KR100350737B1

KR100350737B1 - 2-클로로-3-페닐아미노-5-히드록시-1,4-나프탈렌디온 유도체

Info

Publication number: KR100350737B1
Application number: KR1019990015325A
Authority: KR
Inventors: 유충규; 윤여표; 김대경; 이수환; 박종범
Original assignee: 삼아약품 주식회사
Priority date: 1999-04-29
Filing date: 1999-04-29
Publication date: 2002-08-28
Also published as: KR20000067477A

Abstract

본 발명은 혈소판응집 억제작용을 가지는 상기 일반식(I)의 신규한 2-클로로-3-페닐아미노-5-히드록시-1,4-나프탈렌디온 유도체, 그의 제조방법 및 그를 유효성분으로 포함하는 혈소판응집 억제제에 관한 것이다.

상기 식에서,

R₁, R₂, R₃는 서로 같거나 다른 수소(H), 플루오르(F), 클로로(Cl), 브롬(Br), 아세트(CH₃CO)기, 니트로(NO₂)기, 트리플루오로메틸(CF₃)기 또는 에틸카르복시(C₂H₅OCO)기를 나타낸다.

본 발명은 2-클로로-3-페닐아미노-5-히드록시-1,4-나프탈렌디온 유도체 및 그의 제조방법을 제공하며, 본 발명에 의한 2-클로로-3-페닐아미노-5-히드록시-1,4-나프탈렌디온 유도체는 혈소판 응집억제 작용을 가지고 있어, 임상적으로 유용한 혈소판응집 억제제로 사용할 수 있다.

Description

2-클로로-3-페닐아미노-5-히드록시-1,4-나프탈렌디온 유도체{2-Chloro-3-phenylamino-5-hydroxy-1,4-naphthalenedione Derivatives}

본 발명은 신규한 2-클로로-3-페닐아미노-5-히드록시-1,4-나프탈렌디온 유도체에 관한 것이다. 좀 더 구체적으로, 본 발명은 혈소판응집 억제작용을 가지는 하기 일반식(I)의 신규한 2-클로로-3-페닐아미노-5-히드록시-1,4-나프탈렌디온 유도체, 그의 제조방법 및 그를 유효성분으로 포함하는 혈소판응집 억제 및 혈전증 치료제에 관한 것이다.

상기 식에서,

혈소판은 혈액 구성세포들 중에서 적은 부분을 차지하지만 미세한 자극에 대해서도 쉽게 반응을 나타내며, 혈액응고 작용 등 체내 항상성 유지에 중요한 기능을 담당하고 있다. 또한, 혈소판의 기능 변화에 의해 유발되는 혈소판 응집능의 이상은 지혈기전 이상을 일으키거나 미소순환장애를 일으키게 된다. 특히, 현대사회에서 급격히 발병이 증가되고 있는 고혈압, 동맥경화 등의 성인병과 당뇨병 등의 대사성 질환에서 빈번히 나타나는 혈액장애 역시, 그 주된 요인은 혈소판 응집능의 이상적 항진에 의한 것으로 보고되고 있어, 혈소판 기능을 정상화시킴으로써 이러한 관련질환을 치료 또는 예방할 수 있을 것으로 예상되고 있다.

한편, 혈전(thrombus)의 생성은 혈관 손상으로 인한 출혈시 혈소판이 활성화되어 점착 및 응집이 일어나는 것을 지혈시켜 생체를 보호하는 자연 방어수단이다. 그러나, 노화 등의 병적인 요인에 의해 과도하게 혈소판이 활성화되어 혈관내 응집이 일어나는 경우, 혈전증(thrombosis)을 유발하여 혈액순환에 장해를 주어 심근경색증, 동맥경화증, 고혈압, 당뇨병 등의 성인병의 주요인이 된다. 따라서, 혈전증을 예방하기 위한 혈소판응집억제제 개발에 많은 연구가 이루어져 왔다.

일반적으로, 1,4-나프탈렌디온 유도체는 항응고 작용, 항혈소판 작용, 항균 작용, 항진균 작용 등의 다양한 약리학적 작용을 가지고 있어, 항균제 등과 같은 신의약품의 개발을 위한 중요한 물질로 활용되고 있다.

여러 연구자들의 연구결과에 따르면, 1,4-나프탈렌디온 유도체인 비타민 K₃(메나디온)가 인간 혈소판의 응집작용을 억제하는데 효과가 있다고 보고되어 있으나, 그 작용기전은 아직 명확하지 않은 것으로 알려져 있다(참조: Blackwell, G. J., et al., Thromb. Res., 37, 103-114, 1985).

한편, 2-클로로-3-메틸-1,4-나프탈렌디온(CMN)이 토끼의 혈소판응집반응을 억제시키는 것으로도 밝혀졌는데, 이는 다양한 혈소판 활성화물질(agonist)들에 의한 인지질의 대사과정을 2-클로로-3-메틸-1,4-나프탈렌디온이 억제시키기 때문에 나타나는 것으로 보고되어 있다(참조: Ko, F. N.,et al., Thromb. Res., 57, 453-463, 1990). 또한, 5,8-디히드록시-1,4-나프탈렌디온 유도체(시코닌 유도체)는 혈소판응집반응을 억제시키는 것으로 밝혀졌으며(참조: C.A. Vol. 105, 743p, 226090C; JP(Sho) 61-143,334), 2-알킬/아릴카르복시아미도-3-클로로-1,4-나프탈렌디온도 우수한 혈소판 응집 억제작용을 나타내고(참조: Lien, J. C., et al., Chem. Pharm. Bull., 44(6), 1181-1187, 1996; Lien, J. C., Huang, et al., Bioorg. Med. Chem., 5(12), 2111-2120, 1997), 2-클로로-3-(N-4-시아노페닐-아미도)-1,4-나프탈렌디온은 혈소판 응집에 있어서 가장 중요한 역할을 하고 있는 트롬복산(thromboxane A2) 생성 및 과립방출을 억제함으로써 혈소판 응집억제 효과를 나타내는 것으로 알려져 있다(참조: Chang, T. S., et al., Biochem. Pharmacol.,54, 259-268, 1997).

이에, 본 발명자들은 혈소판응집억제 효과를 나타내는 새로운 화합물을 개발하고자 예의 노력한 결과, 신규한 1,4-나프탈렌디온 유도체인 2-클로로- 3-페닐아미노-5-히드록시-1,4-나프탈렌디온의 다양한 유도체를 합성하고, 전기물질 들이 탁월한 혈소판응집억제 효과를 나타냄을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

결국, 본 발명의 주된 목적은 2-클로로-3-페닐아미노-5-히드록시-1,4-나프탈렌디온 유도체를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 전기 2-클로로-3-페닐아미노-5-히드록시-1,4-나프탈렌디온 유도체의 제조방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 2-클로로-3-페닐아미노-5-히드록시-1,4-나프탈렌디온 유도체를 유효성분으로 함유하는 혈전증 치료제 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명은 혈소판응집억제 효과를 나타내는 2-클로로-3-페닐아미노-5-히드록시-1,4-나프탈렌디온 유도체(I)에 관한 것이다.

상기 식에서,

R₁, R₂, R₃는 서로 같거나 다른 수소(H), 플루오르(F), 클로로(Cl), 브롬(Br), 아세트(CH₃CO)기, 니트로(NO₂)기, 트리플루오로메틸(CF₃)기, 또는 에틸카르복시(C₂H₅OCO)기를 나타낸다.

본 발명에 따르는 일반식(I)로 표시되는 화합물의 구체적인 예로서는,

(1) 2-(4-아세토페닐)-아미노-3-클로로-5-히드록시-1,4-나프탈렌디온(이하, 'PRCK121'이라 함);

(2) 2-(4-클로로-3-니트로페닐)-아미노-3-클로로-5-히드록시-1,4-나프탈렌디온(이하, 'PRCK140'이라 함);

(3) 2-(4-트리플루오로메톡시페닐)-아미노-3-클로로-5-히드록시-1,4-나프탈렌디온(이하, 'PRCK144'라 함);

(4) 2-(2-트리플루오로메톡시페닐)-아미노-3-클로로-5-히드록시-1,4-나프탈렌디온(이하, 'PRCK145'라 함);

(5) 2-(4-메틸-3-니트로페닐)-아미노-3-클로로-5-히드록시-1,4-나프탈렌디온(이하, 'PRCK163'이라 함);

(6) 2-(4-에틸카르복실페닐)-아미노-3-클로로-5-히드록시-1,4-나프탈렌디온 (이하, 'PRCK169'라 함);

(7) 2-(2-클로로-4-브로모페닐)-아미노-3-클로로-5-히드록시-1,4-나프탈렌디온(이하, 'PRCK174'라 함); 및,

(8) 2-(2-브로모-4-플루오로페닐)-아미노-3-클로로-5-히드록시-1,4-나프탈렌디온(이하, 'PRCK178'이라 함)

등을 들 수 있다.

본 발명의 신규한 2-클로로-3-페닐아미노-5-히드록시-1,4-나프탈렌디온 유도체(I)는 화합물(II)의 2,3-디클로로-5-히드록시-1,4-나프탈렌디온을 일반식(III)의 각각 아민과 반응시킴으로써 제조할 수 있다.

상기 식에서,

R₁, R₂, R₃는 상기에서 정의한 바와 같다.

본 발명의 제조방법에서 출발물질로 사용된 화합물(Ⅱ)의 2,3-디클로로-5-히드록시-1,4-나프탈렌디온은 당해 기술분야에서 공지된 화합물이며, 5-히드록시-1,4-나프탈렌디온을 염소(Cl₂)가스와 반응시킴으로써 편리하게 제조할 수 있다. 일반식(III)의 각각 아민은 시판되는 것을 사용한다.

본 발명의 제조방법에 의하면, 화합물(Ⅱ)을 알콜 또는 디메틸설폭사이드 (DMSO) 용매 중에서 일반식(Ⅲ)의 알킬 또는 아릴아민 등의 아민 유도체와 반응시킴으로써, 일반식(I) 화합물을 제조한다. 이때, 용매로 사용되는 알콜로서는 메탄올, 에탄올 또는 이소프로판올 등과 같은 탄소수 1 내지 3개의 저급 알칸올이 바람직하나, 특히, 에탄올이 바람직하고, 반응온도는 일반적으로 실온 내지 100℃, 바람직하게는 사용된 용매의 비점에서 환류 하에 수행할 수 있다. 본 발명에서의 반응시간은 일반적으로 2 내지 6 시간, 바람직하게는 3 내지 5시간이다. 반응이 완결된 후에 수득된 일반식(I)의 화합물은 필요에 따라 통상적인 후처리 방법, 예를 들어, 재결정화 또는 크로마토그라피 등의 방법에 의해 분리 및 정제할 수 있다.

본 발명에 의한 일반식(I)의 화합물은 혈소판응집 억제작용을 가지고 있어 임상적으로 유용한 혈소판응집 억제제 및 혈전증 치료제로 사용할 수 있다.

혈소판 응집능은 혈소판 과립으로부터의 분비능, 혈소판 내의 아라키돈산 유리 및 대사 등의 과정에 따라 크게 영향을 받는 것으로 알려져 있다. 즉, 혈소판은 밀집과립(dense granule), 알파과립(α-granule), 라이소좀(lysosome) 및 퍼옥시좀(peroxisome) 등 다른 세포에 비하여 많은 과립을 함유하고 있으며, 각각의 과립에는 생리학적으로 매우 유용한 물질들이 저장되어 있다. 어떤 자극에 의해 혈소판이 활성화되면, 과립에 저장된 물질들이 세포 밖으로 분비된다. 특히, 밀집과립에는 ADP, ATP 등의 아데닌 뉴클레오타이드, 칼슘 및 세로토닌 등이 저장되어 있어, 혈소판이 응집될 때 유리되어 비가역적인 2차 응집작용을 유발하게 된다. 즉, ADP 또는 트롬빈 등으로 응집을 유도한 경우의 비가역적인 2차 응집반응은 이러한 과립 분비로 인한 결과라고 볼 수 있다. 또한, 혈소판 내의 아라키돈산 대사에 의해 생성된 트롬복산(thromboxane A₂)은 강력한 혈소판응집 유발물질로 알려져 있으며, 혈소판 응집반응에 있어서 중추적인 역할을 한다고 알려져 있다.

이하, 실시예를 통하여 일반식(I)로 표시되는 2-클로로-3-페닐아미노-5-히드록시-1,4-나프탈렌디온 유도체의 제조방법 및 혈소판응집 억제효과를 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: 화합물(II)의 제조

5-히드록시-1,4-나프탈렌디온 20g을 아세트산 200ml에 용해시키고, 생성된 용액에 염소(Cl₂) 가스 약 10g을 주입시킨 후, 실온에서 4시간 동안 진탕시켰다. 이어, 반응 혼합물을 얼음 500g에 붓고 생성된 침전을 여과하여 공기 중에서 건조시켰다. 침전물을 에탄올에 현탁시킨 후, 30분 동안 수욕 중에서 가열하고 실온에서 방치하여 목적으로 하는 2,3-디클로로-5-히드록시-1,4-나프탈렌디온(II) 25.0 g 을 수득하였다(수율 69%).

실시예 2: 화합물(I)의 제조

200ml 환저 플라스크 중에서 실시예 1에서 수득한 2,3-디클로로-5-히드록시-1,4-나프탈렌디온 1g을 95% 에탄올 수용액 50ml에 용해시키고, 여기에 각각 아민을 0.6ml을 가하였다. 이 반응혼합물을 3시간 동안 가열 하에 환류시켜 반응시켰다. 박층 크로마토그라피에 의해 반응의 종결을 확인한 후에 반응액을 냉각시켜 석출된 결정을 여과하고 에탄올로부터 재결정시켜 정제하여, 각각의 다음 목적하는 표제화합물 PRCK121, PRCK140, PRCK144, PRCK145, PRCK163, PRCK169, PRCK174 및 PRCK178을 수득하였다. 전기의 표제화합물에 대한 결과는 다음과 같다.

(1) 2-(4-아세토페닐)-아미노-3-클로로-5-히드록시-1,4-나프탈렌디온(PRCK 121):

m.p. 208-210℃ (dark brown powder); IR (KBr, cm^-1): 3300 (NH), 1640 (C=O), 1350 (SCOCH₃), 1590, 1450, 1350, 1220;¹H-NMR (DMSO-d₆): δ 2.65 (s, 3H, CH₃), 7.30-7.48 (4H, m, benzene ring), 7.70-7.85 (3H, m, 6,7,8 H), 9.80 (1H, s, NH), 12.36 (1H, s, OH); MS (m/z): 341(M⁺), 326 (M-15), 299, 292, 263, 262, 207, 206, 146, 120

(2) 2-(4-클로로-3-니트로페닐)-아미노-3-클로로-5-히드록시-1,4-나프탈렌디온(PRCK140):

m.p. 145-146℃ (bright brown powder); IR (KBr, cm^-1): 3300-2500 (OH), 3240 (NH), 1660 (C=O), 1430, 1270, 1220, 750;¹H-NMR (DMSO-d₆): δ 7.40-7.50 (3H, m, benzene ring), 7.80-7.90 (3H, m, 6,7,8 H), 10.02 (1H, s, NH), 12.90 (1H, s, OH); MS (m/z): 378 (M⁺), 377 (M-1), 343 (M-35), 331, 297, 296, 241, 207, 99

(3) 2-(4-트리플루오로메톡시페닐)-아미노-3-클로로-5-히드록시-1,4-나프탈렌디온(PRCK144):

m.p. 175-180℃ (dark brown powder); IR (KBr, cm^-1): 3220 (s, NH), 3300-2650 (s, OH), 1670 (s, C=O), 1500, 900, 800;¹H-NMR (DMSO-d₆): δ 7.20-7.30 (4H, m, benzene ring), 7.40-7.50 (3H, m, 6,7,8 H), 9.70 (1H, s, NH), 12.40 (1H, s, OH); MS (m/z): 383 (M⁺), 382 (M-1), 348 (M-35), 332, 298, 228, 207, 121

(4) 2-(2-트리플루오로메톡시페닐)-아미노-3-클로로-5-히드록시-1,4-나프탈렌디온(PRCK145):

m.p. 94℃ (yellow brown powder); IR (KBr, cm^-1): 3210 (s, NH), 1670 (s, C=O), 1630, 1440, 1320, 1200, 890, 730;¹H-NMR (DMSO-d₆): δ 7.50-7.73 (4H, m, benzene ring), 7.80-7.90 (3H, m, 6,7,8 H), 9.70 (1H, s, NH), 12.00 (1H, s, OH); MS (m/z): 367 (M⁺), 332 (M-35), 312, 280, 276, 241, 207, 179, 157, 87

(5) 2-(4-메틸-3-니트로페닐)-아미노-3-클로로-5-히드록시-1,4-나프탈렌디온 (PRCK163):

m.p. 192-194℃ (red powder); IR (KBr, cm^-1): 3300 (NH), 1680 (C=O),1620, 1550, 1480, 1370, 1230;¹H-NMR (DMSO-d₆): δ 3.42 (3H, s, CH₃), 7.40-7.50 (3H, m, benzene ring), 7.80 (3H, m, 6,7,8 H), 9.90 (1H, s, NH), 13.00 (1H, s, OH); MS (m/z): 358 (M⁺), 342 (M-15), 323 (M-35), 313, 311, 276, 89

(6) 2-(4-에틸카르복실페닐)-아미노-3-클로로-5-히드록시-1,4-나프탈렌디온 (PRCK169):

m.p. 242-245℃ (brown plate); IR (KBr, cm^-1): 3260 (NH), 2980 (-CH), 1720 (C=O), 1170, 1670 (S, COO), 1620, 1600, 1500, 1180, 700;¹H-NMR (DMSO-d₆): δ 1.41 (3H, t, J=7.5 Hz, CH₃), 4.40 (2H, Q, J=15 Hz COO-CH₂-), 7.20-7.60 (4H, m, benzene ring), 7.90-8.00 (3H, m, 6,7,8 H), 9.70 (1H, s, NH), 12.40 (1H, s, OH); MS (m/z): 371 (M⁺), 360, 326, 298, 290, 264, 263, 235, 207, 145

(7) 2-(2-클로로-4-브로모페닐)-아미노-3-클로로-5-히드록시-1,4-나프탈렌디온(PRCK174):

m.p. 93.5℃ (shining orange green powder); IR (KBr, cm^-1): 3856, 3366 (NH), 2366, 1203 (C-N), 889;¹H-NMR (DMSO-d₆): 6.82-7.50 (3H, m, benzenering), 7.53-7.92 (3H, m, C₆H₃OH), 11.48 (1H, s, OH); MS (m/z): 378 (M⁺), 376 (M-1), 242, 207

(8) 2-(2-브로모-4-플루오로페닐)-아미노-3-클로로-5-히드록시-1,4-나프탈렌디온(PRCK178):

m.p. 110.0℃ (dark orange powder); IR (KBr, ㎝^-1): 3857, 3315 (NH), 1494, 1204 (C-N), 733;¹H-NMR (DMSO-d₆): 6.88-7.41 (3H, m, benzene ring), 7.49-7.93 (3H, m, C₆H₃OH), 11.48 (1H, s, OH), 9.27 (1H, s, NH); MS (m/z): 397 (M⁺), 316 (M-80), 288

실시예 3: 혈소판 활성화물질의 혈소판응집능에 대한 억제효과의 측정

(1) 혈소판을 다량 함유하는 혈장과 세정 혈소판의 조제:

나트륨시트레이트(최종농도 0.38%)를 미리 넣어 둔 주사기를 이용하여, 혈소판 기능이 정상인 건강한 성인남자로 부터 얻은 혈액을 상온에서 160Xg 으로 15분 동안 원심분리시켜, 상등액으로부터 혈소판을 다량 함유하는 혈장을 수득하였다. 혈소판을 다량 함유하는 혈장을 1500Xg 으로 15분동안 다시 원심분리시켜 얻은 침전을 2mM 에틸렌디아민 테트라아세트산을 포함하는 세척용 완충액(129mM 염화나트륨, 0.8mM 제이인산칼륨, 8.9mM 탄산나트륨, 2.8mM 염화칼륨, 0.8mM 염화마그네슘, 5.6mM 글루코즈, 10mM N-[2-히드록시에틸]-피페라진-N'-[2-에탄설폰산], 완충액의 산도 pH 7.4)으로 3회 세척하여 혈장 내의 단백질 및 칼슘 등을 제거한 다음, 0.35% 소혈청알부민(bovine serum albumin)이 함유된 변형된 타이로드 완충액(129mM 염화나트륨, 0.8mM 제이인산칼륨, 8.9mM 탄산나트륨, 2.8mM 염화칼륨 0.8mM 염화마그네슘, 5.6mM 글루코즈, 10mM N-[2-히드록시에틸]피페라진-N'-[2-에탄설폰산], 완충액의 산도 pH 7.4)에 조심스럽게 재현탁시켜 세정 혈소판을 제조하였다.

(2) 혈소판 응집능의 측정:

혈소판 응집능은 본(Born) 등의 방법(참조: Born, G.V.R., Nature, 194, 927, 1962)에 따라 혈소판 응집능 측정기(Chronolog 사, U.S.A.)를 이용하여 탁도의 변화에 따른 빛의 통과 정도의 변화를 측정함으로써 판정하였다. 혈소판이 거의 없는 혈장의 경우에 나타나는 빛의 통과정도를 대조하여, 상기(1)에서 제조된 혈소판을 다량 함유하는 혈장 495㎕ 를 37℃에서 30초 동안 전처리한 다음, 디메틸설폭사이드에 용해시킨 본 발명에 따른 각각 화합물(최적농도 10^-4M)를 가하고 다시 37℃에서 8분 동안 반응시킨 다음, 트롬빈 2.5㎕(최종농도 0.5U/ml)를 첨가하여 나타나는 빛의 통과 정도의 변화를 10분 동안 측정하였다. 또한, 타이로드 완충액의 경우에 나타나는 빛의 정도를 대조로 하여, 상기(1)에서 조제된 세정 혈소판 495㎕를 37℃에서 30초동안 전처리한 다음, 디메틸설폭사이드에 용해시킨 본 발명에 따른 각각의 화합물 2.5㎕를 가하고, 다시 37℃에서 8분 동안 반응시켰다. 이어, 2.5㎕의 혈소판 활성화물질들(콜라겐 10μg/ml, 또는 ADP 2μM)을 가하여 혈소판의 응집을 유발시키고, 10분 동안 나타나는 빛의 통과 정도의 변화를 측정하였다. 실험결과는 혈소판 활성화물질만을 처리한 경우에 나타나는 빛의 통과 정도를 응집이 100% 나타난 것으로 하여, 각 경우의 빛의 통과정도를 상대적인 비유로 계산함으로써 판단하였다.

이때, 시험물질 대신 용매 0.02M 디메틸설폭사이드를 넣은 것을 대조군으로 하여, 대조군의 응집력을 100%로 잡고 약물의 농도별 억제율을 산출한 후, 각 시험물질의 50% 억제율인 IC₅₀값을 구하였다. 약물에 의해 혈소판응집이 억제되는 정도를 다음과 같이 계산하였다.

A - B

억제(inhibition) % = ----- X 100

A

A : 대조군 응집 (%)

B : 약물처치시의 응집 (%)

IC₅₀(혈소판응집을 50% 억제하는 약물의 농도)는 프로빗(Probit) 법에 의해계산하였다.

본 발명 화합물의 콜라겐 및 ADP으로 활성화된 혈소판 응집능에 대한 억제효과

시료	ADP 20μM	콜라겐 200 μg/ml
시료	응집능	억제율(%)	응집능	억제율(%)
PRCK121	22	78	95	5
PRCK140	16	84	14	86
PRCK144	6	94	11	89
PRCK145	1	99	11	89
PRCK163	45	55	75	25
PRCK169	66	66	7	93
PRCK174	9	84	8	90
PRCK178	12	80	7	92

본 발명 화합물의 ADP로 활성화된 혈소판 응집능에 대한 50% 억제율(IC₅₀)

화합물	IC₅₀(μM)
PRCK121PRCK140PRCK144PRCK145PRCK163PRCK169PRCK174PRCK178아스피린	41.527.229.441.837.416.225.226.3148.7

표 1과 표 2의 결과로부터 알 수 있는 바와 같이, 혈소판 활성화물질인 콜라겐, ADP에 의한 세정 혈소판의 응집능에 대한 본 발명 화합물 PRCK121, PRCK140, PRCK144, PRCK145, PRCK163, PRCK169, PRCK174 및 PRCK178의 효과는 각각의 경우에대조군보다 우수한 응집억제효과를 보여 주었으며(표 1), 각각의 혈소판 활성화물질에 의한 혈소판의 응집능을 50% 감소시키는 PRCK121, PRCK140, PRCK144, PRCK145, PRCK163, PRCK169, PRCK174 및 PRCK178의 각각의 농도는 41.5, 27.2, 29.4, 41.8, 37.4, 16.2, 25.2, 26.3μM인 것으로 나타나(표 2), 본 발명의 화합물은 모두 다양한 혈소판 활성화물질 들에 의한 혈소판의 응집능을 억제시키는 것으로 확인되었다.

실시예 4: 항혈전능 시험(antithrombosis test)

실험적 혈전의 유도는 디미노(Dimino) 등의 방법(참조: Dimino, G. and M.J. Silver., J. Pharmacol. Exp. Ther., 225, 57-60, 1983)에 준하여 실시하였다. 이때, 사용된 동물은 하룻밤을 절식시킨 몸무게 약 20 내지 25g 정도의 숫컷 ICR 생쥐였다. 혈전의 유발은 혈소판 응집시약(콜라겐, 에피네프린)을 꼬리정맥에 주사하여 폐의 미소혈관내에 혈전이 생성되도록 하였으며, 사용된 응집시약은 38.8μg의 콜라겐과 4.63μg의 에피네프린이 생리식염수 100㎕에 함유되도록 제조하였고, 생쥐당 200㎕의 용량으로 꼬리정맥에 27 게이지 니들을 사용해 주사하여, PRCK계열의 항혈전효과를 알아보기 위하여, 혈소판 응집시약의 정맥주사 1시간 전에 PRCK121(27 mg/kg, 135 mg/kg), PRCK140(26.7 mg/kg, 133.7 mg/kg)을 옥수수유에 현탁시켜 1ml씩 경구투여하였다. 대조군으로는 아스피린 20 mg/kg을 0.5% 카르복시메틸셀룰로즈(CMC)에 현탁시켜 경구투여하였다. PRCK계열의 항혈전효과는 혈소판 응집시약의 투여로 인하여 발생하는 생쥐 뒷다리의 마비나 죽음으로부터 보호된 실험동물의 숫자의 백분율로 계산하였으며, 여기서 마비는 15분이상 뒷다리의 기능을 상실하거나 떨림상태가 지속될 때를 기준으로 하였고, 유의성 검정은 X²-테스트를 사용하였다.

본 발명 화합물의 쥐의 폐혈전증에 미치는 효과^‡

시료	투여량(mg/kg)	죽거나 마비된 수/실험동물 수	% 보호율
대조군	0.5% CMC	18/21	-
아스피린	50	6/19^***	63.1
PRCK121	300	8/20^***	75.5
PRCK121	60	4/19^**	53.3
PRCK140	300	7/20^***	59.2
PRCK140	60	7/18^**	54.6

^‡PRCK121 및 PRCK140는 에피네프린(13.2 ㎍/mouse)과 콜라겐(114 ㎍/mouse)을 정맥주사하기 90분 전에 경구투여하였다.

대조군과의 유의차:^**P<0.01,^***P<0.001.

표 3의 결과로부터 알 수 있는 바와 같이, 대조군에서 쥐 21마리 중에서 18마리가 죽거나 마비되어 85.7%의 혈전유도가 일어났고, PRCK121 및 140 계열 투여군에서는 용량의존적으로 유의성있게 혈전유발 억제 효과가 있었다. PRCK121 경우에는 60mg/kg에서 53.3%, 300mg/kg에서 75.5%, PRCK140의 경우에는 60mg/kg에서 54.6%, 300mg/kg에서 59.2%의 억제 효과가 있었다. 반면에, 양성 대조인 아스피린의 경우에는 50mg/kg에서 63.1%의 억제 효과를 나타내었다.

실시예 5: 탈체(ex vivo)조건에서의 항혈소판 응집활성 시험

실험 동물은 하룻밤 절식시킨 몸무게 약 320 내지 440g 정도의 수컷 SD(Sprague-Dawley) 랫트를 사용했다. 각 군당 6 내지 9마리로 나누고, 시험물질과 아스피린을 0.5% CMC에 현탁시켜 1ml씩 경구투여하였다. 경구투여 1시간 후 에테르로 신속히 마취시켜 18게이지 니들을 사용해, 2.2% 나트륨시트레이트:혈액의 비율이 1:6(v/v)이 되도록 채혈한 다음, 150g, 10분간 원심분리하여 PRP(platelet rich plasma; 혈소판 풍부 혈장)를 제조하였다. 상등액을 취해 콜라겐과 ADP로 항혈소판 응집활성 시험을 실시하였다.

쥐의 혈소판 응집에 있어 본 발명화합물의 경구투여에 의한 억제효과^‡

시료	ADP (1.3μM)	콜라겐(32.79μg/ml)
시료	응집(%)	억제(%)	응집(%)	억제(%)
대조군	36±2	-	53±5	-
PRCK121	23±2^*	36^*	39±1^*	26^*
PRCK140	25±1^*	31^*	40±3^*	25^*

^‡본 발명화합물은 경구투여하였고, 혈소판응집은 ADP(1.3μM)이나 콜라겐(32.79μg/ml)에 의해 촉진되었다.

*: 대조군과의 유의차(p<0.01)

평균±표준편차, 군당 사용된 동물수: 5 내지 7

상기 실험의 결과는 표 4에 나타내었다. 표 4의 결과로부터 알 수 있듯이, 탈체(ex vivo)조건에서 혈소판응집 억제시험 결과, 대조군에서 있어서 ADP(1.3μM) 및 콜라겐(32.79μg/ml)에서 혈소판 응집 억제 효과를 나타내지 않았으나, PRCK121 및 140에서는, ADP의 경우에 36 및 31%의 혈소판 응집 억제효과가 일어났고, 콜라겐의 경우에는 26 및 25%의 혈소판 응집 억제 효과가 있었다.

따라서, 본 발명 화합물은 상기의 다양한 시험을 통하여 혈소판응집 억제작용을 가지고 있음이 확인되었다.

실시예 6: 급성 독성 시험

본 발명의 화합물을 유효량의 약 1,000배인 2850mg/kg의 양으로 10마리의 SD 랫트에 7일간 정맥투여하였으나, 사상예는 인정되지 않았다(표 5). 체중 측정 결과 시험물질 투여군은 수컷, 암컷 모두가 대조군에 비해 별다른 차이를 나타내지 않았다(표 6). 결과적으로, 본 발명품의 생쥐에 대한 급성 경구독성시험에서 상기의 일반 상태, 체중변화 및 부검 소견 등에는 별다른 독성은 관찰되지 않았다.

상술한 바와 같이, 본 발명에 따르는 일반식(I)의 목적 화합물은 혈소판 응집억제 작용을 나타내며, 따라서 임상적으로 유용한 혈소판응집 억제제 및 혈전증 치료제로 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 화합물(I)을 임상적으로 이용시에 이 활성화합물은 약제학적으로 허용되는 담체를 이용하여 통상적인 방법에 따라, 약제학적 분야에서 통상적인 제제, 예를 들면 정제, 캅셀제, 액제, 현탁제 등의 경구투여용 제제, 주사용 용액 또는 현탁액, 또는 주사시에 주사용 증류수로 재조제하여 사용할 수 있도록 되어 있는 즉시 사용형의 주사용 건조분말 등의 형태인 주사제, 연고제, 크림제, 액제 등의 국소적용형 제제 등의 다양한 제제로 제형화시켜 사용할 수 있다.

이러한 목적을 위해 사용되는 담체는 약제학적 분야에서 통상적인 것으로, 예를 들면 경구투여용 제제의 경우에는 결합제, 활탁제, 붕해제, 부형제, 가용화제, 분산제, 안정화제, 현탁화제, 색소, 향료 등이 있으며, 주사제의 경우에는 보존제, 무통화제, 가용화제, 안정화제 등이 있고, 국소투여용 제제의 경우에는 기제, 부형제, 윤활제, 보존제 등이 있다. 이렇게 제조된 약제학적 제제는 경구적으로 투여하거나, 비경구적으로, 예를 들면 정맥내, 피하, 복강내 투여 또는 국소 적용할 수 있다. 또한, 경구투여시에 약제가 위산에 의해 분해되는 것을 방지하기 위하여 제산제를 병용하거나, 정제 등의 경구투여용 제제를 장용피가 피복된 제제로 제형화하는 것이 바람직할 수도 있다.

본 발명에 있어서의 약제학적 제제의 투여량은, 치료 또는 예방대상 질병의 종류, 투여방법, 환자의 연령, 처리시간 등에 따라서 서로 다르지만, 정맥투여 및 근육투여의 경우 60kg 체중의 성인 1인당 1일 투여량은 유효성분을 기준으로 2.5 내지 100mg/kg의 범위내에서 정하며, 경구투여의 경우는 25 내지 500mg/kg의 범위내에서 정하도록 한다.

이상에서 상세히 설명하고 입증하였듯이, 본 발명은 2-클로로-3-페닐아미노-5-히드록시-1,4-나프탈렌디온 유도체 및 그의 제조방법을 제공한다. 본 발명에 의한 2-클로로-3-페닐아미노-5-히드록시-1,4-나프탈렌디온 유도체는 혈소판 응집억제작용을 가지고 있어, 임상적으로 유용한 혈소판응집 억제제 및 혈전증 치료제로 사용할 수 있다.

Claims

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다음 화합물로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 2-클로로-3-페닐아미노-5-히드록시-1,4-나프탈렌디온 유도체 화합물:

2-(4-아세토페닐)-아미노-3-클로로-5-히드록시-1,4-나프탈렌디온;

2-(4-클로로-3-니트로페닐)-아미노-3-클로로-5-히드록시-1,4-나프탈렌디온;

2-(4-트리플루오로메톡시페닐)-아미노-3-클로로-5-히드록시-1,4-나프탈렌디온;

2-(2-트리플루오로메톡시페닐)-아미노-3-클로로-5-히드록시-1,4-나프탈렌디온;

2-(4-메틸-3-니트로페닐)-아미노-3-클로로-5-히드록시-1,4-나프탈렌디온;

2-(4-에틸카르복실페닐)-아미노-3-클로로-5-히드록시-1,4-나프탈렌디온;

2-(2-클로로-4-브로모페닐)-아미노-3-클로로-5-히드록시-1,4-나프탈렌디온; 및,

2-(2-브로모-4-플루오로페닐)-아미노-3-클로로-5-히드록시-1,4-나프탈렌디온.
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제 2항의 2-클로로-3-페닐아미노-5-히드록시-1,4-나프탈렌디온 유도체를 유효성분으로 하고, 약학적으로 허용되는 담체를 함유하는 혈소판응집 억제제.