각각 86.35%, 15.54% 의 유의적인 억제효과를 나타냈다. 따라서, 본 발명의 화합물은 활성화된 혈소판에서 분비되어 혈소판의 활성화를 증폭시키는 효과가 있는 트롬복산 A2의 합성능을 억제시키는 기전을 경유하여 혈소판의 응집억제에 기여하는 것으로 판단된다.
[실험예 4]
젖산 탈수소효소 유출실험
젖산 탈수소효소(lactic acid dehydrogenase : LDH)는 혈소판의 세포질내에 존재하는 효소로서 혈소판막이 손상되거나 세포용해현상 등의 세포독성이 유발되면 세포외액으로 유출되게 된다. 따라서, 본 발명의 화합물로 전처리한 후에 유출된 젖산 탈수소효소를 정량함으로써 본 발명 화합물의 세포독성 유발여부를 확인하고자 하였다.
세정 혈소판에 본 발명 화합물인 NQ-Y15를 용해시키는 용매인 디메틸설폭사이드(DMSO)(대조군), NQ-Y15, 또는 세포막을 붕해시키는 작용을 하는 트리톤(Triton) X-100(0.1%)을 가한 후에 상온에서 12,000xg으로 2분 동안 원심분리시킨 후에 상등액을 분리하였다. 분리된 상등액에 젖산 탈수소효소 측정시약인 LD-L10R(Sigma사)을 가하고, 자동으로 젖산 탈수소효소를 정량할 수 있는 자동화 임상화학분석기(automated clinical chemistry analyzer) SBA300(Gilford사)을 이용하여 유출된 젖산 탈수소효소를 정량하였다. 측정된 결과는 다음 표 2에 나타내었다.
상기 표 2에 나타난 바와 같이 본 발명에 따르는 화합물인 NQ-Y15는 혈소판의 응집능을 완전히 억제시키는 농도인 0.1mM 농도로 전처리하여 120분 동안 처리한 경우에도 LDH의 농도에 있어서 대조군과 유의적인 차이를 나타내지 않았다. 따라서, NQ-Y15는 고농도에서도 세포독성을 일으키지 않는 것으로 확인되었다.

Claims (10)

  1. 하기 일반식(Ⅰ)의 2-클로로-3-아릴아미노-1,4-나프토퀴논 유도체 :
    상기식에서, X는 질소(N) 또는 탄소(C) 원자를 나타내며, R은 시아노를 나타내거나, X가 질소(N)원자를 나타내는 경우에 R은 또한 알킬, 카복실 또는 아실 그룹을 나타낼 수도 있다.
  2. 제1항에 있어서, X가 질소 또는 탄소원자를 나타내며, R은 시아노를 나타내거나, X가 질소원자를 나타내고, R이 탄소수 1 내지 6의 저급알킬, 카복실 또는 알킬부분의 탄소수가 1 내지 6인 알킬카보닐 그룹을 나타내는 일반식(Ⅰ)의 화합물.
  3. 제2항에 있어서, X가 질소 또는 탄소원자를 나타내며, R이 시아노를 나타내거나, X가 질소원자를 나타내고, R은 메틸, 카복실 또는 아세틸 그룹을 나타내는 일반식(Ⅰ)의 화합물.
  4. 제1항에 있어서, 2-클로로-3-[(4-시아노페닐)-아미노]-1,4-나프토퀴논 및 2-클로로-3-[(5-메틸피리딘-2-일)-아미노]-1,4-나프토퀴논으로 구성된 그룹중에서 선택된 일반식(Ⅰ)의 화합물.
  5. 구조식(Ⅱ)의 2,3-디클로로-1,4-나프토퀴논을 일반식(Ⅲ)의 아릴아민과 반응시킴으로 특징으로 하여 일반식(Ⅰ)의 2-클로로-3-아릴아미노-1,4-나프토퀴논 유도체를 제조하는 방법 :
    상기식에서 X는 질소(N) 또는 탄소(C) 원자를 나타내고, R은 시아노를 나타내거나, X가 질소(N) 원자를 나타내는 경우에 R은 또한 알킬, 카복실 또는 아실 그룹을 나타낼 수도 있다.
  6. 제5항에 있어서, 반응을 알콜 용매의 존재하에서 수행함을 특징으로 하는 방법.
  7. 제6항에 있어서, 알콜 용매가 에탄올임을 특징으로 하는 방법.
  8. 제5항에 있어서, 반응을 실온 내지 100℃의 온도 범위에서 수행함을 특징으로 하는 방법.
  9. 제5항에 있어서, 반응을 2 내지 6시간 동안 수행함을 특징으로 하는 방법.
  10. 제1항 내지 4항중의 어느 한 항에 따르는 일반식(Ⅰ)의 2-클로로-3-아릴아미노-1,4-나프토퀴논 유도체를 함유함을 특징으로 하는 혈액응고 억제제 조성물.
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