KR0135034B1 - Novel 2-chloro-3-arylamino-1.4-naphthoquinone derivatives - Google Patents
Novel 2-chloro-3-arylamino-1.4-naphthoquinone derivativesInfo
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Abstract
본 발명은 강력한 혈소판 응집억제작용을 갖는 하기 일반식(Ⅰ)의 신규한 2-클로로-3-아릴아미노-1,4-나프토퀴논 유도체에 관한 것이다.The present invention relates to novel 2-chloro-3-arylamino-1,4-naphthoquinone derivatives of the general formula (I) below having potent platelet aggregation inhibitory activity.
상기식에서 X는 질소(N) 또는 탄소(C)원자를 나타내며, R은 시아노를 나타내거나, X가 질소(N)원자를 나타내는 경우에 R은 또한 알킬, 카복실 또는 아실 그룹을 나타낼 수도 있다.Wherein X represents a nitrogen (N) or carbon (C) atom, R represents a cyano, or when X represents a nitrogen (N) atom, R may also represent an alkyl, carboxyl or acyl group.
본 발명은 또한 상기 일반식(Ⅰ) 화합물의 제조방법 및 활성성분으로서 상기 일반식(Ⅰ)의 화합물을 함유하는 혈액응고억제제 조성물에 관한 것이다.The present invention also relates to a method for preparing the compound of the general formula (I) and a blood coagulation inhibitor composition containing the compound of the general formula (I) as an active ingredient.
Description
제1도는 트롬빈으로 활성화된 혈소판의 응집능에 대한 본 발명 화합물(NQ-Y15)의 억제효과를 나타내는 그래프이다.1 is a graph showing the inhibitory effect of the compound of the present invention (NQ-Y15) on the aggregation ability of thrombin activated platelets.
제2도는 콜라겐으로 활성화된 혈소판의 응집능에 대한 본 발명 화합물(NQ-Y15)의 억제효과를 나타내는 그래프이다.2 is a graph showing the inhibitory effect of the compound of the present invention (NQ-Y15) on the aggregation ability of platelets activated with collagen.
제3도는 A23187로 활성화된 혈소판의 응집능에 대한 본 발명 화합물(NQ-Y15)의 억제효과를 나타내는 그래프이다.3 is a graph showing the inhibitory effect of the compound of the present invention (NQ-Y15) on the aggregation ability of platelets activated with A23187.
제4도는 트롬빈으로 유도되는 과립내 세로토닌 분비에 대한 본 발명 화합물(NQ-Y15)의 억제효과를 나타내는 그래프이다.4 is a graph showing the inhibitory effect of the compound of the present invention (NQ-Y15) on the thrombin-induced intracellular serotonin secretion.
제5도는 콜라겐으로 유도되는 과립내 세로토닌 분비에 대한 본 발명 화합물(NQ-Y15)의 억제효과를 나타내는 그래프이다.5 is a graph showing the inhibitory effect of the compound (NQ-Y15) on collagen-induced intracellular serotonin secretion.
본 발명은 혈소판 응집 억제작용을 갖는 신규한 1,4-나프토퀴논 유도체에 관한 것이다. 더욱 구체적으로 본 발명은 혈소판 응집 억제작용을 가지고 있어 혈액응고 억제제 및 혈전증 치료제로 사용할 수 있는 다음 일반식(Ⅰ)의 신규한 2-클로로-3-아릴아미노-1,4-나프토퀴논 유도체에 관한 것이다.The present invention relates to novel 1,4-naphthoquinone derivatives having platelet aggregation inhibitory action. More specifically, the present invention relates to a novel 2-chloro-3-arylamino-1,4-naphthoquinone derivative of the following general formula (I), which has a platelet aggregation inhibitory effect and can be used as a blood coagulation inhibitor and a thrombosis therapeutic agent. It is about.
상기식에서 X는 질소(N) 또는 탄소(C)원자를 나타내고, R은 시아노를 나타내거나, X가 질소(N)원자를 나타내는 경우에 R은 또한 알킬, 카복실 또는 아실 그룹을 나타낼 수도 있다.Wherein X represents a nitrogen (N) or carbon (C) atom, R represents a cyano, or when X represents a nitrogen (N) atom, R may also represent an alkyl, carboxyl or acyl group.
혈소판은 혈액 구성세포들 중에서 가장 적은 부분을 차지하지만 미세한 자극에 대해서도 쉽게 반응을 나타내어 혈액응고 작용등 체내항상성 유지에 중요한 기능을 담당하고 있다. 또한 혈소판의 기능 변화에 의해 유발되는 혈소판 응집능의 이상은 혈액유동학에서 주요한 음성적 요인(negative factor)의 하나로서 지혈기전 이상을 일으키거나 미소순환장애를 일으키게 된다. 특히 현대사회에서 급격히 발병이 증가되고 있는 고혈압, 동맥경화 등의 성인병과 당뇨병 등의 대사성 질환에서 빈번히 나타나는 혈행장애 역시 그 주된 요인은 혈소판 응집능의 이상적 항진에 의한 것으로 보고되고 있어 혈소판 기능을 정상화시킴으로써 이러한 관련 질환을 치료 및 예방할 수 있을 것으로 예상되고 있다.Platelets make up the smallest part of the blood constituent cells, but they respond easily to minute stimuli and play important functions in maintaining the body's homeostasis such as blood coagulation. In addition, abnormality of platelet aggregation ability caused by the change of platelet function is one of the major negative factors (hegative factor) in hemodynamics, causing hemostatic dysfunction or microcirculation disorder. In particular, hemodynamic disorders frequently occur in adult diseases such as hypertension and arteriosclerosis, and metabolic diseases such as diabetes, which are rapidly increasing in modern society, and the main factor is reported to be due to the ideal hyperplasia of platelet aggregation ability. It is expected that these related diseases can be treated and prevented.
1,4-나프토퀴논 유도체는 일반적으로 항균작용, 항진균 작용, 항암작용, 항응고 작용 등의 다양한 약리학적 작용을 가지고 있어 항암제, 항균제 등과 같은 신의약품의 개발을 위한 중요한 물질로 활용되고 있다. 여러 연구자들의 연구결과에 따르면 1,4-나프토퀴논 유도체인 비타민 K3(메나디온)가 인간 혈소판의 응집작용을 억제하는 효과가 있다고 보고되었으나, 그 작용기전은 아직 명확하지 않다(참조:Blackwell, G. J., Radomski, M. and Moncada, S. Inhibition of human platelet aggregation by vitamin K. Thromb. Res. 37, 103-114, 1985). 한편, 2-클로로-3-메틸-1,4-나프토퀴논(CMN)이 토끼의 혈소판 응집반응을 억제시키는 것으로도 밝혀졌는데, 이는 다양한 혈소판 활성화물질(agonist)들에 의한 인지질의 대사과정을 2-클로로-3-메틸-1,4-나프토퀴논이 억제시키기 때문에 나타나는 것으로 보고되었다(참조 : Ko, F. N.,Sheu, S. J., Liu, Y. M, Huang, T. F. and Teng, C.M. Inhibition of rabbit platelet aggregation by 1,4-naphthoquinones. Thromb. Res. 57, 453-463, 1990).1,4-naphthoquinone derivatives have various pharmacological actions such as antibacterial action, antifungal action, anticancer action and anticoagulant action, and thus are used as important substances for the development of new drugs such as anticancer drugs and antibacterial drugs. Several researchers have reported that the 1,4-naphthoquinone derivative, vitamin K 3 (menadione), has the effect of inhibiting the aggregation of human platelets, but its mechanism of action is not yet clear (Blackwell). , GJ, Radomski, M. and Moncada, S. Inhibition of human platelet aggregation by vitamin K. Thromb. Res. 37, 103-114, 1985). On the other hand, 2-chloro-3-methyl-1,4-naphthoquinone (CMN) has also been shown to inhibit the platelet aggregation reaction in rabbits, which is responsible for the metabolic process of phospholipids by various platelet agonists. It has been reported to appear because 2-chloro-3-methyl-1,4-naphthoquinone inhibits (see Ko, FN, Sheu, SJ, Liu, Y. M, Huang, TF and Teng, CM Inhibition of rabbit) platelet aggregation by 1,4-naphthoquinones.Thromb.Res. 57, 453-463, 1990).
이에 본 발명자는 1,4-나프토퀴논의 다양한 유도체를 합성하여 그의 혈소판 응집 억제효과를 시험하여 보았으며, 그 결과 지금까지 알려져 있던 1,4-나프토퀴논 유도체와는 다른 구조를 갖는 특정한 신규의 1,4-나프토퀴논 유도체가 강력한 혈소판 응집억제 효과를 나타냄을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.Thus, the present inventors synthesized various derivatives of 1,4-naphthoquinone and tested their platelet aggregation inhibitory effects, and as a result, a novel novel compound having a different structure from the known 1,4-naphthoquinone derivatives has been tested. It was confirmed that the 1,4-naphthoquinone derivative exhibits a potent platelet aggregation inhibitory effect, thereby completing the present invention.
따라서, 본 발명은 다음 일반식(Ⅰ)로 표시되는 신규한 2-클로로-3-아릴아미노-1,4-나프토퀴논 유도체에 관한 것이다.Accordingly, the present invention relates to a novel 2-chloro-3-arylamino-1,4-naphthoquinone derivative represented by the following general formula (I).
상기식에서 X는 질소(N) 또는 탄소(C)원자를 나타내고, R은 시아노를 나타내거나, X가 질소(N)원자를 나타내는 경우에 R은 또한 알킬, 카복실 또는 아실 그룹을 나타낼 수도 있다.Wherein X represents a nitrogen (N) or carbon (C) atom, R represents a cyano, or when X represents a nitrogen (N) atom, R may also represent an alkyl, carboxyl or acyl group.
본 발명에 따른 일반식(Ⅰ)의 화합물에서 바람직한 화합물은 X가 질소 또는 탄소원자를 나타내며, R은 시아노를 나타내거나, X가 질소원자를 나타내고, R은 탄소수 1 내지 6의 저급알킬, 카복실 또는 지방족 아실 그룹, 예를들면 알킬부분의 탄소수가 1 내지 6인 알킬카보닐 그룹을 나타내는 화합물이다.Preferred compounds in the compounds of general formula (I) according to the invention are those in which X represents nitrogen or a carbon atom, R represents cyano, X represents a nitrogen atom, and R represents lower alkyl, carboxyl or Aliphatic acyl groups, for example, alkyl compounds having 1 to 6 carbon atoms in the alkyl moiety.
본 발명에 따른 일반식(Ⅰ)의 화합물중에서 더욱 바람직한 화합물은 X가 질소 또는 탄소원자를 나타내며, R이 시아노를 나타내거나, X가 질소원자를 나타내고 R은 메틸, 카복실 또는 아세틸 그룹을 나타내는 일반식(Ⅰ)의 화합물이다.Among the compounds of general formula (I) according to the invention, more preferred compounds are those in which X represents nitrogen or a carbon atom, R represents cyano, X represents a nitrogen atom and R represents a methyl, carboxyl or acetyl group It is a compound of (I).
본 발명에 따르는 일반식(Ⅰ)의 화합물의 특히 바람직한 예로는 다음과 같은 화합물이 언급될 수 있다 : 2-클로로-3-[(4-시아노페닐)-아미노]-1,4-나프토퀴논, 및 2-클로로-3-[(5-메틸피리딘-2-일)-아미노]-1,4-나프토퀴논.Particularly preferred examples of compounds of general formula (I) according to the invention may be mentioned the following compounds: 2-chloro-3-[(4-cyanophenyl) -amino] -1,4-naphtho Quinones, and 2-chloro-3-[(5-methylpyridin-2-yl) -amino] -1,4-naphthoquinone.
본 발명에 따르면 또한 일반식(Ⅰ)의 신규한 2-클로로-3-아릴아미노-1,4-나프토퀴논 유도체의 제조 방법도 제공된다. 본 발명의 제조방법에 따르면, 일반식(Ⅰ)의 2-클로로-3-아릴아미노-1,4-나프토퀴논 유도체는 구조식(Ⅱ)의 2,3-디클로로-1,4-나프토퀴논을 일반식(Ⅲ)의 아릴아민과 반응시킴으로써 제조될 수 있다.According to the invention there is also provided a process for the preparation of the novel 2-chloro-3-arylamino-1,4-naphthoquinone derivatives of general formula (I). According to the preparation method of the present invention, the 2-chloro-3-arylamino-1,4-naphthoquinone derivative of the general formula (I) is 2,3-dichloro-1,4-naphthoquinone of the formula (II) Can be prepared by reacting with arylamine of general formula (III).
본 발명의 제조방법은 다음과 같은 반응도식으로 나타낼 수 있다.The production method of the present invention can be represented by the following reaction scheme.
상기 반응도식에서, X 및 R은 상기에서 정의한 바와 같은 의미를 갖는다.In the above scheme, X and R have the meaning as defined above.
본 발명의 방법에서 출발물질로 사용된 구조식(Ⅱ)의 2,3-디클로로-1,4-나프토퀴논(DNQ)는 당해 기술분야에서 공지된 화합물이며, 1,4-나프토퀴논을 염소(Cl2)가스와 반응시킴으로써 편리하게 제조될 수 있다.2,3-dichloro-1,4-naphthoquinone (DNQ) of formula (II) used as starting material in the process of the present invention is a compound known in the art, and 1,4-naphthoquinone is chlorine It can be conveniently prepared by reacting with (Cl 2 ) gas.
본 발명의 방법에 따르면, 구조식(Ⅱ)의 DNQ를 알콜 용매중에서 일반식(Ⅲ)의 아릴아민 유도체와 반응시킴으로써 일반식(Ⅰ)의 화합물을 제조한다. 본 반응에 사용되는 알콜 용매로는 메탄올, 에탄올, 프로판올, 이소프로판올, 부탄올 등과 같은 탄소수 1 내지 6의 저급 알칸올 용매가 바람직할 수 있으며, 특히 바람직하게는 에탄올을 사용한다.According to the process of the present invention, the compound of formula (I) is prepared by reacting DNQ of formula (II) with an arylamine derivative of formula (III) in an alcohol solvent. As the alcohol solvent used in the reaction, lower alkanol solvents having 1 to 6 carbon atoms such as methanol, ethanol, propanol, isopropanol, butanol and the like may be preferable, and ethanol is particularly preferable.
본 반응은 일반적으로 실온 내지 100℃의 온도, 바람직하게는 사용된 용매의 비점에서 환류하에 수행할 수 있다. 반응시간은 일반적으로 2 내지 6시간, 바람직하게는 3 내지 5시간이다.The reaction can generally be carried out under reflux at a temperature of room temperature to 100 ° C., preferably at the boiling point of the solvent used. The reaction time is generally 2 to 6 hours, preferably 3 to 5 hours.
반응이 완결된 후에 수득된 일반식(Ⅰ)의 화합물은 필요에 따라 통상적인 후처리 방법, 예를들면 재결정화, 크로마토그라피 등의 방법에 의해 분리 및 정제할 수 있다.After completion of the reaction, the compound of general formula (I) obtained can be separated and purified by conventional post-treatment methods, such as recrystallization, chromatography, etc. as necessary.
본 발명에 따른 일반식(Ⅰ)의 화합물은 강력한 혈소판 응집억제 작용을 가지고 있어 임상적으로 유용한 혈액응고 억제제 및 혈전증 치료제로 사용할 수 있다. 혈소판 응집능은 혈소판 과립으로부터의 분비능, 혈소판내의 아라키돈산 유리 및 대사 등의 과정에 의하여 크게 영향을 받는 것으로 알려져 있다. 즉 혈소판은 다른 세포에 비하여 밀집과립(dense granule), 알파과립(α-granule), 라이소좀(lysosome) 및 퍼옥시좀(peroxisome) 등과 같은 많은 과립을 함유하고 있으며, 각각의 과립에는 생리학적으로 매우 유용한 물질들이 저장되어 있다. 어떤 자극에 의해 혈소판이 활성화되면 과립에 저장된 물질들은 세포의 배출현상(exocytosis)을 통해 세포밖으로 분비된다. 특히 밀집과립에는 ADP, ATP 등의 아데닌 뉴클레오타이드, 칼슘 및 세로토닌 등이 저장되어 있어 혈소판이 응집될 때 유리되어 비가역적인 2차 응집작용을 유발하게 된다. 즉, ADP, 트롬빈 등으로 응집을 유도한 경우의 비가역적인 2차 응집반응이 이러한 과립 분비로 인한 결과라고 할 수 있다. 이하의 실험예에 의해 입증되는 바와 같이 본 발명에 따르는 화합물은 상기 언급한 생리활성물질의 혈소판 응집능 및 과립방출을 억제함으로써 혈소판 응집억제 효과를 나타낸다.The compound of general formula (I) according to the present invention has a strong platelet aggregation inhibitory effect and can be used as a clinically useful anticoagulant inhibitor and thrombosis therapeutic agent. Platelet aggregation ability is known to be greatly affected by processes such as secretion ability from platelet granules, release of arachidonic acid in platelets and metabolism. Platelets contain more granules, such as dense granules, α-granules, lysosomes, and peroxisomes, compared to other cells. Very useful substances are stored. When platelets are activated by a stimulus, the substances stored in the granules are secreted out of the cell through the exocytosis of the cells. In particular, dense granules contain adenine nucleotides such as ADP and ATP, calcium, and serotonin, which are released when platelets aggregate and cause irreversible secondary aggregation. That is, the irreversible secondary aggregation reaction in the case of inducing aggregation with ADP, thrombin, etc. can be said to be a result of the granule secretion. As demonstrated by the following experimental example, the compound according to the present invention exhibits platelet aggregation inhibitory effect by inhibiting platelet aggregation ability and granule release of the above-mentioned bioactive substances.
한편, 활성화된 혈소판에서 활성이 증가하는 PLA2(phospholipase A2)는 혈소판막의 포스파티딜콜린, 포스파티딜에탄올아민, 포스파티딜이노시톨 등의 인지질로부터 아라키돈산을 유리시키게 된다. 유리된 아라키돈산은 사이클로옥시게나제에 의해 극히 짧은 시간 동안만 존재하는 프로스타글란딘 엔도퍼옥사이드 중간체로서 프로스타글란딘 G2와 프로스타글란딘 H2를 생성한다. 이 엔도퍼옥사이드들은 강력한 혈소판 응집작용이 있지만 극히 불안정한 물질로서 트롬복산 합성요소의 작용을 받아 가장 강력한 혈소판 응집능이 있는 트롬복산 A2(TXA2)를 생성한다. 트롬복산 A2는 극히 낮은 농도(0.1μM 이하)에서도 혈소판 부착능 증가, 혈소판의 형태변화 유발, 아데닐레이트 사이클라제 억제를 통한 사이클릭 아데노신 모노포스페이트(cAMP) 생성의 감소, 혈소판내 칼슘 농도의 증가, 피브리노겐 수용체의 노출확대 등을 통한 혈소판 활성화를 통하여 비가역적인 대규모 응집을 유발시킨다. 이하의 실험예에 의해 입증되는 바와 같이 본 발명에 따른 화합물은 이와 같이 활성화된 혈소판에서 나타나는 트롬복산 A2의 합성능을 억제하는 기전을 경유하여 혈소판 응집 억제에 기여하는 것으로 확인되었다.Meanwhile, PLA 2 (phospholipase A 2 ) having increased activity in activated platelets releases arachidonic acid from phospholipids such as phosphatidylcholine, phosphatidylethanolamine, and phosphatidylinositol of the platelet membrane. Free arachidonic acid produces prostaglandin G 2 and prostaglandin H 2 as prostaglandin endoperoxide intermediates present only for a very short time by cyclooxygenase. These endoperoxides have strong platelet aggregation, but they are extremely unstable, producing the most powerful platelet aggregation thromboxane A 2 (TXA 2 ) under the action of thromboxane synthesizing elements. Thromboxane A 2 has increased platelet adhesion, induced platelet morphology, reduced cyclic adenosine monophosphate (cAMP) production through inhibition of adenylate cyclase, and calcium levels in platelets, even at extremely low concentrations (<0.1 μM). Platelet activation through increased neutrophils and increased exposure of fibrinogen receptors leads to large irreversible aggregation. As demonstrated by the following experimental examples, the compounds according to the present invention were found to contribute to the inhibition of platelet aggregation via a mechanism for inhibiting the synthesis ability of thromboxane A 2 in the activated platelets.
상기에서 언급한 바와 같이 본 발명에 따르는 일반식(Ⅰ)에서 목적화합물은 강력한 혈소판 응집억제 작용을 나타내며, 따라서 임상적으로 유용한 혈액응고 억제제 및 혈전증 치료제로 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 화합물(Ⅰ)을 임상적으로 이용하고자 하는 경우에, 이 활성화합물은 약제학적으로 허용되는 담체를 이용하여 통상적인 방법에 따라 약제학적인 분야에서 통상적인 제제, 예를들면 정제, 캅셀제, 트로치제, 액제, 현탁제 등의 경구투여용 제제, 주사용 용액 또는 현탁액, 또는 주사시에 주사용 증류수로 재조제하여 사용할 수 있도록 되어 있는 즉시사용형의 주사용 건조분말 등의 형태인 주사제, 연고제, 크림제, 액제 등의 국소적용형 제제 등의 다양한 제제로 제형화시켜 사용할 수 있다.As mentioned above, the target compound in the general formula (I) according to the present invention exhibits potent platelet aggregation inhibitory action, and thus can be used as a clinically useful anticoagulant inhibitor and thrombosis therapeutic agent. In the case of clinical use of the compound (I) according to the present invention, this active compound is prepared according to a conventional method using a pharmaceutically acceptable carrier, for example, in the pharmaceutical field, for example, tablets, capsules. Injections in the form of oral preparations such as troches, solutions, suspensions, injectable solutions or suspensions, or ready-to-use dry powders which can be reconstituted with injectable distilled water at the time of injection. It can be formulated into various preparations such as topical preparations such as ointments, creams and liquids.
이러한 목적을 위해 사용되는 담체는 약제학적 분야에서 통상적인 것으로, 예를들면 경구투여용 제제의 경우에는 결합제, 활탁제, 붕해제, 부형제, 가용화제, 분산제, 안정화제, 현탁화제, 색소, 향료 등이 있으며, 주사제의 경우에는 보존제, 무통화제, 가용화제, 안정화제 등이 있고, 국소투여용 제제의 경우에는 기제, 부형제, 윤활제, 보존제 등이 있다. 이렇게 제조된 약제학적 제제는 경구적으로 투여하거나, 비경구적으로, 예를들면 정맥내, 피하, 복강내 투여 또는 국소 적용할 수 있다. 또한 경구투여시에 약제가 위산에 의해 분해되는 것을 방지하기 위하여 제산제를 병용하거나, 정제 등의 경구투여용 제제를 장용피가 피복된 제제로 제형화하는 것이 바람직할 수도 있다.Carriers used for this purpose are customary in the pharmaceutical art, for example in the case of oral preparations, binders, suspending agents, disintegrating agents, excipients, solubilizing agents, dispersants, stabilizers, suspending agents, pigments, flavorings In the case of injections, there are preservatives, analgesic agents, solubilizers, stabilizers and the like, and in the case of topical administration agents, there are bases, excipients, lubricants, preservatives and the like. The pharmaceutical preparations thus prepared may be administered orally or parenterally, for example, intravenously, subcutaneously, intraperitoneally, or topically. In addition, in order to prevent the decomposition of the drug by gastric acid during oral administration, it may be desirable to use an antacid or to formulate an oral administration such as tablets into an enteric coating.
본 발명에 따른 일반식(Ⅰ)의 목적하는 2-클로로-3-아릴아미노-1,4-나프토퀴논 유도체의 인체에 대한 투여량은 체내에서의 활성성분의 흡수도, 불활성화율 및 배설속도, 환자의 연령, 성별 및 상태, 치료되어야 하는 질병의 상태 중증도에 따라 적절히 선택되나 일반적으로는 1일에 5mg 내지 35mg, 바람직하게는 10mg 내지 25mg의 양이 투여되도록 한다. 물론 환자 개개인의 상태나 질병의 상태 및 합병증등을 고려하여 전문가의 판단과 개인의 요구에 따라 전문화된 투약법을 사용하여 투여량을 적절히 증감시킬 수 있다. 활성성분의 1일 유효량은 1일 1회 투여하거나 일정시간 간격으로 수회, 바람직하게는 3 내지 6회에 걸쳐 분할투여할 수도 있다.Dose to the human body of the desired 2-chloro-3-arylamino-1,4-naphthoquinone derivative of the general formula (I) according to the present invention is absorbed, inactivation rate and excretion rate of the active ingredient in the body Depending on the age, sex and condition of the patient, and the severity of the condition of the disease to be treated, the dosage is generally 5 mg to 35 mg, preferably 10 mg to 25 mg per day. Of course, the dosage can be appropriately increased or decreased using specialized dosage methods according to the judgment of the expert and the needs of the individual, taking into account the individual patient's condition, disease state and complications. The daily effective amount of the active ingredient may be administered once a day or dividedly administered several times, preferably 3 to 6 times at regular time intervals.
본 발명은 이하의 실시예 및 실험예에 의해 더욱 구체적으로 설명되나, 본 발명이 이들에 의해 어떤 식으로든 제한되는 것은 아니다.The present invention is explained in more detail by the following examples and experimental examples, but the present invention is not limited in any way by these.
[실시예 1]Example 1
2-클로로-3-[(4-시아노페닐)-아미노]-1,4-나프토퀴논의 제조Preparation of 2-chloro-3-[(4-cyanophenyl) -amino] -1,4-naphthoquinone
(1) 1,4-나프토퀴논 20g을 아세트산 200ml에 용해시키고, 생성된 용액에 염소(Cl2)가스 약 10g을 도입시킨 후에 실온에서 4시간 동안 진탕시켰다. 그후 반응혼합물을 얼음 500g에 붓고 생성된 침전을 여과하여 공기중에서 건조시켰다. 침전물을 에탄올에 현탁시킨 후에 30분 동안 수욕중에서 가열하고 실온에서 방치하여 목적하는 2,3-디클로로-1,4-나프토퀴논 28.6g(수율 90%)을 수득하였다.(1) 20 g of 1,4-naphthoquinone was dissolved in 200 ml of acetic acid, and about 10 g of chlorine (Cl 2 ) gas was introduced into the resulting solution, followed by shaking for 4 hours at room temperature. The reaction mixture was then poured into 500 g of ice and the resulting precipitate was filtered and dried in air. The precipitate was suspended in ethanol and then heated in a water bath for 30 minutes and left at room temperature to give 28.6 g (90% yield) of the desired 2,3-dichloro-1,4-naphthoquinone.
(2) 200ml 환저 플라스크중에서 상기 (1)에서 수득한 2,3-디클로로-1,4-나프토퀴논 1g을 95% 에탄올 수용액 50ml에 용해시키고, 여기에 4-시아노아닐린 0.70g을 가하였다. 이 반응혼합물을 3시간 동안 가열하여 환류시켜 반응시켰다. 박층크로마토그라피에 의해 반응의 종결을 확인한 후에 반응액을 냉각시켜 석출된 결정을 여과하고 에탄올로부터 재결정화시켜 정제하여 적황색 플레이트상 물질로서 목적하는 표제 화합물 0.84g(수율 62%)을 수득하였다.(2) 1 g of 2,3-dichloro-1,4-naphthoquinone obtained in (1) above was dissolved in 50 ml of a 95% ethanol aqueous solution in a 200 ml round bottom flask, and 0.70 g of 4-cyanoaniline was added thereto. . The reaction mixture was heated to reflux for 3 hours to react. After confirming the completion of the reaction by thin layer chromatography, the reaction solution was cooled, and the precipitated crystals were filtered, recrystallized from ethanol and purified to give 0.84 g (yield 62%) of the title compound as a reddish yellow plate-like substance.
융점 : 188-189℃Melting Point: 188-189 ℃
[실시예 2]Example 2
2-클로로-3-[(5-메틸피리딘-2-일)아미노]-1,4-나프토퀴논의 제조Preparation of 2-chloro-3-[(5-methylpyridin-2-yl) amino] -1,4-naphthoquinone
4-시아노-아닐린 대신에 2-아미노-5-메틸피리딘 0.5g을 사용하여 5시간 동안 반응시키는 것을 제외하고는 실시예 1-(2)와 동일한 방법에 따라 반응을 수행하여 적황색 플레이트상 물질로서 목적하는 표제화합물 0.99g(수율 76%)을 수득하였다.The reaction was carried out in the same manner as in Example 1- (2) except that the reaction was carried out for 5 hours using 0.5 g of 2-amino-5-methylpyridine instead of 4-cyano-aniline to give a red yellow plate-like material. As the title compound, 0.99 g (yield 76%) of the title compound was obtained.
융점 : 260-261℃Melting Point: 260-261 ℃
본 발명에 따르는 일반식(Ⅰ)의 2-클로로-3-아릴아미노-1,4-나프토퀴논 유도체의 혈소판 응집억제 효과는 이하의 실험예에 의해 명백히 입증되었다. 이하의 실험예에서 본 발명에 따른 화합물로는 실시예 1에서 제조된 2-클로로-3-[(4-시아노페닐)-아미노]-1,4-나프토퀴논(이하에서는 NQ0-Y15라 약칭함)을 사용하였다.The platelet aggregation inhibitory effect of the 2-chloro-3-arylamino-1,4-naphthoquinone derivative of the general formula (I) according to the present invention was clearly demonstrated by the following experimental example. In the following experimental examples, the compound according to the present invention is 2-chloro-3-[(4-cyanophenyl) -amino] -1,4-naphthoquinone (hereinafter referred to as NQ0-Y15) prepared in Example 1. Abbreviated).
[실험예 1]Experimental Example 1
혈소판 활성화물질의 혈소판 응집능에 대한 억제효과의 측정Determination of Inhibitory Effect on Platelet Aggregation Capacity of Platelet Activators
(1) 혈소판을 다량 함유하는 혈장과 세정 혈소판의 조제 :(1) Preparation of plasma and washed platelets containing a large amount of platelets:
나트륨시트레이트(최종농도 0.38%)를 미리 넣어 둔 주사기를 이용하여 랫트의 복대동맥으로부터 채혈하여 얻은 혈액을 상온에서 160xg으로 15분 동안 원심분리시켜 상등액으로서 혈소판을 다량 함유하는 혈장을 수득하였다. 혈소판을 다량 함유하는 혈장을 1500xg으로 15분 동안 다시 원심분리시켜 얻은 침전을 2mM 에틸렌디아민 테트라아세트산을 포함하는 세척용 완충액(129mM 염화나트륨, 0.8mM 제이인산칼륨, 8.9mM 탄산나트륨, 2.8mM 염화칼륨, 0.8mM 염화마그네슘, 5.6mM 글루코즈, 10mM N-[2-하이드록시에틸]-피페라진-N'-[2-에탄설폰산]. 완충액의 산도 pH 7.4)으로 3회 세척하여 혈장내의 단백질, 칼슘 등을 제거한 후에 0.35% 소혈청 알부민(bovine serum albumin)이 함유된 변형된 타이로드 완충액(129mM 염화나트륨, 0.8mM 제이인산칼륨, 8.9mM 탄산나트륨, 2.8mM 염화칼륨, 0.8mM 염화마그네슘, 5.6mM 글루코즈, 10mM N-[2-하이드록시에틸]-피페라진-N'-[2-에탄설폰산]. 완충액의 산도 pH 7.4)에 조심스럽게 재현탁시켜 세정 혈소판을 조제하였다.Blood obtained from the rat abdominal aorta using a syringe preloaded with sodium citrate (final concentration 0.38%) was centrifuged at 160xg for 15 minutes at room temperature to obtain plasma containing a large amount of platelets as supernatant. The precipitate obtained by centrifuging the platelet-rich plasma for 15 minutes again at 1500xg was collected in a wash buffer containing 2 mM ethylenediamine tetraacetic acid (129 mM sodium chloride, 0.8 mM potassium diphosphate, 8.9 mM sodium carbonate, 2.8 mM potassium chloride, 0.8 mM). Magnesium chloride, 5.6 mM glucose, 10 mM N- [2-hydroxyethyl] -piperazine-N '-[2-ethanesulfonic acid] washed three times with pH 7.4 Modified Tyrode buffer (129 mM sodium chloride, 0.8 mM potassium phosphate, 8.9 mM sodium carbonate, 2.8 mM potassium chloride, 0.8 mM magnesium chloride, 5.6 mM glucose, 10 mM N-) after removal with 0.35% bovine serum albumin [2-Hydroxyethyl] -piperazine-N '-[2-ethanesulfonic acid] The washed platelets were prepared by carefully resuspending in pH 7.4) of the buffer solution.
(2) 혈소판 응집능의 측정 :(2) Measurement of platelet aggregation ability:
본 실험에서 혈소판 응집능은 본(Born) 등의 방법(참조 : Born, G. V. R., Nature, 194, 927, 1962)에 따라 혈소판 응집능 측정기(Chronolog사 ; 펜실바니아 하버타운 소재)를 이용하여 탁도의 변화에 따른 빛의 통과 정도의 변화를 측정함으로써 판정하였다. 혈소판이 거의 없는 혈장의 경우에 나타나는 빛의 통과 정도를 대조로 하여 상기 (1)에서 조제된 혈소판을 다량 함유하는 혈장 495μl를 표면이 실리콘으로 처리된 응집 검출계(aggregometer)용 큐벳에 넣고 이 큐벳을 37℃로 온도가 유지되고 있는 큐벳용 채널에 꽂아 30초 동안 유지시킴으로써 전처리한 후에 디메틸설폭사이드에 용해시킨 본 발명에 따른 화합물 NQ-Y15 2.5μl(최종농도 10-4M)를 가하고 다시 37℃에서 8분 동안 반응시킨 후에 트롬빈 2.5μl(최종농도 0.5U/ml)를 첨가하여 나타나는 빛의 통과정도의 변화를 30분 동안 측정하였다. 또한 타이로드 완충액의 경우에 나타나는 빛의 통과정도를 대조로 하여 상기 (1)에서 조제된 세정 혈소판 495μl를 37℃에서 30초 동안 상기에서와 동일한 방법으로 전처리한 후에 디메틸설폭사이드에 용해시킨 본 발명에 따른 화합물인 NQ-Y15 2.5μl를 가하고 다시 37℃에서 8분 동안 반응시킨 후에 2.5μl의 혈소판 활성화물질들(트롬빈 0.1U/ml, 콜라겐 10μg/ml, 또는 하기 구조식으로 표시되는 칼슘이오노포어 A23187 2μM)을 가하여 혈소판의 응집을 유발시키고 10분 동안 나타나는 빛의 통과 정도의 변화를 측정하였다.In this experiment, platelet aggregation ability was changed by using a platelet aggregation ability measuring instrument (Chronolog, Harbortown, PA) according to the method of Born, GVR, Nature, 194, 927, 1962. It was determined by measuring the change in the degree of passage of light. Plasma 495μl plasma containing a large amount of platelets prepared in the above (1) was placed in a silicon-coated agglomerate cuvette, in contrast to the degree of light passing in the case of little platelets. After pretreatment by inserting into a cuvette channel maintained at 37 ° C. for 30 seconds, 2.5 μl of the compound NQ-Y15 (final concentration 10 −4 M) dissolved in dimethyl sulfoxide was added again. After the reaction for 8 minutes at ℃ was added 2.5μl thrombin (final concentration 0.5U / ml) was measured for 30 minutes the change in the degree of light passing through. In addition, 495 μl of the washed platelets prepared in the above (1) were pretreated in the same manner as described above for 30 seconds at 37 ° C, and then dissolved in dimethyl sulfoxide in contrast to the degree of light passing through the tie rod buffer solution. 2.5 μl of NQ-Y15, a compound according to the present invention, was reacted at 37 ° C. for 8 minutes, and then 2.5 μl of platelet activating substances (thrombin 0.1 U / ml, collagen 10 μg / ml, or calcium ionophore represented by the following structural formula). A23187 2 μM) was added to induce platelet aggregation and to measure the change in the extent of light passage over 10 minutes.
실험결과는 혈소판 활성화물질만을 처리한 경우에 나타나는 빛의 통과 정도를 응집이 100% 나타난 것으로 하여 각 경우의 빛의 통과정도를 상대적인 비율로 계산함으로써 판단하였다.The experimental results were determined by calculating the degree of light passing in each case as a relative ratio, indicating that 100% of light passing through the platelet activator was treated.
상기 실험의 결과는 제1도 내지 제3도에 나타내었다. 제1도 내지 제3도에 도시된 결과로부터 알 수 있는 바와 같이, 혈소판 활성화물질인 트롬빈, 콜라겐, A23187에 의한 세정 혈소판의 응집능에 대한 본 발명 화합물 NQ-Y15의 효과는 각각의 경우에 농도 의존적으로 나타났는데, 즉 각각의 혈소판 활성화물질에 의한 혈소판의 응집능을 50% 감소시키는 NQ-Y15의 농도는 트롬빈(0.1U/ml)의 경우에 약 38μM(제1도), 콜라겐(10μg/ml)의 경우에 약 7μM(제2도), A23187(2μM)의 경우에 약 100μM(제4도)인 것으로 나타났다. 따라서, 본 발명 화합물은 다양한 혈소판 활성화물질들에 의한 혈소판의 응집능을 농도 의존적으로 억제시키는 것으로 확인되었다.The results of the experiment are shown in FIGS. 1 to 3. As can be seen from the results shown in FIGS. 1 to 3, the effect of the compound NQ-Y15 of the present invention on the aggregation ability of the washed platelets by the platelet activators thrombin, collagen, A23187 is concentration dependent in each case. In other words, the concentration of NQ-Y15, which reduces the aggregation ability of platelets by each platelet activator by 50%, is about 38 μM (FIG. 1) for collagen (10 μg / ml) for thrombin (0.1 U / ml). ) Was about 7 μM (Figure 2) and A23187 (2 μM) was about 100 μM (Figure 4). Thus, the compounds of the present invention have been found to inhibit the aggregation ability of platelets by various platelet activators in a concentration dependent manner.
[실험예 2]Experimental Example 2
5-[14C]-세로토닌 분비억제 효과의 측정Determination of 5- [ 14 C] -Serotonin Secretion Inhibitory Effect
혈소판은 다른 세포들에 비해 밀집과립, 알파과립, 라이소좀 등과 같은 많은 과립을 함유하고 있으며, 각각의 과립에는 생리학적으로 매우 유용한 물질들이 저장되어 있다. 어떤 자극에 의해 혈소판이 활성화되면 과립에 저장된 물질들은 세포외유출 현상에 의해 세포밖으로 분비된다. 특히 밀집과립에는 아데노신 디포스페이트(ADP), 아데노신트리포스페이트(ATP) 등의 아데닌 뉴클레오타이드, 칼슘 및 세로토닌 등이 저장되어 있어, 혈소판이 응집될 때 유리되어 비가역적인 2차 응집작용을 유발하게 된다. 즉, ADP, 트롬빈 등으로 응집을 유도한 경우의 비가역적인 2차 응집반응이 이러한 과립분비로 인한 결과라고 할 수 있다. 따라서, 과립으로부터 이러한 생리활성물질중의 하나인 세로토닌의 분비에 미치는 본 발명 화합물의 영향을 측정함으로써 본 발명 화합물의 혈소판 응집억제 효과를 확인하기 위하여 다음과 같은 실험을 수행하였다.Platelets contain many granules such as dense granules, alpha granules, lysosomes, etc., compared to other cells, and each granule stores physiologically useful substances. When platelets are activated by a stimulus, the substances stored in the granules are secreted out of the cells by extracellular leakage. In particular, dense granules store adenine nucleotides such as adenosine diphosphate (ADP) and adenosine triphosphate (ATP), calcium, and serotonin, which are released when platelets are aggregated to cause irreversible secondary aggregation. That is, the irreversible secondary aggregation reaction in the case of inducing aggregation with ADP, thrombin, etc. can be said to be a result of the granule secretion. Therefore, the following experiment was carried out to determine the effect of the platelet aggregation inhibitory effect of the compound of the present invention by measuring the effect of the compound of the present invention on the secretion of serotonin, one of such bioactive substances from granules.
후저(Huzoor) 등의 방법(참조 : Huzoor-Akbar, Patel, S., Kokrady, S., Witiak, D.T., Newman, H.A.I. and Feller, D.R., Biochem. Pharmacol. 30, 2013-2020, 1981)에 따라 [14C]-세로토닌이 부하된 혈소판을 이용하여 본 발명 화합물의 세로토닌 분비억제 효과를 측정하였다. 즉, 세정혈소판에 5-[14C]-세로토닌을 가하여 37℃에서 30분 동안 배양한 후에 세척용 완충액(129mM 염화나트륨, 0.8mM 제이인산칼륨, 8.9mM 탄산나트륨, 2.8mM 염화칼륨, 0.8mM 염화마그네슘, 5.6mM 글루코즈, 10mM N-[2-하이드록시에틸]-피페라진-N'-[2-에탄설폰산], 완충액의 산도 pH 7.4)을 이용하여 세척하고 0.35% 소혈청 알부민이 함유된 변형된 타이로드 완충액(129mM 염화나트륨, 0.8mM 제이인산칼륨, 8.9mM 탄산나트륨, 2.8mM 염화칼륨, 0.8mM 염화마그네슘, 5.6mM 글루코즈, 10mM N-[2-하이드록시에틸]-피페라진-N'-[2-에탄설폰산], 산도 pH 7.4)에 재현탁시켜 세포수를 조정하였다. 2μM 이미프라민을 가하여 분비된 세로토닌의 재흡수를 차단시키고 본 발명 화합물인 NQ-Y15를 가한 후에 37℃에서 8분 동안 반응시키고 혈소판 활성화 물질들(트롬빈 또는 콜라겐)을 가하였다. 4mM 에틸렌디아민테트라아세트산, 10mM 포름알데히드를 가하여 반응을 정지시킨 후에 상온에서 12,000xg으로 2분 동안 원심분리시키고, 상등액을 취하여 분비된 5-[14C]-세로토닌의 방사선량을 측정하였다. 측정된 결과는 제4도 및 제5도에 나타내었다.According to Huzoor et al. (See Huzoor-Akbar, Patel, S., Kokrady, S., Witiak, DT, Newman, HAI and Feller, DR, Biochem.Pharmacol. 30, 2013-2020, 1981) Serotonin secretion inhibitory effect of the compound of the present invention was measured using platelets loaded with [ 14 C] -serotonin. That is, 5- [ 14 C] -serotonin was added to the washed platelets, followed by incubation at 37 ° C. for 30 minutes, followed by washing buffer (129 mM sodium chloride, 0.8 mM potassium diphosphate, 8.9 mM sodium carbonate, 2.8 mM potassium chloride, 0.8 mM magnesium chloride, Modified with 5.6 mM glucose, 10 mM N- [2-hydroxyethyl] -piperazine-N '-[2-ethanesulfonic acid], pH pH 7.4) of buffer and containing 0.35% bovine serum albumin Tyrode buffer (129 mM sodium chloride, 0.8 mM potassium diphosphate, 8.9 mM sodium carbonate, 2.8 mM potassium chloride, 0.8 mM magnesium chloride, 5.6 mM glucose, 10 mM N- [2-hydroxyethyl] -piperazine-N '-[2- Ethanesulfonic acid] and acidity pH 7.4) to adjust the cell number. 2 μM imipramine was added to block the resorption of secreted serotonin and after addition of the compound of the present invention, NQ-Y15, the reaction was carried out at 37 ° C. for 8 minutes and platelet activating substances (thrombin or collagen) were added. After stopping the reaction by adding 4 mM ethylenediaminetetraacetic acid and 10 mM formaldehyde, the mixture was centrifuged at 12,000 × g for 2 minutes at room temperature, and the supernatant was taken to measure the radiation dose of 5- [ 14 C] -serotonin secreted. The measured results are shown in FIGS. 4 and 5.
제4도 및 제5도에 도시된 결과로부터 알 수 있는 바와 같이, 제1도 및 제2도에서 확인된 것으로서 혈소판 활성화물질들에 의해 유도되는 혈소판 응집능을 억제하는 농도범위에서 본 발명 화합물인 NQ-Y15는 트롬빈(제4도) 및 콜라겐(제5도)에 의해 증가되는 세로토닌 분비를 억제하였다. 따라서, 본 발명에 따르는 화합물은 활성화된 혈소판에서 응집능을 증폭시키는 효과가 있는 물질들이 밀집과립으로부터 유리되는 것을 억제시키는 기전을 통하여 혈소판의 응집능을 저하시키는데 기여하는 것으로 판단된다.As can be seen from the results shown in FIGS. 4 and 5, the compounds of the present invention in the concentration range of inhibiting platelet aggregation ability induced by platelet activators as identified in FIGS. NQ-Y15 inhibited serotonin secretion increased by thrombin (FIG. 4) and collagen (FIG. 5). Therefore, the compounds according to the present invention are believed to contribute to lowering the aggregation ability of platelets through the mechanism of inhibiting the release of dense granules of substances that have the effect of amplifying the aggregation ability in activated platelets.
[실험예 3]Experimental Example 3
트롬복산 A2생성능에 대한 억제효과의 측정Determination of Inhibitory Effect on Thromboxane A 2 Formation
문헌[Ko, F. N.,Sheu, S. J., Liu, Y. M. Huang, T. F, and Teng, C.M., Inhibition of rabbit platelet aggregation by 1,4-naphthoquinones. Thromb. Res. 57, 453-463, 1990]에 기술된 방법에 따라 다음과 같이 트롬복산 A2의 생성능을 측정하였다. 0.5ml의 세정 혈소판(3×108혈소판/ml)이 담긴 플라스틱 큐벳에서 37℃를 유지시키면서 실험을 수행하였다. 먼저 세정 혈소판을 본 발명 화합물인 NQ-Y15로 8분간 전처리한 후에 콜라겐을 가하였다. 5분 동안 배양한 후에 2mM 에틸렌디아민테트라아세트산과 50μM 인도메타신을 가하여 반응을 정지시켰다. 상온에서 12,000xg으로 2분 동안 원심분리시킨 후에 상등액을 취하여 -20℃에서 보관하였다. 트롬복산 A2는 불안정한 구조를 가지고 있기 때문에 곧바로 안정된 형태인 트롬복산 B2로 변하므로, 트롬복산 B2의 생성을 트롬복산 A2생성의 지표로 하여 방사면역검정법으로 측정했다. 측정된 결과는 다음 표 1에 나타내었다.Ko, FN, Shiu, SJ, Liu, YM Huang, T. F, and Teng, CM, Inhibition of rabbit platelet aggregation by 1,4-naphthoquinones. Thromb. Res. 57, 453-463, 1990], the production capacity of thromboxane A 2 was measured as follows. Experiments were performed at 37 ° C. in a plastic cuvette containing 0.5 ml of washed platelets (3 × 10 8 platelets / ml). First, washed platelets were pretreated with NQ-Y15, a compound of the present invention, for 8 minutes, and then collagen was added. After incubation for 5 minutes, 2mM ethylenediaminetetraacetic acid and 50μM indomethacin were added to stop the reaction. After centrifugation at 12,000xg for 2 minutes at room temperature, the supernatant was taken and stored at -20 ° C. Since thromboxane A 2 has an unstable structure, it immediately changes to a stable form of thromboxane B 2. Therefore, the production of thromboxane B 2 was measured by radioimmunoassay as an index of thromboxane A 2 formation. The measured results are shown in Table 1 below.
상기 표 1에 기재된 결과로부터 알 수 있는 바와 같이 콜라겐 처리에 의해 현저히 증가되는 트롬복산 A2가 본 발명에 따르는 NQ-Y15를 50μM, 30μM 농도로 전처리한 경우에 각각 86.35%, 15.54% 의 유의적인 억제효과를 나타냈다. 따라서, 본 발명의 화합물은 활성화된 혈소판에서 분비되어 혈소판의 활성화를 증폭시키는 효과가 있는 트롬복산 A2의 합성능을 억제시키는 기전을 경유하여 혈소판의 응집억제에 기여하는 것으로 판단된다.As can be seen from the results shown in Table 1 above, when thromboxane A 2 markedly increased by collagen treatment was pretreated with NQ-Y15 according to the present invention at a concentration of 50 μM and 30 μM, respectively, 86.35% and 15.54% were significant. Inhibitory effect was shown. Therefore, the compounds of the present invention are believed to contribute to the inhibition of aggregation of platelets via a mechanism that inhibits the synthesis ability of thromboxane A 2 , which is secreted from activated platelets and has an effect of amplifying the activation of platelets.
[실험예 4]Experimental Example 4
젖산 탈수소효소 유출실험Lactic Acid Dehydrogenase Leakage Experiment
젖산 탈수소효소(lactic acid dehydrogenase : LDH)는 혈소판의 세포질내에 존재하는 효소로서 혈소판막이 손상되거나 세포용해현상 등의 세포독성이 유발되면 세포외액으로 유출되게 된다. 따라서, 본 발명의 화합물로 전처리한 후에 유출된 젖산 탈수소효소를 정량함으로써 본 발명 화합물의 세포독성 유발여부를 확인하고자 하였다.Lactic acid dehydrogenase (LDH) is an enzyme that exists in the cytoplasm of platelets and is leaked to extracellular fluid when cytotoxicity such as platelet membrane damage or cytolysis occurs. Therefore, the pretreatment with the compound of the present invention was performed to quantify the leakage of lactic acid dehydrogenase was to determine whether the cytotoxicity of the compound of the present invention.
세정 혈소판에 본 발명 화합물인 NQ-Y15를 용해시키는 용매인 디메틸설폭사이드(DMSO)(대조군), NQ-Y15, 또는 세포막을 붕해시키는 작용을 하는 트리톤(Triton) X-100(0.1%)을 가한 후에 상온에서 12,000xg으로 2분 동안 원심분리시킨 후에 상등액을 분리하였다. 분리된 상등액에 젖산 탈수소효소 측정시약인 LD-L10R(Sigma사)을 가하고, 자동으로 젖산 탈수소효소를 정량할 수 있는 자동화 임상화학분석기(automated clinical chemistry analyzer) SBA300(Gilford사)을 이용하여 유출된 젖산 탈수소효소를 정량하였다. 측정된 결과는 다음 표 2에 나타내었다.To the washed platelets, dimethyl sulfoxide (DMSO) (control group), NQ-Y15, or Triton X-100 (0.1%), which disintegrates the cell membrane, was added. After centrifugation at 12,000xg for 2 minutes at room temperature, the supernatant was separated. Lactate dehydrogenase measurement reagent LD-L10 R (Sigma) was added to the separated supernatant, and it was leaked using an automated clinical chemistry analyzer SBA300 (Gilford) that can automatically quantify lactate dehydrogenase. Lactic acid dehydrogenase was quantified. The measured results are shown in Table 2 below.
상기 표 2에 나타난 바와 같이 본 발명에 따르는 화합물인 NQ-Y15는 혈소판의 응집능을 완전히 억제시키는 농도인 0.1mM 농도로 전처리하여 120분 동안 처리한 경우에도 LDH의 농도에 있어서 대조군과 유의적인 차이를 나타내지 않았다. 따라서, NQ-Y15는 고농도에서도 세포독성을 일으키지 않는 것으로 확인되었다.As shown in Table 2, NQ-Y15, which is a compound according to the present invention, was significantly different from the control group in the LDH concentration even after pretreatment at a concentration of 0.1 mM which is a concentration that completely inhibits platelet aggregation ability for 120 minutes. Not shown. Therefore, it was confirmed that NQ-Y15 does not cause cytotoxicity even at high concentrations.
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| US8697680B2 (en) | 2008-09-05 | 2014-04-15 | Ramot At Tel Aviv University Ltd. | Naphthoquinone derivatives useful for prevention of amyloid deposits and treatment of diseases involving amyloidogenesis |
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1994
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