JPS63106543A - 化学ルミネッセンス分析でのオキシダ−ゼ酵素系の使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔発明の背景〕 本発明は、イムノアッセイ及びＤＮＡプローブ分析を含
む、化学ルミネッセンス分析法におけるキサンチンオキ
シダーゼ（ＸＯ）酵素反応の利用に関するものである。

イムノアッセイに於ては生物ルミネッセンス又は化学ル
ミネッセンスが様々の物質の検出について利用されてい
る（ＫＩｎｇｌｃｒ、Ｗ、、Ｓｔｒａｓｂｕｒｇｅｒ　
Ｃ。

Ｊ　、　、　ａｎｄソｏｏｄ　Ｗ、Ｇ、、　Ｔｒｅｎｄ
ｓ　ｉｎ　Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ　Ｃｈｃｍ−ｉｓｔｒ
ｙ　２：１３２−１３８．．１９８３．Ｋｒ１ｃｂａ　
Ｌ、Ｊ、、及びＴｈｏｒｐｃＧ、Ｈ，Ｇ、、　　Ａｎａ
ｌｙｓｔ　　１０８：１２７４−１２９８．１９８３）
　　。

化学ルミネッセンス分析は、概して二つのカテゴリーに
分類される。

ａ）定量化の可能な現象が、反応溶液中に反応開始試薬
添加後前られる数秒程度の非常に短時間の発色乃至信号
（ｓｉｇｎａｌ）からなるものであるもの。これには、
トレーサーとしてルミノールのカップリング誘導体（Ｓ
ｃｈｒｏｅｄｅｒ　Ｈ，Ｒ，、ｅＬ　ａｌ：Ｍｅｔｈｏ
ｄｓ　Ｅｎｚ−ｙｉｏｌｏｇｙ　５７：４２７−４４５
．１９７８）を用いる反応や、アクリジニウムエステル
のカップリング誘導体（Ｗｅｅ−ｋｓ　１．ａｎｄ　Ｗ
ｏｏｄｂｅａｄ　Ｊ、Ｓ、１ｎＡｎａｌｙｔｉｃａｌ　
　Ａｐｐｌｉｃａ−Ｌｉｏｎｓ　　ｏｆ’　　Ｂｉｏｌ
ｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅａｎｄ　Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎ
ｅｓｅｅ−ｎｃｅ、　ＡｃａｄｅＬＩｌｉｃ　Ｐｒｅｓ
ｓ、ｐｐ。

１８５−１８８．１９８４）を用いる反応がある。反応
における発色が短命であるという不便さはさておき、こ
の種の方法では測定至に試薬を注入する装置がＺ要であ
る。結果として、マイクロタイトレージョンプレートを
利用することが困難となり、さらに他の検出用容器も比
較的１Ｍ雑かつ高価なものが要求される。

ｂ）定量化の口Ｉ能な現象が、長時間にわたる発色から
なるものであって、測定時間が大幅に延長されかつ適切
な測定のくりかえし及び蛍光測定装置外でのサンプルの
調製ができるもの。このシステムでは注入装置が不要で
、これにより蛍光測定装置の設計の単純化を図ることが
でき、またマイクロタイトレージョン用プレートの使用
も可能となる。

現時点では、比較的安定かつ強い化学ルミネッセンスを
生じさせる方法がひとつだけ報告されている。この方法
は、サイクリック・ジアシルハイドラジドのペルオキシ
ダーゼ依存酸化反応の合成ルシフェリンのような物質に
よる増強効果を基本とするものである（Ｗｈｉｔｅｌｌ
ｅａｄ　Ｔ、Ｐ、、Ｔｈｏｒｐｅ　Ｇ、Ｈ。

Ｇ、、ＣａｒＬｅｒ　Ｔ、Ｊ、Ｎ、ｅＬ　ａｌ、、　Ｎ
ａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ）３０５：１５８−１５９，
１９８３；Ｔｈｏｒｐｅ　Ｃ，！１．Ｇ、、Ｋｒ１ｃｈ
ａ　Ｌ、Ｊ、ｅｔ　ａｌ、。

Ａ、ｎａｌ、　ＢｉｏｅｈｅＩｌｌ、１４５：９７−１
００，１９８５；Ｔｈｏｒｐｅ　Ｇ、Ｉｌ、Ｇ、。

Ｋｒ１ｅｈａ　Ｌ、Ｊ、ｅｔ　ａｌ、、ＣｌＩｎ、　Ｃ
ｈｅＩｌ１３１：１３３５−１３４１゜１９８５）。こ
の方法は現在、様々な物質の検出に利用されている。し
かし、その発色の時間及び安定性は比較的なものである
。／ｌｐＪ定はわずか３０〜４０分程度の間しか行なう
ことができないからである。

発色系に於るキサンチンオキシダーゼの利用はこれまで
に、例えばＢｏｚｕｓｐａｓｈｉ　（米国特許４．３６
３，７５９号）やＭｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｌｏｓｙｓｔ
ｃｍｓＩｎｃ、（ＷＯ−Ａ−８５０３３５６号）によっ
て検討されてきた。しかしながらこれらには、より長時
間の発色を生じさせたという証拠も明確な指標も記載さ
れていない。しかも、キサンチンオキシダーゼは、その
他の多くの全件として過酸化水素も超酸化物陰イオンラ
ジカルも生じさせないその他の多くの酵素システムと一
緒に論じられている。

〔発明の概要〕

ある種のオキシダーゼ酵素システム（例えば、キサンチ
ンオキシダーゼ、コリンオキシダーゼ、サルコシンオキ
シダーゼおよびフマレートオキシダーゼ）は、これらは
酸素含角°フリーラジカル（例えば、超酸化物陰イオン
Ｏ二、水酸基ラジカルＯＨ”）および過酸化物（Ｈ２９
２：過酸化水素）を発生させるものであるが、化学ルミ
ネッセンス試薬（例えばルミノールやその誘導体）を用
いた反応で長期間にわたる化学ルミネッセンス検出可能
産物を生じることが判明した。ここで発生したこれらの
化学ルミネッセンス産物は時間的に非常に安定で、数時
間にわたって、時には数日間にわたってｉＱ］定可定電
能色を生じる。この発色の安定性及び長寿命は、現在知
られ−Ｃいるいずれの方法によるものよりもきわめてす
ぐれている。

本発明のオキシダーゼ酵素システムは、イムノアッセイ
、イムノブロッティング又はヌクレオチドプローブ分析
に於て、被検物に化学ルミネ・ソセンス試薬によって認
識されうる長寿命の特性を付与するトレーサーとして特
に有用である。

一般的にいって、本発明の化学ルミネッセンスオキシダ
ーゼシステムは、適切なオキシダーゼ酵素に結合した被
検出物又はリガンドからなるトレーサーを提供するもの
である。このトレーサーは信号試薬の添加による化学ル
ミネッセンス反応によって検出される。信号試薬は、オ
キシダーゼの基質及び増感剤（例えば遷移金属錯体）及
び化学ルミネッセンス試薬を、強イオン濃度の有機塩基
ＡＨのアルカリ側望ましくはおよそｐＨ９，５から１０
．５の間で働く緩衝液（例えばバルビツール、ホウ酸又
は炭酸緩衝液）に溶解したものである。

オキシダーゼ酵素システムに用いる基質は、当該酵素に
特異的なものであればいずれでも可能である。例えば、
キサンチンオキシダーゼの場合、本発明の酵素システム
に於てキサンチンオキシダーゼと結合しうる基質にはヒ
ポキサンチン、キサンチン、アセトアルデヒド又はプリ
ンがある。ヒポキサンチンは基質としてもっともすぐれ
ている。

本発明では、化学ルミネッセンス試薬としてアクリジニ
ウムエステル、ルシジェニン又はその誘導体、ルミノー
ル又はその誘導体のいずれかが用いられる。ルミノール
およびその誘導体は、２゜３−ジヒドロ−１，４−フタ
ラジンジオン化合物であり、いくつかの先行特許（例え
ば、米国特許第４．５９８，０４４号、同第 ４．４７８，８１７号及び同第 ４．３６３，７５９号各明細書）に明示されている。ア
クリジニウムエステル、ルシジエニンとその誘導体は、
米国特許第４，４７８，８１７号明細書に明示されてい
る。

さらに、本発明は本発明の化学ルミネッセンスオキシダ
ーゼシステムを用いて従来の検出法とは異なることが特
徴である。

本発明の化学ルミネッセンスオキシダーゼシステムは、
特に免疫酵素分析、例えば免疫定量分析、拮抗結合分析
に有用である。こうした免疫定量技術は現在、よくしら
れた技術である。例えば、Ｄａｖｉｄらは米国特許第４
，４８６．５３０号明細書の“発明の背景“に於て免疫
分析に用いる酵素についての各種の手法を論じている。

本発明のオキシダーゼ酵素システムは、アビジン・ビオ
チンシステムを用いる免疫分析手法に於ても利用できる
（ＬａｂｏｒａＬｏｒｙ　Ｔｅｅｈｎｌｑｕｅ、Ｉｎ　
Ｂｉｏ−ｃｈｅｍｉｓＬｒｙ　　ａｎｄ　　Ｍｏ１ｅｃ
ｕｌｅｒ　　１３１ｏ１ｏｇｙ、Ｖｏｌ、１５．Ｒ，ｌ
Ｉ。

Ｂｕｒｄｏｎ他′ｇ［ＥＩｓｅｖｉｅｒ　Ｐｒｅｓｓｉ
照）。この場合には、酵素−ビオチン共役体は、安定な
ビオチン化酵素・アビジン複合体を作るためにアビジン
−ビオチン相互反応の強い親ｆ口性を利用することがで
きる。

この複合体は、両タイプの免疫分析反応、すなわち免疫
定量分析及び拮抗結合分析、に於て用いることができる
普遍的なトレーサーとなるものである。実際、最適化に
より遊離アビジン結合部位を提供することができ（アビ
ジン分子１個当り４ケのビオチン分子を結合させること
ができる）、その部位にさらに他のビオチン化分子を結
合させることができる。

さらに、本発明の化学ルミネッセンスオキシダーゼシス
テムは、ヌクレオチドプローブ分析における化学ルミネ
ッセンス検出システムとしても有用である。ヌクレオチ
ドブローブハイプリダイゼシーション法についての一般
的な記述はＰａ１ｋｏｖらの米国特許第４，３５８，５
３５号明細書に記載されている。

かくして、一般的にいえば、本発明の化学ルミネッセン
スオキシダーゼシステムは、酵素トレーサー又は基質ト
レーサーと特異的な結合対リガンドによって結合する物
質を検出するために設計された広範囲の分析法に応用す
ることができる。

当該技術分野に於て一般的にうけいれられている用語に
したがって、本発明の開示に於ては以下の用語は次のよ
うに定義される。

本発明でいう被検出物とは、特異的な結合可能物質であ
って、その存在または瓜を決定しようとしているものを
言う。被検出物の例を挙げれば、抗原、ハプテン、抗体
、糖蛋白、炭水化物およびオリゴヌクレオチドがある。

本発明でいうリガンドとは、被検出物の特異的な結合相
手であり、他の物質を排除して被検出物と特異的に結合
する親和性を有するものをいう。

リガンドの例を挙げれば、抗体、レクチンおよびヌクレ
オチドがある。

〔発明の詳細な説明〕

以下の記載は、この出願の時点に於て出願人の知る最も
好ましい実施例に関するものである。

化学ルミネッセンスキサンチンオキシダーゼ酵素システ
ム使用の設計法には、以下のもめ力５ある。

被検出物としてハプテン又は抗原を検出する場合には、
以下の操作手順からなる拮抗免疫分析法を用いることが
できる。

ａ）当該検出物に特異的な抗体又はレクチンのようなリ
ガンドを付加した試験管、マイクロタイター穴、ビーズ
のような固参口支持体を用意する。

ｂ）　ビオチン化酵素とビオチン化披検出物の間の直接
的共有結合又はアビジンブリッジによってキサンチンオ
キシダーゼを結合させた被検出物からなるトレーサーを
用意する。

Ｃ）操作手順ａ）で用意した固相支持体と手順ｂ）で用
意したトレーサーの存在下で被検出物、すなわち抗原又
はハプテン、を含むサンプルを反応（１ｎｃｕｂａｔ　
！ｏｎ）させる。

ｄ）当該支持体を洗浄する。

０）キサンチンオキシダーゼと結合した基質、鉄錯体増
感剤及び化学ルミネッセンス試薬を含む信号試薬を添加
する。

ｆ）当該化学ルミネッセンス試薬の化学ルミネッセンス
応答を測定し、得られた測定値から抗原又はハプテン濃
度を情理する。

この方法を実施するために必要な試薬キットは、これは
本発明の主題を構成するものでもあるが、以下のものを
含む。

ａ）被検出物である抗原又はハプテンに対して特異的な
抗体又はレクチンのようなリガンドで被覆した試験管、
マイクロクイタープレート、又はビーズのような固相支
持体。

ｂ）被検出物とキサンチンオキシダーゼとの結合産物。

Ｃ）キサンチンオキシダーゼと結合した基質。

ｄ）化学ルミネッセンス試薬。

Ｃ）鉄錯体増感剤。

ヌクレオチドプローブハイブリダイゼーション注につい
ては、本発明の化学ルミネッセンスキサンチンオキシダ
ーゼシステムは以下の通りにハイブリダイゼーションに
よって形成されたデユープレックスを検出するために用
いることができる。

ａ）　フィルター試験管又はマイクロタイタープレート
のような固相支持体に被検出物の遺伝物質を沈積させる
。

ｂ）被検出物の遺伝物質を実質的に相補的なヌクレオチ
ド配列をもつオリゴヌクレオチドプローブと結合させた
キサンチンオキシダーゼからなるトレーサーをハイブリ
ダイゼーションをおこす条件ドで反応（Ｉｎｃｕｂａｔ
ｉｏｎ）させる。

Ｃ）当該支ｔ、７体を洗浄する。

ｄ）キサンチンオキシダーゼと結合した驕實、鉄錯体増
感剤及び化学ルミネッセンス試薬を添加する。

ｅ〉　化学ルミネッセンス応答を測定して、形成された
デユーブレックスの濃度又は存在を決定する。

この方法を実施するための試薬キットは、以下のものを
含む。

ａ）フィルター、試験管、又はマ・ｒクロタイタープレ
ートのような固［Ｕ支持体。

ｂ）キサンチンオキシダーゼと結合したオリゴヌクレオ
チドプローブ。

Ｃ）キサンチンオキシダーゼと結合した基質。

ｄ）化学ルミネッセンス試薬。

Ｃ）鉄錯体増感剤。

最後に、当然のことであるが、本発明は生物学的サンプ
ル中のキサンチンオキシダーゼを検出する分析にも用い
ることができる。そのようなものには分析には、以下の
ような例が挙げられる。

ａ）キサンチンオキシダーゼに対する抗体を被覆した試
験のような固相支持体を用意する。

ｂ）　　手順ａ）で調製した固相支持体の存在下で、分
析すべきキサンチンオキシダーゼを含むサンプルを反応
（１ｎｃｕｂａｔｉｏｎ）させる。

Ｃ）　当該支持体を洗浄する。

ｄ）　キサンチンオキシダーゼと結合した基質、鉄錯体
増感剤及び化学ルミネッセンス試薬を手、頒Ｃ）で調製
した支持体に添加する。

Ｃ）　当該化学ルミネッセンス試薬の化学ルミネッセン
ス応答をＭ１定し、得られたＭ）定値よりキサンチンオ
キシダーゼの濃度を情理する。

この方法を実施するために必要な試薬キットは、これは
本発明の主題を構成するものでもあるが、以下のものを
含む。

ａ）キサンチンオキシダーゼに対して特異性を有する抗
体で被覆した試験管のような固相支持体。

１））キサンチンオキシダーゼと結合した基質。

Ｃ）化学ルミネッセンス試薬。

ｄ）鉄錯体増感剤。

化学ルミネッセンス試薬としては、ルミノール、イソル
ミノール、Ｎ−（４−アミノブチル）−Ｎ−エチルイソ
ルミノール、又はルシジエニンが用いられる。ルミノー
ルが好ましい。

以下の語例は、免隋分机反応におけるキサンチンオキシ
ダーゼシステムの利点と応用範囲を実際の実験結宋に基
づいて述べるものである。

例１：液相におけるキサンチンオキシダーゼの分析 液相中のキサンチンオキシダーゼ（ＸＯ）活性分析のた
めの最適方法の例は、下記の通りである。

ａ）方　　ｌ去 分析するべきキサンチンオキシダーゼサンプル（５０μ
ｇ）をウシ・アルブミン（０、２９６）およびエチレン
ジアミンテトラ酢酸二ナトリウム塩（ＥＤＴＡ）（１ｍ
Ｍ）を含む０．１Ｍナトリウムバルビタール溶液で希釈
して、５０μｇの溶液（ヒポキサンチン基質（１０ｍＭ
）およびルミノール（０，５Ｘ　１０’Ｍ）を蒸留水に
溶かしたもの）と混合した。

発色Ａｌ１定を、蛍光測定装置＜　ｌｕｍｉｎｏｍｅｔ
ｅｒ）（ｒＰｉｅｏｌｌｔｅ６５００Ｊ　、Ｐａｃｈａ
ｒｄ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ　Ｃｏ、）の光増幅器（ｐ
ｈｏｔｏａ＋ｕｌｔｉｐｌｉｅｒ）の前で行なった。

光量子の放射は、室温で一秒間測定した。得られた値は
、バックグラウンド（キサンチンオキシダーゼの（ｉ在
しない溶液で生じる発光のカウント７秒）を差引いて、
カウント、７秒であられされる。

この方法は、測定の自動化の口Ｊ能性と共にＭ１定の簡
便さと迅速性か特徴であった。

ｂ）反応の速度論 この反応の主たる重要性は得られる化学ルミネッセンス
発光の絶大な安定性と長寿命にある。ルミノールのキサ
ンチンオキシダーゼ依存酸化の他の異なった酵素サンプ
ルに対する速度論は第１図に示されている。実験条件は
１−に述べた通りである。８時間以上の間隔で１秒間ず
つ行なう測定の結果はこの発光の安定性を示している。

１フエムトモル（ｆｍｏｌ）以下のキサンチンオキシダ
ーゼサンプルで、児全に安定した発光は反応開始後１０
分で得られるということは明記されるべきである。

他方サンプル当り１０から１００　ｆｍｏｌのより高い
濃度領域では、発光は徐々に増加し、安定した発光は１
時間で得られる。実際には発光の変動は、測定可能時間
が長いという点に於て、軽視できるものである。

この化学ルミネッセンス応答の速度論と、これまで記載
されてきた他の安定な系における速度論とを比較すれば
、免疫分析に於るキサンチンオキシダーゼの価値が実証
される。すなわち非常に長期間にわたって、感度の損失
を生じることなく　ＩＩ定をくりかえすことができる。

他の結果によれば少なくとも２０時間の開発光信号を測
定することができる。

光量子の放射の安定性はキサンチンオキシダーゼ反応の
触媒特性に従って説明することができる。

すなわちその安定性はＯ二の不均化により生じる過酸化
水素が徐々に蓄積するということと関連している。この
反応の流れは、水酸基ラジカルの形成とその後の発光を
おこすルミノールの酸化に必要な！Ｉａｒｂｅｒ−Ｗｏ
１ｓｓ反応へ至るものである（ＩｌｏｎｒｙＪ、Ｐ、、
Ｍｉｃｈｅｌｓｏｎ　Ａ、Ｍ、（１９７７）、５ｕｐｅ
ｒｏｘｉｄｅ　ａｎｄ　５ｕ−ｐｃｒｏｘｌｄｏ　Ｄｉ
ｓｍｕｔａｓｃｓ、Ｍｉｃｈｃｌｓｏｎ　Ａ、Ｍ、、Ｍ
ｃＣｏｒｄ　Ｊ。

ａｎｄ　Ｆｒ１ｄｏｖｉｃｈ　１．編、ｐ、２ｇ３〜ｐ
、２９０．ＡｃａｄｃｍｉｃＰｒｅｓｓ、）。

〔化学ルミネッセンス反応の一般的特性〕本発明の発光
の安定性とは別に、ＸＯ反応の一般的な特性は以下の通
りである。

ａ）媒質のモル濃度の影響 ０．０２５Ｍから０．２５Ｍの間でのバルビツールの種
々の濃度で得られた化学ルミネッセンス応答は、モル濃
度が高ければより強い応答がおこることを示した。０．
２５Ｍのバルビツールの最終濃度を、その後ずっとルー
チンの方法として用いた。

ｂ）媒質のｐＨの影響 ＸＯ系の化学ルミネッセンス応答はアルカリ側の緩衝液
の使用により最適化された。およそｐＨ９，５から１０
．５の間の緩衝液の使用により発光は、より低いｐＨの
緩衝液を使用した時と比較して１０〜１００倍に増加し
た。有効な緩衝液にはリン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、炭
酸緩衝液、バ　・ルビクール緩衝液及びトリス緩衝液が
ある。

Ｃ）化学ルミネッセンス化合物の性状の影響ルミノール
はＸＯ系に於てその酸化により光量子を放射する唯一の
物質ではない。ルシジエニン（Ｎ−メチル・アクリジニ
ウム）も又、この特性を有する。２３　ｎ　ｇ　（７７
ｆ’ｍｏｌ）のＸＯサンプルに対する最大の化学ルミネ
ッセンス応答を与えるルシジェニンの濃度とルミノール
の濃度を決定する実験を行ない、ルシジエニンの濃度は
１０’Ｍ、ルミノールの濃度は０．５Ｘ１０−４Ｍと決
定した。

ルミノールの使用によりルシノジエンの場合とくらべて
きわめて高い感度（＜０．　３１’ｆｆ１ｏｌ）が得ら
れた。この事実はおそらく、ＸＯ反応によって産生され
る酸素含有ラジカルに関してルミノールは特別な反応性
を有していることに関連がある。

一方ルジノジエンは過酸化物陰ジオンに対してより特異
的である。この場合、過酸化水素及び水酸基ラジカルに
よってもたらされる情報は考慮されていない。

０．５Ｘ１０’Ｍのルミノールの最終濃度をその後ルー
チンのキサンチンオキシダーゼ分析法に於て使用した。

ｄ）基質の特性の影響 第２図には、２通りのキサンチンオキシダーゼ濃度に於
いて、２種類の基質、ヒボキサンチンとアセトアルデヒ
ドを用いた時のルミノールのキサンチンオキシダーゼ依
存酸化反応の時間に関して、光放射の曲線を比較したも
のを示す。

第２図の説明 ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・　５
ｍＭヒポキサンチン５０ｍＭアセトアルデヒド ８０ｆｍｏｌＸ０ ０、８ｒａｏｌＸＯ ヒポキサンチンを用いたときの発光の安定性は、アセト
アルデヒドを用いた場合よりはるかに顕著であった。ア
セトアルデヒドの場合には、事実上、反応開始後２０分
で減少が生じる。

１５０分後にはアセトアルデヒドでの発光強度はヒポキ
サンチンでｉすられる最大応答のわずか４％である。ヒ
ポキサンチンの場合、この時間までには減少はみとめら
れなかった。これにより、安定かつ高い光は子の放射を
得るための基質として、ヒポキサンチンをルーチンに使
用することが正当化される。

ｅ）鉄−ＥＤＴＡ錯体によるルミノールのＸＯ依存酸化
の強化鉄・ＥＤＴＡ錯体は以下のメカニズムによりｌ１
ａｒｂｅｒ−Ｗｅｉｓｓ反応のだめの効果的な触媒とし
て働くということは一般にうけいれられている（Ｗｉｎ
ｔｃｒｂｏｕｒｎ　Ｃ，Ｃ，ｃｔ　ａｌ、Ａｒｅｈ！ｖ
ｃｓ　ｏｆ　Ｂｉｏｃｈｃｍ−１ｓｔｒｙ　ａｎｄ　Ｂ
ｌｏｐｈｙｓｌｅｓ、２４４，１．２７−３４，１９８
［ｉ）。

Ｆｅ３”（ＥＤＴＡ）＋Ｏ二　　　　−２＋ Ｆｅ　　（ＥＤＴＡ）　十Ｈ２Ｏ２ Ｆ　　ｅ　　３＋　（ＥＤＴＡ）　　　−ト　ＯＨ−＋
ＯＨ”第３図には鉄・ＥＤＴＡ錯体の存在下及び非存布
ドで得られた、ＸＯによる反応開始後１５分で測定した
化学ルミネッセンス曲線を示す。

第３図の説明 −５ＩＭ　　Ｅ　Ｄ　Ｔ　Ａ　−Ｆ　ｅＯμＭ　　ＥＤ
ＴＡ−Ｆｅ 鉄錯体は蒸留水でそれぞれ溶解したＦｅＣＦｅＣ１２（
１とＥ　Ｄ　ＴＡ　　Ｎ　ａ　２　（１００ｍＭ）とを
等二混合して調製した。少な（とも３０分経過後、この
溶液はヒポキサンチン／ルミノール混合物で１／１００
に希釈された。ＸＯ反応のための反応（１ｎｃｕｂａｔ
　ｔｏｎ）媒質中の錯体の最終濃度はそれゆえ５μＭで
ある。

コノ鉄・ＥＤＴＡ錯体はルミノールのＸＯ誘発酸化に関
連した化学ルミネッセンス反応を１０倍ずつ増加させる
。したがってこの錯体の使用によりＸＯ活性検出の閾値
をさげることができる。

さらに第４図には、この錯体の存在下で生じる発光は、
非存在下で生じるそれと比べてわずかに不安定であった
ことが示されている。しかしながら反応開始後７時間３
０分では化学ルミネッセンスとして測定された光量子放
射は鉄／ＥＤＴＡ存在ドでは非存在下でのそれと比べて
はるかに高い値を維持していた。

第４図の説明 キサンチンオキシダーゼ濃度０　、８　ｒｍｏｌ及び８
０　ｆ’ｍｏｌにおける鉄／ＥＤＴＡ存（ｌミ下（ｒ−
−１）非存在下（□）でのルミノールのキサンチンオキ
シダーゼ依存酸化の速度論。

こうした特性は、鉄／ＥＤＴＡ錯体は当該反応のための
すぐれた増強物質の代表であり、ルーチンの分析手順で
使用が望ましいということを示している。

例２：アビジンの固相分析 １、ＸＯ−ビオチン共役体の調製 ＸＯ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｃｉｍ　＞土
製）を３．２Ｍの（ＮＨ４）２Ｓ０４に２０　ｍｇ／　
ｍｌのン農度（二汀遊してなる懸濁液を５０００ｇ−で
１０分間遠心分離させ、ベレットを５０ｍＭのＮａＣ１
を含む２０ｍＭのホウ酸緩衝液（ｐＨ８，５）１ｍｌに
溶解し、ビオチンＸＮＨ３（ビオチンε−アミノカプロ
ン酸Ｎヒドロキシスクシンイミドエステル、Ｃａ　Ｉ　
ｂ　１ｏｃｈｃａ＋社製）（１，２ｍｇ／１２μＮ無水
ジメチルホルムアミド）を添加した。この溶液をポルテ
ックスミキサーで、２分間撹拌し、外気温中に１時間放
置し、その後０．１３Ｍの塩化ナトリウムと０．１９６
のアジ化ナトリウムを含む０．０７Ｍ、ｐＨ７，４のリ
ン酸ナトリウム緩衝液（ＰＢＳ）に対して透析した。こ
のＸＯ−ビオチン共役体は無閑状態で４℃で保存した。

２、牛血清アルブミン争ビオチン共役体５０＋ｎｇの牛
血清アルブミン（ＢＳＡ）（フラクションＶ、　Ｆｌｕ
ｂａ社製）をｐＨ８，５で５０　ｍ　Ｍの塩化ナトリウ
ムを含む２０ｍＭのホウ酸緩衝液に溶解し、その後ビオ
チンｘＮＨＳ　（２０１１Ｉｇ／２００μｇ無水ジメチ
ルホルムアミド）溶液を添加した。その後の操作手順は
ビオチン化Ｘｏの調製のために述べたものと同一であっ
た。

３．８ＳＡ−ビオチン被覆試験管 ｐＨ９，６、Ｏ，ＩＭの炭酸緩衝液に溶解したビオチン
化Ｂ　ＳＡ　（５μｇ／ｍｌ）の１５０ｔｔＯをポリス
チレンの試験管（ＳａｒｓＬｅｄｔ製、３．５ｍｌ、５
５Ｘ１２ｍｍ）に添加した。試験管を４℃、１６時間イ
ンキュベート（ｉｎｃｕｂａｔＣ）　Ｌその後２度、蒸
留水で洗浄し試験管に残存する蛋白結合部位を０．１％
アジ化ナトリウムを含む、蒸留水に溶解した０、３℃％
ＢＳＡ溶液５００μｇで飽和した。

４、アビジン分析 ＢＳＡビオチン波覆試験管を０．１％のＢＳＡを含むリ
ン酸緩衝液食塩水（Ｐ　Ｂ　Ｓ）の１ｍｌで２度洗浄し
、その後種々の濃度の卵アビジン（Ｃａｌ−ｂｉｏｅｈ
ｅｍ製）を含む溶液２００μｇを添加した。

この試験管を外気温で３０分インキュベートした。

０．１％ＢＳＡ含有ＰＢＳ　（ＰＢＳ　　ＢＳＡ）で試
験管を２度洗浄した後ＸＯビオチン（２μｇ／２００ｍ
１ＰＢＳ　　ＢＳＡ）をこの試験管に添加して、再び外
気温で２時間インキュベートした。

試験管を洗浄してから、発光試薬（２００μｇ）を添加
した。発光試薬の組成はドの通りである。

０．５Ｘ１０’Ｍルミノール ０．２５Ｍパルビタールナトリウム緩衝液、ｐＨ１０，
２ ５ｍＭヒポキサンチン ０．２５ｍＭ　　ＥＤＴＡニナトリウム５μＭ塩化第一
鉄 試験管を蛍光測定装置（ｌｕｍｉｉｎｏｍｅｔａ）にお
き、５秒間カウントした。第５図はこの方法で行なった
アビジン分析の代表的な実験例を示す。

第５図の説明 横軸：アビジン濃度　μｇ／ｍｌ（ログスケール）縦軸
；アビジン存在ド及び非存在下のカラン８フ秒（ログス
ケール） かくしてＸＯ依存化学ルミネッセンス系によって生じる
光の強度は特異的な結合反応混合液に存在するアビジン
の綴の関数であることが明らがとなった。本発明はかく
して固相分析によって溶液中のリガンドを決定するのに
４用な共役体（ビオチン化ＸＯ）を提供する。

例３：同相拮抗ビオチン分析 ビオチン結合拮抗分析（ｂｉｏＬＩｎ　ｃｏｍｐｅｔｉ
ｔｉｖｅｈｌｎｄｌｎｇ　ａｓｓａｙ）の手順は以下の
通りであった。

既形成複合体ビオチン化Ｘ０（１０Ｍｇ　／　ｍｌ　）
／ストレプトアビジン（０，３μｇ　／　ｍｌ　）をＰ
ＢＳ　　ＢＳＡ中で調製し、外気温で３０分インキュベ
ートした。これをＢＳＡ−ビオチン被覆をほどこした試
験管に加えた。ＢＳＡ−ビオチン被覆試験管は先きに述
べた通りであった。すなわち一種々の濃度のビオチンを
含む溶液１００Ｉ１１−既形成錯体１００μｇ その後外気温で２時間（又は＋４℃で１晩）試験管をイ
ンキュベートし、さらにＰＢＳ　　Ｂ５Ａ１ｍ１で２度
洗浄した。化学ルミネッセンス発光試薬（２００μｍ）
をその後添加し蛍光測定装置（ＩｕＩＩｉｉｎａａ＋ｅ
Ｌｅｒ）で試験管を５秒間カウントした。

第６図はこの方法で行なわれた拮抗分析の代表的な実験
例を示している。この分析の感度はおよそ５μｇ（２０
「鵡０１）である。

第６図の説明 横軸：ビオチン濃度（ｐｇ／サンプル直線スケール） 縦軸：カラン８フ秒（直線スケール） ＸＯ依存化学ルミネッセンス系によって生じる光の強度
は特異的な反応混合物中のビオチンの量の逆の関数であ
った。本発明はかくして拮抗固相分析による液体媒質中
のリガンドの決定のためのトレーサーとして有用な複合
体を提供する。

例４：キソプラズマ抗体の検出 ａ）ビオチン化抗ヒトＩｇＧの調製 ０．２５Ｍの塩化ナトリウム、０．０２ＭでｐＨ７，６
のリン酸緩衝液に溶解した抗ヒトＩｇＧウサギ抗体（２
，５＋ｇ／ｍｌ）　　（ＪａｃｈｓｏｎＬａｈｏｚａｔ
ｏｒｙ）の０．７１ｍ１をビオチンＸＮＨＳ（１０ｍｇ
／１００μｇジメチルホルムアミド）溶液８μｇに添加
した。その後の手順はＸＯのビオチン化のために述べた
ものと同一であった。

ｂ）トキソプラズマ抗原被覆試験管 トキソプラズマ抗原調製物はＩｕｓｌ’Ｈ’ｕｔｅ　Ｖ
ｉｒｉｏｎ（チューリッヒ、スイス）から購入し、同調
製物とともに提供された指示に従って再構成した。ポリ
スチレン試験管を再構成した抗原調製物の１５０μｇで
被覆し、外気温で１晩インキユベートした。この試験管
はＰＢＳ　　ＢＳＡ緩衝液で洗浄後、−２０℃で乾燥し
た状態で保存した。

Ｃ）既形成ビオチン化ＸＯ／ストレプトアビジン／ビオ
チン化抗ＩｇＧ複合体 ビオチン化ＸＯ／ストレプトアビジン／ビオチン化ウサ
ギＩｇ（４合体をＰＢＳ　　ＢＳＡ中でビオチン化Ｘ０
（１０μｇ　／　ｍｌ　）をストレプトアビジン（０，
５μｇ　／　ｍｌ　）と共に１５分間外気温でインキュ
ベートし、その後ビオチン化ウサギＩｇＧ（最終濃度１
．４μｇ／ｍｌ）を添加することによって調製した。

ｄ）抗トキソプラズマ分析 トキソプラズマ抗体分析の手順は以下の通りであった。

被覆した試験管をトキソプラズマ陽性又は陰性の対照血
清２００μｇと共に一３７℃で１時間インキュベートし
た。トキソプラズマ対照血清はＢｉｏＬｒｏｌ　１．ａ
ｈｏｒａＬｏｒｉｅｓから購入した。その後試験管をＰ
ＢＳ　　ＢＳＡ緩衝液で洗浄しＣ）で調製した既形成複
合体（２００μｇ）を添加した。

この試験管を３時間外気温で（又は４℃で１晩）インキ
ュベートし、ＰＢＳ　　ＢＳＡで２度洗浄した。その後
化学ルミネッセンス発光試薬２００μｇを上に述べたよ
うに添加し、試験管を蛍光測定装置で５秒間カウントし
た。

第７図に２通りの異なった濃度のトキソプラズマ陽性の
対照血清を用いて得られた化学ルミネッセンス発光の速
度論の実験例が示されている。信号試薬の添加後３０分
以内に最大発光が出現した。

この発光は３０時間の半減期で減少する。

第７図の説明 横軸：時間（直線スケール） 縦軸二カウント／秒（ログスケール） 第８図は陽性及び陰性血清の各段階希釈について得られ
た化学ルミネッセンス応答を示している。

第８図の説明 横軸二マイクロリーター、コントロール血清（ログスケ
ール） 縦軸：希釈血清存在下及び非存在下のカウント７秒の比
率（ログスケール） ビオチン化ＸＯ／ストレプトアビジン／ビオチン化抗ヒ
トＩｇＧ抗体複合体によって生じる化学ルミネッセンス
発光の強度は分析されるべきサンプル中のトキソプラズ
マに対するヒトＩ　ｇ　Ｇの量に直接１１］関していた
（ここに於て該複合体は対応する抗原で被覆された固相
に固定される）。さらに得られた発光は日の単独で長期
間の光放射を示していた。

トキソプラズマ抗体分析と同様の手法でヒト血清中のク
ラミジア抗体の検出に於て類似の結果が得られた。

例５：ブロラクチン免疫分析 この免疫分析に使用したプロラクチン分子のそれぞれ独
立した部位に対してつくられた２種のモノクローナル抗
体はイムノチック（Ｉｍａ＋ｕｎｏｔｅｅｈ。

Ｌｕｍ＋ｎｇ、Ｆｒａｎｃｅ）から贈与されたものであ
る。

ａ）ビオチン化抗プロラクチンモノクローナル抗体の調
製 ０．１５ｍＭの塩化ナトリウムを含む２０ｍＭのホウ酸
緩衝液（ｐＨ８，６）の０．７５ｍ１に溶解した抗プロ
ラクチンモノクローナル抗体１ｇＧ１　／　ｍｇをジメ
チルホルムアミド２０μｇに溶解した４０μｇのビオチ
ンＸＮＨＳで処理したその後の手順はビオチン化ＸＯの
調製のために上で述べたｆ、順と同一であった。

ｂ）抗プロラクチン抗体波覆試験管 ポリスチレン試験管を、０．１Ｍの炭酸緩衝液（ｐＨ９
，６）　１５０ｕＤに１９．　５μｇのモノクローナル
抗体１　ｇＧ２を溶解したもので被覆した。被覆は外気
温で１晩行ない、試験管を蒸留水で１度洗浄し、残存す
る蛋白結合部位を５００μｇの０．　３％ＢＳＡ蒸留水
溶液で飽和した。被覆した試験管は４℃で保存した。

Ｃ）プロラクチン免疫分析 プロラクチン免疫分析の手順は以下の通りであった。

一披工試験管をＰＢＳ　　ＢＳＡで１００倍希釈したビ
オチン化抗プロラクチン抗体１５０μｇと５０μｇの血
清とで外気温で１晩インキユベートした。

−この試験管をＰＢＳ　　ＢＳＡで２度洗浄した。

−ＰＢＳ　　ＢＳＡで調製された既形成ビオチン化Ｘ０
（１０Ｍｇ／ｍＤ／ストレプトアビジン（０，５μｇ／
ｍｌ）　複合体２００μｇを添加し外気温２時間インキ
ュベートした。

−ＰＢＳ　　ＢＳＡで２度試験管を洗浄した。

−２００μｇの信号試薬を添加した。

−各試験管を蛍光測定装置で５秒間カウントした。

２００μｇ／ｍｌの濃度の場合の化学ルミネッセンス発
光の半減期は３０時間であった。信号試薬の添加後３０
分、２１時間、１４０時間で得られた標準曲線の比較は
、これ以後のタイムコースで化学ルミネッセンス判定の
結果前られる標準曲線は実質的には同一であることを示
した。

比例的により急速にバックグラウンドが減少していくの
で感度は時間と共に上昇するようであった。

第９図の説明 横軸：プロラクチンｎｇ／ｍｌ　（ｉＦｉ線スケスケー
ル軸：異なった標準血清で得られるカウント７秒の最大
濃度（２００ｎｇ／ｍｌ）で得られるカウント７秒に対
する比率（直線スケール） このことは、相補的なモノクローナル抗体で被覆された
固相Ｉユに抗原によって固定されたビオチン化ＸＯ／ス
トレプトアビジン／ビオチン化モノクローナル複合体に
よって生じた化学ルミネッセンス発光の大きさはサンプ
ル中の抗原量に直接関連しているということを証明した
。

例６ニトリヨードチロニン（Ｔ３）免疫分析ａ）トレー
サーの調製 １．１９＋ｇのビオチン化ＢＳＡをｐＨ９，６，０，１
Ｍの炭酸緩衝液（３ｍｌ　）で希釈した。１２ｍ１の０
．０４Ｍのバルビタール緩衝液（ｐＨ９，４）を添加し
、その後で先きに１ｍｌのジメチルホルムアミドに溶解
された２、５ｎｇのＴ３を添加した。共役反応は５０Ｍ
ｇの０．０４Ｍゲルタールアルデヒド水溶液（蒸留水）
を添加することにより開始させた。混合物は外気温で３
時間インキュベートし、それから２００μｇの０．１Ｍ
グリシン水溶液（蒸留水）を添加して反応をとめた。

さらにもう１時間インキュベートしてから、３７．５ｍ
ＭのＳｏｄｉｕｍ　Ｂｏｒｏｈｙｄｒｌｄｅ溶液を加え
、混合物を４℃で１．５時間おいた。この溶液を１．５
ｍｌに濾過濃縮しＣＡｍ１ｃｏｎ　Ｂ１５）　、その後
で共役体をゲル濾過カラムクロマトグラフィーにより精
製した（［ＩＩｔｒｏｇｃｌ　ＡｃＡ４４．Ｉｎｄｕｓ
ｔｒｆｏ　Ｂｉｏｌｏｇ−１ｑｕｃ　Ｆｒａｎｃａｉｓ
ｃ）　　（カラムの大きさ：６０×０．９ｃｍ）。免疫
活性及び酵素活性のある分画はラジオイムノアッセイと
ヒポキサンチン、ルミノール系に於いて化学ルミネッセ
ンスによってそれぞれ位置を決定し、これらの分画をプ
ールした（　ｐｏｏ　ｌ　）。

ｂ）被覆試験管 ０．１Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ９，６）に溶解したヤギ抗ウ
サギＩ　ｇＧ　（ＡＲＧＧ）　　（Ｊａｃｋｓｏｎ　Ｌ
ａｂ−ｏｒａｔｏｒｉｅｓ）の１５０ｔ、ｔｌｌ　　（
１，９５，ｃｚｒ／１５０μΩ）でポリスチレン試験管
を被覆した。これを外気温で１晩インキユベートし、そ
の後試験管を洗浄して、未反応の蛋白結合部位を０．３
％ＢＳＡ水溶液（蒸留水）５００μｇで飽和した。

これらの被覆試験管は４℃で保存した。

Ｃ）抗Ｔ３抗体 抗Ｔ３抗体はカルボジイミドで誘導したＴＢＢＳＡ共役
体でウサギを免疫して得られた。免疫グロブリンは３０
％硫安沈澱を行ないさらにＤＥＡＥＳｃｐｈａｃｅｌ　
（Ｐｈａｒａｔａｃｉａ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗａｄｃ
ｎ）クロマトグラフィーを行なうことによって精製され
た。

ｄ）Ｔ３免疫分析 Ｔ３分析の手順は以下の通りに行なった。

−ＡＲＧＧ彼覆試被覆を種々の濃度のＴ３（０〜１２、
４μｍｏｌ）　、一定の濃度のＴ３ビオチン化ＢＳＡ共
役体及び抗Ｔ３抗体（最終希釈：１／１５０００）でイ
ンキュベート。すべての希釈はＰＢＳ　　ＢＳＡ：で行
ない、インキュベーション時の最終容積は３００μｇ０ ｍ：の試験管を０．０５９６のトリトン×１００を含む
ＰＢＳ　　ＢＳＡで洗浄。

−この試験管を既形成複合体（ビオチン化ＸＯ（１０ｕ
　ｇ／ｍり　／ストレプトアビジン（０，５μｇ／ｍｌ
）とともにインキュベート。

−ＰＢＳ　　ＢＳＡで試験管を洗浄。

−信号試薬２００μｇを添加。

一蛍光測定装置で５秒間各試験管をカウント。

表Ｉは２通りの希釈（１０’、１０−’）のＴ３ビオチ
ン化ＢＳＡ共役体を用いて得られた結果を示す。ＣＰＳ
はカウント７秒（Ｃｏｕｎｔｓ／５ｅｃｏｎｄ）をあら
れし、Ｂ／ＢＯはＴ３非存在Ｆで結合したＣＰＳで除し
た濃度Ｂで結合したＣＰＳをあられす。

Ｔ３　ビオチル化　ＢＳＡ 免疫学的に同相に固定された複合体（ビオチン化ＸＯ／
ストレプトアビジン／ハプテン−ビオチン化ＢＳＡ）に
よって生じた化学ルミネッセンス発光の強度はサンプル
中のハプテン量に反比例した。

例７　：　Ｔ３−ＸＯ共役体を用いるトリヨードチロニ
ン免疫分析 ハプテンＸＯ共役体を用いる免疫分析に於ける化学ルミ
ネッセンスシステムの応用例はトリヨードチロニンの拮
抗免疫分析によって提供される。

ａ）Ｔ３−ＸＯ共役体の調製 ＸＯ調製物（Ｂｏｃｈｒｉｎｇｃｒ）とＴ　３　（Ｆｌ
ｕｋａ）の共役はＹａＩＩａｍｏｔｏの方法（ＣＩｉｎ
ｉｃａｌ　Ｃｈｃｍｉｓｔｒｙ、２７−１０．１７２１
−１７２３ページ、１９８１）に従って行なった。

ＸＯは５ｅｐｈａｄｅｙ　Ｇ−２５カラム（Ｐｈａｒｌ
ｌｌａｅｉａ　ＰＤ−１０）で２度連続してクロマトグ
ラフィーを行なうことにより、０．１Ｍリン酸ＷｉＭ（
ｐＨ７）で平衡させた。得られた調製物の２８０　ｎｏ
＋と４５０止に於ける吸収比率は５．８＋／−０，２に
等しかった。

Ｔ３のジメチルホルムアミド溶液６００μｇ（Ｔ３　１
ｎ＋ｇ／ｍｌ）を６０μＱの４−　（マレイミドメチル
）シクロヘキサン−１カルボン酸コハク酸イミドエステ
ル（ＳＭＣＣ）のジメチルホルムアミド（Ｄ　Ｍ　Ｆ　
）溶液（２ＩＩ１ｇ／ｍｌ）で処理しその後１．２ｍｌ
のリン酸緩衝１ｆＪｔを添加した。混合物は５分おきに
ボーテックスミキサーではげしく撹拌しながら９０分間
３０℃でインキュベートした。

活性化反応は０．１Ｎ１グリシン（１２０μｇ）を添加
することにより停止させた。実際のＴ３−ＸＯ共役は、
リン酸緩衝液で平衡させたＸＯの１００μｇを、上記の
活性化Ｔ３溶液１５０μｇと、混合することにより行な
った。混合物を３０℃で３０分間インキュベートし、そ
の後反応はリン酸緩衝液に溶解した０、１Ｍのメルカプ
トエチルアミンを添加することにより停止させた。

この反応媒質はその後溶離液として０．２！’６ＢＳＡ
を含む０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７）を用いてＬ！Ｉ
ｔｒＯｇＯＩ　ＡｃＡ３４（Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅ　Ｂｌ
ｏｌｏｇｃｑｕｅＦｒａｎｃａｌｓｃ）カラムで精製さ
れた。ＸＯ酵素活性は各分画について測定した。共役誘
導体（Ｔ３−ＸＯ）を含む分画は、ウサギから得られた
ＩｇＧを用いて調製した抗Ｔ３抗体て被覆した試験管に
Ｔ３−ＸＯを結合させてから決定された。各被覆試験管
１：０．１９６ＢＳＡＡ！０２ＩＮ１のバルビタール緩
衝液（ｐＨ８，６）で希釈した分画１００μｇを添加し
てから、３７°Ｃで１時間インキュベートした。この試
験管を蒸留水で洗浄し固定されたＸＯ活性を２００μｇ
の信号試薬を添加することにより決定した。

第１０図は旧ｔｒｏｇｅｌ　ＡｅＡ３４カラムに共役媒
質を通してから抗Ｔ３固相に結合する分画をしらべた結
果を示す。免疫活性ピークの位置を決定し、該当する分
画をまとめた。

第１０図の説明 ｘ　　　　ｘ　　仝ＸＯ活性 ・　抗Ｔ３固相に結合したＸＯ活性 ｂ）拮抗結合法によるＴ３の分析 上で得られたトレーサーをＴ３の免疫分析の実施に用い
た。第１１図は該当するＷ＋定曲線を示す。

第１１図の説明 ・　反応開始後１５分で行なった１秒 間のカウント ｘ　　　　ｘ　　反応開始後１６時間で行なった１秒間
のカウント 横軸：　Ｔ　３　（ｐａ＋ｏｌ）　　（ログスケール）
縦軸二カウント／秒×１Ｏ−２（直線スケール）この分
析には上で述べた抗Ｔ３１ｇＧで被覆した試験管を用い
た。反応媒質（１ｎｃｕｂａｔ１ｏｎ　１ｅｄｉ−ｕａ
＋）はトレーサーを含む１００μｇの１０〜０　、　１
　ｐｍｏｌの各種濃度のＴ３によって構成された。

すべだの希釈は０．１％ＢＳＡを含む０．１Ｍバルビタ
ール緩衝液（ｐＨ８，６）で行なった。

反応（１ｎｃｕｂａＬｉｏｎ）は３７℃で１時間行なっ
た。

固定されたＸＯ活性の決定は上に述べたように行なった
。

反応後１６時間のＸＯ中介化学ルミネッセンス反応によ
って生じた光の量は反応後１５分で測定した光量と比較
してほんのわずかの減少しか示さなかった。したがって
ＸＯ依存化学ルミネッセンス反応の安定性は、固相に於
ても液相に於ても、推断されうる。

本発明の上述の記載は、説明と例証のために、特定の具
体化例についてなされている。しかしながら当該技術分
野に熟達した人々にとって、ここに記載された具体例を
準備し、実施するための手法における様々な修正や変更
が本発明の本質をはなれることなしになされうろことは
明白である。

出願人は本発明の範囲内に入るすべての同等の修正及び
変更をカバーするために前記の特許請求の範囲を志向す
る。

【図面の簡単な説明】

第１図はルミノールのキサンチンオキシダーゼ依存酸化
の速度論を示す図表である。 第２図は基質の違いによる発光の安定性を示す図表であ
る。 第３図は１ＥＤＴＡ錯体によるルミノールのＸＯ依存酸
化の強化を示す図表である。 第４図は鉄ＥＤＴＡ錯体のルミノールのキサンチンオキ
シダーゼ依存酸化の速度論に対する影響を示す図表であ
る。 第５図はアビジンの固相分析の結果を示す図表である。 第６図は固相拮抗ビオチン分析の結果を示す図表である
。 第７図はトキソプラズマ抗体を用いた時の化学ルミネッ
センス発光の速度論を示す図表である。 第８図は抗トキソプラズマ抗体検出の結果を示す図表で
ある。 第９図はプロラクチン免疫分析の結果を示す図表である
。 第１０図はトリヨードチロニンーキサンチンオキシダー
ゼ共役体を用いるトリヨードチロニン免疫分析の結果を
示す図表である。 第１１図は固相に於けるキサンチンオキシダーゼ依存化
学ルミネッセンス反応の安定性を示す図表である。 出願人代理人　　佐　　藤　　−雄 （燕ｐＩ ＴＩＭＥ　（ｈｏｕｒｓ） ＴＩＭＥ　（ｍｉｎｕｔａｓ） ＦＥＭＴＯＭＯＬＥＳ　ＸＯ ＴＩＭ　Ｅ　（ｈｏｕｒｓ） ＡＶＩＤＩＮ　　ＡＳＳＡＹ Ｆｊ５Ｆ−５ ＢＩＯＴＩＮ　　ＡＳＳＡＹ ｐ９　Ｂ１０７ＩＮ １ｇ−Ｃ 丁ＯＸＯＰＬＡＳＭＡ　　ＩＭＭＵＮＯＡｓｓＡＹ・１
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１４０Ｔ
ＩＭＥ　（ｈｏｕｒｓ） ｆ！９ｔ７ ＴＯＸＯＰＬＡＳＭＡ　ＩＭＭＵＮＯＡＳＳＡＹｆ！リ
−３ ｆ！す【ノ ｎｇ／ｍｌ　ＰＲＯＬＡＣＴＩＮ １）ＭＯＬＥＳ　Ｔ３

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、オキシダーゼ、オキシダーゼの基質、化学ルミネッ
   センス試薬及びｐＨおよそ９．５から１０．５の範囲で
   働く増感剤からなる、化学ルミネッセンス分析に有用な
   長期間にわたる発光を生じさせる信号試薬。 ２、オキシダーゼがキサンチンオキシダーゼ、コリンオ
   キシダーゼ、フマレートオキシダーゼ又はサルコシンオ
   キシダーゼである、特許請求の範囲第１項に記載された
   信号試薬。 ３、オキシダーゼがキサンチンオキシダーゼである、特
   許請求の範囲第１項に記載された信号試薬。 ４、キサンチンオキシダーゼの基質がキサンチン、ヒポ
   キサンチン、アセトアルデヒド又はプリンである、特許
   請求の範囲第３項に記載された信号試薬。 ５、キサンチンオキシダーゼの基質がヒポキサンチンで
   ある、特許請求の範囲第３項に記載された信号試薬。 ６、ルミネッセンス試薬がルミノールである、特許請求
   の範囲第１項に記載された信号試薬。 ７、増感剤が遷移金属複合体である、特許請求の範囲第
   １項に記載された信号試薬。 ８、炭酸緩衝液、バルビタール緩衝液、ホウ酸緩衝液、
   リン酸緩衝液又はトリス緩衝液あるいはその他のｐＨお
   よそ９．５から１０．５領域をつくる類似の緩衝液に溶
   解した鉄−ＥＤＴＡ錯体増感剤、キサンチンオキシダー
   ゼ、ヒポキサンチン及びルミノールからなる、特許請求
   の範囲第１項に記載された信号試薬。 ９、特許請求の範囲第１〜８項のいずれかに記載された
   信号試薬を用いる操作手順からなる、長期間にわたる発
   光を生じる、被分析物の拮抗化学ルミネッセンス分析法
   。 １０、被分析物がハプテン又は抗原である、特許請求の
   範囲第９項に記載された方法。 １１、被分析物がトリヨードチロニンである、特許請求
   の範囲第１０項に記載された方法。 １２、リガンドが抗体である、特許請求の範囲第９項に
   記載された方法。 １３、トレーサーが被分析物にビオチン−アビジン結合
   を介して又は直接共有結合したオキシダーゼからなる、
   特許請求の範囲第９〜１２項のいずれか１項に記載され
   た方法。 １４、リガンドが、リガンドに特異的な結合相手で固相
   支持体表面に被膜をつくり、リガンドをこれと反応させ
   ることにより当該支持体表面にリガンドの被膜をほどこ
   したものである、特許請求の範囲第９〜１３項のいずれ
   か１項に記載された方法。 １５、特許請求の範囲第１〜８項のいずれか１項に記載
   された信号試薬を用いる操作手順からなり、長期間にわ
   たる発光を生じさせる、被分析物のサンドイッチ化学ル
   ミネッセンス分析法又はイムノブロッティング法。 １６、被分析物が抗原又は抗体である、特許請求の範囲
   第１５項に記載された方法。 １７、被分析物がプロラクチン、抗トキソプラズマ抗体
   又は抗クラミジア抗体である、特許請求の範囲第１６項
   に記載された方法。 １８、リガンドがモノクローナル抗体である、特許請求
   の範囲第１５項に記載された方法。 １９、トレーサーが相補的リガンドとビオチン・アビジ
   ン結合を介して又は直接共有結合したオキシダーゼから
   なる、特許請求の範囲第１５項に記載された方法。 ２０、以下のａ）〜ｅ）の操作手順からなり、長期間に
   わたる発光を生じさせる、オキシダーゼによるイムノア
   ッセイのための方法。 ａ）当該オキシダーゼに対する抗体で被覆した固相支持
   体を用意すること。 ｂ）固相支持体の存在下に分析すべきオキシダーゼを含
   むサンプルを反応（ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ）させること
   。 ｃ）固相支持体を洗浄すること。 ｄ）特許請求の範囲第１〜８項のいずれか１項に記載さ
   れた信号試薬を固相支持体に添加すること。 ｅ）化学ルミネッセンス応答を測定し、サンプル中のオ
   キシダーゼ量を演繹すること。 ２１、特許請求の範囲第１〜８項のいずれか１項に記載
   された信号試薬を用いる操作手順からなり、長期間にわ
   たる発光を利用するオリゴヌクレオチド被分析物を検出
   するための化学ルミネッセンス法。 ２２、以下のａ）〜ｅ）の操作手順からなり、長期間に
   わたる発光を利用するオリゴヌクレオチド被分析物を検
   出するための化学ルミネッセンス法。 ａ）オリゴヌクレオチド被分析物を一本鎖の状態で固相
   支持体に沈積させること。 ｂ）操作手順ａ）のオリゴヌクレオチド被分析物を、該
   被分析物に対する相補的なオリゴヌクレオチド結合相手
   であるリガンドとオキシダーゼとを結合させたものから
   なるトレーサーとハイブリダイゼーションをおこす条件
   下で反応（ｉｎｃｕｂａｔａｉ−ｏｎ）させること。 ｃ）固相支持体を洗浄すること。 ｄ）特許請求の範囲第１〜８項のいずれか１項に記載さ
   れた信号試薬をこの洗浄済み支持体に添加すること。 ｅ）化学ルミネッセンス応答を測定し、被分析物の存在
   を演繹すること。 ２３、トレーサーがビオチン−アビジン結合を介して又
   は直接共有結合でリガンドと結合したオキシダーゼから
   なる、特許請求の範囲第２２項に記載された方法。 ２４、それぞれ別々の容器に封入した以下のａ）〜ｃ）
   の試薬からなり、長期間にわたる発光を利用して拮抗方
   式又はサンドイッチ方式による化学ルミネッセンス分析
   法で被分析物を検出するために使用するキット。 ａ）被分析物に特異的な結合相手であるリガンドで被覆
   した固相支持体。 ｂ）オキシダーゼと被分析物又はリガンドのいずれかと
   の結合産物からなるトレーサー。 ｃ）特許請求の範囲第１〜８項のいずれか１項に記載さ
   れた信号試薬。 ２５、トレーサーが、被分析物又はリガンドにアビジン
   −ビオチン結合を介して又は直接共有結合したオキシダ
   ーゼからなる、特許請求の範囲第２４項に記載されたキ
   ット。 ２６、それぞれ別々の容器に封入した下記のａ）〜ｃ）
   の試薬からなり、長期間にわたる発光を利用してオリゴ
   ヌクレオチド被分析物を検出する化学ルミネッセンス分
   析法に使用するキット。 ａ）被分析物を沈積させるための固相支持体。 ｂ）オキシダーゼと被分析物に対して相補的なヌクレオ
   チド結合相手であるリガンドとの結合産物からなるトレ
   ーサー。 ｃ）特許請求の範囲第１〜８項のいずれか１項に記載さ
   れた信号試薬。 ２７、トレーサーがビオチン−アビジン結合を介して又
   は直接共有結合で被分析物に結合したキサンチンオキシ
   ダーゼからなる、特許請求の範囲第２６項に記載された
   キット。