KR20070073754A - 항-히스톤 ｈ1 모노크로날 항체 및 그것을 생성할 수 있는하이브리도마 - Google Patents
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Abstract
장기이식시의 거부반응의 억제, 예측 또는 진단에 유용한, 항-히스톤 H1 모노크로날 항체 및 이를 생성하는 하이브리도마와 폴리펩티드가 개시되어 있다.
항-히스톤 H1 모노크로날 항체, 하이브리도마, 면역억제 조성물
Description
관련출원의 참조
본 특허출원은, 먼저 출원된 일본국 특허출원 제2004-257528호(출원일 : 2004년 9월 3일)에 근거한 우선권주장을 수반하는 것이다. 이들 앞의 특허출원에서 개시된 전체 개시 내용은, 이를 인용함으로써 본 명세서의 일부로 된다.
기술 분야
본 발명은, 항-히스톤 H1 모노크로날 항체 및 이를 생성하는 하이브리도마 및 항-히스톤 H1 항체가 특이적으로 인식하는 폴리펩티드에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은, 장기이식에서의 거부반응의 억제, 예측 또는 진단에 유용한 모노크로날 항체 및 이를 생성하는 하이브리도마 및 폴리펩티드에 관한 것이다.
장기이식 의료에서는, 장기이식 후의 거부반응을 억제하기 위해, 종전에도 여러 가지 면역억제제가 사용되고 있다. 이와 같은 면역억제제로는, 예컨대 타크로리무스(FK506), 시클로스포린 A 등을 들 수 있다(Jpn J Pharmacol, 71, 89-100, 1996). 그러나, 종전의 면역억제제에 있어서는, 암세포의 증식촉진, 골수의 기능 억제 등이 강한 부작용, 감염증, 또는 영속투여의 필요성 등이 문제로 되고 있다(Transplantation, 58, 170-178, 1994).
또, 일반적으로 면역억제제의 투약 철회 시기를 판단하는 것이 곤란하였다. 예컨대, 면역억제제의 투여를 계속하지 않더라도 조직이 생착(生着)하는 수 있다. 이와 같은 경우에 갑자기 면역억제제의 투여를 계속하면, 환자에 대해 단순히 독성에 의한 손상을 부여할 염려가 있다. 한편, 면역억제제의 투여를 중단함으로써, 생착되어 있던 조직이 거부로 바꾸어질 가능성도 있다. 이 경우, 면역억제제의 투여를 개재하여도 거부는 면할 수 없는 경우가 많다.
한편, 장기이식에 관한 여러 가지 연구가 되어 있다. 예컨대, 동소성(同所性) 간이식(0LT : orthotopic liver transplantation)의 계에서, 이식편(移植片)의 생착률이 높은 도너(doner) DA 래트의 간(MHC haplotype RTla)을 레시피엔트(recipient) PVG 래트(RTlc)에 이식한 경우, 면역억제제를 투여하지 않고 이식편이 생착한다는 것이 보고되어 있다(Transplantation, 35, 304-311, 1983).
또, DA 래트 간을 이식한 레시피엔트 PVG 래트의 혈청(post-OLT serum)을, 거부반응이 생기는 조합의 이식 모델계에 1회술 전 투여함으로써, 이식편의 거부반응이 억제되었다는 것이 보고되어 있다(J. Surg. Res., 80, 58-61, 1998).
또, 항-히스톤 H1 폴리크로날 항체를, 거부반응이 반드시 생기는 DA(RT1a) 및 LEWIS 래트(RT1l)의 심 이식계(in vivo)에 수술 후 투여함으로써, 거부반응이 억제되어, 레시피엔트가 생존한다는 것이 개시되어 있다(Transplantation, 77, 1595-1603, 2004).
또, 본 발명자들의 일부는, PVG 래트 유래의 이식 후 초기혈청을 이용함으로써 혼합 임파구 배양반응(MLR; mixed lymphocyte reaction)이 억제된다는 것 및, 항-히스톤 H1 항체가 MLR 억제 활성을 나타낸 것이 개시되어 있다(일본국 특개 2004-149507호 공보).
그러나, 장기이식에서의 이식거부를 억제할 수가 있는, 안전성 및 면역억제 활성이 뛰어난 면역억제제를 창출하는 것이 여전히 요구되고 있다. 또, 장기이식에서는, 환자의 예후관리나 면역억제제의 불필요한 투여 방지의 필요성 때문에, 이식거부가 생기는지 여부를 예측 또는 진단하기 위한 정확도가 뛰어난 약제를 창출하는 것도 필요로 한다.
이에 본 발명자들은, 이번에, 현저한 면역억제 활성을 가져, 이식거부의 억제, 예측 또는 진단에 이용할 수 있는 항-히스톤 H1 모노크로날 항체 및 이 항체를 생성하는 하이브리도마를 알아내었다. 그리고, 본 발명자들은, 상기 항-히스톤 H1 모노크로날 항체가 특이적으로 인식하는 특정한 아미노산 서열을 알아내었다. 본 발명은 이러한 발견에 기한 것이다.
따라서, 본 발명은, 현저한 면역 억제 활성을 갖고, 이식거부의 억제, 예측 또는 진단에 이용할 수 있는 항-히스톤 H1 모노크로날 항체 및 이 항체를 생성하는 하이브리도마의 제공을 목적으로 한다.
또, 본 발명은, 상기 항-히스톤 H1 모노크로날 항체가 특이적으로 인식하는, 특정한 아미노산 서열을 포함해서 이루어진 폴리펩티드의 제공을 그 목적으로 한다.
그리고, 본 발명에 의한 모노크로날 항체는, 히스톤 H1 또는 비장세포의 세포막에 존재하는 히스톤 H1-유사 항원을 인식하는 것을 특징으로 하는 것이다.
또, 본 발명에 의한 하이브리도마는, 상기 모노크로날 항체를 생성하는 것이다.
또, 본 발명에 의한 폴리펩티드는, 본 발명에 의한 모노크로날 항체가 인식하는 특정한 아미노산 서열을 포함해서 이루어진 것이다.
본 발명에 의한 모노크로날 항체는, 현저한 면역 억제 활성과 안정성을 가진 것으로, 뛰어난 면역억제제로서 유리하게 이용할 수 있다. 그리고, 본 발명에 의한 모노크로날 항체는, 이식거부의 지표로 되는, 포유동물의 자기항원 단백질에 대한 뛰어난 특이성을 가진 것인바, 따라서, 장기이식에서 포유동물에서의 이식거부를 예측 또는 진단하기 위해 유용하게 이용할 수 있다.
또, 본 발명에 의한 폴리펩티드는, 항원으로서 이용한 경우, 생체에서 항-히스톤 H1 항체의 생성을 유도할 수 있기 때문에, 면역억제제로서 유리하게 이용할 수 있다. 그리고, 본 발명에 의한 폴리펩티드는, 포유동물에서 생성되는 항-히스톤 H1 항체량을 측정하기 위해 이용할 수가 있고, 그에 따라 장기이식에서 이식거부의 예측 또는 진단을 위해 유리하게 이용할 수 있다.
도 1은, 항-히스톤 H1 모노크로날 항체 함유 배양상청을 이용한 MLR 억제 활성 평가의 결과를 나타낸다.
기탁
본 발명에 의한 하이브리도마 1F5, 하이브리도마 3F2, 하이브리도마 15F11, 하이브리도마 17C2 또는 하이브리도마 16G9는, 원기탁일을 2004년 8월 19일로 해서, 일본국 독립행정법인 산업기술종합연구소 특허생물기탁센터(주소 : 일본국 이바라키현 츠쿠바시동 1-1-1 중앙 제6)에서, 수탁번호 BP-10409, 수탁번호 FERM BP-10410, 수령번호 FERM BP-10411, 수탁번호 FERM BP-10412 또는 수탁번호 FERM BP-10413으로 기탁 되어 있다.
모노크로날
항체 및
하이브리도마
본 발명에 의한 모노크로날 항체는, 히스톤 H1, 또는 비장세포에 존재하는 히스톤 H1-유사 항원을 인식하는 것을 하나의 특징으로 하는 것이다. 그리고, 본 발명에 의한 모노크로날 항체는, 바람직하기는 SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 또는 SEQ ID NO: 8로 나타내어지는 아미노산 서열 내의 에피토프(epitope)를 인식하는 것이다. 또, 본 발명의 별개의 바람직한 태양에 의하면, 항-히스톤 H1 모노크로날 항체는, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 또는 SEQ ID NO: 8로 나타내어지는 아미노산 서열을 포함해서 이루어진 폴리펩티드를 인식하는 것이다. 여기서, 이 폴리펩티드는, 바람직하기는 약 12~150개의 아미노산 잔기로 된 것이다. 또, 본 발명의 별개의 바람직한 태양에 의하면, 항-히스톤 H1 모노크로날 항체는, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 또는 SEQ ID NO: 8로 나타내어지는 아미노산 서열로 이루어진 폴 리펩티드를 인식하는 것이다. 또, 본 발명의 별개의 바람직한 태양에 의하면, 항-히스톤 H1 모노크로날 항체는, 하이브리도마 1F5, 하이브리도마 3F2, 하이브리도마 15F11, 하이브리도마 17C2 및 하이브리도마 16G9으로 된 군(群)으로부터 선택되는 적어도 가지 하이브리도마에 의해 생성되는 것이다.
「히스톤 H1」은, 진핵세포 중에 존재해서, 뉴클레오솜 링커 DNA와 결합해서 뉴클레오솜을 형성하는 염기성 단백을 의미한다. 이와 같은 히스톤(histone) H1으로는, 예컨대 인간에 유래한 것으로서 SEQ ID NO: 1로 나타나 있는 아미노산 서열을 포함해서 이루어진 것, 소(牛)에서 유래한 것으로서 SEQ ID NO: 2로 나타나 있는 아미노산 서열을 포함해서 이루어진 것, 또는 마우스(mouse)에 유래한 것으로서 SEQ ID NO: 3으로 나타나 있는 아미노산 서열을 포함해서 이루어진 것을 들 수 있다.
또, 「히스톤 H1-유사 항원(hstone H1-like antigen)」이란, 하이브리도마 1F5, 하이브리도마 3F2, 하이브리도마 15F11, 하이브리도마 17C2 및 하이브리도마 16G9에 의해 생성되는 모노크로날 항체에 의해 비장세포의 세포막에서 인식되는 항원을 의미한다. 그리고, 이 히스톤 H1-유사 항원은, 바람직하기는 SDS-PAGE에서 분자량 31kD를 나타낸 단백질의 일부를 구성하는 것이다. 이와 같은 히스톤 H1-유사 항원으로는, 예컨대 적어도 포유동물 유래의 히스톤 H1의 아미노산 서열의 일부를 가진 단백질을 들 수 있다.
또, 본 발명에 의한 모노크로날 항체는, 소망에 따라, 키메라 항체, 인간형화 항체, 완전 인간형 항체로 할 수 있다. 보다 구체적으로는, 인간항체에 마우스 모노크로날 항체의 항원 결합 도메인 Fv를 바꿔 넣은 키메라 항체(Morrison, S.L., Oi, V.T., "Immunoglobulin Genes" Academic Press(London), 260-274(1989)), 마우스 모노크로날 항체의 항원 결합에 직접 관련되는 Fv 도메인 상의 서열인 상보성 결정영역(CDR:com plementary determining region)을 인간항체의 프레임에 CDR 그라프트 기술에 의해 메워넣은 인간형화 항체(Roguska, M.L. et. al., Humanization of murine monoclonal antibodies through variable domain resurfacing, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91, 969-973(1994))를 들 수 있고, 또 완전 인간형 항체로는, 인간항체 유전자를 마우스에 이식한 트랜스크로모(TransChromo) 마우스에 의한 것(Tomizuka, K. et.al., Functional expression and germline transmission of a human chromosome fragment in chimaeric mice, Nature Genet., 16, 133-143(1997)), 인간항체 파아지 라이브러리(Winter, G. et. al., Making antibodies by phage display technology, Ann. Rev. Immunol., 12, 433-455(1994), Griffiths, A.D. et. al., Isolation of high affinity human antibodies directly from large synthetic repertoires, EMB0. J., 13, 3245-3260(1994))에 의한 것을 들 수 있다.
또, 본 발명의 다른 태양에 따르면, 하이브리도마 1F5, 하이브리도마 3F2, 하이브리도마 15F11, 하이브리도마 17C2 또는 하이브리도마 16G9가 제공된다.
본 발명에 의한 모노크로날 항체 및 하이브리도마는, 예컨대 다음과 같이 제조할 수 있다. 즉, 먼저, 본 발명에 의한 하이브리도마는, 히스톤 H1 또는 히스톤 H1-유사 항원 또는 이들의 에피토프를 포함한 폴리펩티드를 감작항원(sensitizing antigen)으로 사용하여, 이 감작항원에서 면역된 포유동물의 형질세포(면역세포)를 포유동물의 미에로머(myeloma) 세포와 융합시키고, 얻어진 하이브리도마를 크로닝(cloning)하여, 그 하이브리도마 중에서 선별함으로써 얻을 수 있다. 그리고, 본 발명에 의한 모노크로날 항체는, 본 발명에 의한 하이브리도마를 배양해서, 이것이 생성하는 항체를 회수함으로써 얻을 수 있다.
감작항원으로 쓰이는 히스톤 H1 또는 히스톤 H1-유사 항원 또는 이들의 에피토프를 포함한 폴리펩티드는, 예컨대 인간 백혈병 골수세포, 인간 자궁경부암 Hela 세포, 소 흉선, 소 간장, 조류 적혈구 유래인 것을 들 수 있다. 그리고, 이 감작항원은, 예컨대 PBS나 생리식염수 등을 가해 현탁액으로 하고, 소망에 따라FCA(Freund's complete adjuvant), KLH(keyhole limpet hemocyanin) 등의 보조액(adjuvant)와 함께 포유동물의 면역처리에 이용할 수 있다.
포유동물을 면역하는 방법으로는, 당해 기술분야에서의 일반적으로 사용되는 투여법을 이용할 수가 있는바, 구체적으로는 복강내 주사, 비장내 주사, 근육내 주사, 피하주사, 피내주사, 경구투여, 경점막투여, 경피투여 등을 들 수 있으나, 바람직하기는 복강내 주사, 비장내 주사이다. 감작항원의 투여간격은, 감작항원의 투여량 및 포유동물의 종류 등에 대응해서 적의 결정되는바, 예컨대 1개월간에 수회씩으로 할 수 있다.
면역되는 포유동물은 특히 한정되지 않는바, 세포융합에 사용하는 미에로머 세포와의 적합성 등을 고려해서 선택하는 것이 바람직하고, 예컨대 마우스, 래트, 햄스터 등을 들 수가 있으나, 바람직하기는 마우스이다.
또, 면역세포로는, 바람직하기는 비장세포를 사용한다.
본 발명에 이용하는 미에로머 세포로는, 예컨대, P3(P3X63Ag8.653)(J. Immunol., 123, 1548, 1978), p3-U1(Current Topics in Microbiology and Immunology, 81, 1-7, 1978), NS-1(Eur. J. Immunol., 6, 511-519, 1976), MPC-11(Cell, 8, 405-415, 1976), Sp2/0-Ag14(Nature, 276, 269-270, 1978), FO(J. Immunol. Meth., 35, 1-21, 1980), S194(J. Exp. Med., 148, 313-323, 1978), 및 R210(Nature, 277, 131-133, 1979) 등을 들 수 있으나, 바람직하기는 P3 또는 p3-U1로서, 보다 바람직하기는 P3이다.
면역세포와 미에로머 세포와의 세포융합은, 예컨대, 밀스타인 등(Milstein et. al.)의 방법 (Methods Enzymol., 73, 3-46, 1981) 등에 따라 실행할 수 있다. 구체적으로는, 세포융합은, 예컨대 융합촉진제의 존재 하에 배지 중에서 면역세포와 미에로머 세포를 혼합함으로써 실시할 수 있다. 그리고 세포융합에 있어, 적의 배지를 첨가해서 원심분리하는 조작을 반복해서 하이브리도마를 생성할 수 있다.
세포융합에 쓰이는 배지로는, 예컨대, RPMI-1640 배지, MEM 배지 등의 세포융합에서 통상 사용되는 배지를 들 수 있다. 또, 우태아(牛胎芽) 혈청(FBS)과 같은 혈청 보액을 적절히 병용할 수 있다.
또, 세포융합 온도는, 바람직하기는 25 ~ 37℃로서, 보다 바람직하기는 30 ~ 37℃이다.
또, 미에로머 세포와 면역세포와의 혼합비율은, 바람직하기는 1:1 ~ 1:10 정도이다.
융합촉진제로는, 예컨대, 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 센다이 바이러스(HVJ) 등을 들 수가 있으나, 바람직하기는 PEG이다. PEG의 분자량은 적의 선택할 수 있는바, 예컨대 평균분자량 1,000 ~ 6,000 정도로 할 수 있다. 또, 배지 중의 PEG의 농도는, 바람직하기는 약 30 ~ 60%(W/V)이다.
또, 소망에 따라 디메틸 슬폭시드 등의 보조제를 배지에 적의 첨가할 수 있다.
본 발명에 의한 하이브리도마의 선택은, 세포융합에 의해 얻어지는 하이브리도마를, 예컨대 HAT 배지 등의 통상적인 선택 배지에서 배양하고, 통상적인 한계희석법을 이용하게 되는바, 예컨대 히스톤 H1에 대한 항체값 등을 지표로 해서 스크리닝함으로써 실시할 수 있다. HAT 배지에 의한 배양기간은, 목적으로 하는 하이브리도마 이외의 세포(미융합세포)가 사멸하기에 충분한 시간으로서, 통상 수일 ~ 수주 간으로 할 수 있다. 이와 같이 해서 얻어지는 본 발명에 의한 하이브리도마는, 통상적인 배지에서 계대배양 할 수 있고, 또 액체 질소 중에서 장기보존할 수 있다.
또, 본 발명에 의한 모노크로날 항체를 회수하는 방법으로는, 예컨대 하이브리도마를 통상적인 방법으로라 배양을 해서 그 배양 상청으로부터 모노크로날 항체를 얻는 방법, 또는 하이브리도마를 이와 적합성이 있는 포유동물에 투여해서 증식시켜 그의 복수(腹水)로부터 모노크로날 항체를 얻는 방법 등을 들 수 있다. 여기서, 전자의 방법은 고순도의 항체를 얻기에 바람직하고, 후자의 방법은 항체를 대량으로 생산하기에 바람직하였다.
그리고, 본 발명에 의한 모노크로날 항체는, 염석법, 겔 여과법, 친화성 크로마토그래피 등의 방법으로 고순도로 정제할 수 있다.
본 발명에 의한 모노크로날 항체는, 앞에서 설명한 바와 같이 현저한 면역억제 활성을 갖는다. 본 발명에 의한 모노크로날 항체는, 그대로 면역억제제로서 이용할 수 있으나, 약학적으로 허용되는 담체 등과 함께, 의약조성물, 특히 면역억제용 조성물로서 이용할 수 있다. 따라서, 본 발명 1실시태양에 의하면, 본 발명에 의한 모노크로날 항체를 활성성분으로 하는 면역억제용 조성물이 제공된다. 또, 본 발명의 별개의 태양에 의하면, 면역억제용 조성물을 제조함에 있어, 본 발명에 의한 모노크로날 항체의 사용이 제공된다.
본 발명에 의한 면역억제용 조성물은, 심장, 신장, 간장, 골수, 피부 등의 장기의 이식에 의한 거부반응의 치료 및 예방을 위해, 또는 자기면역질환 등의 치료 및 예방을 위해 유용하였다. 본 발명에 의한 면역억제용 조성물은, 예컨대 본 발명에 의한 모노크로날 항체를 주사용 생리식염수, 주사용 증류수, 주사용 완충용액 등으로 용해해서 조제할 수 있다. 그리고, 본 발명에 의한 면역억제용 조성물에는 적당한 용제, 용해보조제, 보존제, 안정제, 유화제, 현탁제, 무통화제, 등장화제, 완충제, 부형제, 증점제, 착색제, 공지의 캐리어(각종 리포솜, 폴리아미노산 캐리어, 합성 고분자, 천연 고분자 등) 등을 함유시킬 수 있다.
또, 본 발명에 의한 면역억제용 조성물은, 전신적 또는 국소적으로 투여할 수가 있는바, 구체적 투여방법으로는, 점적, 정맥내 주사, 근육내 주사, 피하주사, 피내주사, 경구투여, 경점막투여, 경피투여 등을 들 수 있다. 따라서, 본 발명의 별개의 태양에 의하면, 면역억제를 필요로 하는 포유동물의 치료방법에서, 포유동물에 치료상 유효량의 본 발명에 의한 모노크로날 항체를 투여하는 것을 포함해서 이루어진 방법이 제공된다. 본 발명에 의한 모노크로날 항체의 투여량은 포유동물의 상태, 연령 등에 따라 다르나, 통상, 0.05 ~ 40mg/체중kg/일, 바람직하기는 0.1 ~ 1.0mg/체중kg/일을 1회 또는 수회로 나누어 투여할 수 있다. 또, 투여는 1회만으로 할 수도 있고, 예컨대 4주간 사이에 반복 투여할 수도 있다.
또, 본 발명에 의한 모노크로날 항체는, 장기이식시에 이식거부의 지표로 되는 자기항원 단백질과 특이적으로 반응하기 때문에, 포유동물에서의 이식거부를 예측 또는 진단하기 위해 이용할 수 있다. 여기서, 자기항원 단백질(auto-antigenic protein)이라 함은, 포유동물에 존재하는 것으로, 바람직하기는 하이브리도마 1F5, 하이브리도마 3F2, 하이브리도마 15Fll, 하이브리도마 17C2 또는 하이브리도마 16G9에 의해 생성되어 모노크로날 항체에 의해 인식되는 단백질을 의미한다. 따라서, 본 발명의 별개의 태양에 의하면, 본 발명 모노크로날 항체를 활성성분으로 하는 포유동물에서의 이식거부의 예측 또는 진단용 조성물이 제공된다. 상기 조성물에는, 소망에 따라 약학상 허용되는 담체를 첨가할 수 있다. 또, 상기 이식거부는, 바람직하기는 장기이식 후에 생기는 것으로, 보다 바람직하기는 면역억제제의 투여를 중지한 후에 발생하는 것이다. 또, 본 발명의 별개의 태양에 의하면, 포유동물에서의 이식거부의 예측 또는 진단약으로서, 본 발명에 의한 모노크로날 항체의 사용이 제공된다. 또, 본 발명의 별개의 태양에 의하면, 포유동물에서의 이식거부를 예측 또는 진단하는 방법으로서, 포유동물 유래의 생물학적 시료와, 본 발명에 의 한 모노크로날 항체와의 면역반응성 수준을 측정하는 것을 포함해서 이루어지는 방법이 제공된다. 그리고, 상기 방법에서는, 측정된 면역반응성 수준이, 이식거부가 일어난 포유동물의 생물학적 시료와, 본 발명에 의한 모노크로날 항체와의 면역반응성 수준을 참조해서, 미리 설정된 역치(threshold value)보다도 높은 경우에 이식거부의 리스크가 높다고 예측 또는 진단한다. 이 역치는, 포유동물 및 도너의 종, 성별, 이식장기의 종류 및 측정방법 등에 대응해서 당업자에 의해 적의 결정된다. 본 발명에 의한 예측 또는 진단방법에 의하면, 불필요한 면역억제제의 투여를 회피함으로써 환자의 신체적 및 경제적 부담을 경감시킬 수 있다.
또, 상기 생물학적 시료로는, 바람직하기는 혈액이고, 보다 바람직하기는 혈청이다.
상기 면역억제제는, 장기이식에 쓰이는 면역억제제이면 특히 한정되지 않는바, 예컨대 시클로포스파미드(cyclophosphamide) 등의 알킬화제, 아자티오퓨린(azathiopurine), 메토트렉사이트(methotrexate) 및 미조리바인(mizoribine)과 같은 항대사제; 시클로스포린(cyclosporin)과 타크롤리무스(tacrolimus)와 같은 T-세포 활성 억제제; 프레드니솔론(prednisolone), 메틸프레드니솔론, 미코페놀레이트 모페틸(mycophenolate mofetil) 및 아자티오퓨린(azathiopurine) 등의 스테로이드제, 바시릭시마브(basiliximab), 무로모나브(muromonab) 등의 임파구 표면기능 저해제 또는 그들의 조합 등을 들 수 있다.
상기 포유동물 및 이식장기의 도너로는, 인간, 돼지, 비비원숭이(baboons) 등을 들 수 있으나, 바람직하기는 인간이다. 이식되는 장기로는, 예컨대 간장, 심 장, 신장, 피부 등을 들 수 있다.
상기 면역반응성 수준을 측정하는 방법의 구체적인 예로는, 항원 항체반응을 이용하는 방법이면 특히 한정되지 않는바, 예컨대 형광 항체법, 화학 염색법, 효소 항체법, ELSA 법, 방사선면역측정법(radiommunoassay), 면역침강법, 웨스턴 블롯법(Western blot method), 또는 변형 웨스턴 블롯법(웨스턴법, 사우스웨스턴법, 노스웨스턴법, 또는 웨스트-웨스턴법 등) 또는 프로틴 칩 법(protein chip method) 등을 들 수 있다. 따라서, 본 발명의 별개의 바람직한 태양에 의하면, 상기 면역반응성 수준은, 형광 항체법, 화학 염색법, 효소 항체법, ELISA, 방사선면역측정법, 면역 침강법, 웨스턴 브롯법, 웨스턴 블롯 변법 또는 프로틴 칩 법으로 측정하는 것이다.
또, 본 발명의 별개의 태양에 의하면, 포유동물에서의 이식거부를 예측 또는 진단하기 위한 키트(kit)로서, 적어도 항-히스톤 H1 모노크로날 항체를 포함해서 이루어진 키트가 제공된다. 여기서, 상기 이식거부는, 바람직하기는 장기이식 후에 생기는 것으로, 보다 바람직하기는 면역억제제의 투여를 중지한 후에 발생하는 것이다.
폴리펩티드
본 발명에 의한 폴리펩티드는, 앞에서 설명한 바와 같은 본 발명에 의한 항-히스톤 H1 모노크로날 항체의 인식하는 에피토프를 그 아미노산 서열 내에 포함한다. 그리고, 본 발명의 바람직한 태양에 의하면, 폴리펩티드는, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 또는 SEQ ID NO: 8로 나타내어지는 아미노 산 서열로 이루어진 것이다.
또, 본 발명의 별개의 바람직한 태양에 의하면, 폴리펩티드는, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 또는 SEQ ID NO: 8로 나타내어지는 아미노산 서열에서, 1개 또는 수개의 아미노산이 치환, 결실 또는 부가된 아미노산서열로 이루어진 것이다. 여기서, 「1 또는 수개」의 범위는, 바람직하기는 1 ~ 3개, 보다 바람직하기는 1 ~ 2개 정도를 의미한다.
또, 본 발명의 별개의 바람직한 태양에 의하면, 폴리펩티드는, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 또는 SEQ ID NO: 8로 나타내어지는 아미노산 서열의 부분 서열로 된 것이다. 그리고, 상기 부분 서열로는, 바람직하기는 SEQ ID NO: 4에서의 제6 ~ 9 번으로 나타내어지는 부분 서열, SEQ ID NO: 5에서의 제5 ~ 9 번으로 나타내어지는 부분 서열, SEQ ID NO: 6에서의 제2 ~ 5번으로 나타내어지는 부분 서열, SEQ ID NO: 7에서의 제2 ~ 5로 나타내어지는 부분 서열 및 SEQ ID NO: 8에서의 제7 ~ 9번 또는 제11 ~ 12번으로 나타내어지는 부분 서열을 들 수 있다.
또, 본 발명의 별개의 태양에 의하면, 폴리펩티드는, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 또는 SEQ ID NO: 8로 나타내어지는 아미노산 서열 또는 그 부분 서열을 포함해서 이루어진 것이다. 또, 이 폴리펩티드는, 바람직하기는 약 3 ~ 300개, 보다 바람직하기는 약 12 ~ 150개의 아미노산 잔기로 이루어진 것으로 된다.
본 발명에 의한 폴리펩티드는, 본 발명에 의한 모노크로날 항체를 이용한 파 아지 디스플레이 펩티드 라이브러리 키트(phage display peptide library kit)에 의한 해석에 기해 아미노산 서열이 결정된 것이다. 본 발명에 의한 폴리펩티드는, 그 아미노산 서열에 기해 공지의 펩티드 합성장치 등으로 합성할 수 있다.
또, 본 발명에 의한 폴리펩티드는, 그대로 또는 공지의 수법으로 유도체화해서, 생체에서 항-히스톤 H1 항체의 생성을 유도하기 위해 이용할 수 있다. 그리고, 히스톤 H1 또는 히스톤 H1-유사 항원도 또한, 감작항원으로 생체에 투여해서 항-히스톤 H1 항체를 생성시켜줌으로써 면역억제작용을 발휘시킬 수 있다. 따라서, 본 발명의 바람직한 태양에 의하면, 히스톤 H1, 히스톤 H1-유사 항원 또는 본 발명에 의한 폴리펩티드를 활성성분으로 하는 면역억제용 조성물이 제공된다. 또, 본 발명의 별개의 태양에 의하면, 면역억제용 조성물을 제조함에 있어, 히스톤 H1, 히스톤 H1-유사 항원 또는 본 발명에 의한 폴리펩티드의 사용이 제공된다.
상기 면역억제용 조성물은, 의약상 허용되는 담체와 함께 그 투여방법에 대응한 제형으로 제조할 수가 있는바, 예컨대 그 제형이 액제인 경우는, 적당한 용제, 용해보조제, 보존제, 안정제, 유화제, 현탁제, 무통화제, 등장화제 및, 완충제, 부형제, 증점제, 착색제, 공지의 캐리어(각종 리포솜, 폴리아미노산, 캐리어, 합성 고분자, 천연 고분자), 보조액 등을 적의 함유시킬 수 있다.
상기 면역억제용 조성물의 투여방법으로는, 당해 기술분야에서 사용할 수 있는 방법을 이용하면 되는바, 예컨대 동맥내 주사, 점적, 정맥내 주사, 근육내 주사, 피하주사, 피내주사, 경구투여, 경점막투여, 경피투여 등을 들 수 있다. 따라서, 본 발명의 별개의 태양에 의하면, 면역 억제를 필요로 하는 포유동물의 치료방 법으로서, 포유동물에 치료상 유효량의 히스톤 H1, 히스톤 H1-유사 항원 또는 본 발명에 의한 폴리펩티드를 투여하는 것을 포함해서 이루어진 방법이 제공된다. 또, 치료상 유효량은, 포유동물의 병태의 중증도, 성별, 연령, 체중, 습관 등에 따라 다른바, 예컨대 활성성분의 량으로서, 0.005㎍ ~ 2g/체중kg/일로 할 수 있다. 또, 그 투약계획은, 포유동물에서의 항체생성을 확인함으로써 당업자라면 적절히 작성할 수 있다.
또, 히스톤 H1, 히스톤 H1-유사 항원 또는 본 발명에 의한 폴리펩티드는, 포유동물에서 생성되는 항-히스톤 H1 항체와 특이적으로 반응하기 때문에, 포유동물에서의 항-히스톤 H1 항체량의 측정에 이용할 수 있다. 따라서, 본 발명의 별개의 태양에 의하면, 포유동물 유래의 생물학적 시료에서의 항-히스톤 H1 항체량을 측정하기 위한, 히스톤 H1, 히스톤 H1-유사 항원 또는 본 발명에 의한 폴리펩티드를 활성성분으로 하는 조성물이 제공된다. 그리고, 상기 항-히스톤 H1 항체는, 앞에서 설명한 데로 이식거부를 억제하는 기능을 갖기 때문에, 포유동물에서의 항-히스톤 H1 항체량는 이식거부의 예측 또는 진단의 지표로 된다. 따라서, 본 발명의 별개의 바람직한 태양에 의하면, 상기 조성물은, 포유동물에서의 이식거부의 예측 또는 진단에 사용할 수 있다. 또, 본 발명의 별개의 태양에 의하면, 포유동물에서의 이식거부의 예측 또는 진단약으로서의, 본 발명에 의한 히스톤 H1, 히스톤 H1-유사 항원 또는 본 발명에 의한 폴리펩티드의 사용이 제공된다. 상기 이식거부는 장기이식 후에 생기는 것으로, 보다 바람직하기는 면역억제제의 투여를 중지한 후에 발생하는 것이다. 또, 본 발명의 별개의 태양에 의하면, 포유동물에서의 이식거부를 예측 또는 진단하는 방법으로서, 포유동물에서의 생물학적 시료에서의 항-히스톤 H1 항체와, 히스톤 H1, 히스톤 H1-유사 항원 또는 본 발명에 의한 폴리펩티드과의 면역반응성 수준을 측정하는 것을 포함해서 이루어진 방법이 제공된다. 그리고, 상기 방법에서는, 측정된 면역반응성 수준이, 이식거부가 일어난 포유동물의 생물학적 시료 중의 항-히스톤 H1 항체와, 히스톤 H1, 히스톤 H1-유사 항원 또는 본 발명에 의한 폴리펩티드와의 면역반응성 수준을 참조해서 미리 설정된 역치보다도 높은 경우에 이식거부의 리스크가 낮다고 예측 또는 진단하게 된다. 이 역치는, 포유동물 및 도너의 종, 성별, 이식장기의 종류 및 측정방법 등에 대응해서 당업자에 의해 적의 결정된다. 본 발명에 의한 예측 또는 진단방법에 의하면, 불필요한 면역억제제의 투여를 회피함으로써, 환자의 신체적 및 경제적 부담을 경감할 수 있다.
상기 면역반응성 수준을 측정하는 방법의 구체적인 예로는, 항원 항체반응을 이용하는 방법이면 특히 한정되지 않는바, 예컨대 형광 항체법, 화학 염색법, 효소 항체법, ELSA법, 방사선 면역 측정법, 면역 침강법, 웨스턴 블롯법, 또는 웨스턴 블롯 변법(웨스턴법, 사우스 웨스턴법, 노스 웨스턴법, 또는 웨스트 웨스턴법 등), 프로틴 칩법 등을 들 수가 있고, 바람직하기는, 상기 면역반응성 수준은, 형광 항체법, 화학 염색법, 효소 항체법, ELISA, 방사선 면역 측정법, 면역 침강법, 웨스턴 블롯법, 웨스턴 블롯 변법 또는 프로틴 칩 법이고, 보다 바람직하기는 프로틴 칩 법이다. 프로틴 칩 법에서는, 본 발명에 의한 폴리펩티드를 프로틴 칩에 담지함으로써, 포유동물에서의 이식거부의 예측 또는 진단을 신속하고 정확하게 실행할 수 있다.
또, 본 발명의 별개의 태양에 의하면, 포유동물 유래의 생물학적 시료에서의 항-히스톤 H1 항체량을 측정하기 위한 키트로서, 히스톤 H1, 히스톤 H1-유사 항원 또는 본 발명에 의한 폴리펩티드를 적어도 포함해서 이루어진 키트가 제공된다. 또, 본 발명의 별개의 바람직한 태양에 의하면, 상기 키트는 포유동물에서의 이식거부를 예측 또는 진단하기 위한 것이다. 또 여기서, 상기 이식거부는, 바람직하기는 장기이식 후에 생기는 것으로, 보다 바람직하기는 면역억제제의 투여를 중지한 후에 발생하는 것이다.
앞에서 설명한 생물학적 시료, 면역억제제, 이식장기, 포유동물 및 이식되는 장기의 도너 등은, 앞에서 설명한 본 발명에 의한 모노크로날 항체를 이용한 치료방법 및 이식거부의 예측 또는 진단방법과 마찬가지이다.
실시예
이하, 실시예를 들어 본 발명을 구체적으로 설명하는바, 본 발명은 이들의 실시예에 한정되는 것은 아니다.
한편, 시약 및 항체는, 특기하지 않는 한 분석용인 것을 사용하였다. 또, DA 래트 및 PVG 래트(수컷, 7-8주령)은, 각각 Japan SLC사 또는 Seac Yoshitomi사로부터 구입하였다. 또, BALB/c 마우스(수컷, 5-6주령)는 일본 찰즈·리버 주식회사로부터 구입하였다.
참조예
1
혼합임파구
반응(
MLR
) :
래트
세포
무처리의 PVG 래트 유래의 비장 임파구(반응세포) 및 마이토마이신 C(일본국 쿄오와 발효공업 주식회사 제)처리를 실행한 DA 래트 유래의 비장 임파구(자극세포)를 이용하였다. 반응세포는 10% FCS-RPMI 배지에서 5 x 105 세포/mL로 조정하고, 자극세포는 10% FCS-RPMI 배지에서 8 x 106 세포/mL로 조정하였다. 이 반응세포 현탁액 및 자극세포 현탁액을 각각 100μL를 96-웰 둥근바닥 플레이트(Nunc Brand Products사 제)에 파종한 후, 혼합배양 개시시에 항-히스톤 H1 폴리크로날 IgG(Sa nta Cruz Biotechonology사 제 : 0.1, 0.2, 0.4, 0.8, 또는 1.6㎍/웰) 또는 토끼 IgG(normal rabbit IgG: Santa Cruz Biotechonology사 제 : 0.1, 0.2, 0.4, 0.8, 또는 1.6㎍/웰)을 첨가하고, 37℃, 5%CO2/95% air의 조건하에서 3.5일 이상 배양하였다. 이때, 양성대조로서, 타크롤리무스(FK506 : 후지사와 약품사 제)를 첨가하였다. 그리고, 배양 종료 15시간 전에 브로모데옥시유리딘(BrdU) 10μL를 첨가하였다. 그리고, BrdU 라벨링 & 검출 키트 III(로슈 다이아그노스틱제)을 이용해서, 세포내 DNA에 병합된 BrdU 량을 지표로 해서 세포증식도를 측정하였다. 여기서, 세포증식능이 높을수록 BrdU 병합량도 많아진다.
이 결과, 항-히스톤 H1 폴리크로날 IgG를 첨가한 경우, MLR은 의미 있게 저해되어, 타크로로리무스를 첨가한 경우와 같았다.
참조예 2
혼합임파구반응
(
MLR
) : 인간세포
임파구의
조제
인간 2명(A 및 B)으로부터 말초 혈액 10mL를 채취하여, 그 혈액을 원심분 리(1500rpm, 30분) 처리한 후 혈장을 제거하였다. 그리고, 그 잔류물에, 제거한 혈장과 같은 양(3mL)의 PBS를 가해 교반하였다. 이 혼합액에 피콜팩 용액(Ficoll-paque액, Amersham Biosciences사 제) 3mL를 가해 밀도 구배 원심분리기(1500rpm, 30분)로 처리하여, 임파구를 포함한 중간의 백색층을 얻었다. 이 백색층에 멸균한 PBS를 가해 총량 12mL의 세포현탁액으로 하고, 원심분리(1500 rpm, 5분)로 처리하였다. 이 조작을 2회 실행한 후, 얻어진 임파구를 10% FCS-AIM-V 배지(GISCO) 1mL에 현탁하였다.
MLR
B 유래의 임파구(반응세포) 및 마이토마이신 C(Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd,제) 처리를 실행한 A 유래의 임파구(자극세포)를 이용해서 이하의 시험을 실행하였다. 반응세포는 10% FCS-AIM-V 배지에서 5 x 105 세포/mL로 조정하고, 자극세포는 10% FCS-RPMI 배지에서 8 x 106 세포/mL로 조정하였다. 이 반응세포 현탁액 및 자극 세포 현탁액을 각각 100μL를 96-웰 원형바닥 플레이트(Nunc Brand Prodicts 제)에 파종하고, 혼합배양 개시시에 항-히스톤 H1 폴리클로널 IgG(Santa Cruz Biotechonology사 제 : 0.1, 0.2, 0.4, 0.8, 또는 1.6㎍/웰) 또는 토끼 IgG(normal rabbit IgG: Santa Cruz Biotechonology사 제 : 0.1, 0.2, 0.4, 0.8, 또는 1.6μG/웰)를 첨가하고, 37℃, 5% CO2/95% 대기의 조건하에서 2.5일 배양하였다. 이때, 양성대조로 타크롤리무스를 첨가하였다. 한편, 배양 중 각 웰에 최종 농도 10㎕/mL로 되도록 ConA를 첨가하여 자극세포가 증식능을 정지해 있는 것 및, 반응세포가 항원 자극에 의해 세포증식을 일으키는 것을 확인하였다. 그리고, 각 웰을 참조예 1과 마찬가지로 처리하고, BrdU 라벨링 & 검출 키트 III(로슈·다이아그노스틱스사 제)을 이용해서, 세포내 DNA에 병합된 브로모데옥시유리딘(BrdU) 량을 지표로 해서 세포증식도를 측정하였다.
B 유래의 반응세포 및 마이토마이신 C 처리를 실행한 A 유래의 자극세포의 조합에서는 MLR에 의한 세포증식이 확인되었다. 그리고, MLR은 항-히스톤 폴리클로널 항체에 의해 농도의존적으로 억제되었다. 한편, 토끼 IgG(normal rabbit IgG)에서는 MLR은 억제되지 않았다.
실시예 1
하이브리도마의
제조
면역
PBS 중에 항원(Histone H1 Histone F1 Histone KAP, Roche사 제)을 용해시킨 용액 0.8mL(항원농도 : 0.5mg/mL)와 프로인트 완전 보조액(Wako Pure Chemical Industries) 0.8mL를 혼합하여 현탁액(항원농도 : 0.25mg/mL)을 얻었다. 다음, 이 현탁액 0.2mL를 BALB/c 마우스에 복강 내 투여하였다. 그리고, 이 현탁액을 2주간 마다 동량으로 마우스에 투여하였다. 그리고, 투여 개시로부터 16주일 후, PBS 중 항원을 용해시킨 용액 0.2mL(항원 농도 : 600 ~ 1000mg/mL)를 마우스 복강 내에 최종 투여하였다. 한편, 투여할 때는, 안저정맥으로부터 채혈을 실시해서 ELISA에 의해 항체값을 측정하였다. 최종 투여의 4일 후, 전채혈을 실행하고, 얻어진 혈액을 원심분리(2000 rpm, 20분)하여 항혈청을 얻어 이하의 실험의 대조 항혈청으로서 이 용하였다. 또, 전채혈 후 래트로부터 비장을 적출하여, 얻어진 비장세포를 이하의 세포융합에 이용하였다.
세포융합
상기의 비장세포 및 미에로머 세포(P3X63-Ag.8.653)를 비장세포 : 미에로머 세포 = 10:1 ~ 10으로 혼합해서 원심분리(1500rpm, 5분)하였다. 원심분리를 한 후, 아스피레이터를 이용해서 상청을 제거하고, 얻어진 세포 펠렛에 37℃의 폴리에틸렌 글리콜 4000(50% PBS용액) lmL를 1분간에 걸쳐 첨가해서 혼합액으로 하였다. 이 혼합액을 37℃에서 1분간 정치한 후, 37℃의 IMDM 배지(합계 9mL)를 30초마다 1mL씩 가한 후 원심분리기(1500 rpm, 5분)를 하였다. 원심분리 후, 상청을 흡인으로 제거하고, 37℃의 15% FCS(JRH BIOSCIENCES 제) 함유 IMDM(GIBCO 제) 배지를 적당량 첨가하였다. 얻어진 현탁액을 96-웰 배양 플레이트에 100mL씩 분주를 실행하고, 37℃/5% CO2 인큐베이터에서 1일 배양하였다. 그리고 HAT 배지(HAT 분말(HAT MEDIA SUPPLEMENT(×50, Sigma 제)를 무혈청 IMDM 배지 10mL에 녹여, 10% FCS 함유 IMDM 배지에서 50배 희석한 것)을 100mL 첨가하여, 37℃/5% CO2 인큐베이터에서 배양하였다. HAT 배지의 교환은 2 ~3일마다 실행하고, 10일 후에는 HT 배지(HT 분말(HT MEDIA SUPPLEMENT, Sigma 제)를 무혈청 IMDM 배지 10mL에 녹여, 10% FCS 함유 IMDM 배지에서 50배 희석한 것)으로 전환하고서, 3일간 37℃/5% CO2 인큐베이터에서 배양을 실행하였다. 이후 2 ~ 3일마다 배지(HT 배지)의 교환을 실행하였다. 세포 증식을 현미경으로 확인한 후, 배양상청(약 100mL)을 회수하였다. 이 배양상청을 이용 해서, 이하 도시되는 히스톤 H1에 대한 항체값 측정에 의한 하이브리도마의 스크리닝을 실행하였다.
하이브리도마
세포의 스크리닝
항체값
측정
히스톤 H1(5mg, calf thymus histone H1, 로슈 다이아그노스틱스사 제)를 함유한 완충액(Bicarbonate buffer : 100 mM NaHCO3-NaOH, pH9.2 ~ 9.5, 히스톤 H1 농도 : 1mg/mL)를 1웰당 50㎕씩 96-웰 평저(平底) 플레이트에 첨가하고, 실온에서 2시간 정치해서 코팅하였다. 플레이트를 세정 버퍼(PBST)에서 3회 세정하고, 브로킹 버퍼(3% 스킴밀크 1% BSA, PBS)를 200 ~ 250㎕/웰로 가하고, 4℃로 밤새도록 반응시킨 후 3회 세정하였다. 그리고, 하이브리도마의 배양상청을 100㎕/웰로 가하고, 37℃에서 4시간 또는 4℃로 밤새도록 반응시켰다. 플레이트를 3회 세정한 후, 희석 버퍼(10 mM Tris-HCl(pH 8.0), 0.9%(W/V) NaCl, 0.05 %(W/V) Tween20)에서 10000배 희석한 비오틴표지 항마우스 IgG(Biotion-labeled anti-mouse IgG, SIGMA)를 50㎕/웰로 가해, 실온에서 2시간 반응시켰다. 그 후 6회 세정한 후, 희석 버퍼에서 1000배 희석한 알칼리 포스파타제-표지 스트렙타리딘(streptavidin)을 50㎕/웰로 가해, 실온에서 1 ~ 2 시간 반응시켰다. 그 후 6회 세정을 실행하고, 형광기질 버퍼(Attophos substrate buffer, 로슈다이아그노스틱스사 제)를 50㎕/웰로 가해 플레이트를 차광하고 발색시켰다. 형광 강도는 CytoFluorII(PerSeptive 제)로 측정하였다.
하이브리도마의
선별
상기 항체값 측정에서 양성의 결과를 나타낸 웰(1×105 세포/mL)에 15% FCS 10% HCF(hybridoma cloning factor, Origen) 함유 IMDM 배지를 가해, 약 200 세포/웰로 되도록 96-웰 배양플레이트에 분주하여 37℃ 5% CO2 인큐베이터에서 배양을 실행하였다. 그리고, 상기와 마찬가지로 항체값 측정을 실행하여, 항체생성량의 많은 하이브리도마를 선택하였다.
그리고 한계 희석을 실행하여, 선택된 하이브리도마가 0.5 ~ 1 세포/웰이 되도록 15% FCS 10% HCF 함유 IMDM 배지에서 희석하고, 37℃/5% CO2 인큐베이터에서 약 3 ~ 4일간 배양한 후, 상기와 마찬가지로 항체값 측정을 실행하여, 항체생성량이 많은 하이브리도마를 선택하였다. 그리고, 한계 희석을 반복하여, 38개의 항 H1 모노크로날 항체를 생성하는 하이브리도마를 얻었다. 이 중, 대조 항혈청보다 항체값이 높은 10개의 하이브리도마를 선택해서 1F5, 3F2, 15 A11, 15F11, 16D1, 16G9, 17C2, 17E2, 21E3, 및 22A12로 명명하였다.
시험예
1 : 항-
히스톤
H1
모노크로날
항체 함유
배양상청에
의한
MLR
억제활성평가시험
항-히스톤 H1 모노크로날 항체 함유 배양상청의 조제
각 하이브리도마는, 15% FCS I0% HSF 함유 IMDM 배지를 이용해서 배양하였다(1×106 세포/mL). 이 배양상청 15mL를 CENTRIPREP YM-I0(MILLIPORE)을 이용해서 원심분리(2000G, 2.5시간)하여, 항-히스톤 H1 모노크로날 항체를 함유하는 배양상청의 농축액을 얻었다.
MLR
얻어진 배양상청의 농축액(1000배 희석액)을 이용해서, 참조예 1과 마찬가지 방법에 따라 MLR 억제활성 평가시험을 실행하였다. 대조로서, 면역 전 래트 혈청(1000배 희석액), 토끼 IgG(Normal rabbit IgG 1.6mg, Santa Cruz Biotechonology 제) 1.6㎍/웰, 항-히스톤 H1 폴리크로날 항체(anti-histone H1 polyclonal IgG 200㎍, Santa Cruz Biotechonology 제) 1.6㎍/웰, 타크롤리무스 1.6㎍/웰을 이용하였다. 한편, 희석액으로는 IMDM 배지를 이용하였다.
결과는 도 1에 나타낸 것과 같았다. 1F5, 3F2, 15A11, 15F11, 16D1, 16G9, 17C2, 및 17E2의 8개의 하이브리도마의 배양상청은, 항-히스톤 H1 폴리크로날 항체 및 타크롤리무스와 동등한 MLR 억제활성을 나타내었다. 한편, 도 1에서, PVG/PVG는 마이토마이신 C 자극에 의해 증식능을 소실한 PYG 임파구와 반응세포인 PYG 임파구과의 혼합배양을 나타내고, DA/PVG는 마찬가지로 해서 증식능을 잃은 DA 임파구와 반응세포 인 PVG 임파구의 혼합배양을 나타낸다.
시험예 2 : 항-히스톤 H1 모노크로날 항체의 인식부위의 특정 1
측정용 샘플의 조제
PVG 래트로부터 비장세포를 적출하여 와이즈만의 방법(Weissman et al., Science, 239, 1018-1021, 1988)으로 세포파쇄를 실행하였다. 비장세포에 PBS 1mL를 가해 원심분리(1,500rpm, 5분)한 후 비장세포를 회수하였다. 이 세포를 실린 지(sylinge)를 이용해서 현탁하고, 동량의 150 mM NaCl를 가하였다. 얻어진 세포현탁액을 원심분리(300×g, 10분)하여 침전물 및 상청을 얻었다. 이 침전물을 불용성 분획(핵 분획 함유)으로 하고, 상청을 세포막 함유 가용성 분획(fraction)으로 하였다. 불용성 분획에는 5-배량(v/v)의 전기영동용 샘플 버퍼(0.25M Tris-HCl(pH 6.8) 25mL, SDS 2.0g, 초순수 9mL, 글리세롤 10mL, BPB 5mg)를 가해 5분간 끓인 후, 원심분리를 실행하고, 얻어진 상청을 측정용 샘플로 하였다. 또, 세포막 함유 가용성 분획에는 EDTA를 최종농도 5mM으로 되도록 첨가하였다. 이 세포막 함유 가용성 분획 중 100 ~200μL를 회수하였다. 나머지 세포막 함유 가용성 분획을 초원심(4℃, 200000×g, 45분)으로 처리하였다. 그리고, 얻어진 침전물을 세포막 분획으로 하고, 얻어진 상청을 세포막 제거 가용성 분획으로 하였다. 세포막 분획에 대해서는, 5-배량(v/v)의 전기영동용 샘플 버퍼를 가해 5분간 끓인 후, 원심분리를 실행하였다. 그리고, 얻어진 상청을 측정용 샘플로 하였다.
또, 시험예 1에서 얻어진 항-히스톤 H1 모노크로날 항체 함유 배양상청 10mL를 바인딩 버퍼(20mM 인산 버퍼, pH 7.0)로 희석하여, 50mL의 용액을 얻었다. 이 용액을, HiTrap 단백질 G 칼럼(HiTrap Protein G HP, Amersham Biosciences 제) 중에 0.2 ~ 1mL/min의 흐름속도로 장전하고, 4℃로 밤새도록 순환시켰다. 그 후, 결합 완충액 5mL를 1~2mL/min의 흐름속도로 장전하여 칼럼을 세정하였다. 그리고, 칼럼 세정 후, 상기 세포막 함유 가용성 분획용액을 0.2 ~1 mL/min 흐름속도로 장전하고, 4℃로 밤새도록 순환시켰다. 다음, 바인딩 버퍼 2mL를 1 ~2mL/min 흐름속도로 장전하고, 흐름-통과한 분획(flow-through fraction)을 얻었다. 이 흐름-통과한 분획을 측정용 샘플로 하였다.
항-
히스톤
H1
모노크로날
항체의 정제
HiTrap NHS 칼럼(HiTrap NHS-activated HP, Amersham Biosciences AB 제)에 1mM HCL 용액을 1 ~ 2mL/min의 흐름속도로 장전하고, 다음에 히스톤 H1 용액(히스톤 H1(로슈다이아그노스틱스사 제) 10.5mg, 커플링 버퍼(0.2 M NaHC03, 0.5M NaCl pH 8.3)) 1mL를 1mL/min의 흐름속도로 장전하고, 장전 후 즉시 칼럼을 밀폐해서 결합을 실행하였다(15~30분). 결합 후, 버퍼 A(0.5 M 모노에탄올아민, 0.5 M NaCl pH 8.3), 버퍼 B(0.1 M 아세트산 나트륨, 0.5 M NaCl pH 4.0) 및 중성 버퍼(1.0 M Tris-HCl, pH 9.0)에서 칼럼 내부를 세정하였다. 다음에 시험예 1에서 얻어진 항-히스톤 H1 모노크로날 항체 함유 배양 상청을 칼럼 내로 1mL/min의 흐름속도로 장전하여 순환시켰다(4℃, overnight). 다음에 인산 버퍼 5mL로 세정한 후, 용출 버퍼를 0.2~1 mL/min의 흐름속도로 5mL를 장전하여, 용출된 분획으로부터 정제 항-히스톤 H1 모노크로날 항체를 얻었다.
SDS-PAGE
Laemmli의 불연속 완충액계에서의 전기영동법(Nature, 227, 680-685, 1970)으로 각 측정용 샘플을 SDS-PAGE로 처리하였다. 대조로는, 히스톤 H1(5mg, 로슈다이아그노스틱스사 제)를 이용하였다. SDS-PAGE 후, 얻어진 겔을 이하의 쿠마씨 염색(Coomassi staining) 또는 웨스턴 브롯팅(Western blotting)에 이용하였다.
쿠마씨
염색
SDS-PAGE 후의 겔은, 염색액(0.25% Coomassie brilliant blue R/에탄올: 초산 : 증류수 = 9 : 2 : 9)에 담그어 약 1시간 진탕한 후, 탈색액(에탄올 : 아세트산 : 증류수 = 25 : 8 : 65)에 담그어 약 1시간 동안 탈색하였다. 그 후 보존액(메탄올 : 아세트산 : 증류수 = 10 : 15 : 175)에 담그어 백그라운드를 탈색하였다.
웨스턴 브롯팅
SDS-PAGE 후의 겔을 세미드라이식 전사장치(AE-6675, ATTO 제)로 이용해서 PVDF 막에 전사하였다. 다음에, 전사 후의 PVDF 막을 브로킹 용액(5% skim milk 1% BSA의 PBST 용액)에 담그어 진탕하였다(4℃로 24시간, 또는 실온에서 1시간). 다음에, PVDF 막에 대해, 일차 항체로서 정제 항-히스톤 H1 모노크로날 항체를 함유한 용액(브로킹 용액에서 500배로 희석한 것)을 가해 실온에서 1시간 진탕한 후, PBST에서 15분×1회, 5 분×3회 세정하였다. 세정 후, PVDF 막에 대해, 블로킹 용액으로 20000배 희석한 2차 항체(HRP-anti-mouse IgG, Sigma) 용액을 가해 실온에서 1시간 진탕하였다. 진탕 후, PBST에서 15분×l회, 5분×3회 세정하였다. 그리고, ECL 웨스턴 블롯팅 검출 시스템(ECL Plus Western blotting detection system, Amersham Biosciences AB)을 이용해서 특이항체의 결합을 검출하고, X선 필름 RX-U(FUJI PHOTO FILM, Tokyo, Japan)에서 노광 후 현상하였다.
웨스턴 브롯팅의 결과, 세포막 분획의 31kD의 위치에 특이적인 밴드가 검출되었다. 그리고, 이 밴드는 쿠마씨 염색에서 히스톤 H1과 같은 위치에 검출되었다.
시험예
3 : 항-
히스톤
H1
모노크로날
항체의 인식부위의 특정 2
PVG 래트의 비장세포를 4% 포르말린 함유 PBS 용액에 현탁해서, 실온에서 20 분간 고정화하였다. 그리고, 비장세포를 염색용 버퍼(1 %(v/v) FCS, 0.1%(w/v) 소듐 아지드 함유 PBS 용액, 4℃)에서 3회 세정한 후, 염색용 버퍼 100mL 중 세포수를 2×106개 포함한 혼합액을 조정하였다. 이 혼합액에 1차 항체(피오틴 표지된 항-히스톤 H1 모노크로날 항체 2mL 또는 피오틴 표지된 정상 마우스 IgG 5mL)를 가해 37℃에서 1시간 반응시켰다. 이 반응 후, 비장세포를 염색용 버퍼(4℃)에서 3회 세정하고, 그리고 비장세포에 염색용 버퍼 100mL를 가하고, FITC 표지 스트랩토 아비진(BD PharMingen 제) 1mL를 가해, 실온에서 30시간 반응시켰다. 반응 후, 비장세포를 염색용 버퍼(4℃)에서 3회 세정하고, 비장세포에 PBS 500mL 중을 가해 현탁액으로 하였다. 또, 이 현탁액에 프로피디움 이오디드(Propidum Iodide, Sigma)를 최종농도 5mg/mL으로 되도록 첨가해서 실온에서 20분 반응시켰다. 얻어진 세포를 50% 글리세린 함유 PBS 용액으로 봉입한 후, 형광현미경으로 관찰하였다.
그 결과, 비장세포의 주위(세포막) 부분만 특이적으로 형광염색이 되었다.
시험예
4: 항-
히스톤
H1
모노크로날
항체의 인식부위의 특정 3
파아지
디스플레이
하이브리도마 1F5, 3F2, 15F11, 17C2 또는 16G9로부터 생성되는 항-히스톤 H1 항체에 관해, Ph.D. -12 파아지 디스플레이(phage display) 펩티드 라이브러리 키트(New England BioLabs, Inc.로부터 구입)를 이용해서 패닝(panning) 실험을 실행하였다. 정제한 각 모노크로날 항체를 0.lM NaHCO3(pH 8.6)에 용해시켜, 직접 미세역가 플레이트(Nunc, Catalog #430341)에 코팅을 해서 4℃로 밤새도록 인큐베이 트하였다. 각 웰에 블로킹 버퍼(0.lM NaHCO3, 5mg/ml BSA, 0.02% NaN)를 가하고, 적어도 1시간 4℃로 인큐베이트 한 후, TBST(50mM Tris, 150mM NaCl, 0.1% Tween 20)에서 세정하였다. 첫 번째의 패닝에서 오리지날 라이브러리 중의 4 x 1010개의 파아지를 스크리닝에 이용하였다. 결합되지 않은 파아지를 TBTS에 의한 세정을 반복함으로써 제거하였다. 결합된 파아지를 0.2m Glycine-HCI(pH 2.2), 1mg/ml BSA에 의해 용출시켰다. 용출된 파아지를 20mL E. coli ER2738 배지에 의해 증식시켰다. 얻어진 파아지를, 폴리에틸렌 글리콜을 이용해서 침전시켜, 2 번째 패닝에 이용하였다. 그리고, 마찬가지 조작 순서에 따라 3번째의 패닝을 실행하였다. 3번째 패닝에서 얻어진 플라그를 100배 희석하고, ER2738 배지를 이용해서 증식시켰다. 이들을 내용물로 하는 튜브를 4.5 ~ 5시간 진탕하면서 37℃에서 인큐베이트 하였다. 단일-가닥 파아지 DNA를 요오드 버퍼(Iodide buffer: 10mM Tris-HCI, 1mM EDTA, 4M NaI)와 에탄올로 침전시키고 정제하였다. DNA 서열 분석을 위해 파아지 DNA를 20μL TE 버퍼(10mM Tris-HCI pH 8.0, 1mM EDTA)에 용해시켰다.
DNA 서열분석
얻어진 정제된 파아지 DNA에 대해, 상기 Ph.D.-12 파아지 디스플레이 펩티드 라이브러리 키트에 첨부된 프라이머 DNA 및 DYEnamicTM ET Terminator Cycle Sequencing Premix Kit(Amersham Biosciences사 제)을 이용해서, 시퀀싱 PCR 반응을 실행하고(PCR 반응 조건 : 95℃에서 30초, 50℃에서 15초, 60℃에서 1분으로 이 루어진 30사이클) PCR 산물을 AutoSeqTM G-50(Amersham Biosciences)을 이용해서 정제하였다. 그리고, ABl PRISMTM 310 Genetic Analyzer(PE Biosystems)을 이용해서 파아지 펩티드의 DNA 서열을 결정하였다. 결정된 DNA 서열을 기준으로 하는 아미노산 서열을 다음에 나타내었다:
하이브리도마
균주
아미노산 서열
1F5 : NYQTYTPRPPHS(SEQ ID NO: 4)
3F2 : VTNNQTSPRWEI(SEQ ID NO: 5)
15F11 : WKPVSLTLHTHP(SEQ ID NO: 6)
17C2 : HATGTHGLSLSH(SEQ ID NO: 7)
16G9 : SSVLYGGPPSAA(SEQ ID NO: 8)
경합 ELISA(Competition ELISA)
상기 파아지 DNA로부터 결정된 아미노산 서열을 가진 각 펩티드를 통상적인 방법으로 합성하였다. 얻어진 펩티드, 정제한 각 모노크로날 항체 및 히스톤 H1 항원(Roche, Catalog # 1004875)을 이용하여, 경합 ELISA를 실행하였다. 이 때, 히스톤 H1 항원의 비오티닐화(biotinylation))에는 EZ-Link Sulfo-NHS-Biotinylation kit(Pierce 제)를 이용하고, 발색시약으로서 ABTS 용액(Sigma, A3219)을 이용하였다. 발색은 ELISA 측정기(Thermo Labsystem, Multiskan Ascent)를 이용해서 405nm로 검출하였다. 측정치는 3회 측정한 흡수치의 평균으로 하였다.
그 결과, 합성한 상기 펩티드가, 정제한 각 모노크로날 항체와 히스톤 H1 항 원과의 결합을 저해하는 것이 확인되었다.
SEQUENCE LISTING
<110> AmaterasPharma Inc.
<120> Histone H1 monoclonal antibody and the hybridoma for production thereof
<130> 156278
<160> 8
<170> PatentIn version 3.1
<210> 1
<211> 50
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Histone H1 partial sequence
<400> 1
Ser Glu Thr Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Glu Lys
1 5 10 15
Thr Pro Val Lys Lys Lys Ala Arg Lys Ser Ala Gly Ala Ala Lys Arg
20 25 30
Lys Ala Ser Gly Pro Pro Val Ser Glu Leu Ile Thr Lys Ala Val Ala
35 40 45
Ala Ser
50
<210> 2
<211> 105
<212> PRT
<213> Bos taurus
<220>
<223> Histone H1 partial sequence
<400> 2
Ser Glu Thr Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Ala Pro Pro Ala Glu Lys
1 5 10 15
Thr Pro Val Lys Lys Lys Ala Ala Lys Lys Pro Ala Gly Ala Arg Arg
20 25 30
Lys Ala Ser Gly Pro Pro Val Ser Glu Leu Ile Thr Lys Ala Val Ala
35 40 45
Ala Ser Lys Glu Arg Ser Gly Val Ser Leu Ala Ala Leu Lys Lys Ala
50 55 60
Leu Ala Ala Ala Gly Tyr Asp Val Glu Lys Asn Asn Ser Arg Ile Lys
65 70 75 80
Leu Gly Leu Lys Ser Leu Val Ser Lys Gly Thr Leu Val Gln Thr Lys
85 90 95
Gly Thr Gly Ala Ser Gly Ser Phe Lys
100 105
<210> 3
<211> 221
<212> PRT
<213> Mus musculus
<220>
<223> Histone H1 partial sequence
<400> 3
Met Ser Glu Thr Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Val Glu
1 5 10 15
Lys Thr Pro Val Lys Lys Lys Ala Lys Lys Thr Gly Ala Ala Ala Gly
20 25 30
Lys Arg Lys Ala Ser Gly Pro Pro Val Ser Glu Leu Ile Thr Lys Ala
35 40 45
Val Ala Ala Ser Lys Glu Arg Ser Gly Val Ser Leu Ala Ala Leu Lys
50 55 60
Lys Ala Leu Ala Ala Ala Gly Tyr Asp Val Glu Lys Asn Asn Ser Arg
65 70 75 80
Ile Lys Leu Gly Leu Lys Ser Leu Val Ser Lys Gly Thr Leu Val Gln
85 90 95
Thr Lys Gly Thr Gly Ala Ser Gly Ser Phe Lys Leu Asn Lys Lys Ala
100 105 110
Ala Ser Gly Glu Ala Lys Pro Lys Ala Lys Lys Ala Gly Ala Ala Lys
115 120 125
Ala Lys Lys Pro Ala Gly Ala Ala Lys Lys Pro Lys Lys Ala Thr Gly
130 135 140
Ala Ala Thr Pro Lys Lys Thr Ala Lys Lys Thr Pro Lys Lys Ala Lys
145 150 155 160
Lys Pro Ala Ala Ala Ala Gly Ala Lys Lys Val Ser Lys Ser Pro Lys
165 170 175
Lys Val Lys Ala Ala Lys Pro Lys Lys Ala Ala Lys Ser Pro Ala Lys
180 185 190
Ala Lys Ala Pro Lys Ala Lys Ala Ser Lys Pro Lys Ala Ser Lys Pro
195 200 205
Lys Ala Thr Lys Ala Lys Lys Ala Ala Pro Arg Lys Lys
210 215 220
<210> 4
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Epitope of Histon H1
<400> 4
Asn Tyr Gln Thr Tyr Thr Pro Arg Pro Pro His Ser
1 5 10
<210> 5
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Epitope of Histon H1
<400> 5
Val Thr Asn Asn Gln Thr Ser Pro Arg Trp Glu Ile
1 5 10
<210> 6
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Epitope of Histon H1
<400> 6
Trp Lys Pro Val Ser Leu Thr Leu His Thr His Pro
1 5 10
<210> 7
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Epitope of Histon H1
<400> 7
His Ala Thr Gly Thr His Gly Leu Ser Leu Ser His
1 5 10
<210> 8
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Epitope of Histon H1
<400> 8
Ser Ser Val Leu Tyr Gly Gly Pro Pro Ser Ala Ala
1 5 10
Claims (32)
- 히스톤 H1 또는 비장세포의 세포막에 존재하는 히스톤 H1-유사 항원을 인식하는 모노크로날 항체.
- 제1항에 있어서, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 또는 SEQ ID NO: 8로 나타내어지는 아미노산 서열 내에 위치하는 에피토프를 인식하는 모노크로날 항체.
- 하이브리도마 1F5, 하이브리도마 3F2, 하이브리도마 15F11, 하이브리도마 17C2 및 하이브리도마 16G9로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 하이브리도마에 의해 생성되는 모노크로날 항체.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 모노크로날 항체를 활성성분으로 포함하는 면역억제용 조성물.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 모노크로날 항체를 활성성분으로 포함하는 포유동물에서의 이식거부의 예측 또는 진단용 조성물.
- 제5항에 있어서, 상기 이식거부가 면역억제제의 투여를 중지한 후에 발생하 는 것인 조성물.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 모노크로날 항체를 포함하는, 포유동물에서의 이식거부의 예측 또는 진단용 키트.
- 제7항에 있어서, 상기 이식거부가 면역억제제의 투여를 중지한 후에 발생하는 것인 키트.
- 히스톤 H1 또는 비장세포의 세포막에 존재하는 히스톤 H1-유사 항원을 인식하는 모노크로날 항체를 생성하는 하이브리도마.
- 제9항에 있어서, 상기 모노크로날 항체는 SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 또는 SEQ ID NO: 8로 나타내어지는 아미노산 서열 내에 위치하는 에피토프를 인식하는 것인 하이브리도마.
- 하이브리도마 1F5, 하이브리도마 3F2, 하이브리도마 15F11, 하이브리도마 17C2 또는 하이브리도마 16G9.
- SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 또는 SEQ ID NO: 8로 나타내어지는 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드.
- SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 또는 SEQ ID NO: 8로 나타내어지는 아미노산 서열에서, 1개 또는 수개의 아미노산의 치환, 결실 또는 부가를 포함하는 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드.
- SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 또는 SEQ ID NO: 8로 나타내어지는 아미노산 서열의 부분 서열로 이루어진 폴리펩티드.
- SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 또는 SEQ ID NO: 8로 나타내어지는 아미노산 서열 또는 그 부분 서열을 포함하는 폴리펩티드.
- 히스톤 H1, 히스톤 H1-유사 항원 또는 제12항 내지 제15항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드를 활성성분으로 포함하는 면역억제용 조성물.
- 포유동물 유래의 생물학적 시료에서의 항-히스톤 H1 항체량을 측정하기 위한, 히스톤 H1, 히스톤 H1-유사 항원 또는 제12항 내지 제15항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드를 활성성분으로 포함하는 조성물.
- 제17항에 있어서, 상기 포유동물에서의 이식거부의 예측 또는 진단을 위한 것인 조성물.
- 제18항에 있어서, 상기 이식거부는 면역억제제의 투여를 중지한 후에 발생하는 것인 조성물.
- 포유동물 유래의 생물학적 시료에서의 항-히스톤 H1 항체량을 측정하기 위한 키트로서, 최소한 히스톤 H1, 히스톤 H1-유사 항원 또는 제12항 내지 제15항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드를 포함하는 키트.
- 제20항에 있어서, 상기 포유동물에서의 이식거부를 예측 또는 진단하기 위한 키트.
- 제21항에 있어서, 상기 이식거부는 면역억제제의 투여를 중지한 후에 발생하는 것인 키트.
- 면역억제를 필요로 하는 포유동물의 치료방법으로, 상기 포유동물에 치료상 유효량의 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 모노크로날 항체를 투여하는 것을 포함하는 치료방법.
- 포유동물에서의 이식거부를 예측 또는 진단하는 방법으로, 상기 포유동물 유래의 생물학적 시료와, 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 모노크로날 항체와 의 면역반응성 수준을 측정하는 것을 포함하는 방법.
- 제24항에 있어서, 상기 이식거부는 면역억제제의 투여를 중지한 후에 발생하는 것인 이식거부를 예측 또는 진단하는 방법.
- 면역억제를 필요로 하는 포유동물의 치료방법으로서, 상기 포유동물에 치료상 유효량의 히스톤 H1, 히스톤 H1-유사 항원 또는 제12항 내지 제15항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드를 투여하는 것을 포함하는 치료방법.
- 포유동물에서의 이식거부를 예측 또는 진단하는 방법으로서, 상기 포유동물 유래의 생물학적 시료에서의 항-히스톤 H1 항체와, 히스톤 H1, 히스톤 H1-유사 항원 또는 제12항 내지 제15항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드와의 면역반응성 수준을 측정하는 것을 포함하는 방법.
- 제27항에 있어서, 상기 이식거부는 면역억제제의 투여를 중지한 후에 발생하는 것인 이식거부를 예측 또는 진단하는 방법.
- 면역억제용 조성물을 제조하기 위한, 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 모노크로날 항체의 용도.
- 포유동물에서의 이식거부의 예측 또는 진단약으로서, 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 모노크로날 항체의 용도.
- 면역억제용 조성물의 제조를 위한, 히스톤 H1, 히스톤 H1-유사 항원 또는 제12항 내지 제15항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드의 용도.
- 포유동물에서의 이식거부의 예측 또는 진단을 위한 약제로서, 히스톤 H1, 히스톤 H1-유사 항원 또는 제12항 내지 제15항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드의 용도.
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