BRPI0620747A2 - anticorpo contra periostina, e uma composição farmacêutica compreendendo este para prevenir ou tratar uma doença na qual está envolvida periostina - Google Patents

anticorpo contra periostina, e uma composição farmacêutica compreendendo este para prevenir ou tratar uma doença na qual está envolvida periostina Download PDF

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Ryuichi Morishita
Naruto Katsuragi
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Univ Osaka
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Abstract

ANTICORPO CONTRA PERIOSTINA, E UMA COMPOSIçãO FARMACêUTICA COMPREENDENDO ESTE PARA PREVENIR OU TRATAR UMA DOENçA NA QUAL ESTá ENVOLVIDA PERIOSTINA. A presente invenção refere-se a um anticorpo contra uma isoforma de periostina tendo atividade adesiva anticelular, especialmente um anticorpo antiperiostina tendo a capacidade de neutralizar propriedades adesivas anticelulares, bem como um agente profilático ou terapêutico para doenças relacionadas com periostina compreendendo o anticorpo. Apresente invenção também proporciona métodos para detectar e quantificar a isoforma de periostina em uma amostra usando o anticorpo, bem como um método para diagnosticar doenças relacionadas com periostina compreendendo medir a quantidade da isoforma de periostina pelo método de detecção ou quantificação.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "ANTICORPO CONTRA PERIOSTINA, E UMA COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA COMPREENDENDO ESTE PARA PREVENIR OU TRATAR UMA DOENÇA NA QUAL ESTÁ ENVOLVIDA PERIOSTINA"
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
CAMPO TÉCNICO
A presente invenção refere-se a anticorpos contra isoformas de periostina de células tendo propriedades antiadesivas, especialmente anticorpos antiperiostina tendo a capacidade de neutralizar propriedades de células antiadesivas. Mais especificamente, refere-se a anticorpos antiperiostina reconhecendo uma variante de junção de periostina tendo propriedades antiadesivas de células especificamente expressadas em tecido intersticial durante reestruturação tecidual tal como hipertrofia cardíaca, as quais são úteis para prevenção ou tratamento de doenças relacionadas com periostina, tais como falência cardíaca, ou são úteis para diagnóstico destas doenças.
ANTECEDENTES DA TÉCNICA
A falência cardíaca crônica é uma condição na qual o coração não pode bombear sngue suficiente para vários órgãos devido a redução da contratilidade do miocárdio. Convencionalmente, tem sido tratada com fármacos cardiotônicos que aumentam a contratilidade do miocárdio tais como fármacos de digital. No entanto, foi demonstrado que estes fármacos prejudicam o prognóstico vital durante administração de longo termo, devido a excessivo consumo de energia do miocárdio. Portanto, terapias recentemente prevalescentes são aquelas usando diuréticos, β- bloqueadores ou inibidores da angiotensina que reduzem excessiva carga de trabalho sobre o coração pelo sistema nervoso simpático ou sistema renina-angiotensina-aldosterona ativado na condição de falência cardíaca. No entanto, pacientes com falência cardíaca têm atividades limitadas em sua vida diária e não podem manter sua qualidade de vida porque são proibidos de exercício duro ou similar. Além disso, o prognóstico vital de pacientes com falência cardíaca não pode ser totalmente garantido. Portanto é desejável desenvolver um novo fármaco eficaz para tratar falência cardíaca, o qual permita uma melhora na qualidade de vida e uma melhora no prognóstico vital de longo termo.
Por outro lado, periostina é uma proteína da matriz extracelular e consiste em um polipeptídeo tendo um peso molecular de cerca de 90000. Cada cadeia de polipeptídeo tem uma seqüência de sinalização, um domínio rico em cisteína, um domínio repetido quatro vezes, e um domínio de C- terminal.
Periostina foi primeiro denominada fator 2 osteoblasto-específico (OSF-2) e foi isolada e identificada como um gene especificamente expressado na linhagem celular de osteoblasto de camundongo MC3T3-E1 (documento de patente N51, documento não patente Ns 1), e posteriormente se tornou conhecida como periostina e foi reportado que tem atividade de estimulação de adesão em células de osteoblasto (documento não patente Ns 2).
Em estudos anteriores, imaginou-se que periostina fosse uma matriz extracelular especificamente expressada em tecido ósseo. No entanto, atualmente se sabe que é expressada não somente em tecido ósseo mas também muito elevadamente no início de falência cardíaca (documento não patente N9 3, documento não patente N9 4), aneurismas (documento não patente N9 5), cânceres altamente metastáticos (documento não patente N9 6, documento não patente N9 7, documento não patente N9 8), pré-eclâmpsia (documento não patente N9 9) bem como muito ligeiramente em tecido normal. Além disso, foi demonstrado que algumas variantes de junção de periostina são expressadas em osteoblastos (documento não patente N9 1, documento não patente N9 2, documento não patente N9 10, documento não patente N9 3).
Quanto a funções da periostina, foi reportado que uma variante de junção de periostina consistindo em 811 aminoácidos (correspondendo a PN-2 na figura 1) (documento não patente N9 2) e uma variante de junção de periostina consistindo em 782 aminoácidos (documento não patente N9 11) têm propriedades adesivas de células. Em contraste, foi reportado que uma variante de junção de periostina consistindo em 838 aminoácidos (correspondendo a PN-1 na figura 1) evita que fibroblastos cardíacos venham a aderir a uma lâmina revestida com a variante de junção de periostina, isto é, não tem atividade adesiva de células; a expressão genética da variante de junção de periostina consistindo em 838 aminoácidos (correspondendo a PN-1 na figura 1) está significativamente aumentada em ratos - modelo de falência cardíaca comparados com ratos normais; esta variante é um fator agravante induzindo dilatação do coração; e que a taxa de sobrevida foi significativamente aumentada por inibição da expressão desta proteína (documento não patente N- 3). Além disso, há um relatório de um agente profilático ou terapêutico para falência cardíaca, na qual um nucleotídeo anti-sentido contra a variante de junção de periostina consistindo em 838 aminoácidos é usado para suprimir expressão da variante de junção de periostina (documento de patente Ns 2).
Conforme mostrado acima, foi sugerido que a expressão do gene de periostina está relacionada com a patologia de falência cardíaca, mas não se sabe a relação entre a estrutura de variantes de junção de periostina e falência cardíaca.
Portanto, nós fizemos uma tentativa de esclarecer a estrutura da periostina relacionada com a patologia de falência cardíaca usando anticorpos.
Quanto a anticorpos contra periostina, há relatórios de um anticorpo relacionado com a inibição de quimiotaxia de periostina (documento não patente N° 12) e um anticorpo tendo atividade inibitória contra crescimento celular induzido por periostina (documento não patente N° 13). No entanto, nunca houve nem um relatório de anticorpos apresentando a estrutura de uma região responsável por atividade adesiva de células da periostina nem um relatório apresentando a relação entre a atividade adesiva de células da periostina e doenças tais como falência cardíaca.
Documento de patente N° 1: JPA N9 HEI-5-268982
Documento de patente N° 2: Republication WO 02/020055 Documento de patente N9 3: Publicação de Patente Internacional N9 WO 2005/019471
Documento não patente Ns 1: Takeshita S. et ai., Biochem J (1993) 294, 271-8
Documento não patente N- 2: Horiuchi K. et al., J. Bone Miner. Res. (1999) 14, 1239-49
Documento não patente N9 3: Katsuragi N. et al., Circulation (2004) 110, 1806-13
Documento não patente Nq 4: Wang D. et al., Hypertension (2003) 42, 88-95 Documento não patente N5 5: Peters DG. et al., Stroke (2001) 32, 1036-42
Documento não patente N9 6: Shao R. et al., Mol Cell Biol. (2004) 24, 3992- 4003
Documento não patente N9 7: Gonzalez HE. et al., Arch Otolaryngol Head Neck Surg. (2003) 129, 754-9 Documento não patente N9 8: Sasaki H. et al., Breast Câncer Res Treat.(2003) 77, 245-52
Documento não patente N9 9: Sasaki H. et al., Am J Obstet Gynecol. (2002) 186, 103-8
Documento não patente N9 10: Litvin J. et al., J Cell Biochem. (2004) 92, 1044-61
Documento não patente N9 11: Gillan L. et al-, Câncer Res. (2002) 62, 5358- 64
Documento não patente N9 12: Lindner V. et al., Arterioscler Thromb Vasc Biol. (2005) 25, 77-83 Documento não patente N9 13: Tai IT. et al., Carcinogenesis (2005) 26, 908- 15
Descoberta da Invenção
A presente invenção tem por objetivo proporcionar, por exemplo, um agente profilático ou terapêutico novo e eficaz para falência cardíaca, o qual permite uma melhora na qualidade de vida e uma melhora no prognóstico vital de longo termo. Mais especificamente, a presente invenção tem por objetivo proporcionar um anticorpo contra uma isoforma de periostina tendo atividade de células antiadesivas. A presente invenção também tem por objetivo proporcionar um hibridoma produzindo o anticorpo, DNA codificando o anticorpo, um vetor recombinante contendo o DNA1 um transformante obtenível introduzindo o vetor recombinante em uma célula hospedeira, bem como um método para produzir o anticorpo, compreendendo cultivar o transformante e coletar o anticorpo da cultura. A presente invenção adicionalmente tem por objetivo proporcionar uma composição farmacêutica compreendendo o anticorpo para prevenir ou tratar uma doença na qual está envolvida uma isoforma de periostina tendo atividade de célülas antiadesivas. A presente invenção adicionalmente tem por objetivo proporcionar um método para prevenir ou tratar uma doença na qual está envolvida uma isoforma de periostina tendo atividade de células antiadesivas, compreendendo administrar a composição farmacêutica a um paciente, bem como um método para diagnosticar a doença.
Esclareceu-se que uma variante de junção de periostina não tendo atividade adesiva de células (PN-1) tem atividade de células antiadesivas, isto é, a atividade de separação de células aderidas. Por outro lado, também confirmou-se que periostina tendo atividade adesiva de células (PN-2) não tem atividade de células antiadesivas, isto é, não destaca células aderidas. Além disso, observou-se uma diferença em estrutura e atividade adesiva de células entre variantes de junção de periostina tendo atividade de células antiadesivas (PN-1) e periostina não apresentando atividade de células antiadesivas (PN-2), e considerou-se que doenças relacionadas com isoformas de periostina tendo atividade de células antiadesivas podem ser prevenidas ou tratadas inibindo uma região especificamente presente nas variantes de junção de periostina tendo atividade de células antiadesivas. Em outras palavras, nós consideramos que inibidores contra a referida região podem ser úteis como agentes profiláticos ou terapêuticos para doenças relacionadas com isoformas de periostina tendo atividade de células antiadesivas.
Análise de variantes de junção de periostina altamente expressadas durante falência cardíaca revelou que os domínios de C- terminal nos quais as variantes de junção são formadas consistem nos éxons 15 a 23; especificamente os ratos têm as seguintes variantes (1) a (4):
(1) uma variante conservando todos os éxons (denominada PN- 1; consistindo' em 838 aminoácidos mostrados como SEQ ID NO: 1; a seqüência de cDNA mostrada como SEQ ID NO: 6),
(2) uma variante carecendo do Éxon-17 (denominada PN-2; consistindo em 811 aminoácidos mostrados como SEQ ID NO: 5; 27 aminoácidos (Éxon-17) mostrados na SEQ ID NO: 3 são eliminados de PN- 1; a seqüência de cDNA mostrada como SEQ ID NO: 7),
(3) uma variante carecendo do Éxon-21 (denominada PN-3; consistindo em 810 aminoácidos),
(4) uma variante carecendo do Éxon-17 e Éxon-21 (denominada PN-4; consistindo em 783 aminoácidos).
Além de ratos, PN-1 e PN-2 de camundongo e ser humano também foram encontradas (PN-1 de camundongo: SEQ ID NO: 8 (seqüência de aminoácidos), SEQ ID NO: 9 (cDNA seqüência); PN-2 de camundongo: SEQ ID NO: 10 (seqüência de aminoácidos), SEQ ID NO: 11 (seqüência de cDNA); PN-1 humana: SEQ ID NO: 12 (seqüência de cDNA); PN-2 humana: SEQ ID NO: 13 (seqüência de aminoácidos), SEQ ID NO: 14 (seqüência de cDNA)). Entre estas, PN-1 foi altamente expressada ao passo que PN-2 e PN-3 foram expressadas em uma menor extensão em tecido de hipertrofia cardíaca de rato. Portanto, nós contemplamos preparar um anticorpo especificamente reconhecendo a parte de resíduo aminoácido codificada pelo Éxon-17 como um inibidor contra este sítio, cujo sítio é estruturalmente diferente em PN-1 e PN-2 e exclusivamente encontrado em PN-1.
De modo a preparar um anticorpo, o material usado como um imunogênio deve ser hidrofílico, e se um anticorpo tiver de ser preparado usando uma parte de um polipeptídeo grande tal como proteína, a parte usada como um imunogênio deve ser exposta sobre a superfície da proteína para formar uma parte do epitopo. Portanto, de modo a examinar a possibilidade de usar a cadeia de peptídeo Éxon-17 como um antígeno, uma pesquisa de epitopo foi inicialmente realizada usando o software Accelrys que é amplamente usado no campo da bioinformática Mac Vector 7.2. Foi considerado a partir de "Hidrofilicidade", "Probabilidade Superficial" e "Antigenicidade" que TTKIITKLVEPKIKVIQGSLQPIIKTE (SEQ ID NO: 3) da região do Éxon-17 é essencialmente hidrofóbico, sugerindo que esta região muito improvavelmente deve ser exposta sobre a superfície da molécula de proteína e não tem imunogenicidade, de modo que não pode ser usada para preparar um anticorpo, e portanto, presumiu-se que seria difícil usar para preparar praticamente um anticorpo.
No entanto, arriscou-se preparar um anticorpo contra a seqüência de aminoácidos codificada por Éxon-17 com a suposição de que o uso de um anticorpo contra uma região de polipeptídeo codificada por Éxon-17 especificamente encontrada em PN-1 seria mais adequada para inibir especificamente funções de PN-1. Um peptídeo consistindo em 27 aminoácidos constituindo um peptídeo codificado pela região Éxon-17 foi sintetizado e usado para imunizar coelhos, e o soro resultante foi purificado para dar uma fração de IgG, em que um anticorpo policlonal antipeptídeo Éxon-17 foi preparado. Quando proteína PN-1 de periostina foi em seguida adicionada a uma cultura 80% confluente de fibroblastos de coração, foi observado quase 100% de separação celular (isto é, atividade de células antiadesivas). A administração do anticorpo antipeptídeo Éxon-17 a este sistema experimental inibiu a separação celular mediada por proteína PN-1 de periostina, mostrando que o anticorpo antipeptídeo Éxon-17 é um anticorpo tendo uma atividade neutralizante contra proteína PN-1 de periostina. Em seguida, ratos modelos de enfarte do miocárdo agudo foram preparados e a administração semanal do anticorpo antipeptídeo Éxon-17 foi continuada para mostrar que dilatação do coração foi significativamente inibida 4 semanas depois da preparação dos modelos, e que a função do coração foi aprimorada. Também foi demonstrado que estas propriedades foram sustentadas e fibrose cardíaca foi inibida mesmo 8 semanas depois da preparação dos modelos. Isto indica que o anticorpo antipeptídeo Éxon- 17 é um anticorpo tendo a atividade de inibir dilatação do coração e fibrose cardíaca associadas com o progresso da condição de falência cardíaca, e a atividade de melhorar a função cardíaca, levando à realização da presente invenção.
Como uma solução para os problemas descritos acima, a presente invenção proporciona um anticorpo contra uma isoforma de periostina tendo atividade de células antiadesivas especificamente expressada no coração durante falência cardíaca ou similar, particularmente um anticorpo contra o sítio de junção de periostina.
A saber, a presente invenção inclui os seguintes aspectos.
(1) Um anticorpo contra uma isoforma de periostina tendo atividade de células antiadesivas.
(2) Um anticorpo contra uma isoforma de periostina tendo uma seqüência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 1 ou na SEQ ID NO: 2.
(3) Um anticorpo contra uma isoforma de periostina tendo uma seqüência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 3 ou na SEQ ID NO: 4.
(4) Um anticorpo contra uma isoforma de periostina tendo uma seqüência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 34.
(5) Um anticorpo contra uma região responsável pela atividade de células antiadesivas de uma isoforma de periostina tendo atividade de células antiadesivas.
(6) Um anticorpo contra um peptídeo consistindo em uma seqüência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 3 ou na SEQ ID NO: 4 ou uma parte da mesma.
(7) Um anticorpo contra um peptídeo tendo uma seqüência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 34 ou uma seqüência de aminoácidos parcial da mesma.
(8) O anticorpo conforme definido em qualquer um de (1) a (7), o qual especificamente reconhece uma seqüência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 3 ou na SEQ ID NO: 4, ou um sítio parcial da mesma.
(9) O anticorpo conforme definido em qualquer um de (1) a (7), o qual especificamente reconhece uma seqüência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 34, ou um sítio parcial da mesma. (10) Um anticorpo ligando a um peptídeo consistindo em uma seqüência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 26.
(11) O anticorpo conforme definido em qualquer um de (1) a
(10), o qual tem uma capacidade para neutralizar atividade de células antiadesivas.
(12) O anticorpo conforme definido em qualquer um de (1) a
(11), o qual é um anticorpo policlonal, anticorpo monoclonal, anticorpo quimérico, anticorpo humanizado ou anticorpo humano.
(13) O anticorpo conforme definido em (12), o qual é um anticorpo monoclonal.
(14) Um anticorpo produzido por uma linhagem celular de hibridoma FERM BP-10718.
(15) Um fragmento de anticorpo consistindo em um fragmento parcial do anticorpo monoclonal conforme definido em (13).
(16) Um derivado de anticorpo compreendendo uma proteína ou fármaco de baixo peso molecular ligado ao anticorpo conforme definido em qualquer um de (1) a (14) ou ao fragmento de anticorpo conforme definido em (15).
(17) Um hibridoma produzindo o anticorpo conforme definido em qualquer um de (1) a (14).
(18) O hibridoma conforme definido em (17), o qual é uma linhagem celular de hibridoma FERM BP-10718.
(19) DNA codificando o anticorpo conforme definido em qualquer um de (1) a (14), o fragmento de anticorpo conforme definido em (15) ou o derivado conforme definido em (16), em que o derivado compreende uma proteína ligada ao anticorpo ou fragmento de anticorpo.
(20) Um vetor recombinante contendo o DNA conforme definido em (19).
(21) Um transformante obtenível introduzindo o vetor recombinante conforme definido em (20) em uma célula hospedeira.
(22) Um método para produzir o anticorpo conforme definido em qualquer um de (1) a (14), o fragmento de anticorpo conforme definido em (15) ou o derivado conforme definido em (16), em que o derivado compreende uma proteína ligada ao anticorpo ou fragmento de anticorpo, o referido método compreendendo cultivar o transformante conforme definido em (21) para produzir o anticorpo, fragmento de anticorpo ou derivado na cultura, e coletar o anticorpo, fragmento de anticorpo ou derivado da cultura.
(23) Uma composição farmacêutica compreendendo o anticorpo conforme definido em qualquer um de (1) a (14), o fragmento de anticorpo conforme definido em (15) ou o derivado conforme definido em (16).
(24) Uma composição farmacêutica para prevenir ou tratar uma doença na qual está envolvida uma isoforma de periostina tendo atividade de células antiadesivas, compreendendo o anticorpo conforme definido em qualquer um de (1) a (14), o fragmento de anticorpo conforme definido em (15) ou o derivado conforme definido em (16).
(25) A composição farmacêutica conforme definido em (24), em que a doença é falência cardíaca, enfarte do miocárdio, dilatação do coração, hipertrofia cardíaca, fibrose cardíaca, cardiomiopatia, miocardite, doença valvular, câncer, aneurisma, arteriosclerose, doença neurodegenerativa central, doença renal, artrite reumatóide, osteoporose, enfisema pulmonar, hipertensão pulmonar, doença pulmonar obstrutiva crônica (DPOC), nefrite, pancreatite, hepatite, fibrose hepática ou fibrose pulmonar.
(26) Um método para prevenir ou tratar uma doença na qual está envolvida uma isoforma de periostina tendo atividade de células antiadesivas, compreendendo administrar a composição farmacêutica conforme definido em (23) a um paciente.
(27) O método conforme definido em (26), em que a doença é falência cardíaca, enfarte do miocárdio, dilatação do coração, hipertrofia cardíaca, fibrose cardíaca, cardiomiopatia, miocardite, doença valvular, câncer, aneurisma, arteriosclerose, doença neurodegenerativa central, doença renal, artrite reumatóide, osteoporosis, enfisema pulmonar, hipertensão pulmonar, doença pulmonar obstrutiva crônica (DPOC), nefrite, pancreatite, hepatite, fibrose hepática ou fibrose pulmonar. (28) Um método para diagnosticar uma doença na qual está envolvida uma isoforma de periostina tendo atividade de células antiadesivas, usando o anticorpo conforme definido em qualquer um de (1) a (14), o fragmento de anticorpo conforme definido em (15) ou o derivado conforme definido em (16).
(29) O método conforme definido em (28) em que o anticorpo é um anticorpo marcado.
(30) O método conforme definido em (28) ou 29, em que a doença é falência cardíaca, enfarte do miocárdio, dilatação do coração, hipertrofia cardíaca, fibrose cardíaca, cardiomiopatia, miocardite, doença valvular, câncer, aneurisma, arteriosclerose, doença neurodegenerativa central, doença renal, artrite reumatóide, osteoporosis, enfisema pulmonar, hipertensão pulmonar, doença pulmonar obstrutiva crônica (DPOC), nefrite, pancreatite, hepatite, fibrose hepática ou fibrose pulmonar.
(31) O anticorpo conforme definido em qualquer um de (1) a (14), o fragmento de anticorpo conforme definido em (15) ou o derivado conforme definido em (16), o qual tenha sido marcado.
(32) Um método para quantificar uma isoforma de periostina tendo atividade de células antiadesivas em uma amostra usando o anticorpo conforme definido em qualquer um de (1) a (14), o fragmento de anticorpo conforme definido em (15) ou o derivado conforme definido em (16).
(33) Um método para detectar uma isoforma de periostina tendo atividade de células antiadesivas em uma amostra usando o anticorpo conforme definido em qualquer um de (1) a (14), o fragmento de anticorpo conforme definido em (15) ou o derivado conforme definido em (16).
(34) Um reagente diagnóstico para uma doença na qual está envolvida uma isoforma de periostina tendo atividade de células antiadesivas, compreendendo o anticorpo conforme definido em qualquer um de (1) a (14), o fragmento de anticorpo conforme definido em (15) ou o derivado conforme definido em (16).
A expressão "seqüência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO:" conforme usado aqui, neste requerimento de patente, inclui variantes da seqüência de aminoácidos obtida eliminando, substituindo ou adicionando um ou mais aminoácidos.
BREVE EXPLANAÇÃO DOS DESENHOS
A figura 1 é um diagrama esquemático apresentando uma variante de junção de periostina de rato.
A figura 2 é um diagrama apresentando resultados do teste das propriedades antiadesivas de células de PN-1 de rato (Exemplo 2).
A figura 3 é um diagrama apresentando resultados do teste da inibição da atividade de PN-1 de rato por anticorpo antipeptídeo Éxon-17 de rato (Exemplo 3).
A figura 4-1 é um diagrama apresentando resultados do teste da inibição da dilatação do coração por anticorpo antipeptídeo Éxon-17 de rato 4 semanas depois da preparação de modelos de enfarte agudo do miocárdio (Exemplo 4: espessura da parede anterior, espessura da parede posterior).
A figura 4-2 é um diagrama apresentando resultados do teste da inibição da dilatação do coração por anticorpo antipeptídeo Éxon-17 de rato 4 semanas depois da preparação de modelos de enfarte agudo do miocárdio (Exemplo 4: diâmetro interno diastólico final, diâmetro interno sistólico final, função cardíaca).
A figura 4-3 é um diagrama apresentando resultados do teste da inibição da dilatação do coração por anticorpo antipeptídeo Éxon-17 de rato 4 semanas depois da preparação de modelos de enfarte agudo do miocárdio (Exemplo 4: freqüência cardíaca, área de enfarte).
A figura 5-1 é um diagrama apresentando resultados do teste da inibição da dilatação do coração por anticorpo antipeptídeo Éxon-17 de rato 8 semanas depois da preparação de modelos de enfarte agudo do miocárdio (Exemplo 4: espessura da parede anterior, espessura da parede posterior).
A figura 5-2 é um diagrama apresentando resultados do teste da inibição da dilatação do coração por anticorpo antipeptídeo Éxon-17 de rato 8 semanas depois da preparação de modelos de enfarte agudo do miocárdio (Exemplo 4: diâmetro interno diastólico final, diâmetro interno sistólico final, função cardíaca). A figura 5-3 é um diagrama apresentando resultados do teste da inibição da dilatação do coração por anticorpo antipeptídeo Éxon-17 de rato 8 semanas depois da preparação de modelos de enfarte agudo do miocárdio (Exemplo 4: freqüência cardíaca, área de enfarte).
A figura 6-1 é um diagrama apresentando hemodinâmica de ratos modelos tratados com anticorpo antipeptídeo Éxon-17 de rato (Exemplo 4: LVP, freqüência cardíaca).
A figura 6-2 é um diagrama apresentando hemodinâmica de ratos modelos tratados com anticorpo antipeptídeo Éxon-17 de rato (Exemplo 4: (+) dP/dt, (-) dP/dt).
A figura 6-3 é um diagrama apresentando hemodinâmica de ratos modelos tratados com anticorpo antipeptídeo Éxon-17 de rato (Exemplo 4: SBP, DBP, LVEDP).
A figura 7 é um diagrama apresentando os resultados da análise histológica de ratos modelos tratados com anticorpo antipeptídeo Éxon-17 de rato (Exemplo 4).
A figura 8 é um diagrama apresentando os diâmetros do eixo menor de células do miocárdio de ratos modelos tratados com anticorpo antipeptídeo Éxon-17 de rato (Exemplo 4).
A figura 9-1 é um diagrama apresentando os resultados da análise da expressão genética de ratos modelos tratados com anticorpo antipeptídeo Éxon-17 de rato (Exemplo 4: G3PDH).
A figura 9-2 é um diagrama apresentando os resultados da análise da expressão genética de ratos modelos tratados com anticorpo antipeptídeo Éxon-17 de rato (Exemplo 4: ET-1/G3, Angiotensinogênio/G3).
A figura 9-3 é um diagrama apresentando os resultados da análise da expressão genética de ratos modelos tratados com anticorpo antipeptídeo Éxon-17 de rato (Exemplo 4: oc-MHC/G3, p-MHC/G3).
A figura 9-4 é um diagrama apresentando os resultados da análise da expressão genética de ratos modelos tratados com anticorpo antipeptídeo Éxon-17 de rato (Exemplo 4: Col-l/G3, Col-lll/G3). A figura 9-5 é um diagrama apresentando os resultados da análise da expressão genética de ratos modelos tratados com anticorpo antipeptídeo Éxon-17 de rato (Exemplo 4: TGF-p/G3, TNF-a/G3).
A figura 10 é um diagrama apresentando resultados do teste das propriedades antiadesivas de células de PN-1 humano (Exemplo 15).
A figura 11 é um diagrama apresentando resultados do teste da inibição da atividade de PN-1 humano por anticorpo monoclonal anti-Éxon- humano (Exemplo 16).
A figura 12-1 é um diagrama apresentando resultados do teste da inibição da dilatação do coração por anticorpo monoclonal anti-Éxon-17 humano 4 semanas depois da preparação de modelos de enfarte agudo do miocárdio (Exemplo 17: espessura da parede anterior, espessura da parede posterior).
A figura 12-2 é um diagrama apresentando resultados do teste da inibição da dilatação do coração por anticorpo monoclonal anti-Éxon-17 humano 4 semanas depois da preparação de modelos de enfarte agudo do miocárdio (Exemplo 17: diâmetro interno diastólico final, diâmetro interno sistólico final, função cardíaca).
A figura 12-3 é um diagrama apresentando resultados do teste da inibição da dilatação do coração por anticorpo monoclonal anti-Éxon-17 humano 4 semanas depois da preparação de modelos de enfarte agudo do miocárdio (Exemplo 17: freqüência cardíaca, área de enfarte).
AS MODALIDADES MAIS PREFERENCIAIS DA INVENÇÃO
Em uma modalidade, a presente invenção proporciona um anticorpo contra uma isoforma de periostina tendo atividade de células antiadesivas. Periostina aqui é uma das proteínas da matriz extracelular e se sabe que inclui algumas variantes de junção, algumas das quais são especificamente expressadas no coração durante falência cardíaca ou similares. Na presente invenção, anticorpos podem ser usados como substâncias (isto é, como inibidores) para inibir funções de uma variante de junção de periostina especificamente expressada no coração durante falência cardíaca ou similar devido a sua alta especificidade, segurança para seres humanos e por outras razões. Na presente invenção, um anticorpo pode ser preparado contra um antígeno composto de um peptídeo sintetizado quimicamente consistindo em uma seqüência de aminoácidos codificada pela região de Éxon-17 do domínio de C-terminal no qual uma variante de junção específica para o coração durante falência cardíaca ou similar é formada, embora um peptídeo similar também possa ser obtido a partir de qualquer fonte por digestão enzimática de proteína periostina ou por técnicas de engenharia genética.
Na presente invenção, a expressão "tendo atividade de células antiadesivas" significa tendo a ação de separar ou eliminar células aderidas. Do mesmo modo, a expressão "não tendo nenhuma atividade de células antiadesivas" significa que células aderidas não são nem separadas nem escamadas. Neste caso, as células mantêm seu estado aderido. A presença ou ausência de atividade de células antiadesivas pode ser determinada cultivando células (por exemplo, fibroblastos do coração) em uma lâmina de cultura para permitir que as células venham a aderir à lâmina de cultura, adicionando uma amostra de teste e adicionalmente cultivando as células, lavando a lâmina para remover células separadas, corando as células restantes, e confirmando o estado das células aderidas.
Na presente invenção, isoformas de periostina tendo atividade de células antiadesivas preferencialmente incluem isoformas de periostina consistindo em uma seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 (periostina de rato PN-1, 838 aminoácidos), SEQ ID NO: 2 (periostina humana PN-1, 836 aminoácidos tendo uma seqüência de sinal N-terminal mais curta por 2 aminoácidos do que a de periostina de rato), ou SEQ ID NO: 8 (periostina de camundongo PN-1). Outras isoformas de periostina tendo atividade de células antiadesivas incluem isoformas de periostina tendo uma seqüência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 3 (27 aminoácidos codificados pelo Éxon-17 de periostina de rato), SEQ ID NO: 4 (27 aminoácidos codificados pelo Éxon-17 de periostina humana) ou SEQ ID NO: 21 (27 aminoácidos codificados pelo Éxon-17 de periostina de camundongo). Exemplos adicionais incluem isoformas de periostina tendo uma seqüência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 22 (9 aminoácidos cobrindo do 1e ao 99 aminoácidos do N-término da seqüência de aminoácidos codificada pelo Éxon-17 de periostina humana), SEQ ID NO: 23 (9 aminoácidos cobrindo do Ie ao 9Q aminoácidos do N-término da seqüência de aminoácidos codificada pelo Éxon-17 de periostina de rato) ou SEQ ID NO: 24 (9 aminoácidos cobrindo do 1a ao 99 aminoácidos do N-término da seqüência de aminoácidos codificada pelo Éxon-17 de periostina de camundongo). Exemplos adicionais incluem isoformas de periostina tendo uma seqüência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 34 (6 aminoácidos cobrindo do 1Q ao 6δ aminoácidos do N-término da seqüência de aminoácidos codificada pelo Éxon-17 de periostina humana).
Regiões responsáveis pela atividade de células antiadesivas de periostina incluem, por exemplo, o sítio de junção do Éxon-17. Exemplos específicos incluem uma parte de resíduo aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 3 de uma isoforma de periostina tendo uma seqüência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 1 (672-698 aminoácidos de SEQ ID NO: 1), uma parte de resíduo aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 4 de uma isoforma de periostina tendo uma seqüência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 2 (670-696 aminoácidos de SEQ ID NO: 2), e uma parte de resíduo aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 21 de uma isoforma de periostina tendo uma seqüência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 8 (672-698 aminoácidos de SEQ ID NO: 8). Exemplos adicionais incluem uma seqüência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 22 ou SEQ ID NO: 23, bem como SEQ ID NO: 34 (uma seqüência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 22 ou SEQ ID NO: 23, bem como uma seqüência de aminoácidos consistindo nos 1Q ao 6e resíduos aminoácidos de N-terminal de SEQ ID NO: 22 ou SEQ ID NO: 23).
Em uma modalidade preferencial da presente invenção, a expressão "capaz de reconhecer especificamente um sítio responsável por anti-adesão celular" significa que uma região responsável por anti-adesão celular de periostina preferencialmente incluindo o sítio de junção do Éxon- 17 pode ser especificamente reconhecida. Por exemplo, anticorpos capazes de reconhecer especificamente um sítio responsável por anti-adesão celular de periostina incluem anticorpos contra uma parte de resíduo aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 3 de uma isoforma de periostina tendo uma seqüência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 1 (672-698 aminoácidos de SEQ ID NO: 1), uma parte de resíduo aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 4 de uma isoforma de periostina tendo uma seqüência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 2 (670-696 aminoácidos de SEQ ID NO: 2), uma parte de resíduo aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 21 de uma isoforma de periostina tendo uma seqüência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 8 (672-698 aminoácidos de SEQ ID NO: 8), ou uma parte da mesma. Exemplos adicionais incluem anticorpos contra um polipeptídeo tendo uma seqüência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 22 ou SEQ ID NO: 23, ou uma parte da mesma. Exemplos adicionais incluem anticorpos contra uma isoforma de periostina tendo uma seqüência de aminoácidos consistindo nos 1Q ao 6o. resíduos aminoácidos de N-terminal de SEQ ID NO: 22 ou SEQ ID NO: 23 (SEQ ID NO: 34).
A expressão "inibindo uma região responsável pela atividade de células antiadesivas de periostian" significa que a ação ou atividade da "região responsável pela atividade de células antiadesivas de periostina" acima é inibida, e mais especificamente significa que a ação ou atividade de periostina é inibida usando, por exemplo, um anticorpo capaz de reconhecer especificamente o sítio acima responsável por atividade de células antiadesivas.
Em uma modalidade, anticorpos da presente invenção são anticorpos monoclonais e anticorpos policlonais obtidos usando os antígenos conforme descrito acima. Os "anticorpos monoclonais" aqui se referem a qualquer anticorpo monoclonal apresentando reatividade contra os antígenos descritos acima, e os "anticorpos monoclonais" incluem anticorpos naturais obtidos imunizando mamíferos tais como camundongos, ratos, hamsters, porcos-da-índia ou coelhos com os antígenos, anticorpos monoclonais quiméricos (anticorpos quiméricos) e anticorpos monoclonais humanizados (anticorpos humanizados; anticorpos enxertados com CDR) que podem ser preparados usando técnicas de recombinação genética, bem como anticorpos monoclonais humanos (anticorpos humanos) que podem ser preparados usando animais transgênicos produtores de anticorpos humanos ou similares. Os anticorpos da presente invenção incluem anticorpos monoclonais tendo qualquer isótipo tal como IgG (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4), IgM, IgA, IgD ou IgE, preferencialmente IgG (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4) ou IgM.
Quando os peptídeos descritos acima devem ser usados como antígenos, podem ser usados sozinhos como antígenos mas também podem ser usados para imunização por adsorção a um material macromolecular tal como polivinil pirrolidona, látex ou metacrilato dê polímetila, ou ligação a uma proteína de veículo tal como KLH (Hemocianina de Keyhole Limpet) ou BSA (albumina sérica bovina), e pode ser usado qualquer método. Geralmente, os peptídeos podem ser ligados preferencialmente a uma proteína de veículo por métodos conhecidos (por exemplo, "New series of Development of Drugs, Vol. 14, Hirokawa Publishing Co., 1991"). Os peptídeos são ligados a uma proteína de veículo através de resíduos cisteína introduzidos no C-ou N-término dos peptídeos de modo que os peptídeos tenham direcionalidade. Reticuladores usados comumente no campo da técnica podem ser usados contanto que sejam adequados para estes fins. Reticuladores adequados incluem succinimidil-4-(N-maleimidometil)ciclohexano-1-carboxilato (nas partes que se seguem abreviado como "SMCC") ou éster de ácido-N- hidroxissuccinimida 3-maleimidobenzóico (MBS). Anticorpos monoclonais são preparados cultivando hibridomas preparados pelo método de fusão celular de Kohler e Milstein (G. Kohler et al Nature (1975) 256,495-7) para secretar os anticorpos e isolar os mesmos das culturas. Isto é, um mamífero é imunizado com um peptídeo tendo uma seqüência de aminoácidos codificada pelo Éxon-17 ou similar e em seguida células produtoras de anticorpos deste animal são fundidas a células de mieloma para dar hibridomas. A pesquisa de hibridomas produtoras de anticorpos ligando ao Éxon-17 é realizada, por exemplo, por um imunoensaio enzimático (nas partes que se seguem abreviado como "ELISA") para sobrenadantes de hibridoma usando uma microlâmina sobre a qual o antígeno tenha sido imobilizado. Animais a serem imunizados não são especificamente limitados, mas incluem vários mamíferos tais como camundongos, ratos, porcos-da- índia, coelhos, carneiro, cabras, gatos, cães, e etc. Entre os animais listados acima, camundongos Balb/c são geralmente usados para preparação de anticorpos monoclonais devido à facilidade de manuseio ou por outras razões, mas também podem ser usadas outras cepas de camundongos. A concentração do antígeno usado para imunização aqui é selecionada para formar quantidades suficientes de linfócitos estimulados antigenicamente. Preferencialmente, 1 a 100 μg de um antígeno é diluído para uma concentração apropriate com salina fisiológica ou similar e suspendido em adjuvante completo de Freund ou adjuvante incompleto de Freund ou similar, e a suspensão é administrada a um animal por injeção intraperitoneal ou subcutânea ou outros meios. A administração é realizada uma vez a várias vezes a cada 2 a 4 semanas. A imunização final normalmente é realizada administrando a solução de 1 a 100 μg do antígeno em salina fisiológica por injeção intravenosa ou subcutânea ou outros meios. Vários dias depois da imunização final, células produtoras de anticorpos tais como linfócitos, preferencialmente células esplênicas ou células de linfonodos, são removidas do animal imunizado por fusão celular. Fusão celular usando células esplênicas como células produtoras de anticorpos é explicada abaixo, embora células produtoras de anticorpos diferentes de células esplênicas também possam ser usadas para fusão celular. Células esplênicas preparadas a partir do baço removido asseticamente 3 a 4 dias depois da imunização final são fundidas a células de mieloma apropriadas na presença de um promotor de fusão. As células de mieloma usadas para fusão podem ser derivadas de mamíferos, mas geralmente as derivadas da mesma espécie que o animal usado para imunização. Várias linhagens celulares já são conhecidas, por exemplo, SP2/0-Ag14(SP2) [Nature, 276, 269(1978)], NS-1-Ag4/1(NS-1), P3-X63Ag8U.1(P3U1) [Curr. Top. Microbiol. Immunol. 81, 1-7(1978): disponíveis na ATCC sob o № ATCC CRL-1597], P3-NS1-1-Ag4-1, P3-X63Ag8(P3), FO, X63Ag8.653(X63.653), 210.RCY3.Ag1.2.3, S194/5XXO.BU1, SKO-007, GM15006TG-A12 e semelhantes são preferencialmente usadas para camundongos, e Y3.Ag1.2.3 e semelhante são preferencialmente usadas para ratos. Promotores de'fusão preferenciais incluem polietileno glicol (PEG) tendo um peso molecular de 1000 a 6000 e vírus Sendai (HVJ). Geralmente, a proporção de células esplênicas e células de mieloma durante fusão é preferencialmente de 10:1 a 2:1.
Hibridomas podem ser separadas das células fundidas por cultura de uma mistura de células esplênicas não fundidas, células de mieloma não fundidas e células fundidas em um meio seletivo inibindo a sobrevida de células de mieloma não fundidas por um período apropriado até as células não fundidas morrerem (cerca de 1 semana). O meio seletivo pode ser, por exemplo, meio HAT médium (meio contendo hipoxantina, aminopterina e timidina). Neste meio seletivo, células de mieloma não fundidas morreram, e células esplênicas não fundidas morreram depois de um certo período de tempo (depois de cerca de 1 semana) porque são células não tumorais, de modo que hibridomas podem ser obtidos selecionando células viáveis. Hibridomas produzindo anticorpos desejados podem ser obtidos por pesquisa de cepas produzindo os anticorpos desejados e clonagem das cepas para preparar anticorpos monoclonais por • limitação da diluição padrão. Deste modo hibridomas obtidos produzindo anticorpos monoclonais da presente invenção podem crescer em meios adequados para seu .crescimento e podem ser prontamente armazenados em freezers profundos ou nitrogênio líquido. Portanto os hibridomas obtidos podem produzir anticorpos cultivando os mesmos em meios nutrientes ou dentro da cavidade abdominal de um mamífero, e os anticorpos produzidos podem ser purificados a partir de sobrenadantes da cultura ou de fluido de ascite ou soro do mamífero. Como um exemplo dos hibridomas da presente invenção, pode ser usado um hibridoma que foi depositado sob FERM BP- 10718 em 1s de novembro de 2006 junto ao International Patent Organism Depositary, o National Institute of Advanced Industrial Science and Technology. Purificação dos anticorpos pode ser realizada por métodos de isolamento / purificação de rotina tais como centrifugação, diálise, salgar com sulfato de amônio ou similar, cromatografia de permuta iônica usando uma coluna DEAE ou similar, filtração por gel, cromatografia por afinidade, e etc. Os isótipos e subclasses de anticorpos monoclonais obtidos deste modo podem ser determinados usando um método de identificação tal como teste de Ouchterlony, ELISA, ou RIA. O teste de Ouchterlony é conveniente mas requer uma operação de concentração se a concentração do anticorpo monoclonal for baixa. Quando se usa ELISA ou RIA, no entanto, os isótipos e subclasses dos anticorpos monoclonais podem ser identificados por reação direta dó sobrenadante da cultura com uma fase sólida adsorvida a antígeno e por uso de anticorpos correspondendo a vários isótipos e subclasses de imunoglobulina como anticorpos secundários. Métodos mais convenientes empregam kits de identificação disponíveis comercialmente (por exemplo, kit Mouse Typer; Bio-Rad) ou similares. A quantificação de proteína pode ser realizada pelo método de Folin-Lowry e cálculo da absorvência a 280 nm [1,4 (OD280) = 1 mg/ml de imunoglobulina]. Os anticorpos monoclonais obtidos deste modo da presente invenção reconhecem especificamente uma seqüência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 1 ou na SEQ ID NO: 2, uma seqüência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 3 ou na SEQ ID NO: 4, uma isoforma de periostina (PN-1) tendo uma seqüência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 34, um peptídeo consistindo em uma seqüência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 3 ou na SEQ ID NO: 4, ou um peptídeo tendo uma seqüência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 34. Preferencialmente, os anticorpos monoclonais da presente invenção podem reconhecer especificamente e ligar a um peptídeo consistindo da seqüência de aminoácidos YTTKIITKVV (SEQ ID NO: 26), isto é, um peptídeo consistindo em uma seqüência de aminoácidos cobrindo do -1Q tirosina ao 9S valina do N-término da seqüência de aminoácidos da cadeia de peptídeo Éxon-17 de periostina humana (SEQ ID NO: 4), e um peptídeo consistindo em uma seqüência de aminoácidos cobrindo do 6699 tirosina ao 679Q valina do N- término da seqüência de aminoácidos de periostina humana PN-1 (SEQ ID NO: 2). A saber, os anticorpos monoclonais da presente invenção podem reconhecer especificamente um sítio de seqüência de aminoácidos (TTKIITKW; SEQ ID NO: 22), ou uma parte da mesma, o qual cobre do treonina de N-ferminal ao 99 valina da seqüência de aminoácidos da cadeia de peptídeo Éxon-17 de periostina humana (SEQ ID NO: 4). Mais preferencialmente, os anticorpos monoclonais da presente invenção podem reconhecer e ligar a um peptídeo compreendendo substituições de alanina no 19 e no 8-1 Oe aminoácidos do N-término de um peptídeo consistindo em uma seqüência de aminoácidos (YTTKIITKW; SEQ ID NO: 26) cobrindo do - 1° tirosina ao 9e valina do N-término da cadeia de peptídeo Éxon-17 de periostina humana (SEQ ID NO: 4). A saber, Os anticorpos monoclonais da presente invenção podem reconhecer especificamente no mínimo um sítio de seqüência de aminoácidos (SEQ ID NO: 34), ou uma parte da mesma, o qual cobre da 1â treonina ao 6- treonina do N-término da seqüência de aminoácidos da cadeia de peptídeo Éxon-17 de periostina humana (SEQ ID NO: 4) ou da seqüência de aminoácidos da cadeia de peptídeo Éxon-17 de periostina de rato (SEQ ID NO: 3). Além disso, os anticorpos monoclonais da presente invenção têm a atividade de suprimir ou inibir as propriedades antiadesivas de células de proteína de periostina-1 humana, isto é, neutralizar as propriedades antiadesivas de células de proteína de periostina-1 humana. Além do mais, os anticorpos monoclonais da presente invenção podem suprimir a dilatação do coração, hipertrofia cardíaca e fibrose cardíaca induzida durante falência cardíaca ou similar para melhorar a função cardíaca.
Quando anticorpos policlonais são usados como anticorpos da presente invenção, os anticorpos policlonais podem ser obtidos por métodos de rotina tais como o método descrito em "New Lecture on Biochemical Experiments, 12, editado pela Japanese Biochemical Society, Tokyo Kagaku Dozin, 1992". Animais a serem imunizados não são especificamente limitados, mas incluem cavalos, cabras, carneiro, coelhos, porcos-da-índia, camundongos, galinhas e etc. Quando um coelho deve ser imunizado, um antígeno é diluído para uma concentração apropriada com salina fisiológica ou similar e suspendido em adjuvante completo de Freund, adjuvante incompleto de Freund ou adjuvante de hidróxido de alumínio ou similares, e a suspensão é injetada em uma dose de 10 a 1000 μg por animal seguida por 1 a 3 injeções de reforço depois de 2 a 4 semanas para dar anti-soros.
Injeção subcutânea multissítio é preferencial. Preparação de anticorpos policlonais a partir de anti-soros pode ser realizada pelo método conforme descrito para a purificação de anticorpos monoclonais. Deste modo anticorpos policlonais obtidos da presente invenção especificamente reconhecem uma seqüência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 1 ou na SEQ ID NO: 2, uma seqüência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 3 ou na SEQ ID NÒ: 4, uma isoforma de periostina (PN-1) tendo uma seqüência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 34, um peptídeo consistindo em uma seqüência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 3 ou na SEQ ID NO: 4, ou um peptídeo tendo uma seqüência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 34. Preferencialmente, os anticorpos policlonais da presente invenção podem especificamente reconhecer e ligar a um peptídeo consistindo da seqüência de aminoácidos YTTKIITKVV (SEQ ID NO: 26), isto é, um peptídeo consistindo em uma seqüência de aminoácidos cobrindo o —18 tirosina ao 9S valina do N-término da seqüência de aminoácidos da cadeia de peptídeo Éxon-17 de periostina humana (SEQ ID NO: 4), e um peptídeo consistindo em uma seqüência de aminoácidos cobrindo do 6699 tirosina ao 679° valina do N-término da seqüência de aminoácidos de periostina humana PN-1 (SEQ ID NO: 2). A saber, os anticorpos policlonais da presente invenção podem reconhecer especificamente um sítio de seqüência de aminoácidos (TTKIITKVV; SEQ ID NO: 22), ou uma parte do mesmo, o qual cobre do treonina de N-terminal a 9a valina da seqüência de aminoácidos da cadeia de peptídeo Éxon-17 periostina humana (SEQ ID NO: 4). Mais preferencialmente, os anticorpos policlonais da presente invenção podem reconhecer e ligar a um peptídeo compreendendo substituições de alanina no 1° e no 8-10° aminoácidos do N-término de um peptídeo consistindo em uma seqüência de aminoácidos (YTTKIITKVV; SEQ ID NO: 26) cobrindo a 1a tirosina a 9- valina do N-término da cadeia de peptídeo Éxon-17 de periostina humana (SEQ ID NO: 4). A saber, os anticorpos policlonais da presente invenção podem reconhecer especificamente no mínimo um sítio de seqüência de aminoácidos (SEQ ID NO: 34), ou unia parte da mesma, o qual cobre do 1- treonina ao 69 treonina do N-término da seqüência de aminoácidos da cadeia de peptídeo Éxon-17 de periostina humana (SEQ ID NO: 4) ou da seqüência de aminoácidos da cadeia de peptídeo Éxon-17 de periostina de rato (SEQ ID NO: 3). Além disso, os anticorpos policlonais da presente invenção têm a atividade de suprimir ou inibir as propriedades antiadesivas de células de proteína de periostina-1 humana, isto é, neutralizar as propriedades antiadesivas de células de proteína de periostina-1 humana. Além do mais, os anticorpos policlonais da presente invenção podem suprimir a dilatação do coração, hipertrofia cardíaca e fibrose cardíaca induzida durante falência cardíaca ou similar para melhorar a função cardíaca. Preparação de anticorpos humanizados
Imunoglobulina G (nas partes que se segue referida simplesmente como "IgG") consiste em duas cadeias de polipeptídeo leves tendo um peso molecular de cerca de 23000 (nas partes que se segue referida como "cadeia leve") e duas cadeias de polipeptídeo pesadas tendo um peso molecular de cerca de 50000 (nas partes que se segue referida como "cadeia pesada"). As cadeias pesada e leve têm ambas uma estrutura de repetição de regiões de seqüência de aminoácidos conservadas consistindo em cerca de 110 resíduos, as quais constituem uma unidade básica de estrutura tridimensional de IgG (nas partes que se segue referida como "domínio"). As cadeias pesada e leve consistem de 4 e 2 domínios sucessivos, respectivamente. Tanto nas cadeias pesada e leve, a seqüência de aminoácidos do domínio de terminal amino é mais variável entre moléculas de anticorpo diferente da dos outros domínios, e este domínio é denominado domínio variável (nas partes que se segue referida como "domínio V"). No término amino da IgG, os domínios V das cadeias pesada e leve são complementarmente associadas para formar uma região variável. Em contraste, os domínios restantes formam coletivamente uma região constante. A região constante tem uma seqüência característica de cada espécie animal, por exemplo, a região constante de IgG de camundongo difere da região constante de IgG humana de modo que IgG de camundongo é reconhecida como substância estranha pelo sistema imune humano, resultando em uma reação de anticorpo anticamundongo humano (nas partes que se segue referido como "HAMA" (Human Anti Mouse Antibody)) (Schroff RW. et al. Câncer Res. (1985) 45,879-85). Portanto, anticorpos de camundongo não podem ser administrados repetidamente a seres humanos. De modo a administar os anticorpos referidos a seres humanos, as moléculas de anticorpos devem ser modificadas para prevenir reação HAMA ao mesmo tempo que mantendo a especificidade dos anticorpos. De acordo com os resultados de cristalografia de raios X, um domínio semelhante geralmente está sob a forma de uma estrutura cilíndrica elíptica formada de duas folhas beta antiparalelas consistindo em 3 a 5 cadeias beta. Na região variável, três alças para cada um dos domínios V das cadeias pesada e leve são reunidas para formar um sítio de ligação ântigênica. Estas alças são denominadas regiões determinantes de complementaridade (nas partes que se seguem referidas como "CDRs"), as quais são as mais variáveis na seqüência de aminoácidos. As partes remanescentes da região variável diferente das CDRs servem para manter as estruturas das CDRs e são denominadas "framework'. Kabatt et al. coletaram uma série de seqüências primárias de regiões variáveis de cadeia pesada e leve e prepararam uma tabela classificando as seqüências primárias em CDRs e frameworks com base na conservação de seqüência (Kabatt et al. SEQUENCES OF IMMUNOLOGICAL INTEREST, 5th edition, NIH publication, Ns 91-3242, E.A.). Os frameworks foram adicionalmente classificados em uma pluralidade de subgrupos tendo padrões de seqüências de aminoácidos comuns. Também foi vista a presença de um framework de consenso entre seqüências humanas e de camundongos. Os estudos referidos sobre características estruturais de IgG levou ao desenvolvimento dos processos para preparar os anticorpos humanizados descritos abaixo. Em um estágio anterior dos estudos, foram propostos anticorpos quiméricos tendo uma região variável de um anticorpo de camundongo fundido a uma região constante de um anticorpo humano (Morrison SL. et al Proc Natl Acad Sci U.S.A. (1984)81, 6851-5). No entanto, os anticorpos quiméricos referidos podem induzir uma resposta HAMA, especialmente quando são administrados por um longo termo, porque eles ainda contêm muitos resíduos aminoácidos não-humanos (Begent et al., Br. J. Câncer, (1990)62, 487).
Foi proposto um método para reduzir adicionalmente resíduos aminoácidos derivados de um mamífero não humano que pode induzir uma reação HAMA a humanos transferindo somente as CDRs para um anticorpo humano (Peter T et al. Nature, (1986) 321, 522-5), mas enxertação de somente as CDRs normalmente foi insuficiente para manter atividade de imunoglobulina contra o antígeno. Por outro lado, Chothia et al. usaram dados cristalográficos de raios X em 1987 para descobrir que (a) as seqüências de aminoácidos das CDRs contêm um sítio ligando diretamente ao antígeno e um sítio mantendo as estruturas das CDRs, e possíveis estruturas tridimensionais das CDRs são classificadas em múltiplos padrões típicos (estruturas canônicas), e que (b) as classes das estruturas canônicas são determinadas por não somente as CDRs mas também os tipos de aminoácidos em localizações específicas sobre o framework (Chothia C. et al. J. Mol. Biol. (1987)196, 901-17). Com base neste achado, um documento sugeriu que quando se usa enxertação de CDR, resíduos aminoácidos sobre uma parte do framework também devem ser enxertados em um anticorpo humano além das seqüências de CDR (JPA N9 HEI-4-502408). Geralmente, um anticorpo derivado de um mamífero não humano tendo CDRs a serem enxertadas é definido como "doador", e um anticorpo humano no qual as CDRs são enxertadas é definido como "aceitador", e considerações em enxertação de CDR devem conservar as estruturas das CDRs na extensão possível para manter a atividade da molécula de imunoglobulina. Para atingir este objetivo, deve-se ter dois pontos em mente, isto é, (a) qual subgrupo de aceitador deve ser selecionado, e (b) qual resíduo aminoácido deve ser selecionado do framework do doador. Queen et al. propuseram métodos para criar imunoglobulinas em que um resíduo aminoácido no frameworkóe um doador é enxertado em um aceitador além das seqüências de CDR quando é satisfeito no mínimo um dos seguintes critérios (JPA N9 HEI-4-502408):
(a) o aminoácido na região de framework do aceitador é raro para esta posição e o aminoácido correspondente no doador é comum para esta posição;
(b) o aminoácido é imediatamente adjacente a uma das CDRs;
ou
(c) é previsto que o aminoácido tem um átomo de cadeia lateral dentro de cerca de 3 Ângstroms das CDRs em um modelo de imunoglobulina tridimensional e é capaz de interagir com o antígeno ou com as CDRs do anticorpo humanizado.
O DNA codificando a cadeia pesada ou leve de um anticorpo monoclonal anti-Éxon-17 da presente invenção pode ser obtido por preparação de RNAm de células de hibridoma produzindo o anticorpo monoclonal anti-Éxon-17, conversão do RNAm em cDNA por transcriptase reversa e em seguida isolamento do DNA codificando a cadeia pesada ou leve do anticorpo.
Preparação de anticorpos humanos
Conforme usado aqui, neste requerimento de patente, o "anticorpo humano" ou "imunoglobulina humana" significa uma imunoglobulina na qual todas as regiões constituindo a imunoglobulina incluindo regiões variáveis de cadeia pesada (VH) e regiões constantes de cadeia pesada (CH) bem como regiões variáveis de cadeia leve (VL) e regiões constantes de cadeia leve (CL) são derivadas de genes codificando uma imunoglobulina humana. Em outras palavras, significa um anticorpo no qual a cadeia pesada é derivada de um gene de cadeia pesada de imunoglobulina humana e a cadeia leve é derivada de um gene de cadeia leve de imunoglobulina humana. Anticorpos humanos podem ser preparados por métodos de rotina, por exemplo, por imunização de um animal transgênico preparado por integração de no mínimo um gene de imunoglobulina humana no lócus de um mamífero não humano tal como um camundongo com um antígeno, na mesma maneira conforme descrito acima para a preparação de anticorpos monoclonais. Por exemplo, camundongos transgênicos produzindo anticorpos humanos podem ser preparados pelos métodos descritos em documentos anteriores (Mendez MJ et al. Nature Genetics (1997)15, 146-56, Green LL et al. Nature Genetics (1994)7, 13-21, JPA HEI-4-504365; Publicação Internacional N° WO 94/25585; Nikkei Science, June, pp. 40-50, 1995; Nils Lonberg et al. Nature (1994) 368, 856-9, e JPA N° H El-6-500233).
Anticorpos usados na presente invenção não são limitados a moléculas de anticorpos inteiras e podem ser fragmentos de anticorpos ou derivados na medida que podem inibir (suprimir) a atividade de uma isoforma de periostina tendo atividade de células antiadesivas.
Fragmentos de anticorpos incluem, por exemplo, Fab, F(ab')2, Fv, anticorpo de cadeia única (scFv), anticorpo dissulfeto-estabilizado (dsFv), um peptídeo contendo CDR e etc.
Entre os fragmentos de anticorpos da presente invenção, Fab, F(ab')2 e semelhantes podem ser obtidos tratando um anticorpo inibindo a atividade de células antiadesivas de periostina com uma enzima proteolítica tal como papaína ou pepsina, ou alternativamente, pode ser preparado construindo um gene codificando o fragmento de anticorpo resultante e introduzindo este constructo em um vetor de expressão, seguido por expressão em uma célula hospedeira apropriada.
Entre os fragmentos de anticorpos da presente invenção, scFv pode ser preparado encadeando junto uma região V de cadeia H e uma região V de cadeia L de um anticorpo inibindo a atividade de células antiadesivas de periostina usando um encadeador de peptídeo apropriado ou similar. Alternativamente, scFv pode ser preparado construindo um segmento de DNA codificando as seqüências inteiras ou seqüências de aminoácidos desejadas de um gene codificando uma cadeia H ou região V de cadeia H do anticorpo acima e um gene codificando uma cadeia L ou região V de cadeia L do anticorpo, e introduzindo este constructo em um vetor de expressão, seguido por expressão em uma célula hospedeira apropriada.
Entre os fragmentos de anticorpos da presente invenção, dsFv é um fragmento de anticorpo no qual polipeptídeos modificados para substituir um resíduo aminoácido por um resíduo cisteína em ambas as regiõres V de cadeia H quanto L de um anticorpo inibindo a atividade de células antiadesivas de periostina são encadeados juntos entre estes resíduos cisteína através de uma ligação dissulfeto. Um resíduo aminoácido a ser substituído por um resíduo cisteína pode ser selecionado por estimativa estereoestruturál do anticorpo. dsFv pode ser preparado construindo um segmento de DNA codificando a seqüência inteira ou uma seqüência de aminoácidos desejada de um gene codificando o fragmento de anticorpo, e introduzindo este constructo em um vetor de expressão, seguidao por expressão em uma célula hospedeira apropriada.
Entre os fragmentos de anticorpos da presente invenção, um peptídeo contendo CDR compreende no mínimo uma ou mais regiões de CDR selecionadas entre regiões de CDR em cadeias H ou L de um anticorpo inibindo a atividade de células antiadesivas de periostina. Além disso, múltiplas regiões de CDR podem ser encadeadas juntas por técnicas usando um encadeador de peptídeo apropriado ou similar. O peptídeo contendo CDR também pode ser preparado construindo um segmento de DNA codificando a seqüência inteira ou uma seqüência de aminoácidos desejada de um gene codificando o peptídeo, e introduzindo este constructo em um vetor de expressão, seguido por expressão em uma célula hospedeira apropriada. Alternativamente, o peptídeo contendo CDR também pode ser preparado por síntese química tal como método Fmoc ou tBoc.
Na presente invenção, também é possível usar derivados dos anticorpos ou fragmentos de anticorpos acima, os quais são modificados para ter uma proteína ou composto de baixo peso molecular ligado aos mesmos. Estas modificações podem ser realizadas por técnicas conhecidas.
DNAs codificando os anticorpos, fragmentos de anticorpos e seus derivados ligados a proteína da presente invenção podem ser determinados em uma maneira de rotina. Além disso, vetores recombinantes contendo os DNAs podem ser preparados em uma maneira de rotina e introduzidos em uma maneira de rotina em células hospedeiras para criar transformantes'. Além disso, estes anticorpos, fragmentos de anticorpos e seus derivados ligados a proteína podem ser preparados em uma maneira de rotina cultivando os transformantes para produzir os anticorpos, fragmentos de anticorpos e seus derivados ligados à proteína nas culturas, e coletando os anticorpos, fragmentos de anticorpos e seus derivados ligados à proteína das culturas.
Em uma modalidade, os anticorpos, fragmentos de anticorpos ou derivados da presente invenção podem ser usados para prevenir ou tratar doenças nas quais está envolvida uma isoforma de periostina tendo atividade de células antiadesivas. "Doenças nas quais está envolvida uma isoforma de periostina tendo atividade de células antiadesivas" se referem a doenças durante as quais um gene de uma isoforma de periostina tendo atividade de células antiadesivas é altamente expressado e a produção de uma proteína codificada pelo gene está aumentada. Também se referem a doenças cuja patologia é exacerbada por um aumento no gene ou proteína. As doenças referidas nas quais está envolvida uma isoforma de periostina tendo atividade de células antiadesivas não são especificamente limitadas, mas incluem falência cardíaca, enfarte do miocárdio, aumento (dilatação) do coração, hipertrofia cardíaca, fibrose cardíaca, cardiomiopatia, miocardite, doença valvular, .cânceres, aneurismas, arteriosclerose, doença neurodegenerativa central, doenças renais, artrite reumatóide, osteoporose, enfisema pulmonar, hipertensão pulmonar, doença pulmonar obstrutiva crônica (DPOC), nefrite (aguda e crônica), pancreatite (aguda e crônica), hepatite (aguda e crônica), fibrose hepática ou fibrose pulmonar. Cânceres aos quais os anticorpos da presente invenção podem ser aplicados incluem, mas não estão limitados a, cânceres de mama, intestino grosso, pulmão, melanoma maligno, osso, pâncreas, estômago, pele, útero, ovário, reto, cólon, útero, trompa de falópio, esôfago, intestino delgado, tireóide, paratireóide, glândula adrenal, próstata, bexiga e rim, especialmente cânceres de mama, intestino grosso, pulmão e melanoma maligno.
A presente invenção também proporciona um reagente diagnóstico para uma doença (por exemplo, falência cardíaca) na qual está envolvida uma isoforma de periostina tendo atividade de células antiadesivas, preparada por marcação de um anticorpo conforme descrito acima com um marcador. Marcadores que podem ser usados aqui incluem enzimas, radioisótopos, corantes fluorescentes e etc. As enzimas usadas aqui não são especificamente limitadas na medida que satisfazem critérios tais como alto número de renovação, estabilidade mesmo depois de conjugação, e a capacidade para reagir especificamente com seus substratos para desenvolver cor, e etc., e podem ser usadas enzimas usadas em imunoensaios enzimáticos de rotina (EIA). Exemplos de enzimas preferenciais incluem peroxidases, β-galactosidases, fosfatases alcalinas, glicose oxidase, acetilcolina esterase, glicose-6-fosfato deidrogenase, malato deidrogenase, e etc. Inibidores enzimáticos e coenzimas e semelhantes também podem ser usados.
A conjugação destas enzimas e anticorpos pode ser realizada por métodos conhecidos usando reticuladores tais como compostos de maleimida. Substratos que podem ser usados são materiais conhecidos, selecionados dependendo das enzimas usadas. Por exemplo, quando a enzima usada é uma peroxidase, pode ser usado 3,3',5,5'- tetrametilbenzidina, ou quando a enzima usada é uma fosfatase alcalina, pode ser usado paranitrofenol ou similar. Radioisótopos que podem ser usados como marcadores incluem aqueles usados no radioimunoensaio (RIA) de rotina tais como 1251 e 3H. Corantes fluorescentes que podem ser usados são aqueles usados no fluoroimunoensaio de rotina tais como isotiocianato de fluorescência (FITC) e isotiocianato tetrametil rodamina (TRITC). O presente reagente diagnóstico também pode ser usado como colocação imunohistológica capaz de corar especificamente tecido intersticial do coração afetado. Quando é marcado com um radioisótopo, também pode ser usado para estudar por imagens a lesão durante falência cardíaca por administração interna.
A presente invenção também proporciona um método para detectar ou quántificar uma isoforma de periostina tendo atividade de células antiadesivas em uma amostra biológica obtida preparando soro de sangue humano ou animal, isto é, em soro, compreendendo o uso do anticorpo, fragmento de anticorpo ou derivado da presente invenção. A presente invenção adicionalmente proporciona um método para diagnosticar uma doença (por exemplo, falência cardíaca) na qual está envolvida uma isoforma de periostina tendo atividade de células antiadesivas, compreendendo detecção ou quantificação da isoforma de periostina. No presente método, uma isoforma de periostina tendo atividade de células antiadesivas pode ser detectada por um denominado sanduíche ELISA (ensaio imunossorvente ligado a enzima). Quando o kit diágnóstico da presente invenção é usado, uma amostra é inicialmente contactada com uma lâmina sobre a qual um anticorpo antiperiostina primário foi imobilizado para formar um complexo, e um anticorpo antiperiostina secundário marcado com um marcador é ligado a este complexo, e em seguida a intensidade de sinal do marcador neste complexo ternário é medido, por meio do que uma isoforma de periostina tendo atividade de células antiadesivas pode ser detectada ou quantificada. Em particular, como uma isoforma de periostina tendo atividade de células antiadesivas é uma variante de junção a qual é especificamente expressada durante a patologia de falência cardíaca ou similar, a patologia em falência cardíaca ou similar pode ser diagnosticada monitorando sua produção.
Deste modo, um anticorpo da presente invenção pode ser usado aqui como o anticorpo secundário por marcação do anticorpo.
Composições farmacêuticas compreendendo os anticorpos, fragmentos de anticorpos ou derivados da presente invenção como ingredientes ativos podem ser preparados usando carregadores e/ou excipientes ou outros aditivos, os quais são usados em técnicas de formulação de rotina. Os ingredientes ativos das composições farmacêuticas de acordo com a presente invenção são preferencialmente administrados em mistura com carregadores, excipientes, diluentes ou similares farmacologicamente aceitáveis por qualquer modo de administração usado comumente para preparações farmacêuticas, por exemplo, pela via oral ou parenteral (por exemplo, intravenosa, intramuscular ou subcutânea). Por exemplo, as composições farmacêuticas da presente invenção podem ser preparadas misturando apropriadamente os ingredientes ativos com carregadores, aromas, excipientes, estabilizantes, diluentes, emulsificantes, soluções, suspensões, xaropes ou similares fisiologicamente aceitáveis, e podem ser usados sob a forma de comprimidos, pós, grânulos, soluções ou similar. Aditivos os quais podem ser incorporados em comprimidos ou similares incluem, por exemplo, aglutinantes tais como gelatina e lubrificantes tais como amido de milho. Comprimidos também podem ser revestidos com um revestimento de açúcar ou uma película gástrica ou entérica. Na forma de dosagem de cápsulas, as composições acima podem compreender adicionalmente carregadores líquidos. Composições estéreis injetáveis também podem ser preparadas aplicando fórmulas de rotina. Veículos aquosos injetáveis incluem soluções isotônicas contendo glicose e semelhante, os quais podem ser usados em combinação com solubilizantes apropriados tais como polietileno glicol e etc. As composições também podem ser incorporadas com tampões, estabilizantes, conservantes, antioxidantes, agentes sedativos e semelhantes. Para administração oral, quando os ingredientes ativos têm a probabilidade de serem decompostos no trato digestivo, as composições podem ser administradas por via oral como formulações que são resistentes a decomposição no trato digestivo, por exemplo, como microcápsulas encapsulando os ingredientes ativos dentro de lipossomas. Também é possível usar outros modos de administração pretendidos para absorção através de membranas mucosas diferentes do trato digestivo, inclusive vias retal, intranasal, sublingual e transpulmonar. Neste caso, as composições podem ser administradas sob a forma de supositórios, gotas nasais, comprimidos sublinguais, agentes transpulmonares ou similar.
Quando as composições farmacêuticas da presente invenção são usadas pára fins terapêuticos, sua dosagem é determinada em uma dosagem terapeuticamente eficaz, a qual varia dependendo, por exemplo, da idade e do peso corporal de um sujeito ao qual a composição deve ser administrada, da gravidade dos sintomas e da via de administração, e portanto a administração é determinada em uma base individual. Em geral, a dosagem diária para adulto para administração oral é cerca de 0,1 a 1000 mg, administrada como uma dose única ou em doses divididas. Para administração intravenosa contínua, as composições podem ser administradas na faixa de 0,01 μg/kg/min a 1,0 μg/kg/min, desejavelmene 0,025 μg/kg/min a 0,1 μg/kg/min.
Os exemplos seguintes ilustram adicionalmente a presente invenção em detalhes e especificamente, sem, no entanto, limitar deste modo a invenção. EXEMPLOS
[Exemplo de preparação 1] Pesquisa para periostina por subtração 1-1 Preparação de ratos modelo patológico de falência cardíaca e coleção de amostras ventriculares esquerdas
•Ratos machos Dahl sensíveis a sal (DahI-S) (Shimizu Laboratory Supplies) foram criados em uma dieta a 8% de sal elevado a partir de 6 semanas de idade, e o ventrículo esquerdo foi coletado de três animais cada no estágio de hipertrofia cardíaca (11 semanas de idade) e no estágio de falência cardíaca (14 semanas de idade). 1-2 Preparação de mRNA
RNA total foi preparado a partir de cerca de 500 mg do ventrículo esquerdo usando ISOGEN (Nippon Gene) conforme instruído pelo fabricante. Em seguida, RNAm foi purificado a partir dé cerca de 40 μg do RNA total combinado de três animais cada no estágio de hipertrofia cardíaca e estágio de falência cardíaca usando Fast Track 2.0 Kit (Invitrogen) conforme instruído pelo fabricante para recuperar cerca de 3 μg de RNAm em cada estágio.
1 -3 Subtração de cDNA
Foi realizada subtração de cDNA usando kit de subtração de cDNA PCR-SeIect (CIontech) conforme instruído pelo fabricante. Isto é, cDNA foi sintetizado a partir de 2 μς de cada RNAm obtido em 1-2 acima e digerido com a enzima de restrição Rsal. Em seguida, foi realizada hibridização de subtração usando o cDNA sintetizado a partir dos animais com 14 semanas de idade como cDNA verificador e o cDNA sintetizado a partir dos animais com 11 semanas de idade como cDNA condutor depois de 2 adaptadorés incluídos no kit terem sido encadeados separadamente ao cDNA verificador. Em seguida, um fragmento de cDNA com nível de expressão alterado foi especificamente amplificado por PCR usando iniciadores complementares aos adaptadorés para dar o produto de amplificação 1.
Foi realizada uma operação de subtração similar usando o cDNA sintetizado a partir dos animais com 11 semanas de idade como cDNA verificador e o cDNA sintetizado a partir dos animais com 14 semanas de idade como cDNA condutor para dar o produto de amplificação 2.
1-4 Triagem de dotblot
A. Preparação de dotblots
O produto de amplificação 1 foi clonado por TA em um vetor de PCR II (Invitrogen) e clones tendo o fragmento de inserto foram selecionados. O fragmento de inserto de cada clone foi amplificado por reação de PCR, e em seguida 1 μl cada da solução de reação foi tratado termicamente e em seguida dot blotted sobre 2 filtros de membrana de náilon (Boehringer) e fixado com um reticulador UV (Stratagene).
B. Preparação de sondas de cDNA
O produto de amplificação 1 foi digerido com as enzimas de restrição Rsal e Eael, Smal para remover os adaptadorés e submetido a marcação de prime aleatória com DIG-dUTP usando o kit de marcação / detecção de DNA: DIG High Prime DNA kit II (Boehringer) conforme instruído pelo fabricante para preparar sonda de cDNA 1. Similarmente, foi preparada a sonda de cDNA 2 a partir do produto de amplificação 2.
C. Triagem
Uma das membranas de dot blot preparadas em A acima foi hibridizada com sonda de cDNA e a outra com sonda de cDNA 2. Especificamente, foi realizada hibridização em solução DIG Easy Hyb a 42°C de um dia para o outro usando o kit de marcação / detecção de DNA: DiG High Prime DNA kit II (Boehringer) conforme instruído pelo fabricante. As membranas foram lavadas duas vezes com 2 x SSC1 0,1% de SDS em temperatura ambiente por 5 minutos e duas vezes com 0,1 x SSC, 0,1% de SDS a 68°C por 15 minutos, e em seguida reagidas com anticorpos DIG marcados com fosfatase alcalina no tampão de bloqueio incluído no kit, e em seguida CSPD pronto para uso foi adicionado para fomentar a quimiluminescência e filme de raios X foi exposto. Clones apresentando um sinal mais forte na sonda de cDNA 1 do que sonda de cDNA 2 foram selecionados como clones positivos e seqüenciados.
1-5 Seqüenciamento
As seqüências de nucleotídeos foram determinadas por análise em um modelo de seqüenciamento de DNA automático 373A (PE Applied Biosystems) usando kit de seqüenciamento de ciclo terminador de corante THERMO Sequenase® II (Amersham Pharmacia). Seqüências genéticas obtidas deste modo foram comparadas com seqüências no banco de dados GenBank para revelar que um dos clones (SF014) foi um gene tendo uma homologia de 86% com periostina de camundongo (GenBank N- de Acesso D13664).
[Exemplo de preparação 2] Clonagem de cDNA de periostina de rato
cDNA de periostina de rato foi isolado por triagem de 10 subgrupos de fagos de cerca de 4000 clones (um total de cerca de 40.000 clones) preparados a partir de uma biblioteca de cDNA de aorta de rato (Clontech) inseridos em vetor Dgt11 por PCR usando os iniciadores (1) 5'- GTTCATTGAAGGTGGCGATGGTC-3' (SEQ ID NO: 15), e (2) 5'- GAGATAAAATCCCTGCATGGTCCT-31 (SEQ ID NO: 16) designados com base na seqüência de nucleotídeos de SF014 para dar 3 subgrupos positivos. Um dos subgrupos foi triado por hibridização usando o fragmento amplificado por PCR como uma sonda marcada com fosfatase alcalina usando AIkPhos Direct® (Amersham Pharmacia) para dar um clone positivo de periostina de rato n9 1. Seu fragmento de inserto foi subclonado no sítio EcoRI de pBluescript II (Stratagene) e a seqüência total de nucleotfdeos foi determinada de acordo com o método do Exemplo de preparação 1-5.
O clone resultante tinha uma extensão de cerca de 3 kb correspondendo o nucleotídeo 292 até a extremidade 3' de periostina de camundongo (GenBank Accession Ne D13664), sugerindo que era um clone 5'-truncado.
Portanto, foi usado o kit de amplificação de cDNA SMART® RACE cDNA Amplification Kit (CIontech) conforme instruído pelo fabricante para realizar a reação 5'-RACE usando cDNA de aorta de rato como um tempiate e o iníciador (2) Si-Gagataaaatccctgcatggtcct-S' (seq id NO: 16) e um iniciador (3) 5'-CACGGTCGATGACATGGACAACACC-3' (SEQ ID NO: 17) designado com base na seqüência de nucleotídeos de periostina de rato n5 1. O produto de PCR resultante foi clonado por TA no vetor de PCR Il de Invitrogen para dar um clone designado como periostina de rato 5'RACE ne 1. A seqüência de nucleotídeos foi determinada de acordo com o método do Exemplo de preparação 1-5.
Os resultados mostraram que periostina de rato 5'RACE n- 1 foi um clone maior por cerca de 300 bp do que a periostina de rato n9 1 inicialmente obtida na direção 5' com a extremidade 5' sendo mais longa por 15 bp do que a extremidade 5' de periostina de camundongo (GenBank Accession N° D13664). Dez subgrupos de fagos de cerca de 40.000 clones (um total de cerca de 400.000 clones) preparados a partir da biblioteca de cDNA de aorta de rato foram triados por PCR usando um iniciador (4) 5'- ACGGAGCTCAGGGCTGAAGATG-3' (SEQ ID NO: 18) designado com base na seqüência de nucleotídeos de periostina de rato 5'RACE n91 e o iniciador (3) 5'-CACGGTCGATGACATGGACAACACC-3' (SEQ ID NO: 17) para dar 2 subgrupos positivos. Um dos subgrupos foi triado por hibridização usando o fragmento amplificado por PCR como uma sonda para dar um clone positivo designado como periostina de rato n9 2. O fragmento de inserto foi subclonado no sítio EcoRI de pBluescript Il (Stratagene) e a seqüência de nucleotídeos foi determinada de acordo com o método do Exemplo de preparação 1-5.
O clone resultante tinha uma extensão de cerca de 2,6 kb com a extremidade 5' sendo a mesma que a do clone obtido com S1-RACE e a extremidade 3' correspondendo a até o nucleotídeo 2410 de periostina de camundongo (GenBank Accession Nq D13664). A seqüência de nucleotídeos de periostina de rato 5'RACE nQ 1 previamente obtida era exatamente a mesma que a seqüência de nucleotídeos da região relevante de periostina de rato ns 2. A extensão inteira dè cDNA de periostina de rato foi completada por periostina de rato n9 1 e periostina de rato n- 2. A seqüência de nucleotídeos deste cDNA de extensão inteira e a seqüência de aminoácidos traduzida desta seqüência de nucleotídeos são mostradas como SEQ ID NOs: 6 e 1.
[Exemplo de preparação 3] Construção de um vetor de expressão de proteína de fusão Myc-His-periostina de rato
Foi preparado um vetor de expressão tendo um epitopo Mye e 6 etiquetas de histidina no término carboxila da proteína traduzida da região codificante do gene de periostina de rato obtido no Exemplo de preparação 2, e tendo um promotor de CMV.
Inicialmente, um fragmento de cerca de 500 bp obtido por digestão de periostina de rato 5'RACE n9 1 obtida no Exemplo de preparação 2 com as enzimas de restrição EcoRI e Hindlll e um fragmento de cerca de 2780 bp obtido por digestão de periostina de rato n9 1 obtido no Exemplo de preparação 2 com as enzimas de restrição Hindlll e Hpal foram ligados a um fragmento de vetor obtido digerindo vetor pTracer-CMV2 (Invitrogen) com as enzimas de restrição EcoRI e EcoRV usando um kit de ligação (Takara Bio Inc.) para dar um plasmídeo designado como pTracer- CMV2/periostina de rato. pTracer-CMV2/periostina de rato preparado deste modo foi digerido com as enzimas de restrição EcoRI e Smal para dar um fragmento de cerca de 2330 bp contendo a região codificante do gene de periostina de rato, e foi realizado PCR usando periostina de rato ns 1 obtida no Exemplo de preparação 2 como um template e iniciador (5) 5'- GACCCGGGAAGAACGCATCATC-3' (SEQ ID NO: 19) designado com base na seqüência do template e iniciador (6) 5'- TGGGTGACCCTGAGAACGGCCTTCTCTTGATC-31 (SEQ ID NO: 20) designado para inserir um sítio BstEII imediatamente antes do códon de parada de periostina de rato e o produto de amplificação foi purificado e em seguida digerido com as enzimas de restrição Smal e BstEII para dar um fragmento de cerca de 270 bp. Estes dois fragmentos foram ligados a um fragmento vetoriàl obtido por digestão de um vetor de expressão construindo o plasmídeo pcDNA4/Myc-His/type C (Invitrogen) com as enzimas de restrição EcoRI e BstEII usando um kit de ligação (Takara Bio Inc.) para dar um plasmídeo designado como pcDNA4/Myc-His/periostina de rato. A seqüência total de nucleotídeos do inserto foi confirmada pela método descrito no Exemplo de preparação 1-5.
[Exemplo de preparação 4] Construção de um vetor de expressão de baculovírus
O plasmídeo pcDNA4/Myc-His/periostina de rato obtido no Exemplo de preparação 3 foi digerido com as enzimas de restrição Sacl e Pmel para excisar um fragmento peptídico de rato ΡΝ-1/Myc-His. Este fragmento foi ligado a um fragmento vetorial obtido digerindo pFastBacHTc (Invitrogen) com as enzimas de restrição Sacl e Kpnl (blunting) usando um kit de ligação (Takara Bio Inc.) para dar um vetor de expressão designado como pFastBac/periostina-1 de rato/Myc-His. A seqüência de nucleotídeos do inserto foi confirmada pelo método descrito no Exemplo de preparação 1- 5.
[Exemplo de preparação 5] Preparação e cultura de um baculovírus recombinante
Células DH10BAC de Escherichia coli foram transformadas com pFastBac/periostina-1 de rato/Myc-His obtido no Exemplo de preparação 5 para preparar um baculovírus recombinante. Eletroforese e PCR confirmaram que o baculovírus resultante contém o inserto desejado. Células de inseto Sf9 (2 x 10"6 células/mL) infectadas com este baculovírus recombinante a MOI = 0,1 foram cultivadas em um meio livre de soro (contendo 50 μg/ml. de gentamicina em 2000 mL de Sf-900IISFM (Invitrogen)) a 28°C por 4 a 5 dias e em seguida o sobrenadante da cultura foi colhido.
[Exemplo de preparação 6] Purificação de proteína periostina de rato
A uma coluna SP Sepharose Fast Flow (10 mL de volume de leito) equilibrada com um tampão de equilíbrio (tampão de acetato de sódio a 50 mM, pH 6,0, cloreto de sódio a 0,1 M) foi aplicado 2000 mL do sobrenadante da cultura obtido no Exemplo de preparação 5, e a fração de fluxo contínuo resultante foi reunida como uma fração de fluxo contínuo de SP Sepharose.
A coluna foi lavada com o tampão de equilíbrio até a absorvência a 280 nm se aproximar de 0 (cerca de 100 mL) para dar uma fração de lavagem SP Sepharose.
A coluna foi elutriada com 100 mL de um tampão de elutriação (fosfato de dihidrogênio de sódio a 50 mM (pH 8,0), cloreto de sódio a 0,5 M, imidazol a 5 mM) para dar uma fração de elutriado SP Sepharose.
Em seguida, 100 mL da fração de elutriado SP Sepharose foi aplicada a uma coluna de Ni-NTA agarose (5 mL de volume de leito) equilibrada com tampão de fosfato de sódio a 50 mM, pH 8,0, cloreto de sódio a 0,5 M e imidazol a 5 mM, e a fração de fluxo contínuo resultante foi reunida como uma fração de fluxo contínuo de Ni-NTA agarose.
A coluna foi lavada com cerca de 50 mL de um tampão de lavagem (50 mL de fosfato de dihidrogênio de sódio, pH 8,0, cloreto de sódio a 0,5 M, imidazol a 5 mM) para dar uma fração de lavagem de Ni-NTA agarose.
A coluna foi elutriada com cerca de 25 mL cada de tampões de elutriação (1) fosfato de dihidrogênio de sódio a 50 mM, cloreto de sódio a 0,5 M, imidazol a 20 mM, seguido por composições similares exceto que as concentrações de imidazol foram (2) 30 mM, (3) 40 mM, (4) 50 mM e (5) 60 mM para dar frações de elutriado de Ni-NTA agarose (1)-(6). Foi demonstrado que as frações contêm a proteína desejada por Western blotting foram concentradas para 1 ml_ ou menos.
Em seguida, as amostras concentradas foram aplicadas a uma coluna de filtração por gel (Sephacryl S-200HR φ11ιτιηη χ 95 cm; volume de leito 90) equilibrada com PBS degaseificado (-) (NaCI a 137 mM, Na2HPO4 a 8,1 mM, KCI a 2,68 mM, KH2PO4 a 1,47 mM) e elutriada com PBS (-) e o elutriado foi Iiofilizado para dar uma proteína periostina de rato purificada.
[Exemplo 1]
Síntese de cadeia de peptídeo Éxon-17 de rato e preparação de anticorpo policlonal contra esta
Uma estrutura específica para PN-1 de rato foi identificado como seqüência Éxon-17 por comparação de seqüências uma vez que foi induzida dilatação do coração por aumento da expressão do gene PN-1 no coração de ratos SD normais e a taxa de sobrevida foi aumentada por administração de um oligonucleotídeo anti-sentido contra periostina de rato ao coração de ratos modelo de falência cardíaca de Dahl e foi demonstrado que PN-1 de rato não tem propriedades adesivas de células em contraste com PN-2 previamente reportado. Um peptídeo tendo um resíduo Cys adicionado ao N- término da seqüência de aminoácidos constituindo este Éxon-17 foi quimicamente sintetizado em produção de 10 mg em uma pureza de 80% ou mais. Coelhos (Kbl:JW) foram imunizados com o polipeptídeo ligado a 6 mg de uma proteína de veículo KLH. FCA (adjuvante completo de Freund) foi usado na imunização primária, e FIA (adjuvante incompleto de Freund) foi usado nas imunizações secundária e subseqüentes. A administração foi realizada em 20 sítios subcutâneos dorsais nas semanas 0, 2, 4 e 6 usando uma dose de peptídeo de 800 μg/animal na imunização primária, e 400 μg/animal nas imunizações secundária e subseqüentes. O título de anticorpos foi determinado por ELISA e os soros totais foram coletados na semana 7. Em seguida, uma coluna de afinidade foi preparada por uso de um peptídeo sintético, e somente o anticorpo reagindo especificamente com o peptídeo Éxon-17 foi coletado. O anticorpo policlonal contra o peptídeo codificado pelo Éxon-17 de periostina de rato é referido nas partes que se seguem como anticorpo antipeptídeo Éxon-17 de rato.
[Exemplo 2]
Estudo in vitro da presença ou ausência de atividade de células antiadesivas de PN-1 de rato
Fibroblastos de coração de rato foram obtidos por um método similar ao descrito na literatura (Ruwhof C, van Wamel AE, Egas JM1 van der Laarse A. Mol Cell Biochem. 2000 May; 208 (1-2):89-98, Ashizawa N, Graf K, Do YS, Nunohiro T, Giachelli CM, Meehan WP, Tuan TL, Hsueh WA. J Clin Invest. 1996 Nov. 15; 98 (10):2218-27). Especificamente, 20 ratos SD com 1 a 2 dias de idade foram anestesiados com éter e o tórax foi desinfetado com etanol. O coração foi isolado e colocado em uma placa contendo PBS (-), onde o coração foi incisado transversamente para sangrá-lo e foi adicionalmente lavado com PBS (-) três vezes, e em seguida PBS (-) foi descartado até o mínimo nível possível e o coração foi picado com tesouras. Em seguida, o tecido picado foi agitado em uma mistura a 1:1 de PBS (-): colagenase / tripsina a 37°C por 15 minutos, e em seguida as células foram lisadas pipetando tão completamente quanto possível. Em seguida, o Iisado celular foi filtrado através de uma malha de platina em um tubo de centrífuga, e a malha de platina foi lavada com 10 ml de meio M199 contendo 10% de soro e 10 ml de PBS (-). Em seguida, o tubo da centrífuga foi centrifugado a 1500 rpm por 10 minutos, e as células obtidas como uma fração de pélete foram agitadas em 20 ml de meio M199 contendo 10% de soro e laminadas sobre uma placa. A placa foi deixada em repouso a 37°C por 1 hora, e em seguida células aderidas à placa foram coletadas como fibroblastos de coração de rato. Os fibroblastos de coração de rato foram laminados sobre uma lâmina de 96 cavidades em uma densidade de 6,4 χ 104 células/ 100 μΙ e cultivadas de um dia para o outro, e em seguida a cultura foi incubada em meio DMEM fresco com 10% de FBS contendo 10 μg/ml de cicloheximida a 37°C por 1 hour. Em seguida, as células foram lavadas duas vezes com meio DMEM (livre de soro) preaquecido a 37°C, e proteína periostina de rato preparada de acordo com os Exemplos de preparação foi adicionada a meio DMEM (livre de soro) em uma concentração final de 10 μg/ml. Fibronectina tendo propriedades estimuladoras de adesão celular foi usada como um controle positivo e BSA (albumina sérica bovina) foi usada como um controle negativo. Depois de incubação a 37°C por 1 hora, microscopia mostrou que todas as células foram separadas no grupo tratado com proteína periostina de rato, e as células foram lavadas duas vezes com PBS (-) e em seguida fixadas em 10% de formalina tamponada neutra por 30 minutos. Em seguida, as células foram lavadas com PBS (-) três vezes e em seguida coradas com cristal violeta por 30 minutos. Em seguida, o grau de coloração foi medido usando uma leitora de lâminas a 550 nm (BIO-RAD, Modelo 680 MICRO PLATE READER) (figura 2). Em conseqüência, os grupos controle tratados com fibronectina e BSA e o grupo não tratado não apresentaram propriedades antiadesivas de células porque as células aderidas não foram separadas, em contraste com o grupo tratado com PN-1 de rato no qual as células foram separadas, mostrando que PN-1 de rato teve um efeito de separação sobre células aderidas, isto é, propriedades antiadesivas de células. [Exemplo 3]
Estudo in vitro da atividade neutralizante de anticorpo antipeptídeo Éxon-17 de rato
Fibroblastos de coração de rato SD obtidos por um método similar ao do Exemplo 2 foram laminados sobre uma lâmina de 96 cavidades em uma densidade de 6,4 χ 104 células / 100 μl e cultivados de um dia para
O outro, e em seguida a cultura foi incubada em meio DMEM fresco com 10% de FBS contendo 10 μg/ml de cicloheximida a 37°G por 1 hora. Em seguida, as células foram lavadas duas vezes com meio DMEM (livre de soro) preaquecido a 37°C, e proteína periostina de rato e anticorpo antipeptídeo Éxon-17 de rato foram adicionados a meio DMEM (livre de soro) em concentrações finais de 10 μg/ml e 100 μg/ml, respectivamente. Proteína periostina de rato somente foi usada como um controle positivo e BSA foi usado como um controle negativo. Depois de incubação a 37°C por 1 hora, microscopia mostrou que todas as células foram separadas no grupo tratado com proteína periostina de rato somente, e as células foram lavadas duas vezes com PBS (-) e em seguida fixadas em 10% de formalina tamponada neutra por 30 minutos. Em seguida, as células foram lavadas com PBS (-) três vezes e em seguida coradas com cristal violeta por 30 minutos. Em seguida, o grau de coloração foi medido usando uma leitora de lâminas a 550 nm (BIO-RAD, Modelo 680 MICRO PLATE READER) (figura 3). Os resultados mostraram que anticorpo antipeptídeo Éxon-17 de rato é um anticorpo tendo a atividade de inibir separação de células aderidas induzida por PN-1, isto é, inibir as propriedades antiadesivas de células de PN-1, isto é, neutralizar as propriedades antiadesivas de células de PN-1 de rato.
[Exemplo 4]
Efeito de anticorpo antipeptídeo Éxon-17 de rato sobre ratos modelo de enfarte agudo do miocárdio
Um rato macho Lewis pesando 250 a 300 g foi fixado sobre uma mesa cirúrgica de rato depois do animal ser completamente anestesiado por administração peritoneal de pentobarbital (0,1 ml/100 g). Um tubo foi inserido por via oral dentro da traquéia e conectado a um ventilador de rato (volume tidal 3 ml, 80 respirações/min), e a pele foi incisada lateralmente a partir do terceiro espaço intercostal esquerdo do esterno e o músculo peitoral maior subjacente também foi incisado lateralmente, e o espaço intercostal foi aberto usando um afastador de costela de rato para expor o coração.
Em seguida, a artéria coronária esquerda quase abaixo do átrio esquerdo foi ligada com seda 1.0 usando uma agulha curva tendo um diâmetro de 5 mm. Depois de confirmação visual de que as paredes anterior e lateral ao longo dsa quais corre a artéria coronária esquerda tinha mudado de vermelho para branco para mostrar bloqueio suficiente da corrente sangüínea coronária e o desaparecimento de movimento das paredes nestes sítios (no grupo de operação simulada, a agulha foi passada através da artéria coronária e em seguida removida sem ligação), a terceira e quarta costelas foram fixadas por ligação com seda 3.0 silk (depois do pulmão ser expandido para remover o ar existente fora do pulmão na gaiola de costelas de modo que o pulmão possa ser facilmente expandido). O sítio de incisão na pele foi suturado com seda 3.0 na mesma maneira e em seguida observado por um tempo, e o tubo foi removido depois de confirmação de recuperação da consciência e recomeço de respiração espontânea.
Modelos de enfarte agudo do miocárdio foram preparados seqüencialmente pelo procedimento precedente.
No dia seguinte, ecocardiografia percutânea foi realizada sob anestesia intranasal com isoflurano, e pequenos modelos de enfarte tendo um tamanho de enfarte de menos de 20% da periferia inteira do ventrículo esquerdo foram excluídos. Os modelos de enfarte restantes foram classificados em ordem de função cardíaca crescente, e alternativamente classificados em um grupo tratado com anticorpo antipeptídeo Éxon-17 de rato e um grupo tratado com um anticorpo controle (IgG de coelho) cada 200 μg através da veia da cauda.
Os anticorpos foram administrados a cada grupo no dia seguinte à preparação dos modelos e em intervalos de 6 dias depois da administração inicial, um total de 4 vezes.
O coração foi avaliado por ecocardiografia através da parede do tórax em intervalos de uma semana até o final de 8 semanas. Ao final de 8 semanas, um tubo foi inserido dentro da traquéia e conectado a um ventilador sob anestesia com pentobarbital, e a pele foi incisada da esquerda do pescoço e os músculos do pescoço foram retraídos com fórceps para expor a artéria carótida comum esquerda, e depois do sangramento ser interrompido por ligação na origem da artéria carótida esquerda, a artéria foi perfurada em um sítio distai por pequenas tesouras e um cateter espelho de rato foi inserido a partir deste sítio em uma maneira tal que a ponta do cateter com um sensor de pressão atingiu o interior do ventrículo esquerdo enquanto o cateter foi conectado a um computador para medir a função cardíaca e a pressão sangüínea e similares.
Os resultados da ecocardiografia 4 semanas depois da preparação dos modelos mostraram que a redução da espessura da parede anterior e da espessura da parede posterior do coração foi inibida, o aumento do diâmetro interno diastólico final e diâmetro interno sistólico final foi inibido, e que o valor EF indicativo da função contrátil do coração aumentou no grupo tratado com anticorpo antipeptídeo Éxon-17 de rato significativamente comparado com o grupo controle tratado com IgG de coelho. Em resumo, a dilatação do coração foi inibida, mostrando que a função cardíaca foi melhorada (figura 4-1 a figura 4-3). Os resultados da ecocardiografia 8 semanas depois da preparação dos modelos também mostraram inibição de dilatação do coração e melhora da função cardíaca na mesma maneira que os resultados depois de 4 semanas (figura 5-1 a figura 5-3). Estes resultados sugeriram que o efeito de anticorpo antipeptídeo Éxon-17 de rato inibindo dilatação do coração e melhorando a função cardíaca é mantido mesmo cerca de 4 semanas depois da administração do anticorpo. Em seguida, hemodinâmica apresentou diferenças significativas em derivada máxima da pressão ventricular esquerda ((+)dP/dt), derivada mínima da pressão ventricular esquerda ((-)dP/dt) e da pressão diastólica final ventricular esquerda (LVEDP) no grupo tratado com anticorpo antipeptídeo Éxon-17 de rato comparado com o grupo controle tratado com IgG, sugerindo que a função cardíaca foi melhorada (figura 6-1 a figura 6-3). Em seções de coração coradas com tricromo Masson, sítios azuis reduzidos no grupo tratado com anticorpo antipeptídeo Éxon-17 de rato comparado com o grupo controle tratado com IgG, mostraram que fibrose foi inibida (figura 7). Análise dos diâmetros do eixo menor de células do miocárdio mostrou que a redução dos diâmetros do eixo menor de células do miocárdio foi inibida significativamente no grupo tratado com anticorpo antipeptídeo Éxon-17 de rato comparado com o grupo controle tratado com IgG (figura 8). Este resultado se correlaciona com o resultado da ecocardiografia. Além disso, os resultados de análise da expressão genética em sítios de enfarte e sítios não de enfarte mostraram que os níveis de expressão de endotelina-1 (ET-1), colágeno tipo I, III, e TGF-beta e sítios não de enfarte diminuíram significativamente no grupo tratado com o anticorpo neutralizante comparado com o grupo tratado com o anticorpo controle para níveis comparáveis aos do grupo simulado, indicando que a condição foi melhorada (figura 9-1 a figura 9-5). [Exemplo 5]
Clonagem de cDNA de periostina-1 humana de extensão total
cDNA preparado a partir de 1 μg de RNA total derivado de coração humano (Clontech, catálogo № 64100-1, lote № 4120493) foi usado como um template para realizar PCR com KOD mais DNA poljmerase (Toyobo Co., Ltd.) usando os seguintes iniciadores para clonagem de extensão total: cadeia de sentido 5'-
AAGCTAGCCACCATGATTCCCI I I I IACCCAT-3' (SEQ ID NO: 27) e cadeia anti-sentido õ -AACTCCACAATTTCCCTCAT-3' (SEQ ID NO: 28). Os produtos de PCR resultantes foram clonados usando um kit de clonagem por PCR Zero Blunt TOPO PCR Cloning (Invitrogen).
Uma cadeia de sentido 5'-TAACCAAAGTTGTGGAACCAA-3' (SEQ ID NO: 29) foi preparada a partir de uma região correspondendo a periostina humana Éxon-17, enquanto uma cadeia anti-sentido 5'- TGTGTCTCCCTGAAGCAGTC-3' (SEQ ID NO: 30) foi preparada a partir de uma região correspondendo a Éxon-21, seguida por seleção de clones detectados com estes iniciadores deste grupo de clones. Em seguida, as 20 seqüências de nucleotídeos dos clones selecionados foram determinadas para selecionar um clone não unido, deste modo completando a clonagem de extensão total de cDNA de periostina-1 humana. O clone resultante foi designado como pCR4 / periostina-1 humana.
[Exemplo 6]
Construção de vetor de expressão de periostina-1 humana para translação in vitro
O plasmídeo pCR4/periostina-1 humana obtido no Exemplo 5 foi digerido com as enzimas de restrição Pme I e Not I para excisar um fragmento de DNA de periostina-1 humana, o qual foi então neutralizado. Um vetor de expressão pTNT (Promega), no qual CATCACCATCACCATCACTAA (6 x His + códon de terminação) (SEQ ID NO: 31) tinha sido inserido, foi digerido enzimaticamente no sítio Mlu I em seu sítio de multiclonagem e em seguida neutralizado. O fragmento de DNA obtido acima foi ligado a este vetor usando um kit de ligação (TaKaRa Bio Inc.).
Erri seguida, para o fim de criar fusão in-frame com a etiqueta His, encadeadores sintéticos (cadeia de sentido 5'- CTAGAAGACGATTAAGGGAAGGTCGTTCTCAGCTGGAAGTTCTGTTCCA GGGGCCC-3" (SEQ ID NO: 32) e cadeia anti-sentido 5'- GGGCCCCTGGAACAGAACTTCCAGCTGAGAACGACCTTCCCTTAATCGT CTT-3' (SEQ ID NO: 33)) foram preparados e ligados ao fragmento de vetor digerido com as enzimas de restrição Xba I e Sma I usando um kit de ligação. A seqüência de nucleotídeos da parte ligada foi confirmada, e o vetor de expressão resultante foi designado como pTNT/periostina-1 humana/His. [Exemplo 7]
Síntese de proteína por translação in vitro
O vetor de expressão obtido no Exemplo 6 foi proporcionado para síntese de proteína in vitro com TNT SP6 Quick Coupled Transcription/Translation Systems (Promega). Mais especificamente, relativo a 2 μg do vetor de expressão de pTNT/periostina-1 humana/His, 40 μΙ de SP6 Quick Master Mix e 1 μΙ de 1 mM de metionina foram adicionados e diluídos com água tratada com DEPC para dar um volume total de 50 μΙ, seguida por reação a 30°C por 90 minutos. O produto da reação foi armazenado a -80°C até purificação. [Exemplo 8]
Purificação de proteína de periostina humana (PN-1)
A proteína sintética obtida no Exemplo 7 foi purificada usando um sistema de purificação de proteína MagZ (MagZ Protein Purification System (Promega)). Mais especificamente, à proteína sintética obtida no Exemplo 7, 2 volumes de tampão de ligação/lavagem MagZ (Binding/Wash MagZ) foram adicionados e bem-misturados. A amostra preparada deste modo foi adicionada a partículas de ligação MagZ (MagZ Binding Particles). Depois de agitar esta mistura a 4°C por 1 hora, o sobrenadante foi removido e as partículas de ligação MagZ foram lavadas quatro vezes com tampão de ligação/lavagem MagZ, seguida por elutriação da proteína sintética com tampão de elutriação MagZ (MagZ Elution). A proteína purificada deste modo foi armazenada a -80°C até o uso.
[Exemplo 9]
Preparação de anticorpo monoclonal contra cadeia de peptídeo Éxon-17 de periostina humana
(1) Preparação de antíqeno
Um peptídeo (peptídeo antigênico; SEQ ID NO: 25) tendo um resíduo Cys adicionado ao N-término da seqüência de aminoácidos constituindo Éxon-17 de periostina humana (SEQ ID NO: 4) foi sintetizado quimicamente pelo método Fmoc para obter o peptídeo antigênico em 10 mg de rendimento em uma pureza de 90% ou mais. Como uma proteína de veículo, KLH (5mg, CALBIOCHEM) foi ligado a este peptídeo antigênico para dar uma solução antigênica. Isto é, KLH foi dissolvido em PBS (0,01 M) e ajustado para 3,3 mg/mL, ao qual uma solução a 0,2524 mg/mL de MBS (GE Healthcare Bio-Sciences KK) foi em seguida adicionada gota a gota e reagida com agitação em temperatura ambiente por 60 minutos.
Diclorometano foi Usado para remover MBS livre, para deste modo obter KLH-MB. Este KLH-MB (5 mg) foi misturado com o peptídeo antigênico (5 mg) dissolvido em tampão de fosfato de sódio a 0,01 M (pH 7,2) e reagido com agitação a 4°C por 12 horas para obter a solução antigênica.
(2) Imunização
Três camundongos fêmeas BALB/c de 6 semanas de idade foram cada um injetado por via subcutânea em ambas as patas com todo o volume de uma emulsão mista da solução antigênica (50 μΙ) contendo 100 μg de peptídeo antigênico ligado a KLH obtido em (1) e FCA (adjuvante completo de Freund, 50 μΙ). Os camundongos foram em seguida injetados duas vezes em ambas as patas com uma emulsão mista preparada in situ da solução antigênica acima e FIA (adjuvante incompleto de Freund) em um intervalo de 2 semanas. Os camundongos foram em seguida sacrificados por deslocamento cervical e os Iinfonodos em suas patas foram coletados asseticamente.
Enquanto suprindo meio RPMI (Kohjinbio Co., Ltd.), os Iinfonodos acima foram triturados e passados através de uma malha de cerca de 10 μmde medida de poro para obter células de linfonodo suspendidas em meio RPMI. Esta suspensão foi centrifugada a 1000 rpm por 10 minutos para obter células de Iinfonodo como uma fração de pélete. Depois desta fração de pélete ser hemolisada para remover hemácias em uma solução (1 ml) preparada adicionando 20 mM de tampão HEPES (pH7,4) a uma solução a 0,84% de cloreto de amônio, a centrifugação foi repetida a 1.000 rpm por 5 minutos. A fração de pélete resultante (fração celular) foi lavada várias vezes com meio RPMI e em seguida usada para fusão celular.
(3) Preparação de células de mieloma
A linhagem celular de mieloma de camundongo P3X63Ag8U.1 (P3U1) que foi resistente a 8-azaguanina e não secretou imunoglobulina foi cultivada em meio RPMI contendo 20% de soro de feto de vitelo (FCS) em uma incubadora a 10% de CO2, em 37°C. Células na fase de crescimento logarítmico foram coletadas e centrifugadas a 1.000 rpm por 5 minutos para obter as células somente como uma fração de pélete, as quais foram em seguida suspendidas em meio RPMI.
(4) Fusão celular
O meio RPMI obtido em (2) contendo 108 a 3 x 108 células de linfonodo imunizadas e o meio RPMI obtido em (3) contendo 108 células de mieloma foram misturadas e em seguida centrifugadas a 1.000 rpm por 10 minutos. O sobrenadante foi removido gentilmente para obter as células como uma fração de pélete, seguido por adição de 1 ml de 25% (em peso/ vol) de polietileno glicol 1500 (PEG 1500, Boehringer). As células foram adicionalmente diluídas para um volume total de 10 ml por lenta adição de meio RPMI. A esta suspensão, 20% de meio RPMI contendo FCS (10 ml) foi adicionado e deixado em repouso por um tempo, seguido por centrifugação a 1.000 rpm por 5 minutos. A fração de pélete resultante (fração celular) foi ajustada para uma densidade celular de 106 células/ml por adição de 20% de meio RPMI contendo FCS1 e esta suspensão celular foi dispensada a 200 μl/cavidade em lâminas de cultura de 96 cavidades (Corning). Depois de cultivar em uma incubadora a 37°C, 5% de CO2l por 24 horas, solução HAT (Invitrogen) foi adicionada e a cultura foi continuada por um adicional de 2 semanas.
(5) Varredura por ELISA
Foi realizada varredura para determinar cavidades positivas apresentando uma reação entre o sobrenadante da cultura e o peptídeo antigênico.
Para uso como uma solução antigênica para teste, o peptídeo antigênico (2 mg) obtido em (1) foi ligado a ovalbumina (OVA) como uma proteína de veículo para preparar um conjugado.
Cada cavidade de uma lâmina de microtítulo de 96 cavidades (Falcon 353912) foi revestido com o conjugado acima (1 μg/ml) deixando em repouso de um dia para o outro a 4°C. Depois de lavar esta lâmina, o sobrenadante da cultura de (4) (50 μl, contendo anticorpos monoclonais) foi adicionado gota a gota a cada cavidade e deixado em repouso em uma incubadora a 37°C por 2 horas, seguida por lavagem com PBS(-) (salina tamponada com fosfato). Depois de adição de anticorpo de IgG anticamundongo de carneiro conjugado a fosfatase alcalina (Zymed), a lâmina foi deixada em repouso em uma incubadora a 37°C por 1 hora, lavada com PBS(-) e em seguida se desenvolveu cor por 20 minutos por adição de um substrato de desenvolvimento de cor (ALP). A absorvência (título de anticorpos) a 490 nm de OD foi medida para cada cavidade com uma leitora de lâminas (BIO-RAD, Modelo 680 MICRO PLATE READER) para confirmar sua reatividade com o peptídeo antigênico, para deste modo determinar cavidades positivas apresentando uma reação entre o sobrenadante da cultura e o peptídeo antigênico. (6) Clonagem de células produtoras de anticorpos
Células nas cavidades positivas cuja reatividade com o peptídeo antigênico foi confirmada por ELISA em (5) foram proporcionadas por clonagem de linhagens celulares produtoras de anticorpos por diluição limitante. A saber, células nas cavidades positivas foram laminadas dentro de cada cavidade de uma lâmina de cultura de 96 cavidades e cultivadas em uma incubadora a 5% CO2, e 37°C por 2 semanas. Na mesma maneira conforme usado em (5), reatividade com o peptídeo antigênico foi confirmada por ELISA para o sobrenadante da cultura em cada cavidade, e clonagem por diluição limitante foi repetida novamente para cada cavidade positiva para obter 30 células tendo uma alta reatividade com o peptídeo antigênico e apresentando bom crescimento de colônia. Estas células foram transferidas para lâminas de cultura de 24 cavidades e cultivadas em uma incubadora a 5% CO2, e 37°C por 2 semanas. Na mesma maneira conforme usado em (5), reatividade com o peptídeo antigênico (título de anticorpos) foi confirmada novamente por ELISA para cada sobrenadante da cultura. Células em 10 cavidades apresentando uma alta absorvência em OD 490 nm, isto é, 10 linhagens celulares de hibridoma foram determinadas como sendo úteis como células produtoras de anticorpos e foram selecionadas. Linhagens celulares de hibridoma
<table>table see original document page 53</column></row><table>
Como as células produtoras de anticorpos obtidas deste modo sempre produzem os anticorpos da presente invenção, isto é, anticorpos monoclonais anti-Éxon-17 humano, o sobrenadante da cultura na qual estas células produtoras de anticorpos foram cultivadas pode ser usado diretamente como a solução de anticorpo da presente invenção. Deve ser observado que a linhagem celular produtora de anticorpos (hibridoma) N9 1 (SBM337) acima, a qual produz anticorpo monoclonal anti-Éxon-17 humano, foi depositada sob FERM BP-10718 em 1Q de novembro de 2006 junto ao International Patent Organism Depositary, o National Institute of Advanced Industrial Science and Technology.
(7) Confirmação da capacidade de ligação a proteína de periostina humana (PN-1)
Anticorpos produzidos pelas 10 células produtoras de anticorpos obtidas em (6) fòram confirmados por sua capacidade de ligação a proteína de periostina humana (PN-1) por dot blotting. A saber, a proteína sintética obtida no Exemplo 8 (30 μg/ml) foi pintada em volumes de 5 μΙ sobre uma membrana de nitrocelulose Hybond-ECL (GE Healthcare Bio-Sciences KK) e lavada uma vez com solução de TBS (10 mM de Tris-HCI (pH 8,0), 150 mM de NaCI). Tampão de bloqueio (Block Ace, Snow Brand Milk Products Co., Ltd.) foi adicionado e agitado em temperatura ambiente por 1 hora. Depois de uma solução a 1 μg/ml de cada anticorpo monoclonal (anticorpoprimário) obtido em (6) ser adicionada à membrana e agitada por 3 horas, a membrana foi lavada quatro vezes com solução de TBS sob agitação por 10 minutos. Depois de uma solução a 0,4 μg/ml de um anticorpo de IgG anticamundongo marcado com HRP (Promega) (anticorpo secundário) ser adicionada à membrana e agitada em temperatura ambiente por 1 hora, a membrana foi lavada quatro vezes com solução de TBS sob agitação por 10 minutos. Reagentes de detecção (ECL mais sistema de detecção Western blotting, GE Healthcare Bio-Sciences KK) foram adicionados e reagidos por 1 minuto para detectar a quimiluminescência. Em conseqüência, foi confirmado que todas as 10 células produtoras de anticorpos clonadas em (6) ligam a periostina humana PN-1.
(8) Produção em massa e purificação de anticorpo monoclonal
Camundongos BALB/c foram administrados por via intraperitoneal com pristano [2,6,10,14-tetrametil] pentadecano (0,5 ml, Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) e mantidos por 2 a 3 semanas. Os hibridomas produtores de anticorpos monoclonais N2 1 e Ns 3 os quais tinham sido mantidos na fase de crescimento logarítmico foram coletados e centrifugados para remover o sobrenadante da cultura. Às células em cada fração de pélete, meio RPMI livre de FCS foi adicionado para preparar uma suspensão celular em uma densidade celular de 1 χ 107 células/ml. Esta suspensão celular foi injetada por via intraperitoneal nos camundongos BALB/c pré-tratados com pristano e, depois de cerca de três semanas, o fluido da ascite exsudado foi coletado da região abdominal por uma seringa.
Depois de cada fluido da ascite coletado ser filtrado usando um filtro com um tamanho de poro de φ0,22 μιτι, os filtrados foram purificados em uma maneira de rotina por cromatografia de afinidade sobre uma coluna Protein G-sepharose (Millipore, 11511324) para preparar dois anticorpos monoclonais anti-Éxon-17 humano.
[Exemplo 10]
Recognition site Análise de sítio de reconhecimento de anticorpo monoclonal anti-Éxon-17 humano em cadeia de peptídeo Éxon-17 de periostina humana
Os dois anticorpos monoclonais resultantes (NQ 1 e N9 3) foram analisados para seus sítios de reconhecimento na cadeia de peptídeo Éxon- 17 de periostina humana (identificação de epitopo). A saber, com base em uma seqüência de aminoácidos consistindo em 45 aminoácidos no total entre a -9ã fenilalanina do N-término e a 9- isoleucina do C-término da cadeia de peptídeo Éxon-17 de periostina humana (SEQ ID NO: 4; a 1- treonina até o 27Q ácido glutâmico), os 36 peptídeos seguintes compostos de 10 aminoácidos foram sintetizados sobre uma membrana de celulose para preparar um arranjo peptídico ligado a membrana (serviço SPOTs personalizado da Sigma-Aldrich Japan K.K.).
1
FKEIPVTVYT
2
KEIPVTVYTT
3
El PVTVYTTK
4
IPVTVYTTKI
5
PVTVYTTKII 6 VTVYTTKIIT
7 TVYTTKIITK
8 VYTTKIITKV
9 YTTKIITKW
10 TTKIITKVVE
11 TKIITKVVEP
12 KIITKVVEPK
13 IITKVVEPKI
14 ITKVVEPKIK
15 TKVVEPKIKV
16 KVVEPKIKVI
17 VVEPKIKVIE
18 VEPKIKVIEG
19 EPKIKVIEGS
20 PKIKVIEGSL
21 KIKVIEGSLQ
22 IKVIEGSLQP
23 KVIEGSLQPI
24 VIEGSLQPII
25 IEGSLQPIIK
26 EGSLQPIIKT
27 GSLQPIIKTE
28 SLQPIIKTEG
29 LQPIIKTEGP
30 QPIIKTEGPT
31 PIIKTEGPTL
32 IIKTEGPTLT
33 IKTEGPTLTK
34 KTEGPTLTKV
35 TEG PTLTKVK
36 EGPTLTKVKI Esta membrana foi deixada em repouso em um pequeno volume de metanol por 5 minutos e em seguida foi lavada três vezes com solução de TBS. Tampão de bloqueio (caseína, incluída em SPOTs) foi adicionado e agitado em temperatura ambiente por 2 horas. Depois de uma solução a 1 μg/ml de cada anticorpo monoclonal (anticorpo primário) obtido no Exemplo 9(8) ser adicionada à membrana e agitado por 3 horas, a membrana foi lavada três vezes em solução de TBS sob agitação por 10 minutos. Depois de uma solução a 0,4 μg/ml de um anticorpo de IgG anticamundongo marcado com HRP (Promega) (anticorpo secundário) ser adicionada à membrana e incubada por 2 horas, a membrana foi lavada três vezes em solução de TBS sob agitação por 5 minutos. Reagentes de detecção (SuperSignal West Pico, Pierce) foram adicionados e reagidos por 1 minuto para detectar a quimiluminescência. Em conseqüência, foi visto que os anticorpos monoclonais N° 1 e N° 3 reagem com e ligam a somente peptídeo sintético N° 9 consistindo da seqüência de aminoácidos YTTKIITKVV (SEQ ID NO: 26), isto é, um peptídeo consistindo em uma seqüência de aminoácidos cobrindo da -1ã tirosina à 93 valina do N-término da seqüência de aminoácidos da cadeia de peptídeo Éxon-17 de periostina humana (SEQ ID NO: 4) ou cobrindo da 669ã tirosina à 679ã valina do N-término da seqüência de aminoácidos de periostina humana PN-1 (SEQ ID NO: 2).
[Exemplo 11]
Análise de recognição de sítio de reconhecimento de anticorpo policlonal anti-Éxon-17 de rato em cadeia de peptídeo Éxon-17 de periostina humana.
Na mesma maneira conforme mostrado no Exemplo 10, o anticorpo policlonal preparado no Exemplo 1 foi analisado para seu sítio de reconhecimento na cadeia de sítio peptídeo Éxon-17 de periostina humana (identificação de epitopo). Em conseqüência, como no caso dos anticorpos monoclonais no Exemplo 10, foi visto que o anticorpo policlonal reage com somente peptídeo sintético N° 9, indicando que o anticorpo policlonal especificamente reconhece o mesmo sítio que os anticorpos monoclonais. Isto sugere que anticorpos tendo a mesma especificidade são obteníveis em ambos os casos onde um peptídeo Éxon-17 de periostina de rato é usado como um antígeno para preparar um anticorpo policlonal e onde um peptídeo Éxon-17 de periostina humana é usado como um antígeno para preparar um anticorpo monoclonal.
[Exemplo 12]
Confirmação de capacidade de ligação a proteína periostina de rato (PN-1)
Os dois anticorpos monoclonais resultantes (NQ 1 e Nq 3) foram confirmados por sua capacidade de ligação a proteína periostina de rato (PN-1) por dot blotting. A saber, a proteína purificada obtida no Exemplo de preparação 6 (30 μg/ml) foi pintada em volumes de 5 μl sobre uma membrana de nitrocelulose Hybond-ECL (GE Healthcare Bio-Sciences KK) e lavada uma vez com solução de TBS (10 mM de Tris-HCI (pH8,0), 150 mM de NaCI). Tampão de bloqueio (Block Ace1 Snow Brand Milk Products Co., Ltd.) foi adicionado e agitado em temperatura ambiente por 1 hora. Depois de uma 1 μg/ml de solução de cada anticorpo monoclonal (anticorpo primário) ser adicionada à membrana e agitada por 3 horas, a membrana foi lavada quatro vezes com solução de TBS sob agitação por 10 minutos. Depois de uma 0,4 μg/ml de solução de um anticorpo de IgG anticamundongo marcado com HRP (Promega) (anticorpo secundário) ser adicionada à membrana e agitada em temperatura ambiente por 1 hora, a membrana foi lavada quatro vezes com solução de TBS sob agitação por 10 minutos. Reagentes de detecção (ECL mais sistema de detecção por Western blotting, GE Healthcare Bio-Sciences KK) foram adicionados e reagidos por 1 minuto para detectar a quimiluminescência. Em conseqüência, foi confirmado que os dois anticorpos monoclonais resultantes também ligam a periostina de rato PN-1.
[Exemplo 13]
Análise de epitopo de anticorpo monoclonal anti-Éxon-17 humano
Os resultados do Exemplo 10 indicaram que a parte de epitopo de cada anticorpo monoclonal anti-Éxon-17 humano reconhece uma seqüência de aminoácidos (TTKIITKVV; SEQ ID NO: 22) cobrindo da treonina de N- terminal à 9- valina da cadeia de peptídeo Éxon-17 de periostina humana (SEQ ID NO: 4). Igualmente, os resultados do Exemplo 12 confirmaram que cada anticorpo monoclonal anti-Éxon-17 humano também liga a proteína periostina de rato (PN-1). Estes resultados sugeriram que a parte de epitopo de cada anticorpo monoclonal anti-Éxon-17 humano reconhece uma região, cujos aminoácidos não diferem entre seres humanos e ratos, na seqüência de aminoácidos (TTKIITKVV; SEQ ID NO: 22) cobrindo da treonina de N- terminal à 9ã valina da cadeia de peptídeo Éxon-17 de periostina humana (SEQ ID NO: 4), isto é, toda a seqüência de aminoácidos, ou uma parte da mesma, o qual cobre da treonina de N-terminal à 1- Iisina da cadeia de peptídeo Éxon-17 de periostina humana (SEQ ID NO: 4) ou a cadeia de peptídeo Éxon-17 de periostina de rato (SEQ ID NO: 3). Portanto, para análise adicional da parte de epitopo, foi realizada triagem de alánina.
Com base em uma seqüência de aminoácidos (YTTKIITKVV; SEQ ID NO: 26) cobrindo da -1- tirosina à 9ã valina do N-término da cadeia de peptídeo Éxon-17 de periostina humana (SEQ ID NO: 4), os 10 peptídeos seguintes modificados para substituir alguns aminoácidos por alaninas foram sintetizados em uma pureza de 80% ou mais. Ne 1 YTTKIITKVV Ne 2 ATTKIITKAA Ns 3 AATKIITKAA N9 4 AAAKIITKAA . N9 5 AAAAIITKAA N9 6 AAAAAITKAA N9 7 ATTKIITAAA N9 8 ATTKIIAAAA N9 9 ATTKIAAAAA N9 10 ATTKAAAAAA
Os peptídeos sintéticos (1 mg cada) foram solubilizados com 50 μl de PBS(-), pintados em volumes de 1,5 μl sobre uma membrana de nitrocelulose Hybond-ECL (GE Healthcare Bio-Sciences KK) e lavados uma vez com solução de TBS. Tampão de bloqueio (Block Ace, Snow Brand Milk Products Co., Ltd.) foi adicionado e agitado em temperatura ambiente por 1 hora. Depois de uma 1 μς/ml de solução de cada anticorpo monoclonal (anticorpo primário) obtido no Exemplo 9(8) ser adicionada à membrana e agitada por 3 horas, a membrana foi lavada quatro vezes com solução de TBS sob agitação por 10 minutos. Depois de uma 0,4 μg/ml de solução de um anticorpo de IgG anticamundongo marcado com HRP (Promega) (anticorpo secundário) ser adicionado à membrana e agitado em temperatura ambiente por 1 hora, a membrana foi lavada quatro vezes com solução de TBS sob agitação por 10 minutos. Reagentes de detecção (SuperSignaI West Pico, Pierce) foram adicionados e reagidos por 1 minuto para detectar a quimiluminescência.
Em conseqüência, foi visto que os anticorpos monoclonais reagem fortemente com peptídeo sintético ne 7 mostrado acima (um peptídeo compreendendo substituições de alanina no I2 e no 8-1 Oe aminoácidos do N-término de um peptídeo consistindo em uma seqüência de aminoácidos (YTTKIITKVV; SEQ ID NO: 26) cobrindo do -1ã tirosina a 9§ valina do N-término da cadeia de peptídeo Éxon-17 de periostina humana (SEQ ID NO: 4)), reagem fracamente com peptídeos sintéticos n- 1 (a peptídeo consistindo em uma seqüência de aminoácidos (YTTKIITKVV; SEQ ID NO: 26) cobrindo a 1ã tirosina a 9- valina do N-término da cadeia de peptídeo Éxon-17 de periostina humana (SEQ ID NO: 4)) n9 2 (a peptídeo compreendendo substituições de alanina no 19 e no 9-109 aminoácidos do N- término de um peptídeo consistindo em uma seqüência de aminoácidos (YTTKIITKVV; SEQ ID NO: 26) cobrindo a 1â tirosina a 9ã valina do N- término da cadeia de peptídeo Éxon-17 de periostina humana (SEQ ID NO: 4)), e reagem mais fracamente com peptídeos sintéticos n9 3 (a peptídeo compreendendo substituições de alanina no 19, no 29 e no 9-109 aminoácidos do N-término de um peptídeo consistindo em uma seqüência de aminoácidos (YTTKIITKVV; SEQ ID NO: 26) cobrindo a 1ã tirosina a 9ê valina do N-término da cadeia de peptídeo Éxon-17 de periostina humana (SEQ ID NO: 4)) e nQ 8 (a peptídeo compreendendo substituições de alanina no 1° e no 7-1° aminoácidos do N-término de um peptídeo consistindo em uma seqüência de aminoácidos (YTTKIITKW; SEQ ID NO: 26) cobrindo a 1a tirosina a 9a valina do N-término da cadeia de peptídeo Éxon-17 de periostina humana (SEQ ID NO: 4)).
[Exemplo 14]
Análise de sítio de reconhecimento de anticorpo policlonal anti- Éxon-17 de rato em cadeia de peptídeo Éxon-17 de periostina humana
Na mesma maneira conforme mostrado no Exemplo 13, o anticorpo policlonal preparado no Exemplo 1 foi analisado para seu sítio de reconhecimento na cadeia de peptídeo Éxon-17 de periostina humana (identificação de epitopo). Em conseqüência, como no caso dos anticorpos monoclonais no Exemplo 13, foi visto que o anticorpo policlonal reage fortemente com peptídeo sintético n° 7, reage fracamente com peptídeos sintéticos n° 1 e n° 2, e reage ainda mais fracamente com peptídeos sintéticos n° 3 e n° 8, indicando que o anticorpo policlonal especificamente reconhece o mesmo sítio que os anticorpos monoclonais. Isto sugere que anticorpos tendo a mesma especificidade são obteníveis em ambos os casos onde um peptídeo Éxon-17 de periostina de rato é usado como um antígeno para preparar um anticorpo policlonal e onde um peptídeo Éxon-17 de periostina humana é usado como um antígeno para preparar um anticorpo monoclonal.
[Exemplo 15]
Estudo in.vitro da presença ou ausência de atividade de células antiadesivas de periostina-1 humana
Na mesma maneira conforme mostrado no Exemplo 2, fibroblastos de coração humano (Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd., catalog N9 CS-ABI-5118) foram laminados sobre uma lâmina de 96 cavidades em uma densidade de 6,4 x 104 células / 100 μl e cultivados de um dia para o outro, e em seguida a cultura foi incubada em meio CSC fresco (Cell System Corporation) com 10% de FBS contendo 10 μg/ml de cicloheximida a 37°C por 1 hora. Em seguida, as células foram lavadas duas vezes com meio CSC (livre de soro) preaquecido a 37°C, e proteína de periostina-1 humana preparada de acordo com os Exemplos foi adicionada a meio CSC (livre de soro) em uma concentração final de 1 μς/ηιΙ. Fibronectina tendo propriedades estimuladoras de adesão celular foi usada como um controle positivo e BSA (albumina sérica bovina) não tendo propriedades adesivas de células foi usada como um controle negativo. Depois de incubação a 37°C por 3,5 horas, microscopia mostrou que todas as células foram separadas no grupo tratado com proteína de periostina humana, e as células foram lavadas duas vezes com PBS (-) e em seguida fixadas em 10% de formalina tamponada neutra por 30 minutos. Em seguida, as células foram lavadas com PBS (-) três vezes e em seguida coradas com cristal violeta por 30 minutos. Em seguida, o grau de coloração foi medido usando uma leitora de lâminas a 550 nm (BIO-RAD, Modelo 680 MICRO PLATE READER) (figura 10). Em conseqüência, os grupos controle tratados com fibronectina e BSA e o grupo não tratado não apresentaram propriedades antiadesivas de células, em contraste com o grupo tratado com proteína de periostina-1 humana no qual as células foram separadas, mostrando que proteína de periostina-1 humana tinha propriedades antiadesivas de células.
[Exemplo 16]
Estudo in vitro da atividade neutralizante de anticorpo monoclonal anti-Éxon-17 humano
Na mesma maneira conforme mostrado no Exemplo 3, fibroblastos de coração humano foram laminados sobre uma lâmina de 96 cavidades em uma densidade de 6,4 χ 104 células/ 100 μΙ e cultivadas de um dia para o outro, e em seguida a cultura foi incubada em meio CSC fresco com 10% de FBS contendo 10 μg/ml de cicloheximida a 37°C por 1 hora. Em seguida, as células foram lavadas duas vezes com meio CSC (livre de soro) pré- aquecida a 37°C, e proteína de periostina-1 humana e anticorpo monoclonal anti-Éxon-17 humano (n9 1 ou Ns 3) foram adicionados a meio CSC (livre de soro) em concentrações finais de 1 μg/ml e 200 μg/ml, respectivamente. Proteína periostina-1 humana somente foi usada como um controle positivo e BSA foi usada como um controle negativo. Depois de incubação a 37°C por 3,5 horas, microscopia mostrou que todas as células foram separadas no grupo tratado com proteína de periostina humana somente, e as células foram lavadas duas vezes com PBS (-) e em seguida fixadas em 10% de formalina tamponada neutra por 30 minutos. Em seguida, as células foram lavadas com PBS (-) três vezes e em seguida coradas com cristal violeta por 30 minutos. Em seguida, o grau de coloração foi medida usando uma leitora de lâminas a 550 nm (BIO-RAD, Modelo 680 MICRO PLATE READER) (figura 11). Os resultados mostraram que anticorpos monoclonais anti-Éxon- 17 humano são anticorpos tendo a atividade de inibir as propriedades antiadesivas de células de proteína de periostina-1 humana, isto é, neutralizar as propriedades antiadesivas de células de proteína de periostina-1 humana.
Conforme mostrado acima, as propriedades antiadesivas de células de proteína de periostina-1 humana foram inibidas por anticorpos contra Éxon-17 de proteína de periostina-1 humana os quais especificamente reconhecem uma seqüência ou uma parte da mesma consistindo no 1° ao 6o. aminoácidos de N-terminal de Éxon-17, sugerindo que Éxon-17, no mínimo um segmento do peptídeo ou uma parte do mesmo consistindo no 1° ao 6o. aminoácidos de N-terminal de Éxon-17 constitui uma região relacionada com as propriedades antiadesivas de células de proteína de periostina-1 humana.
[Exemplo 17]
Efeito de anticorpo monoclonal Éxon-17 anti-humano sobre modelo de enfarte agudo do miocárdio em ratos
Na mesma maneira conforme mostrado no Exemplo 4, um rato macho Lewis pesando 250 a 300 g foi fixado sobre uma mesa cirúrgica de rato depois do animal ser completamente anestesiado por administração peritoneal de pentobarbital (0,1 ml/100 g). Um tubo foi inserido por via oral dentro da traquéia e conectado a um ventilador de rato (volume tidal 3 ml, 80 respirações/min), e a pele foi incisada lateralmente a partir do terceiro espaço intercostal esquerdo do esterno e o músculo peitoral maior subjacente também foi incisado lateralmente, e o espaço intercostal foi aberto usando um afastador de costela de rato para expor o coração. Em seguida, a artéria coronária esquerda quase abaixo do átrio esquerdo foi ligada com seda 1,0 usando uma agulha curva tendo um diâmetro de 5 mm. Depois de confirmação visual de que as paredes anterior e lateral ao longo das quais corre a artéria coronária esquerda mudaram de vermelho para branco para mostrar bloqueio suficiente da corrente sangüínea coronária e o desaparecimento do movimento da parede nestes sítios (no grupo de operação simulada, a agulha foi passada através da artéria coronária e em seguida removida sem ligação), a terceira e a quarta costelas foram fixadas por ligação com seda 3,0 (depois do pulmão ser expandido para remover o ar existente fora do pulmão na gaiola de costelas de modo que o pulmão possa ser facilmente expandido). O sítio de incisão na pele foi suturado com seda 3,0 na mesma maneira e em seguida observado por um tempo, e o tubo foi removido depois de confirmação de recuperação da consciência e recomeço da respiração espontânea.
Modelos de enfarte agudo do miocárdio foram preparados seqüencialmente pelo procedimento precedente.
No dia seguinte, foi realizada ecocardiografia percutânea sob anestesia intranasal com isoflurano, e foram excluídos pequenos modelos de enfarte tendo um tamanho de enfarte de menos de 20% da periferia inteira do ventrículo esquerdo. Os modelos de enfarte restantes foram classificados em ordem de função cardíaca crescente, e classificados alternadamente em um grupo tratado com anticorpo monoclonal Éxon-17 anti-humano (n°3) e um grupo tratado com um anticorpo controle (IgG de coelho) cada 200 μg através de veia da cauda.
Os anticorpos foram administrados a cada grupo no dia seguinte à preparação dos modelos e em intervalos de 6 dias depois da administração inicial, um total de 4 vezes.
O coração foi avaliado por ecocardiografia através da parede do tórax em intervalos de uma semana até o fim de 4 semanas. Os resultados da ecocardiografia 4 semanas depois da preparação dos modelos mostraram que a redução da espessura da parede anterior e espessura da parede posterior do coração foi inibida, o aumento do diâmetro interno diastólico final e diâmetro interno sistólico final foi inibido, e que o valor ou valor EF indicativo da função contrátil do coração aumentou no grupo tratado com anticorpo monoclonal de Éxon-17 anti-humano significativamente comparado com o grupo controle tratado com IgG de coelho. Em resumo, foi inibida dilatação do coração, mostrando que a função cardíaca foi melhorada (figura 12-1 afigura 12-3).
Conforme mostrado acima, em ratos modelo de enfarte agudo do miocárdio, os efeitos de inibição da dilatação do coração e melhora da função cardíaca foram causados por anticorpos contra Éxon-17 de proteína de periostina-1 humana os quais têm um epitopo composto de no mínimo uma seqüência ou uma parte da mesma consistindo nos 1Q ao 6o. aminoácidos de N-terminal de Éxon-17, sugerindo que Éxon-17 de proteína de periostina-1 humana, especialmente uma região compreendendo no mínimo um segmento de peptídeo ou uma parte da mesma consistindo no 1Q ao 6o. aminoácidos de N-terminal de Éxon-17 é uma região relacionada com dilatação do coração e função cardíaca reduzida depois de enfarte do miocárdio.
APLICABILIDADE INDUSTRIAL
Doenças nas quais periostina está envolvida podem ser prevenidas e tratadas por supressão da função de uma isoforma de periostina tendo atividade de células antiadesivas altamente expressada em uma doença tal como falência cardíaca, inibição da agravação da condição e melhora da função do tecido por uso de um anticorpo contra a isoforma de periostina tendo atividade de células antiadesivas. Além disso, a presença das doenças e o grau de progresso dos sintomas podem ser conhecidos por medição da quantidade da isoforma de periostina em uma amostra de um paciente. Listagem de Seqüências
<110> Asubio Pharma.
<120> "ANTICORPO CONTRA PERIOSTINA, E UMA COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA COMPREENDENDO ESTE PARA PREVENIR OU TRATAR UMA DOENÇA NA QUAL ESTÁ ENVOLVIDA PERIOSTINA"
<130> D-11-35US
<160> 34
<170> Patente de versão 3.1
<210> 1
<211> 838
<212> PRT
<213> Rattus sp.
<400> 1
Met Val Pro Leu Leu Pro Leu Ser Ala Leu Leu Leu Leu Phe Leu Cys 1 5 10 15
Ala Asn Ala Asn Ser Tyr Tyr Asp Lys Val Leu Ala 25 30
His Ser Arg Ile Arg Gly Arg Asp Gln Gly Pro Asn Val Cys Ala Leu 35 40 45
Gln Gln Ile Leu Gly Thr Lys Lys Lys Tyr Phe Ser Ser Cys Lys Asn 50 55 60
Trp Tyr Gln Gly Ala Ile Cys Gly Lys Lys Thr Thr Val Leu Tyr Glu 65 70 75 80
Cys Cys Pro Gly Tyr Met Arg Met Glu Gly Met Lys Gly Cys Pro Ala 85 90 95
Val Met Pro Ile Asp His Val Tyr Gly Thr Leu Gly Ile Val Gly Ala
Asp Val Asp Pro 20 100 105 110
Thr Thr Thr Gln His Tyr Ser Asp Val Ser Lys Leu Arg Glu Glu Ile 115 120 125
Glu Gly Lys Gly Ser Tyr Thr Tyr Phe Ala Pro Ser Asn Glu Ala Trp 130 .135 140
Asp Asn Leu Asp Ser Asp Ile Arg Arg Gly Leu Glu Asn Asn Val Asn 145 150 155 160
Val Glu Leu Leu Asn Ala Leu His Ser His Met Val Asn Lys Arg Met 165 170 175
Leu Thr Lys Asp Leu Lys His Gly Met Val Ile Pro Ser Met Tyr Asn 180 185 190
Asn Leu Gly Leu Phe Ile Asn His Tyr Pro Asn Gly Val Val Thr Val 195 200 205
Asn Cys Ala Arg Val Ile His Gly Asn Gln Ile Ala Thr Asn Gly Val 210 215 220
Val kis Val Ile Asp Arg Val Leu Thr Gln Ile Gly Thr Ser Ile Gln 225 230 235 240
Asp Phe Ile Glu Ala Glu Asp Glu Leu Ser Ser Phe Arg Ala Ala Ala 245 250 255
Ile Thr Ser Asp Leli Leu Glu Ser Leu Gly Arg Asp Gly His Phe Thr 260 265 270 Leu Phe Ala Pro Thr Asn Glu Ala Phe Glu Lys Leu Pro Arg Gly Val 275 280 285
Leu Glu Arg Ile Met Gly Asp Lys Val Ala Ser Glu Ala Leu Met Lys 290 295 300
Tyr His Ile Leu Asn Thr Leu Gln Cys Ser Glu Ala Ile Thr Gly Gly 305 310 315 320
Ala Val Phe Glu Thr Met Glu Gly Asn Thr Ile Glu Ile Gly Cys Glu 325 330 335
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<210> 2
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<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 2
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I
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Lys 65
Lys Ser Ile
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Glu
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Ala Val Phe Glu Thr Met Glu Gly Asn Thr Ile Glu Ile Gly Cys Glu 325 330 335
Gly Asp Ser Ile Ser Ile Asn Gly Ile Lys Met Val Asn Lys Lys Asp 340 345 350
Ile Val Thr Lys Asn Gly Val Ile His Leu Ile Asp Glu Val Leu Ile 355 360 365
Pro Asp Ser Ala Lys Gln Val Ile Glu Leu Ala Gly Lys Gln Gln Thr 370 375 380
Thr Phe Thr Asp Leu Val Ala Gln Leu Gly Leu Ala Ser Ser Leu Lys 385 390 395 400
Pro Asp Gly Glu Tyr Thr Leu Leu Ala Pro Val Asn Asn Ala Phe Ser 405 410 415
Asp Asp Thr Leu Ser Met Asp Gln Arg Leu Leu Lys Leu Ile Leu Gln 420 425 430
Asn His Ile Leu Lys Val Lys Val Gly Leu Ser Asp Leu Tyr Asn Gly 435 440 445
Gln Ile Leu Glu Thr Ile Gly Gly Lys Gln Leu Arg Val Phe Val Tyr 450 455 460
Arg Thr Ala Ile Cys Ile Glu Asn Ser Cys Met Val Arg Gly Ser Lys 465 470 475 480
Gln Gly Arg Asn Gly Ala Ile His Ile Phe Arg Glu Ile Ile Gln Pro 485 490 495
Ala Glu Lys Ser Leu His Asp Lys Leu Arg Gln Asp Lys Arg Phe Ser 500 505 510
Ile Phe Leu Ser Leu Leu Glu Ala Ala Asp Leu Lys Asp Leu Leu Thr 515 520 525
Gln Pro Gly Asp Trp Thr Leu Phe Ala Pro Thr Asn Asp Ala Phe Lys 530 535 540
Gly Met Thr Ser Glu Glu Arg Glu Leu Leu Ile Gly Asp Lys Asn Âla 545 550 555 560
Leu Gln Asn Ile Ile Leu Tyr His Leu Thr Pro Gly Val Tyr Ile Gly 565 570 575
Lys Gly Phe Glu Pro Gly Val Thr Asn Ile Leu Lys Thr Thr Gln Gly 580 585 590
Ser Lys Ile Tyr Leu Lys Gly Val Asn Glu Thr Leu Leu Val Asn Glu 595 600 605
Leu Lys Ser Lys Glu Ser Asp Ile Met Thr Thr Asn Gly Val Ile His 610 615 620
Val Val Asp Lys Leu Leu Tyr Pro Ala Asp Ile Pro Val Gly Asn Asp 625 630 635 640 Gln Leu Leu Glu Leu Leu Asn Lys Leu Ile Lys Tyr Ile Gln Ile Lys 645 650 655
Phe Val Arg Gly Ser Thr Phe Lys Glu Ile Pro Met Thr Val Tyr Thr 5 660 665 670
Thr Lys Ile Ile Thr Lys .Val Val Glu Pro Lys Ile Lys Val Ile Gln 675 680 685
Gly Ser Leu Gln Pro Ile Ile Lys Thr Glu Gly Pro Ala Met Thr Lys 690 695 700
Ile Gln Ile Glu Gly Asp Pro 705 710
Thr Val Thr Glu Val Ile His 725
Lys Ile Ile Asp Gly Vál Pro 740
Glu Glu Arg Ile Ile Thr Gly 755
Thr Gly Gly Gly Glu Thr Gly 770 775
Asp Phe Arg Leu Ile Lys Glu Gly Glu 715 720
Gly Glu Pro Val Ile Lys Lys Tyr Thr 730 735
Val Glu Ile Thr Glu Lys Gln Thr Arg 745 750
Pro Glu Ile Lys Tyr Thr Arg Ile Ser 760 765
Glu Thr Leu Gln Lys Phe Leu Gln Lys 780
Glu Val Ser Lys Val Thr Lys Phe Ile GlU Gly Gly Asp Gly His Leu 785 790 795 800
Phe Glu Asp Glu Glu Ile Lys Arg Leu Leu Gln Gly Asp Thr Pro Ala 805 810 815 Lys Lys Ile Pro Ala Asn Lys Arg Val Gln Gly Pro Arg Arg Arg Ser
835
<210> 9 <211> 2517 <212> DNA
<213> Mus musculus <400> 9
atggttcctc tcctgccctt atatgctctg ctgctgctgt tcctgtgtga tattaaccct 60
gcaaatgcca acagttacta tgacaaggtc ctggctcaca gccgcatcag gggtcgggat 120
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tcctgtaaga actggtatca aggtgctatc tgcgggaaga aaaccactgt gctatatgaa 240
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gacttccttg aagcagaaga cgacctttca tcatttagag cagccgccat cacctctgac 780
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<210> 10
<211> 811
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 10
Met Val Pro Leu Leu Pro Leu Tyr Ala Leu Leu Leu Leu Phe Leu Cys
1 5 10 15
Asp Ile Asn Pro Ala Asn Ala Asn Ser Tyr Tyr Asp Lys Val Leu Ala 20 25 30
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Gln Gln Ile Leu Gly Thr Lys Lys Lys Tyr Phe Ser Ser Cys Lys Asn 50 55 60
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Cys Cys Pro Gly Tyr Met Arg Met Glu Gly Met Lys Gly Cys Pro Ala 85 90 95
Val Met Pro Ile Asp His Val Tyr Gly Thr Leu Gly Ile Val Gly Ala 100 105 110
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Val Glu Leu Leu Asn Ala Leu His Ser His Met Val Asn Lys Arg Met 165 170 175
Leu Thr Lys Asp Leu Lys His Gly Met Val Ile Pro Ser Met Tyr Asn 180 185 190 Asn Leu Gly Leu Phe Ile Asn His Tyr Pro Asn Gly Val Val Thr Val
195 200 205
Asn Cys Ala Arg Val Ile His Gly Asn Gln Ile Ala Thr Asn Gly Val 210 215 220
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225 230 235 240
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Leu Gly Arg Asp Gly His Phe Thr 265 270
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Ile Lys Met Val Asn Lys Lys Asp 345 350
His Leu Ile Asp Glu Val Leu Ile
355
360
365 Pro Asp Ser Ala Lys Gln Val Ile Glu Leu Ala Gly Lys Gln Gln Thr 370 375 380
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Pro Asp Gly Glu Tyr Thr Leu Leu Ala Pro Val Asn Asn Ala Phe Ser 405 410 415
Asp Asp Thr Leu Ser Met Asp Gln Arg Leu Leu Lys Leu Ile Leu Gln 420 425 430
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Gly Met Thr Ser Glu Glu Arg Glu Leu Leu Ile Gly Asp Lys Asn Ala 545 550 555 560
Leu Gln Asn Ile Ile Leu Tyr His Leu Thr Pro Gly Val Tyr Ile Gly 565 570 575
Lys Gly Phe Glu Pro Gly Val Thr Asn Ile Leu Lys Thr Thr Gln Gly 580 585 590
Ser Lys Ile Tyr Leu Lys Gly Val Asn Glu Thr Leu Leu Val Asn Glu 595 600 605
Leu Lys Ser Lys Glu Ser Asp Ile Met Thr Thr Asn Gly Val Ile His 610 615 620
Val Val Asp Lys Leu Leu Tyr Pro Ala Asp Ile Pro Val Gly Asn Asp 625 630 635 640
Gln Leu Leu Glu Leu Leu Asn Lys Leu Ile Lys Tyr Ile Gln Ile Lys 645 650 655
Phe Val Arg Gly Ser Thr Phe Lys Glu Ile Pro Met Thr Val Tyr Arg 660 665 670
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Ile Lys Glu Gly GlU Thr Val Thr Glu Val Ile His Gly Glu Pro Val 690 695 700 Ile Lys Lys Tyr Thr Lys Ile Ile Asp Gly Val Pro Val Glu Ile Thr 705 710 715 720
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<210> 11
<211> 2436
<212> DNA
<213> Mus musculus
<400> 11
atggttcctc tcctgccctt atatgctctg ctgctgctgt tcctgtgtga tattaaccct gcaaatgcca acagttacta tgacaaggtc ctggctcaca gccgcatcag gggtcgggat cagggcccaa acgtctgtgc cctccagcaa attctgggca ccaaaaagaa atacttcagc tcctgtaaga actggtatca aggtgctatc tgcgggaaga aaaccactgt gctatatgaa tgctgccctg gctatatgag aatggaaggg atgaaaggct gccccgcagt gatgcctatt gaccatgttt atggcacgct gggcattgtg ggagccacta ccactcagca ctactccgat gtctcgaagc tgagagaaga gattgaagga aacgaggctt gggagaacct ggattctgac gttgagctac tgaatgcctt acacagccac ctgaaacacg gcatggttat tccttcaatg tatcccaatg gggttgtcac tgtgaactgt acaaatggtg tcgtccatgt cattgaccgt gacttccttg aagcagaaga cgacctttca ctcttggagt cccttggaag agatggtcac ttcgagaaac tgccacgagg tgtcctagaa gctctcatga agtaccacat cctaaatacc gccgtgtttg agaccatgga aggaaacact tccattaacg gaatcaagat ggtgaacaag cacctgattg atgaagtcct cattcctgat aaacagcaaa ccactttcac cgaectggta ccagatggag agtacacctt attagcacct agcatggacc aacgccttct taagctaatt ggccttagcg acctctacaa tggacagata gtctttgtgt atcggacggc tatctgcata cagggaagga atggtgccat tcacatattc ctgcacgaca agctgcggca agacaagcgc gcagatttga aagatctcct gacacagccc gatgccttca agggaatgac tagcgaagaa ctccaaaaca tcattcttta tcacctgacc cccggagtca ctaatatcct gaagaccaca aacgaaacgc ttctagtgaa tgagttgaag ggtgtcatcc acgtcgtgga çaaactcctc cagctcttgg aattactgaa caaactgata agcaccttca aagaaatccc catgactgtc gaaggtgatc ccgacttcag gctgattaaa ggagagccag tcattaaaaa gtacaccaaa gaaaaacaga ctcgggaaga acgaatcatt tccacaggag gtggagaaac aggagagacc
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<210> 12
<211> 2511 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 12
atgattccct ttttacccat gttttctcta ctattgctgc ttattgttaa ccctataaac 60
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ccaaatgtct gtgcccttca acagattttg ggcaccaaaa agaaatactt cagcacttgt 180
aagaactggt ataaaaagtc catctgtgga cagaaaacga ctgttttata tgaatgttgc 240
cctggttata tgagaatgga aggaatgaaa ggctgcccag cagttttgcc cattgaccat 300
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ttactgaatg ctttacatag tcacatgatt aataagagaa tgttgaccaa ggacttaaaa 540
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aatggggttg tcactgttaa ttgtgctcga atcatccatg ggaaccagat tgcaacaaat 660
ggtgttgtcc atgtcattga ccgtgtgctt acacaaattg gtacctcaat tcaagacttc 720
attgaagcag aagatgacct ttcatctttt agagcagctg ccatcacatc ggacatattg 780
gaggcccttg gaagagacgg tcacttcaca ctctttgctc ccaccaatga ggcttttgag 840
aaacttccac gaggtgtcct agaaaggttc atgggagaca aagtggcttc cgaagctctt 900
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attcatgttg tagataaact cctctatcca gcagacacac ctgttggaaa tgatcaactg 1920 ctggaaatac ttaataaatt aatcaaatac atccaaatta agtttgttcg tggtagcacc 1980
ttcaaagaaa tccccgtgac tgtctataca actaaaatta taaccaaagt tgtggaacca 2040 aaaattaaag tgattgaagg cagtcttcag cctattatca aaactgaagg acccacacta 2100 acaaaagtca aaattgaagg tgaacctgaa ttcagactga ttaaagaagg tgaaacaata 2160
áctgaagtga tccatggaga gccaattatt aaaaaataca ccaaaatcat tgatggagtg 2220 cctgtggaaa taactgaaaa agagacacga gaagaacgaa tcattacagg tcctgaaata 2280 aaatacactà ggatttctac tggaggtgga gaaacagaag aaactctgaa gaaattgtta 2340
caagaagagg tcaccaaggt caccaaattc attgàaggtg gtgatggtca tttatttgaa 2400
gatgaagaaa ttaaaàgact gcttcaggga gacacacccg tgaggaagtt gcaagccaac 2460
aaaaaagttc aaggttctag aagacgatta agggaaggtc gttctcagtg a 2511
<210> 13 <211> 809 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 13
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1 5 10 15
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30 20 25 30
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Ser Lys Glu Ser Asp Ile Met Thr Thr Asn Gly Val Ile His Val Val 610 615 620
Asp Lys Leu Leu Tyr Pro Ala Asp Thr Pro Val Gly Asn Asp Gln Leu 625 630 ■ 635 640
Leu Glu Ile Leu Asn Lys Leu Ile Lys Tyr Ile Gln Ile Lys Phe Val 645 650 655
Arg Gly Ser Thr Phe Lys Glu Ile Pro Val Thr Val Tyr Arg Pro Thr 660 665 670
I
Leu Thr Lys Val Lys Ile Glu Gly Glu Pro Glu Phe Arg Leu Ile Lys 675 680 685
Glu Gly Glu Thr Ile Thr Glu Val Ile His Gly Glu Pro Ile Ile Lys 690 695 700
Lys Tyr Thr Lys Ilfe Ile Asp Gly Val Pro Val Glu Ile Thr Glu Lys 705 710 715 720 Glu Thr Arg Glu Glu Arg Ile Ile Thr Gly Pro Glu Ile Lys Tyr Thr 725 730 735
Arg Ile Ser Thr Gly Gly Gly Glu Thr Glu Glu Thr Leu Lys Lys Leu 740 745 750
Leu Gln Glu Glu Val Thr Lys Val Thr Lys Phe Ile Glu Gly Gly Asp 755 760 765
Gly His Leu Phe Glu Asp Glu Glu Ile Lys Arg Leu Leu Gln Gly Asp 770 775 780
Thr Pro Val Arg Lys Leu Gln Ala Asn Lys Lys Val Gln Gly Ser Arg 785 790 795 800
Arg Arg Leu Arg Glu Gly Arg Ser Gln 805
<210> 14
<211> 2430
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 14
atgattccct ttttacccat gttttctcta ctattgctgc ttattgttaa ccctataaac 60
gccaacaatc attatgacaa gatcttggct catagtcgta tcaggggtcg ggaccaaggc 120
ccaaatgtct gtgcccttca acagattttg ggcaccaaaa agaaatactt cagcacttgt 180
aagaactggt ataaaaagtc catctgtgga cagaaaacga ctgttttata tgaatgttgc 240
cctggttata tgagaatgga aggaatgaaa ggctgcccag cagttttgcc cattgaccat 300
gtttatggca ctctgggcat cgtgggagcc accacaacgc agcgctattc tgacgcctca 360
aaactgaggg aggagatcga gggaaaggga tccttcactt actttgcacc gagtaatgag 420
gcttgggaca acttggattc tgatatccgt agaggtttgg agagcaacgt gaatgttgaa 480
ttactgaatg ctttacatag tcacatgatt aataagagaa tgttgaccaa ggacttaaaa 540 aatggcatga ttattccttc aatgtataac aatttggggc ttttcattaa ccattatcct 600
aatggggttg tcactgttaa ttgtgctcga atcatccatg ggaaccagat tgcaacaaat 660
ggtgttgtcc atgtcattga ccgtgtgctt acacaaattg gtacctcaat tcaagacttc 720
attgaagcag aagatgacct ttcatctttt agagcagctg ccatcacatc ggacatattg 780
gaggcccttg gaagagacgg tcacttcaca ctctttgctc ccaccaatga ggcttttgag 840
aaacttccac gaggtgtcct agaaaggttc atgggagaca aagtggcttc cgaagctctt 900
atgaagtacc acatcttaaa tactctccag tgttctgagt ctattatggg aggagçagtc 960
tttgagacgc tggaaggaaa tacaattgag ataggatgtg acggtgacag tataacagta 1020
aatggaatca aaatggtgaa caaaãaggat attgtgacaa ataatggtgt gatccatttg 1080
attgatcagg tcctaattcc tgattctgcc aaacaagtta ttgagctggc tggaaaacag 1140
caaaccacct tcacggatct tgtggcccaa ttaggcttgg catctgctct gaggccagat 1200
ggagaataca ctttgctggc acctgtgaat aatgcatttt ctgatgatac tctcagcatg 1260
gttcagcgcc tccttaaatt aattctgcag aatcacatat tgaaagtaaa agttggcctt 1320
aatgagcttt acaacgggca aatactggaa accatcggag gcaaacagct cagagtcttc 1380
gtatatcgta cagctgtctg cattgaaaat tcatgcatgg agaaagggag taagcaaggg 1440
agaaacggtg cgattcacat attccgcgag atcatcaagc cagcagagaa atccctccat 1500
gaaaagttaa aacaagataa gcgctttagc accttcctca gcctacttga agctgcagac 1560
ttgaaagagc tcctgacaca acctggagac tggacattat ttgtgccaac caatgatgct 1620
tttaagggaa tgactagtga agaaaaagaa attctgatac gggacaaaaa tgctcttcaa 1680
àacatcattc tttatcacct gacaccagga gttttcattg gaaaaggatt tgaacctggt 1740
gttactaaca ttttaaagac cacacaagga agcaaaatct ttctgaaaga agtaaatgat 1800
acacttctgg tgaatgaatt gaaatcaaaa gaatctgaca tcatgacaac aaatggtgta 1860
attcatgttg tagataaact cctctatcca gcagacacac ctgttggaaa tgatcaactg 1920
ctggaaatac ttaataaatt aatcaaatac atccaaatta agtttgttcg tggtagcacc 1980
ttcaaagaaa tccccgtgac tgtctataga cccacactaa caaaagtcaa aattgaaggt 2040
gàacctgaat tcagactgat taaagaaggt gaaacaataa ctgaagtgat ccatggagag 2100
ccaattatta aaaaatacac caaaatcatt gatggagtgc ctgtggaaat aactgaaaaa 2160
gagacacgag aagaacgaat cattacaggt cctgaâataa aatacactag gatttctact 2220
ggaggtggag aaacagaaga aactctgaag aaattgttac aagaagaggt caccaaggtc 2280
accaaattca ttgaaggtgg tgatggtcat ttatttgaag atgaagaaat taaaagactg 2340
cttcagggag acacacccgt gaggaagttg caagccaaca aaaaagttca aggttctaga 2400
agacgattaa gggaaggtcg ttctcagtga 2430 <210> 15
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial <220>
<223> Iniciador NaI
<400> 15
gttcattgaa ggtggcgatg gtc
<210> 16
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Iniciador Ν°2
<400> 16
gagataaaat ccctgcatgg tcct
<210> 17
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Iniciador Ν°3
<400> 17
cacggtcgat gacatggaca acacc
<210> 18
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial <220>
<223> Iniciador ΝΒ4
<400> 18
acggagctca gggctgaaga tg 22
<210> 19
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial <220>
<223> Iniciador Ν25
<400> 19
gacccgggaa gaacgcatca tc 22
<210> 20
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Iniciador N26
<400> 20
tgggtgaccc tgagaacggc cttctcttga tc 32
<210> 21 <211> 27
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 21
Thr Thr Lys Ile Ile Thr Lys Val Val Glu Pro Lys Ile Lys Val Ile
1 5 ' 10 15
Glu Gly Ser Leu Gln Pro Ile Ile Lys Thr Glu 20 25
<210> 22
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 22
Thr Thr Lys Ile Ile Thr Lys Val Val 1 5
<210> 23
<211> 9
<212> PRT
<213> Rattus sp.
<400> 23
Thr Thr Lys Ile Ile Thr Lys Leu Val 1 5 .
<210> 24
<211> 9
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 24
Thr Thr Lys Ile Ile Thr Lys Val Val
1 5
<210> 25 <211> 28 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 25
Cys Thr Thr Lys Ile Ile Thr Lys Val Val Glu Pro Lys Ile Lys Val Ile Glu Gly Ser Leu Gln Pro Ile Ile Lys Thr Glu 20 25
<210> 26
<211> 10
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 26
Tyr Thr Thr Lys Ile Ile Thr Lys Val Val 1 5 10
<210> 27
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial <220>
<223> Iniciador N27
<400> 15
aagctagcca ccatgattcc ctttttaccc at
<210> 28
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial <220>
<223> Iniciador Na8
<400> 20
aactccacaa tttccctcat
<210> 29 <211> 21
<212> DNA
<213> Artificial <220>
<223> Iniciador N89
<400> 29
taaccaaagt tgtggaacca a 21
<210> 30
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial <220>
<223> Iniciador NaIO
<400> 30
tgtgtctccc tgaagcagtc 20
<210> 31
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial <220>
<223> Iniciador NaIl
<400> 31
catcaccatc accatcacta a 21
<210> 32
<211> 56
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Iniciador Ns12 <400> 32
ctagaagacg attaagggaa ggtcgttctc agctggaagt tctgttccag gggccc
<210> 33
<211> 52
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Iniciador N213
<400> 33
gggcccctgg aacagaactt ccagctgaga acgaccttcc cttaatcgtc tt
<210> 34 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 34
Thr Thr Lys Ile Ile Thr TRATADO DE BUDAPESTE SOBRE O RECONHECIMENTO INTERNACIONAL DO DEPÓSITO DE MICROORGANISMOS PARA FINS DE PROCESSSAMENTO DE MATÉRIA DE PATENTES
RECIBO NO CASO DE DEPÓSITO ORIGINAL
Emitido por força da regra 7.1 pela autoridade Internacional de depósito identificado no final desta página.
Depositante
Nome: DAIICHI ASUBIO PHARMA CO., LTD. Presidente: Seiichi YOKOYAMA
Endereço: 9-11, Akasaka 2-chome, Minato-ku, Tokyo 107-8541 Japan
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Claims (34)

1. Anticorpo contra uma isoforma de periostina tendo atividade adesiva anticelular.
2. Anticorpo contra uma isoforma de periostina tendo uma seqüência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 1 ou na SEQ ID NO: 2.
3. Anticorpo contra uma isoforma de periostina tendo uma seqüência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 3 ou na SEQ ID NO: 4.
4. Anticorpo contra uma isoforma de periostina tendo uma seqüência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 34.
5. Anticorpo contra uma região responsável pela atividade adesiva anticelular de uma isoforma de periostina tendo atividade adesiva anticelular.
6. Anticorpo contra um peptídeo consistindo em uma seqüência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 3 ou na SEQ ID NÒ: 4 ou uma parte da mesma.
7. Anticorpo contra um peptídeo tendo uma seqüência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 34 ou uma seqüência de aminoácidos parcial da mesma.
8. Anticorpo de qualquer uma das reivindicações 1 a 7, o qual especificamente reconhece uma seqüência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 3 ou na SEQ ID NO: 4, ou um sítio parcial da mesma.
9. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a -7, o qual especificamente reconhece uma seqüência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 34, ou um sítio parcial da mesma.
10. Anticorpo ligando a um peptídeo consistindo em uma seqüência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 26.
11. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, o qual tem a capacidade de neutralizar atividade adesiva anticelular.
12. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, o qual é um anticorpo policlonal, anticorpo monoclonal, anticorpo quimérico, anticorpo humanizado ou anticorpo humano.
13. Anticorpo de acordo com a reivindicação 12, o qual é um anticorpo monoclonal.
14. Anticorpo produzido por uma linhagem celular de hibridoma FERM BP-10718.
15. Fragmento de anticorpo consistindo em um fragmento parcial do anticorpo monoclonal como definido na reivindicação 13.
16. Derivado de anticorpo compreendendo uma proteína ou fármaco de baixo peso molecular ligado ao anticorpo de qualquer uma das reivindicações 1 a 14 ou o fragmento de anticorpo como definido na reivindicação 15.
17. Hibridoma produzindo o anticorpo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 14.
18. Hibridoma de acordo com a reivindicação 17, o qual é uma linhagem celular de hibridoma FERM BP-10718.
19. DNA codificando o anticorpo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 14, o fragmento de anticorpo como definido na reivindicação 15 ou o derivado como definido na reivindicação 16, em que o derivado compreende uma proteína ligada ao anticorpo ou fragmento de anticorpo.
20. Vetor recombinante contendo o DNA como definido na reivindicação 19.
21. Transformante obtenível introduzindo o vetor recombinante como definido na reivindicação 20 em uma célula hospedeira.
22. Método para produzir o anticorpo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 14, o fragmento de anticorpo como definido na reivindicação 15 ou o derivado como definido na reivindicação 16, em que o derivado compreende uma proteína ligada ao anticorpo ou fragmento de anticorpo, o método referido compreendendo cultivar o transformante como definido na reivindicação 21 para produzir o anticorpo, fragmento de anticorpo ou derivado na cultura, e coletar o anticorpo, fragmento de anticorpo ou derivado da cultura.
23. Composição farmacêutica compreendendo o anticorpo de qualquer uma das reivindicações 1 a 14, o fragmento de anticorpo como definido na reivindicação 15 ou o derivado da reivindicação 16.
24. Composição farmacêutica para prevenir ou tratar uma doença na qual está envolvida uma isoforma de periostina tendo atividade adesiva anticelular, compreendendo o anticorpo como definido em qualquer uma das reivindicações. 1 a 14, o fragmento de anticorpo como definido na reivindicação 15 ou o derivado como definido na reivindicação 16.
25. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 24, em que a doença é falência cardíaca, infarte do miocárdio, dilatação do coração, hipertrofia cardíaca, fibrose cardíaca, cardiomiopatia, miocardite, doença valvular, câncer, aneurisma, arteriosclerose, doença neurodegenerativa central, doença renal, artrite reumatóide, osteoporose, enfisema pulmonar, hipertensão pulmonar, doença pulmonár obstrutiva crônica (DPOC), nefrite, pancreatite, hepatite, fibrose hepática ou fibrose pulmonar.
26. Método para prevenir ou tratar uma doença na qual está envolvida uma isoforma de periostina tendo atividade adesiva anticelular, compreendendo administrar a composição farmacêutica como definida na reivindicação 23 a um paciente.
27. Método de acordo com a reivindicação 26, em que a doença é falência cardíaca, infarte do miocárdio, dilatação do coração, hipertrofia cardíaca, fibrose cardíaca, cardiomiopatia, miocardite, doença valvular, câncer, aneurisma, arteriosclerose, doença neurodegenerativa central, doença renal, artrite reumatóide, osteoporose, enfisema pulmonar, hipertensão pulmonar, doença pulmonar obstrutiva crônica (DPOC), nefrite, pancreatite, hepatite, fibrose hepática ou fibrose pulmonar.
28. Método para diagnosticar uma doença na qual está envolvida uma isoforma de periostina tendo atividade adesiva anticelular, compreendendo medir a quantidade da isoforma de periostina em uma amostra biológica usando o anticorpo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 14, o fragmento de anticorpo como definido na reivindicação 15 ou o derivado como definido na reivindicação 16.
29. Método de acordo com a reivindicação 28 em que o anticorpo é um anticorpo marcado.
30. Método de acordo com a reivindicação 28 ou 29, em que a doença é falência cardíaca, infarte do miocárdio, dilatação do coração, hipertrofia cardíaca, fibrose cardíaca, cardiomiopatia, miocardite, doença valvular, câncer, aneurisma, arteriosclerose, doença neurodegenerativa central, doença renal, artrite reumatóide, osteoporose, enfisema pulmonar, hipertensão pulmonar, doença pulmonar obstrutiva crônica (DPOC), nefrite, pancreatite, hepatite, fibrose hepática ou fibrose pulmonar.
31. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, o fragmento de anticorpo como definido na reivindicação 15 ou o derivado como definido na reivindicação 16, o qual tenha sido marcado.
32. Método para quantificar uma isoforma de periostina tendo atividade adesiva anticelular em uma amostra usando o anticorpo como definido em qualquer uma das reivindicações 1a 14, o fragmento de anticorpo como definido na reivindicação 15 ou o derivado da reivindicação 16.
33. Método para detectar uma isoforma de periostina tendo atividade adesiva anticelular em uma amostra usando o anticorpo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 14, o fragmento de anticorpo como definido na reivindicação 15 ou o derivado como definido na reivindicação 16.
34. Reagente diagnóstico para uma doença na qual está envolvida uma isoforma de periostina tendo atividade adesiva anticelular, compreendendo o anticorpo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 14, o fragmento de anticorpo como definido na reivindicação 15 ou o derivado como definido na reivindicação 16.
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