JPWO2006025580A1 - 抗ヒストンh1モノクローナル抗体およびこれを産生するハイブリドーマ - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、抗ヒストンH1モノクローナル抗体およびこれを産生するハイブリドーマならびに抗ヒストンH1抗体が特異的に認識するポリペプチドに関する。さらに詳しくは、本発明は、臓器移植における拒絶反応の抑制、予測または診断に有用な、モノクローナル抗体およびこれを産生するハイブリドーマならびにポリペプチドに関する。
臓器移植医療においては、臓器移植後の拒絶反応を抑制するため、従前種々の免疫抑制剤が使用されている。このような免疫抑制剤としては、例えば、タクロリムス(FK506)、シクロスポリンAなどを挙げることができる(Jpn J Pharmacol,71, 89-100, 1996)。しかしながら、従前の免疫抑制剤にあっては、ガン細胞の増殖促進、骨髄機能抑制などの強い副作用、感染症、さらには永続投与の必要性などが問題となっている(Transplantation, 58, 170-178, 1994)。
また、本発明は、前記抗ヒストンH1モノクローナル抗体が特異的に認識する、特定のアミノ酸配列を含んでなる、ポリペプチドの提供をその目的とする。
本発明によるハイブリドーマ 1F5、ハイブリドーマ 3F2、ハイブリドーマ 15F11、ハイブリドーマ 17C2またはハイブリドーマ 16G9は、原寄託日を2004年8月19日として、独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター(住所:日本国 茨城県つくば市東1−1−1 中央第6)において、受領番号ABP−10409、受領番号FERM ABP−10410、受領番号FERM ABP−10411、受領番号FERM ABP−10412または受領番号FERM ABP−10413のもと寄託されている。
本発明によるモノクローナル抗体は、ヒストンH1、または脾細胞に存在するヒストンH1様抗原を認識することを一つの特徴とするものである。そして、本発明によるモノクローナル抗体は、好ましくは配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7または配列番号8で表されるアミノ酸配列内のエピトープを認識するものである。また、本発明の別の好ましい態様によれば、抗ヒストンH1モノクローナル抗体は、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7または配列番号8で表されるアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドを認識するものである。ここで、このポリペプチドは、好ましくは約12〜150個のアミノ酸残基からなるものとされる。また、本発明の別の好ましい態様によれば、抗ヒストンH1モノクローナル抗体は、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7または配列番号8で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを認識するものである。また、本発明の別の好ましい態様によれば、抗ヒストンH1モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ 1F5、ハイブリドーマ 3F2、ハイブリドーマ 15F11、ハイブリドーマ 17C2およびハイブリドーマ 16G9からなる群から選択される少なくとも一つのハイブリドーマにより産生されるものである。
また、免疫細胞としては、好ましくは脾細胞を使用する。
また、細胞融合温度は、好ましくは25〜37℃であり、より好ましくは30〜37℃である。
また、ミエローマ細胞と免疫細胞との混合比率は、好ましくは1:1〜1:10程度である。
また、所望によりジメチルスルホキシドなどの補助剤を培地に適宜添加することができる。
上記免疫抑制剤は、臓器移植に用いられる免疫抑制剤であれば特に限定されないが、例えば、シクロフォスファミドなどのアルキル化剤、 アザチオプリン、メソトレキサート、ミゾリビンなどの代謝拮抗剤、シクロスポリン、タクロリムスなどのT細胞活性阻害剤、プレドニゾロン、メチルプレドニゾロン、ミコフェノール酸モフェチル、アザチオプリンなどのステロイド剤、バシリキシマブ、ムロモナブなどのリンパ球表面機能阻害剤またはそれらの組み合わせなどが挙げられる。
本発明によるポリペプチドは、上述のような、本発明による抗ヒストンH1モノクローナル抗体の認識するエピトープをそのアミノ酸配列内に含んでなるものである。そして、本発明の好ましい態様によれば、ポリペプチドは、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7または配列番号8で表されるアミノ酸配列からなるものである。
なお、試薬および抗体は、特記しない限り分析用のものを使用した。また、DAラットおよびPVGラット(オス、7−8週齢)は、それぞれJapan SLC社または Seac Yoshitomi社より購入した。また、BALB/cマウス(オス,5−6週齢)は日本チャールズ・リバー株式会社より購入した。
混合リンパ球反応(MLR);ラット細胞
無処理のPVGラット由来の脾臓リンパ球(応答細胞)およびマイトマイシンC(協和発酵工業株式会社製)処理を行ったDAラット由来の脾臓リンパ球(刺激細胞)を用いた。応答細胞は10%FCS−RPMI培地にて5×105 細胞/mLに調整し、刺激細胞は10%FCS−RPMI培地にて8×106 細胞/mLに調整した。この応答細胞懸濁液および刺激細胞懸濁液をそれぞれ100μLを96穴丸底プレート(Nunc Brand Products社製)に播種した後、混合培養開始時に抗ヒストンH1ポリクローナルIgG(Santa Cruz Biotechonology社製:0.1、0.2、0.4、0.8、もしくは1.6μg/ウェル)またはウサギIgG(normal rabbit IgG:Santa Cruz Biotechonology社製:0.1、0.2、0.4、0.8、もしくは1.6μg/ウェル)を添加し、37℃,5%CO2/95% airの条件下にて3.5日以上培養した。この際、陽性対照として、タクロリムス(FK506:藤沢薬品社製)を添加した。さらに、培養終了15時間前にブロモデオキシウリジン(BrdU)10μLを添加した。そして、BrdUラベリング&ディテクションキットIII(ロシュ・ダイアグノスティクス社製)を用いて、細胞内DNAに取り込まれたBrdU量を指標として細胞増殖度を測定した。ここで、細胞増殖能が高い程BrdU取り込み量も多くなる。
混合リンパ球反応(MLR);ヒト細胞
リンパ球の調製
ヒト2人(AおよびB)より末梢血10mLを採取し、その血液を遠心分離(1500rpm、30分)にて処理した後、血漿を除去した。そして、その残渣に、除去した血漿と等量(3mL)のPBSを加えて攪拌した。この混合液にフィコール−パーク溶液(Ficoll-paque液、Amersham Biosciences社製)3mLを加えて密度勾配遠心分離(1500rpm、30分)にて処理し、リンパ球を含む中間の白層を得た。この白層に滅菌したPBSを加えて総量12mLの細胞懸濁液とし、遠心分離(1500rpm、5分) にて処理した。この操作を2回行った後、得られたリンパ球を10%FCS−AIM−V培地(GIBCO)1mLに懸濁した。
B由来のリンパ球(応答細胞)およびマイトマイシンC(協和発酵工業株式会社製)処理を行ったA由来のリンパ球(刺激細胞)を用いて以下の試験を行った。応答細胞は10%FCS−AIM−V培地にて5×105 細胞/mLに調整し、刺激細胞は10%FCS−RPMI培地にて8×106 細胞/mLに調整した。この応答細胞懸濁液および刺激細胞懸濁液をそれぞれ100μLを96穴丸底プレート(Nunc Brand Products社製)に播種し、混合培養開始時に抗ヒストンH1ポリクローナルIgG(Santa Cruz Biotechonology社製:0.1、0.2、0.4、0.8、もしくは1.6μg/ウェル)またはウサギIgG(normal rabbit IgG:Santa Cruz Biotechonology社製:0.1、0.2、0.4、0.8、もしくは1.6μg/ウェル)を添加し、37℃,5 %CO2/95 % airの条件下にて2.5日培養した。この際、陽性対照として、タクロリムスを添加した。なお、培養中、各ウェルに終濃度10μg/mLとなるようにConAを添加し、刺激細胞が増殖能を停止していること、および反応細胞が抗原刺激により細胞増殖起こすことを確認した。そして、各ウェルを参考例1と同様に処理し、BrdUラベリング&ディテクションキットIII(ロシュ・ダイアグノスティクス社製)を用いて、細胞内DNAに取り込まれたブロモデオキシウリジン(BrdU)量を指標として細胞増殖度を測定した。
ハイブリドーマの製造
免疫
PBS中に抗原(Histone H1 Histone F1 Histone KAP、Roche社製)を溶解させた溶液 0.8mL(抗原濃度:0.5mg/mL)とフロイトコンプリートアジュバンド(和光純薬株式会社製)0.8mLとを混合し、懸濁液(抗原濃度:0.25mg/mL)を得た。次に、この懸濁液0.2mLをBALB/cマウスに腹腔内投与した。さらに、この懸濁液を2週間毎に同量にてマウスに投与した。そして、投与開始から16週間後、PBS中抗原を溶解させた溶液 0.2mL(抗原濃度:600〜1000mg/mL)をマウス腹腔内へ最終投与した。なお、投与の際には、眼底静脈より採血を行ってELISAにより抗体価を測定した。最終投与の4日後、全採血を行い、得られた血液を遠心分離(2000rpm、20分)し、抗血清を得て以下の実験のコントロール抗血清として用いた。また、全採血後、ラットより脾臓を摘出し、得られた脾細胞を以下の細胞融合に用いた。
上記の脾細胞およびミエローマ細胞(P3X63-Ag.8.653)を脾細胞:ミエローマ細胞=10:1〜10にて混合して遠心分離(1500rpm,5分)した。遠心分離した後、アスピレーターを用いて上清を除去し、得られた細胞ペレットに37℃のポリエチレングリコール4000(50%PBS溶液)1mLを1分間かけて添加して混合液とした。この混合液を37℃にて1分間静置した後、37℃のIMDM培地(計9mL)を30秒毎に1 mLずつ加えた後、遠心分離(1500rpm、5分)した。遠心分離後、上清を吸引除去し、37℃の15%FCS(JRH BIOSCIENCES製)含有IMDM(GIBCO製)培地を適量添加した。得られた懸濁液を96ウェル培養プレートに100mLずつ分注を行い、37℃/5%CO2インキュベーターにて1日培養した。さらにHAT培地(HAT粉末(HAT MEDIA SUPPLEMENT(×50)、SIGMA製)を無血清IMDM培地10mLに溶かし、10%FCS含有IMDM培地にて50倍希釈したものである。)を100mL添加し、37℃/5%CO2インキュベーターにて培養した。HAT培地の交換は2〜3日毎に行い、10日後にはHT培地(HT粉末(HT MEDIA SUPPLEMENT、SIGMA製)を無血清IMDM培地10mLに溶かし、10%FCS含有IMDM培地にて50倍希釈したものである。)に切り替え、3日間、37℃/5%CO2インキュベーターにて培養を行った。以後2〜3日ごとに培地(HT培地)の交換を行った。細胞増殖を顕微鏡により確認した後、培養上清(約100 mL)を回収した。この培養上清を用いて、以下に示されるヒストンH1に対する抗体価測定によるハイブリドーマのスクリーニングを行った。
抗体価測定
ヒストンH1(5mg、calf thymus histone H1、ロシュダイアグノスティックス社製)を含む緩衝液(Baicarbonate buffer:100 mM NaHCO3-NaOH、pH9.2〜9.5、ヒストンH1濃度:1mg/mL) を1ウェル当り50μLずつ96ウェル平底プレートへ添加し、室温にて2時間静置してコーティングした。プレートを洗浄バッファー(PBST)にて3回洗浄し、ブロッキングバッファー(3%スキムミルク1%BSA、PBS)を200〜250mL/ウェルにて加え、4℃にて一昼夜反応させた後、3回洗浄した。そして、ハイブリドーマの培養上清を100mL/ウェルにて加え、37℃にて4時間または4℃にて一昼夜反応させた。プレートを3回洗浄した後、希釈バッファー(10 mM Tris-HCl ( pH 8.0 )、0.9 % ( W/V ) NaCl、0.05 % ( W/V ) Tween20)にて10000倍希釈したビオチン標識抗マウスIgG(Biotion-labeled anti-mouse IgG 、SIGMA)を50mL/ウェルにて加え、室温にて2時間反応させた。その後6回洗浄した後、希釈バッファーにて1000倍希釈したアルカリフォスファターゼ標識ストレプタリジン(streptarridin)を50mL/ウェルにて加え、室温にて1〜2時間反応させた。その後6回洗浄を行い、蛍光基質バッファー(Attophos substrate buffer、ロシュダイアグノスティックス社製)を50mL/ウェル加えてプレートを遮光し発色させた。蛍光強度はCytoFluorII(パーセプティブ社製)にて測定した。
上記抗体価測定にて陽性の結果を示したウェル(1×105細胞/mL)に15%FCS10%HCF(Hybridoma cloning factor、オリジン社製)含有IMDM培地を加えて、約200細胞/ウェル となるように96ウェル培養プレートに分注し、37℃5%CO2インキュベーターにて培養を行った。そして、上記と同様に抗体価測定を行い、抗体産生量の多いハイブリドーマを選択した。
抗ヒストンH1モノクローナル抗体含有培養上清の調製
各ハイブリドーマは、15%FCS10%HSF含有IMDM培地を用いて培養した(1×106細胞/mL)。この培養上清15mLをCENTRIPREP YM-10(MILLIPORE)を用いて遠心分離(2000g、2.5時間)し、抗ヒストンH1モノクローナル抗体を含有する培養上清の濃縮液を得た。
得られた培養上清の濃縮液(1000倍希釈液)を用いて、参考例1と同様の方法にしたがってMLR抑制活性評価試験を行った。対照として、免疫前ラット血清(1000倍希釈液)、ウサギIgG(Normal rabbit IgG 1.6mg、Santa Cruz Biotechonology製)1.6μg/ウェル、抗ヒストンH1ポリクローナル抗体(anti-histone H1 polyclonal IgG 200μg、Santa Cruz Biotechonology製)1.6μg/ウェル、タクロリムス 1.6μg/ウェルを用いた。なお、希釈液としてはIMDM培地を用いた。
測定用サンプルの調製
PVGラットより脾細胞摘出し、ワイズマンの方法(Weissman et al., Science, 239, 1018-1021, 1988)にしたがって細胞破砕を行った。脾細胞にPBS 1mLを加えて遠心分離(1,500rpm、5分)した後、脾細胞を回収した。この細胞をシリンジを利用して懸濁し、同量の150mM NaClを加えた。得られた細胞懸濁液を遠心分離(300×g、10分)し、沈殿物および上清を得た。この沈殿物を不溶性画分(核画分含有)とし、上清を細胞膜含有可溶性画分とした。不溶性画分には5倍量(v/v)の電気泳動用サンプルバッファー(0.25 M Tris-HCl (pH 6.8) 25mL、SDS 2.0g 、超純水 9mL、 glycerol 10mL、BPB 5mg)を加えて5分間煮沸した後、遠心分離を行い、得られた上清を測定用サンプルとした。また、細胞膜含有可溶性画分にはEDTAを終濃度5mMとなるように添加した。この細胞膜含有可溶性画分のうち、100〜200μLを回収した。残りの細胞膜含有可溶性画分を超遠心(4℃、200000×g、45分)にて処理した。そして、得られた沈殿を細胞膜画分とし、得られた上清を細胞膜除去可溶性画分とした。細胞膜画分については、5倍量(v/v)の電気泳動用サンプルバッファーを加えて5分間煮沸した後、遠心分離を行った。そして、得られた上清を測定用サンプルとした。
HiTrap NHSカラム(HiTrap NHS-activated HP、 Amersham Biosciences AB製)に1 mM HCL溶液を1〜2mL/minにて送液し、次にヒストンH1溶液(ヒストンH1(ロシュダイアグノスティクス社製)1 0.5mg、カップリング バッファー(0.2M NaHCO3,0.5 M NaCl pH 8.3))1mLを1mL/minにて送液し、送液後、直ちにカラムを密閉してカップリングを行った(15〜30分)。カップリング後、バッファーA( 0.5 M monoethanolamine,0.5 M NaCl pH 8.3)、バッファーB(0.1 M sodium acetate,0.5 M NaCl pH 4.0)および中性バッファー(1.0M Tris-HCl,pH 9.0)にてカラム内を洗浄した。次に試験例1にて得られた抗ヒストンH1モノクローナル抗体含有培養上清をカラム内へ1 mL/minにて送液し、循環させた(4℃,overnight)。次にリン酸バッファー 5mLにて洗浄した後、エリューションバッファーを0.2〜1mL/minにて5mL 送液し、溶出された画分から精製抗ヒストンH1モノクローナル抗体を得た。
Laemmliの不連続緩衝液系における電気泳動法(Nature, 227, 680-685, 1970)にしたがって、各測定用サンプルをSDS−PAGEにて処理した。コントロールとしては、ヒストンH1(5mg、ロシュダイアグノスティクス社製)を用いた。SDS−PAGEの後、得られたゲルは以下のクーマシー染色またはウエスタンブロッティングに用いた。
SDS−PAGE後のゲルは、染色液(0.25% クーマシーブリリアントブルーR / エタノール:酢酸:蒸留水=9:2:9)に浸し約1時間振盪した後、脱色液(エタノール:酢酸:蒸留水=25:8:65)に浸し約1時間し脱色した。その後保存液(メタノール:酢酸:蒸留水=10:15:175)に浸してバックグラウンドを脱色した。
SDS−PAGE後のゲルをセミドライ式転写装置(AE-6675,ATTO製)を用いてPVDF膜に転写した。次に、転写後のPVDF膜をブロッキング溶液(5% skim milk 1% BSAの PBST溶液)に浸して振盪した(4℃にて一昼夜 、または室温にて1時間)。次に、PVDF膜に対して、一次抗体として精製抗ヒストンH1モノクローナル抗体を含む溶液(ブロッキング溶液にて500倍に希釈したものである)を加えて室温にて1時間振盪した後、PBSTにて15 min×1回,5 min×3回洗浄した。洗浄後、PVDF膜に対して、ブロッキング溶液で20000倍希釈した二次抗体(HRP-anti-mouse IgG(SIGMA製))溶液を加えて室温で1時間振盪した。振盪後、PBSTにて15分×1回,5分×3回洗浄した。さらに、ECLウェスタン ブロッティング ディテクション システム(ECL Plus Westen blotting detection system、Amersham Biosciences AB)を用いて特異抗体の結合を検出し、X線フィルムRX-U(FUJI PHOTO FILM,Tokyo,Japan)にて露光後現像した。
PVGラットの脾細胞を4%ホルマリン含有PBS溶液に懸濁し、室温にて20分間固定化した。さらに、脾細胞を染色用バッファー(Staining buffer:1%(v/v) FCS、0.1%(w/v)Sodium azide含有PBS溶液、4℃)にて3回洗浄した後、染色用バッファー 100mL中細胞数を2×106個含む混合液を調整した。この混合液に一次抗体(ビオチン標識した抗ヒストンH1モノクローナル抗体 2mLまたはビオチン標識したノーマルマウス IgG 5mL)を加えて37℃にて1時間反応させた。この反応の後、脾細胞を染色用バッファー(4℃)にて3回洗浄し、さらに脾細胞に染色用バッファー 100mLを加え、FITC標識ストレプトアビジン(BD PharMingen製) 1mLを加えて、室温にて30時間反応させた。反応後、脾細胞を染色用バッファー(4℃)にて3回洗浄し、脾細胞にPBS 500mL中を加えて懸濁液とした。また、この懸濁液にプロピジウム イオジド(Propidum Iodide、SIGMA)を終濃度5mg/mLとなるように添加して室温にて20分反応させた。得られた細胞を50%グリセリン含有PBS溶液にて封入した後、蛍光顕微鏡にて観察した。
この結果、脾細胞の周囲(細胞膜)部分のみが特異的に蛍光染色された。
ファージディスプレイ
ハイブリドーマ 1F5、3F2、15F11、17C2または16G9から産生される抗ヒストンH1抗体に関し、Ph.D.-12ファージディスプレイペプチドライブラリーキット(New England BioLabs, Inc.から購入)を用いて、パンニング実験を行った。精製した各モノクローナル抗体を0.1M NaHCO3 (pH 8.6)に溶解し、直接マイクロタイタープレート(Nunc, catalog #430341)にコートして4℃で一晩インキュベートした。各ウェルにブロッキングバッファー(0.1M NaHCO3, 5 mg/ml BSA, 0.02% NaN3) を加え、少なくとも1時間4℃でインキュベートした後、TBST (50mM Tris, 150mM NaCl, 0.1% Tween 20)で洗浄した。1回目のパンニングでオリジナルライブラリーの中の4 x 1010個のファージをスクリーニングに用いた。結合しなかったファージをTBTSによる洗浄を繰り返すことによって除去した。結合したファージを0.2M Glycine-HCl (pH 2.2), 1mg/ml BSAによって溶出した。溶出したファージを20mL E Coli ER2738 cultureによって増殖させた。得られたファージを、ポリエチレングリコールを用いて沈殿させて、2回目のパンニングに用いた。さらに、同様の操作手順にしたがって、3回目のパンニングを行った。3回目のパンニングにおいて得られたプラークを1:100にて希釈し、ER2738 cultureを用いて増殖させた。これらを内容物とするチューブを4.5〜5時間振とうしながら37℃にてインキュベートした。1本鎖ファージDNAをイオジド バッファー(Iodide buffer:10mM Tris-HCl, 1mM EDTA, 4M NaI)とエタノールで沈殿、精製した。DNAシークエンス解析のためにファージDNAを20μL TEバッファー(10 mM Tris-HCl pH 8.0, 1mM EDTA)に溶解させた。
得られた精製ファージDNAについて、上記Ph.D.-12ファージディスプレイペプチドライブラリーキット添付のプライマーDNAおよびDYEnamicTM ET Terminator Cycle Sequencing Premix Kit(Amersham Biosciences社製)を用いて、シークエンシングPCR反応を行った(PCR反応条件:95℃(30秒)、次いで50℃(15秒)、次いで60℃(1分)30サイクル)。PCR産物をAutoSeqTM G-50(Amersham Biosciences)を用いて精製した。そして、ABI PRISMTM 310 Genetic Analyzer(PE Biosystems)を用いてファージペプチドのDNAシークエンスを決定した。決定されたDNAシークエンスに基づくアミノ酸配列は以下に示される通りであった。
1F5 :NYQTYTPRPPHS(配列番号4)
3F2 :VTNNQTSPRWEI(配列番号5)
15F11 :WKPVSLTLHTHP(配列番号6)
17C2 :HATGTHGLSLSH(配列番号7)
16G9 :SSVLYGGPPSAA(配列番号8)
上記ファージDNAから決定されたアミノ酸配列を有する、各ペプチドを常法にしたがって合成した。得られたペプチド、精製した各モノクローナル抗体およびヒストンH1抗原(Roche, catalog # 1004875)を用い、競合ELISAを行った。この際、ヒストンH1抗原のビオチニル化にはEZ-Link Sulfo-NHS-Biotinylation kit (Pierce製)を用い、発色試薬としてABTS溶液(Sigma, A3219)を用いた。発色はELISA測定器(ThermoLabsystem, Multiskan Ascent)を用いて405 nmで検出した。測定値は3回測定した吸収値の平均とした。
この結果、合成した上記ペプチドが、精製した各モノクローナル抗体とヒストンH1抗原との結合を阻害することが確認された。
Claims (32)
- ヒストンH1または脾細胞の細胞膜に存在するヒストンH1様抗原を認識することを特徴とする、モノクローナル抗体。
- 配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7または配列番号8で表されるアミノ酸配列内に位置するエピトープを認識することを特徴とする、請求項1に記載のモノクローナル抗体。
- ハイブリドーマ 1F5、ハイブリドーマ 3F2、ハイブリドーマ 15F11、ハイブリドーマ 17C2およびハイブリドーマ 16G9からなる群から選択される少なくとも一つのハイブリドーマにより産生される、モノクローナル抗体。
- 請求項1〜3のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体を有効成分とする、免疫抑制用組成物。
- 請求項1〜3のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体を有効成分とする、哺乳動物における移植拒絶の予測または診断用組成物。
- 前記移植拒絶が免疫抑制剤の投与を中止した後に生ずるものである、請求項5に記載の組成物。
- 哺乳動物における移植拒絶を予測または診断するためのキットであって、請求項1〜3のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体を少なくとも含んでなる、キット。
- 前記移植拒絶が免疫抑制剤の投与を中止した後に生ずるものである、請求項7に記載のキット。
- ヒストンH1または脾細胞の細胞膜に存在するヒストンH1様抗原を認識することを特徴とするモノクローナル抗体を産生する、ハイブリドーマ。
- 前記モノクローナル抗体が、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7または配列番号8で表されるアミノ酸配列内に位置するエピトープを認識することを特徴とする、請求項9に記載のハイブリドーマ。
- ハイブリドーマ 1F5、ハイブリドーマ 3F2、ハイブリドーマ 15F11、ハイブリドーマ 17C2またはハイブリドーマ 16G9。
- 配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7または配列番号8で表されるアミノ酸配列からなる、ポリペプチド。
- 配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7または配列番号8で表されるアミノ酸配列において、1個または数個のアミノ酸が置換、欠失もしくは付加したアミノ酸配列からなる、ポリペプチド。
- 配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7または配列番号8で表されるアミノ酸配列の部分配列からなる、ポリペプチド。
- 配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7または配列番号8で表されるアミノ酸配列またはその部分配列を含んでなる、ポリペプチド。
- ヒストンH1、ヒストンH1様抗原または請求項12〜15のいずれか一項に記載のポリペプチドを有効成分とする、免疫抑制用組成物。
- 哺乳動物由来の生物学的試料における抗ヒストンH1抗体量を測定するための、ヒストンH1、ヒストンH1様抗原または請求項12〜15のいずれか一項に記載のポリペプチドを有効成分とする、組成物。
- 前記哺乳動物における移植拒絶の予測または診断のための、請求項17に記載の組成物。
- 前記移植拒絶が免疫抑制剤の投与を中止した後に生ずるものである、請求項18に記載の組成物。
- 哺乳動物由来の生物学的試料における抗ヒストンH1抗体量を測定するためのキットであって、ヒストンH1、ヒストンH1様抗原または請求項12〜15のいずれか一項に記載のポリペプチドを少なくとも含んでなる、キット。
- 前記哺乳動物における移植拒絶を予測または診断するための、請求項20に記載のキット。
- 前記移植拒絶が免疫抑制剤の投与を中止した後に生ずるものである、請求項21に記載のキット。
- 免疫抑制を必要とする哺乳動物の治療方法であって、前記哺乳動物に治療上有効量の請求項1〜3のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体を投与することを含んでなる、方法。
- 哺乳動物における移植拒絶を予測または診断する方法であって、前記哺乳動物由来の生物学的試料と、請求項1〜3に記載のモノクローナル抗体との免疫反応性レベルを測定することを含んでなる、方法。
- 前記移植拒絶が免疫抑制剤の投与を中止した後に生ずる、請求項24に記載の移植拒絶を予測または診断する方法。
- 免疫抑制を必要とする哺乳動物の治療方法であって、前記哺乳動物に治療上有効量のヒストンH1、ヒストンH1様抗原または請求項12〜15のいずれか一項に記載のポリペプチドを投与することを含んでなる、方法。
- 哺乳動物における移植拒絶を予測または診断する方法であって、前記哺乳動物由来の生物学的試料における抗ヒストンH1抗体と、ヒストンH1、ヒストンH1様抗原または請求項12〜15のいずれか一項に記載のポリペプチドとの免疫反応性レベルを測定することを含んでなる、方法。
- 前記移植拒絶が免疫抑制剤の投与を中止した後に生ずる、請求項27に記載の移植拒絶を予測または診断する方法。
- 免疫抑制用組成物の製造における、請求項1〜3のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体の使用。
- 哺乳動物における移植拒絶の予測または診断薬としての、請求項1〜3のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体の使用。
- 免疫抑制用組成物の製造における、ヒストンH1、ヒストンH1様抗原または請求項12〜15のいずれか一項に記載のポリペプチドの使用。
- 哺乳動物における移植拒絶の予測または診断薬としての、ヒストンH1、ヒストンH1様抗原または請求項12〜15のいずれか一項に記載のポリペプチドの使用。
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