FR2602592A1 - Utilisation du systeme enzymatique xanthine-oxydase en immuno-analyse, procedes de dosage correspondants et coffrets de reactifs necessaires pour la mise en oeuvre de ces procedes. - Google Patents
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Abstract
L'INVENTION PORTE SUR L'UTILISATION EN IMMUNO-ANALYSE DU SYSTEME ENZYMATIQUE XANTHINE-OXYDASE FOURNISSANT DES ENTITES SUSCEPTIBLES D'ETRE RECONNUES PAR UN REACTIF CHIMILUMINESCENT. LE SUBSTRAT QUI EST ASSOCIE A LA XANTHINE-OXYDASE EST CHOISI PARMI L'HYPOXANTHINE, LA XANTHINE, L'ACETALDEHYDE ET LA PURINE. LE SYSTEME ENZYMATIQUE EST ASSOCIE A UN SYSTEME POTENTIALISATEUR, TEL QU'UN COMPLEXE FER-ACIDE ETHYLENEDIAMINETETRACETIQUE, EVENTUELLEMENT ASSOCIE, LORSQUE LE PRODUIT DE COUPLAGE COMPREND LE REACTIF LUMINESCENT, A DU PERBORATE. APPLICATIONS : DOSAGES IMMUNOLOGIQUES PAR COMPETITION D'UN ANTIGENE OU D'UN HAPTENE OU SELON UN SYSTEME "SANDWICH" D'UN ANTIGENE; DOSAGE DE LA XANTHINE-OXYDASE.
Description
UTILISATION DU SYSTEME ENZYMATIQUE XANTHINE-OXYDASE EN
IMMUNO-ANALYSE, PROCEDES DE DOSAGE CORRESPONDANTS ET
COFFRETS DE REACTIFS NECESSAIRES POUR LA MISE EN OEUVRE DE
CES PROCEDES
La présente invention concerne l'application de la réaction enzymatique xanthine-oxydase [XO] au développement de dosages immunologiques faisant appel au phénomène de chimiluminescence. L'utilisation de la bioluminescence et de la chimiluminescence en immuno-analyse a été étendue à de nombreux analytes (KINGLER W., STRASBURGER C.J., WOOD W.G., Trends in Analytical Chemistry 2, 6, 132, 136, 1983; KRICKA L.J., THORPE G.H.G. Analyst 108, 1274-1296, 1983.) Les dosages par immunochimiluminescence peuvent être classés en deux catégories: (a) Le phénomène quantifiable consiste dans un signal de très courte durée (quelques secondes>, obtenu apres injection instantanée dans le milieu réactionnel d'un réactif déclenchant. Tels sont les cas des dosages 20 utilisant, comme traceur, les dérivés de couplage du luminol (SCHROEDER H. R., et coll: Methods Enzymology 57, 424-445 1978) ou des esters d'acridinium (WEEKS I, WOODHEAD J.S.,dans Analytical Applications of
Bioluminescence and Chemiluminescence, Academic Press, 25 pp 185-188 1984) .
Cette procédure, outre l'inconvénient lié à la brièveté du signal, impose un appareillage d'injection des réactifs dans la chambre de mesure elleméme. Elle apparaît donc peu applicable aux plaques de micro30 titration et nécessite un appareillage relativement
sophistique et coûteux.
(b) Le phénomene quantifiable consiste dans un signal de plus longue durée, mesurable pendant une période appréciable, permettant de répéter éventuellement des 35 mesures et de préparer les échantillons en dehors du luminomètre. Le système d'injection n'est plus requis, ce qui simplifie la conception et la réalisation du luminomètre et permet l'utilisation de plaques de microtitration. Actuellement, une seule procédure permettant d'obtenir un signal de chimiluminescence relativement stable et intense a été décrite. Celle-ci est basée sur l'amplification de la réaction d'oxydation peroxydase dépendante des diacyl hydrazides cycliques par des composés 10 tels que la luciférine de synthèse, les dérives du 6-hydroxybenzothiazole ou des phénols substitués (paraiodophénol> (WHITEHEAD T.P., THORPE G.H.G., CARTER T.J.N.et coll Nature (London) 305-158-159 1983; THORPE G. H. G., KRICKA L. J. et coll, Anal. Biochem. 145, 97, 100, 15 1985; THORPE G.H.G, KRICKA L.J. et coll, Clin. Chem. 31,8
1335-1341 1985>.
Cette méthode donne lieu actuellement au développement du dosage de nombreux analytes. Cependant il faut remarquer que la constance du signal n'est que relative, puisque les mesures ne peuvent être pratiquées que
pendant quelques dizaines de minutes.
Il a maintenant été découvert que le système enzymatique xanthine-oxydase, producteur de radicaux libres oxygénés (anion superoxyde O, radical hydroxyle OH*) et de 25 peroxyde (H202 O eau oxygénée), detectables par chimiluminescence du luminol notamment, permet lorsqu'il est appliqué en immuno-analyse, d'obtenir un signal très stable dans le temps, mesurable pendant des periodes de plusieurs
heures; cette stabilité est très supérieure à celle de 30 toutes les méthodes actuellement connues.
Ce système enzymatique peut à la fois être envisagé dans le cadre d'une procédure immuno-enzymatique proprement dite (utilisation de dérives de couplage de la XO>. Il peut également impliquer l'emploi de derivés de 35 couplage du luminol (ou autres reactifs chimiluminescents>
comme traceurs de l'immuno-essai.
Dans le premier cas,le traceur consisté dans un dérivé de couplage de la XO elle-même avec un antigène ou un
anticorps monoclonal.
L'activité XO est donc fixée, puis détectée, sur une phase solide supportant un anticorps spécifique ou un antigène. - Dans le second cas, le traceur utilisé consiste dans un dérivé de couplage du luminol (ou autre> avec un antigène ou un anticorps monoclonal. Après réaction immunologique, ce dérivé est fixé sur une phase solide,
support d'un anticorps spécifique ou d'un antigène.
Après lavage dudit support, le système XO permet alors
de révéler la présence de ce dérivé de couplage.
Selon la présente invention, on peut également 15 envisager de doser la xanthine-oxydase dans des milieux biologiques. La présente invention a d'abord pour objet l'utilisation, en immuno-analyse, du système enzymatique
xanthine-oxydase fournissant des entités susceptibles d'être 20 reconnues par un réactif chimiluminescent.
Le substrat qui est associé à la xanthine-oxydase dans ce système enzymatique est choisi parmi l'hypoxanthine, la xanthine, l'acétaldéhyde et la purine. On préfère tout
particulièrement l'hypoxanthine.
Conformément à une caractéristique intéressante de la présente invention, ce système enzymatique est associé à un systeme potentialisateur, tel qu'un complexe fer-acide éthylènediaminetétracétique, éventuellement associé à du perborate. La présente invention a également pour objet
differents procédés de dosage.
Le premier consiste en un procédé pour le dosage immunologique par compétition d'un antigène ou d'un haptène, caractérisé par le fait qu'il consiste à: (a) préparer un support solide, tel qu'un tube, pourvu d'un anticorps spécifique dudit antigène ou dudit haptène; (b) préparer un traceur constitué par un dérivé de couplage - ou bien dudit antigène ou dudit haptène et de la xanthine-oxydase; - ou bien dudit antigène ou dudit haptène et d'un réactif chimiluminescent; (c) mettre & incuber l'échantillon renfermant l'antigène ou l'haptène à doser en présence du support solide préparé à l'étape (a) et du traceur préparé à l'étape (b); (d) laver ledit support; (e) ajouter un substrat associé à la xanthineoxydase et, ou bien un réactif chimiluminescent, ou bien de la xanthine oxydase, suivant que le derivé de couplage comprend respectivement de la xanthine-oxydase ou un réactif chimiluminescent; et (f) mesurer la réponse chimiluminescente dudit réactif chimiluminescent et déduire de la mesure ainsi effectuée la concentration recherchée en antigène ou haptène. Le coffret des réactifs nécessaires pour la mise 20 en oeuvre de ce procédé, qui fait égaiement l'objet de la présente invention, est caractérisé par le fait qu'il comprend: - un support solide, tel qu'un tube, pourvu d'un anticorps spécifique de l'antigène ou de l'haptène à 25 doser; - un produit de couplage - ou bien de l'antigène ou de l'haptène à doser et de la xanthine-oxydase; - ou bien de l'antigène ou de l'haptène à doser et 30 d'un réactif chimiluminescent; - un substrat associe à la xanthine-oxydase;et - ou bien de la xanthine oxydase, suivant que le dérivé de couplage comprend respectivement de la xanthineoxydase ou un reactif chimiluminescent. 35 Le second procédé est un procédé pour le dosage immunologique selon un système "sandwich" d'un antigène, caractérisé par le fait qu'il consiste &: (a> préparer un support solide, tel qu'un tube, pourvu d'un anticorps spécifique dudit antigène, (b) mettre & incuber l'échantillon renfermant l'antigène à doser en présence du support solide préparé à l'étape (a); (c) laver ledit support; (d) préparer un traceur constitué par un produit de couplage - ou bien d'un autre anticorps spécifique dudit antigène et de la xanthine-oxydase; - ou bien d'un autre anticorps spécifique dudit 15 antigène et d'un réactif chimiluminescent; (e) aJouter au support préparé à l'étape (c) le traceur préparé à l'étape (d>; ou bien un réactif chimiluminescent ou bien de la xanthine-oxydase, suivant que le derive de couplage comprend respectivement de la xanthine-oxydase ou un réactif chimiluminescentiet un substrat associé à la xanthineoxydase; et (f) mesurer la réponse chimiluminescente dudit réactif chimiluminescent et déduire de la mesure ainsi
effectuée la concentration recherchée en antigene.
Le coffret des réactifs nécessaires pour la mise en oeuvre de ce procédé, qui fait également l'objet de la présente invention, est caractérisé par le fait qu'il comprend: - un support solide, tel qu'un tube, pourvu d'un anticorps spécifique de l'antigène à doser; - un produit de couplage - ou bien d'un autre anticorps spécifique dudit antigène et de la xanthineoxydase; - ou bien d'un autre anticorps spécifique dudit antigène et d'un réactif chimiluminescent; - un substrat associé & la xanthine-oxydase; et - ou bien un réactif chimiluminescent ou bien de la xanthine-oxydase, suivant que le dérivé de couplage comprend respectivement de la xanthineoxydase ou un réactif chimiluminescent. Enfin, l'invention se rapporte à un procédé pour le dosage imnmunologique de la xanthine-oxydase, caractérisé par le fait qu'il consiste à: (a) préparer un support solide, tel qu 'un tube, revêtu d'un 10 anticorps anti-xanthine-oxydase; (b) mettre à incuber l'échantillon renfermant la xanthineoxydase à doser en présence du support solide préparé à l'étape (a); (c> laver ledit support; (d) ajouter au support préparé à l'étape <c) un substrat associé à la xanthine-oxydase et un-réactif chimiluminescent; et (e) mesurer la réponse chimiluminescente dudit réactif chimiluminescent et déduire de la mesure ainsi efffectuée la concentration recherchée en xanthine oxydase. Le coffret des réactifs nécessaires pour la mise en oeuvre de ce procédé, qui fait également l'objet de la présente invention, est caractérisé par le fait qu'il 25 comprend: - un support solide, tel qu'un tube, pourvu d'un anticorps présentant une spécificité anti-xanthineoxydase;
- un substrat associé à la xanthine-oxydase; et 30 - un réactif chimiluminescent.
Le substrat associé & la xanthine-oxydase est tel
que defini ci-dessus.
En outre, conformément à une caractéristique intéressante des procédés selon l'invention, on associe au 35 systeme enzymatique xanthine-oxydase un système
potentialisateur, tel qu'un complexe fer-acide éthylène-
diaminetétracétique, éventuellement associé, lorsque le produit de couplage comprend le réactif chimiluminescent, à du perborate. Les coffrets de réactifs correspondants comportent alors un système potentialisateur du système enzymatique xanthine-oxydase, tel qu'un complexe fer-acide éthylènediaminetétracétique, éventuellement associé, dans le cas des deux premiers dosages mentionnés (par compétition ou selon un système "sandwich") et lorsque le produit de
couplage mis en jeu comprend le réactif chimiluminescent,à 10 du perborate.
On choisit, comme réactif chimiluminescent, le luminol ou la lucigénine; de préférence, on choisit le luminol. Dans ce qui suit, on illustrera, en s'appuyant sur 15 des résultats d'expérience, les avantages et les applications du système enzymatique xanthine-oxydase en immuno-analyse. A - DOSAGE DE LA XO PAR CHIIiU-1MiNESCENCE DU LUXINOL 20
(a) DESCRIPTION DE LA REACTION ENZYXATIQUE
On décrira ci-apres un exemple de procédure optimisée de dosage de l'activité xanthine-oxydase: L'échantillon analysé <50 p1,) dilué dans une solution de véronal sodique 0,1X, contenant de l'albumine bovine (0, 2%> et de l'EDTA disodique (1 mM), est mélangé avec 50 il d'une solution dans l'eau distillée de substrat
hypoxanthine <10 mN) et de luminol (0,5xl0-'M).
La mesure de lumière est alors effectuée devant le photomultiplicateur d'un luminometre <PACKARD Instruments) (Picolite). L'émission des photons est mesuree pendant une durée d'une seconde a la température ambiante. Les résultats obtenus sont exprimes en coups/seconde après soustraction du bruit de fond (coups/seconde correspondant a l'émission de lumière par le milieu en absence de xanthine oxydase). Ce mode opératoire est donc caractérisé par ses extrêmes facilité et rapidité de mise en oeuvre, ainsi que par sa possibilité d'automatisation du comptage. L'intérêt essentiel de cette réaction réside dans
la grande stabilité du signal de chimiluminescence obtenue.
La cinétique de l'oxydation du luminol - xanthineoxydase dépendante pour différentes prises d'essai d'enzyme 10 est représentée sur la figure 1 Légende de la Figure 1 - ordonnées: coups par seconde;
- abcisses: temps (heures).
Les conditions expérimentales sont celles décrites 15 précédemment. Les mesures d'une durée de 1 seconde, échelonnées sur une période de huit heures, démontrent la stabilité du signal. Il faut remarquer que, pour des prises d'essai de xanthine-oxydase inférieures & 1 femtomole (fmole), la stabilisation complète de l'émission est atteinte 10 minutes après le début de la réaction. En revanche, pour les doses supérieures comprises dans l'échelle 10-100 fmoles par prise d'essai, le signal brut augmente progressivement et la stabilisation est obtenue- en
1 heure. En fait, ces variations restent négligeables par 25 rapport & la durée des mesures.
La comparaison de la cinétique de cette réponse chimiluminescente avec celle correspondant aux autres systèmes stables actuellement décrits, démontre l'intérêt de la xanthine-oxydase en immuno-analyse, les mesures pouvant 30 être répétées sans perte de sensibilité pendant une période
de temps très prolongée.
D'autres résultats ont permis de montrer que le signal est utilisable pendant des periodes d'au moins 20 heures. La stabilité de l'émission de photons peut être interprétée en fonction du caractère autocatalytique de la réaction xanthine-oxydase, liée & l'accumulation progressive 9 d'H202 provenant de la dismutation de 02!. Une séquence fait 10
intervenir alors la réaction d'HABER-WEISS, responsable de la formation de radicaux hydroxyle.
Hypoxanthine + 2 0 2 + 2H+ XO Acide urique + 02- + H20
2 02- + 2H+_ H 0 +
2 0 - + 2 H - -_ H20 02
H2 2 + 02 HABER WEISS OH + 2 + OHOH + LH m LH + H2O
LHr + r2et - -a lLHOOLH2représentant le luminol.
<b) APPLICATION AU DOSAGE DE LA TRIIODOTYRONINE Un exemple d'application du système [XO-luminol] à 15 l'immuno-analyse est fourni par le dosage par compétition de
la triiodotyronine (ci-après désignée par l'abréviation T3>.
- Préparation du coniugué T3 XO 20 Le couplage de la T3 <Fluka) avec une préparation de XO (BOEHRINGER> a été effectué selon la méthode de
YAXANOTO, Clinical Chemistry, 27-10 pages 1721-1723, 1981.
La XO est équilibrée en tampon phosphate O,1M 25 pH = 7 par passage sur une colonne de Sephadex G25 (PD 10 Pharmacia) par deux passages successifs. Le rapport des absorbances à 280 nm et 450 nm de la préparation obtenue est
égal à 5,8.
600)1 d'une solution de T3 à 1 mg/ml dans le 30 diméthylformamide <DMF) sont traités par 60 MI d'une solution de SMCC dans le DMF (2 mg/ml), puis 1,2 ml de tampon phosphate sont ajoutés. Le mélange est mis à incuber à 30'C pendant 90 minutes avec une agitation violente au
Vortex toutes les cinq minutes.
La réaction d'activation est bloquée par addition de glycocolle M (120 Ml) . Le couplage proprement dit T3-XO
est effectué en mélangeant 100 gg de XO équilibrée en tampon phosphate (200 pg) avec 150 pl de la solution de T3 activée.
Une incubation de 30 minutes & 30'C est pratiquée, puis la réaction est arrêtée par adjonction de mercapto-éthylamine 0,1X dans le tampon phosphate. Le milieu réactionnel est alors purifié sur une colonne d'Ultrogel AcA 34 <Industrie Biologique Française) avec, comme éluant, le tampon phosphate 0,1M, pH 7, contenant 0,2%5 de sérum albumine bovine (SAB). L'activité 10 enzymatique XO totale est mesurée sur chaque fraction. Les fractions contenant le dérivé de couplage sont localisées après fixation de ce dernier sur des tubes revêtus d'anticorps anti-T3 préparés à l'aide d'IgG obtenues chez le lapin. Apres addition, dans chaque tube revêtu, de 100pl de 15 fraction diluée dans le tampon véronal 0,1M, pH = 8,6, contenant 0,1% de SAB, une incubation d'une heure à 37' est pratiquée. Les tubes sont lavés à l'eau distillée, puis l'activité XO immobilisée est recherchée par addition de 100 pl de tampDon véronal 0,5g, pH 10,2 contenant 0,2% de SAB, et 20 de 100 pl d'une solution d'hypoxanthine <10 m1> et de
luminol (0,5x10-4M).
La figure 2 montre les résultats de la fixation sur la phase solide anti T3 après passage du milieu de couplage sur
colonne d'Ultrogel AcA34. Un pic immunoréactif peut être 25 localisé et les fractions correspondantes sont rassemblées.
Légende de la Figure 2: Activité XO totale 0 Activité XO fixée sur la phase solide anti Tes En ordonnées = coups par seconde
En abscisses = humeros des fractions.
- Dosage immunologique de la T3 par compétition Le traceur ainsi obtenu a été utilisé pour réaliser un
dosage immunologique de T3.
Légende de la Figure 3 À Comptage de 1 seconde effectuée 15 minutes après le début de la réaction "_-___ Comptage de 1 seconde effectuée 16 heures après le début de la réaction, 10 - En abscisses = pmoles de T3 (échelle logarithmique)
3 -2
- En ordonnées = coups par seconde x 10.
La figure 3 montre la courbe d'étalonnage correspondante. Le dosage met en oeuvre les tubes revêtus d'IgC 15 anti T3 précédemment décrits. Le milieu d'incubation consiste en des doses variables de T3 comprises entre 10 et 0,1 pmoles sous un volume de 100)l en présence du traceur
(100 jal).
Toutes les dilutions sont effectuées en tampon 20 véronal 0,iM, pH 8,6, contenant 0,1% de SAB. La durée d'incubation à 37' est de 1 heure. La détermination de l'activité XO immobilisée est effectuée comme précédemment décrit. On remarquera qu'il existe une excellente 25 superposition entre les mesures de chimiluminescence effectuées 15 minutes et 16 heures apres le début de la réaction enzymatique. On peut donc conclure en la stabilité de la réaction de chimiluminescence XO dependante aussi bien en phase solide qu'en phase liquide. 30 (c) CARACTERISTIQUES GENERALES Outre la stabilité du signal, les caracteristiques générales de la réaction XO sont les suivantes; 35 - Influence de la nolarité du milieu La figure 4 montre les courbes de réponse chimiluminescentes obtenues pour des concentrations variables de véronal comprises entre 0,025 M et 0,25M. Il apparait que les réponses sont d'autant plus élevées
que la molarité est forte.
Légende de la Figure 4 Concentration de véronal sodique = ó 0,025M y0, 05X 0,15M
C----D 0,25E
Coordonnées logarithmiques: - En abscisses = prise d'essai de XO
- En ordonnées = coups par minute.
Une concentration finale en véronal de 0,25M a en
conséquence été retenue pour la procédure de routine.
- Influence de la nature du composé chimiluminescent 20 Le luminol ne constitue pas la seule substance dont l'oxydation conduit à l'émission de photons dans le système XO. Cette propriété est également partagée par
la lucigénine (N-méthyl acridinium>.
Une expérience préliminaire a permis de déterminer les concentrations respectives dé lucigénine [10-5 M et de -4 luminol [0,5xlO-4M] donnant la réponse chimiluminescente la plus élevée pour une prise d'essai de XO de 23 ng <(77 femtomoles). $O La figure 5 montre les courbes de réponses
chimiluminescentes obtenues avec les deux produits.
Légende de la Figure 5 A _ f.avec le luminol 0,25 x 10 4M 0 D avec la lucigéniẻ 0,5 x 10-5M Il apparaît que l'utilisation du luminol conduit à une sensibilité très supérieure (< à 0,3 femtomoles> à celle obtenue avec la lucigénine. Ce fait est probablement lié à la réactivité particulière du luminol vis-à-vis des radicaux 5 oxygénés produits par la réaàtion XO (O21, H202, OH#), alors
que la lucigénine est plus spécifique de l'anion superoxyde.
Dans ce cas, l'information apportée par l'eau oxygénée et les radicaux hydroxyle n'est pas prise en compte. L'utilisation du luminol à la concentration finale de 0,5xlO-1K a donc été retenue pour la procédure de dosage de
la xanthine-oxydase en routine.
- Influence de la nature du substrat 15 La figure 6 montre la comparaison des courbes-.. d'émission de lumière en fonction du temps lors de
l'oxydation du luminol xanthine-oxydase dépendante, avec deux substrats différents = hypoxanthine et acétaldéhyde 20 avec deux doses différentes de xanthine-oxydase.
Légende de la Figure 6 ------ = Hypoxanthine 5mX = Acétaldéhyde 50imn = 80 femtomoles X 0 = 0,8 femtomole X 0 Il apparaît que la stabilité du signal obtenu avec l'hypoxanthine est beaucoup plus marquée que celle correspondant à l'acétaldéhyde. Dans ce dernier cas en
effet, la décroissance intervient après un délai de 20 30 minutes suivant l'initiation de la réaction.
Après 150 minutes, l'intensité du signal représente seulement 4% de la réponse maximale. Dans le cas de l'hypoxanthine, aucune décroissance n'est observée à ce moment-là. Ceci justifie l'utilisation en routine de ce 35 substrat pour obtenir une émission de photons à la fois
stable et élevée.
- Potentialisation de l'oxydation du luminol XO dépendante par le complexe FER-EDTA Il est généralement admis (WINTERBOURN CC. et coll. - Archives of Biochemistry et Biophysics 244, 1; 275 34 - 1986) que le complexe fer-EDTA constitue un catalyseur efficace de la réaction de HABER WEISS selon le mécanisme suivant:ascenseur Fe <EDTA) + 02 Fe2+ (EDTA) + O
2 3+ 2
Fe (EDTA) + H202 Fe <EDTA) + OH- + OH La figure 7 montre les courbes de chimiluminescence mesurées 15 minutes après le déclenchement de la reaction par XO et obtenues en présence ou en absence de complexe Fer EDTA. Légende de la Figure 7 0= EDTA-Fe 5pM A y= EDTA-Fe 0.M Le complexe précité est préparé par mélange à parties égales de solution de Cl 2Fe (1 mX) et d'EDTA Na2
(100 me).
Après un laps de temps minimum de 30 minutes, cette
solution est dilué au 1/100 dans le mélange hypoxanthineluminol.
La concentration finale du complexe dans le milieu
d'incubation de la réaction XO est donc de 5 >.
Le complexe EDTA-fer augmente d'un facteur 10 la réponse chimiluminescente liée à l'oxydation du luminol induite par la XO. L'utilisation du complexe permet donc de
diminuer le seuil de détection de l'activité XO.
En outre, la figure 8 montre que le signal assure en 30 présence de ce complexe est légèrement moins stable que celui obtenu en son absence. Cependant, 7 h 30 apres l'initiation de la réaction, l'émission de photons obtenue en présence de Fe-EDTA demeure beaucoup plus élevée que celle observée en son absence. 35 Légende de la Figure 8 Cinétiques de l'oxydation du luminol xanthine-oxydase dépendante en présence _ ou en l'absence /_ de complexe EDTA Fe <5pM), pour des doses de xanthine-oxydase
de 0,8 et 80 femtomoles.
Ces propriétés indiquent que le complexe fer-EDTA constitue un bon amplificateur de la réaction étudiée et que son utilisation peut être proposée dans la procédure de routine.
B - DOSAGE DU LUMINOL UTILISANT LE SYSTEME HYPOXANTHINEXANTHINE OXYDASE.
La détection des dérivés du luminol utilisés comme traceurs en immunoanalyse est classiquement basée sur la mise en oeuvre du système H202-microperoxydase en milieu alcalin. Le signal obtenu se caractérise par sa brièveté
<quelques secondes).
En fait, le système hypoxanthine XO peut être adapté au
dosage du luminol et, par conséquent, de ses dérivés.
La figure 9 montre les courbes de variations de chimiluminescence en fonction de la concentration en luminol
obtenu dans diverses conditions expérimentales.
Leégende de la Figure 9 > y XO 2,3>g/ml $ O XO 2,3>g/ml; perborate 1 mM XO 2,3pg/ml; perborate 1 mM EDTA-Fe 125uM XO 0,23ig/ml; perborate lmM EDTA-Fe 125pM. Le milieu d'incubation (100 al) consiste dans l'hypoxanthine <5 jM), la XO (2,3 et 0,23 ug/ml> l'EDTA Na2 (0,5 mM) et le luminol à concentration variable. Ces composés sont en solution dans le tampon véronal (0,25 M, pH ,2>. Il apparaît ainsi que ia sensibilité (10 -ioles) 35 de luminol par prise d'essai est comparable à celle couramment décrite lorsque le système H202 peroxydase est 1O mis en jeu. De plus, l'adjonction de perborate <(concentration finale lmn) dans le milieu réactionnel, entraîne à la fois une augmentation de l'intensité du signal et de la sensibilité. Cet effet d'amplification est encore plus marqué lorsque le milieu d'incubation contient à la fois du perborate de sodium (1 m{> et un complexe EDTA-Fe
(concentration finale (125 microX).
Enfin, on remarquera que la stabilité du signal évoque à l'occasion du dosage de la XO est également retrouvée lorsque le luminol, et donc ses dérivés, sont mesurés (resultats non présentés). Cette stabilité est remarquable et pour des doses très basses de dérivés
(10- 13M >.
Claims (10)
1 - Utilisation en immuno-analyse du système enzymatique xanthine-oxydase fournissant des entités susceptibles d'être reconnues par un réactif chimiluminescent. 2 - Utilisation selon la revendication 1, caractérisée par le fait que le substrat qui est associé à la xanthine-oxydase est choisi parmi l'hypoxanthine, la
xanthine, l'acétaldéhyde et la purine.
3 - Utilisation selon la revendication 2, caractérisée par le fait que le substrat associé à la
xanthine-oxydase est l'hypoxanthine.
4 - Utilisation selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisée par le fait que le système enzymatique est 15 associé à un système potentialisateur, tel qu'un complexe
fer-acide éthylènediaminetétracétique, éventuellement
associé à du perborate.
- Procéde pour le dosage immunologique par compétition d'un antigène ou d'un haptène, caractérisé par 20 le fait qu'il consiste à: (a> préparer un support solide, tel qu'un tube, pourvu d'un anticorps spécifique dudit antigène ou dudit haptène; (b> préparer un traceur constitue par un dérivé de couplage - ou bien dudit antigène ou dudit haptène et de la 25 xanthine-oxydase; - ou bien dudit antigène ou dudit haptène et d'un réactif chimiluminescent; (c) mettre à incuber l'échantillon renfermant l'antigène ou l'haptène à doser en présence du support solide prépare 30 à l'étape (a> et du traceur préparé à l'étape (b); (d) laver ledit support; (e) ajouter un substrat associé à la xanthine-oxydase et, ou bien un reactif chimiluminescent, ou bien de la xanthine oxydase, suivant que le dérive de couplage 35 comprend respectivement de la xanthine- oxydase ou un réactif chimiluminescent; et <f> mesurer la réponse chimiluminescente dudit réactif chimiluminescent et déduire de la mesure ainsi
effectuée la concentration recherchée en antigène ouhaptène.
6 - Procédé pour le dosage inmmunologique selon un système "sandwich" d'un antigène, caractérisé par le fait qu'il consiste à: (a> préparer un support solide, tel qu'un tube, pourvu d'un anticorps spécifique dudit antigène, <b) mettre à incuber l'échantillon renfermant l'antigène à doser en présence du support solide préparé à l'étape <a); <c) laver ledit support; <d) préparer un traceur constitué par un. produit de 15 couplage - ou bien d'un autre anticorps spécifique dudit antigène et de la xanthine-oxydase; - ou bien d'un autre anticorps spécifique dudit antigène et d'un réactif chimiluminescent; (e) ajouter au support préparé à l'étape <c) le traceur préparé à l'étape (d); ou bien un réactif chimiluminescent ou bien de la xanthine-oxydase, suivant que le dérivé de couplage comprend respectivement de la xanthine-oxydase ou un réactif chimiluminescent;et un substrat associé à la xanthineoxydase; et (f) mésurer la réponse chimiluminescente dudit réactif chimiluminescent et déduire de la mesure ainsi effectuée la concentration recherchée en antigène. 30 7 - Procédé pour le dosage immunologique de la xanthine- oxydase, caractérisé par le fait qu'il consiste a: (a) préparer un support solide, tel qu'un tube, revêtu d'un anticorps anti-xanthine- oxydase; (b) mettre à incuber l'échantillon renfermant la xanthine35 oxydase à doser en présence du support' solide prépare à l'étape (a); <c> laver ledit support; <d> ajouter au support préparé à l'étape <c> un substrat associé à la xanthine-oxydase et un réactif chimiluminescent; et <e) mesurer la réponse chimiluminescente dudit réactif chimiluminescent et déduire de la mesure ainsi
efffectuée la concentration recherchée en xanthineoxydase.
8 - Procédé selon l'une des revendications 5 à 7, 10 caractérisé par le fait que l'on choisit le substrat associé
à la xanthine-oxydase parmi l'hypoxanthine, la xanthine,
l'acétaldéhyde et la purine.
9 - Procédé selon la revendication 8, caractérisé par le fait que l'on choisit l'hypoxanthine comme substrat
associé à la xanthine-oxydase.
- Procédé selon l'une des revendications 5 à 9, caractérisé par le fait que l'on associe au système
enzymatique xanthine-oxydase un système potentialisateur, tel qu'un complexe fer-acide éthylènediaminetétracétique, 20 éventuellement associé, lorsque le produit de couplage
comprend le réactif chimiluminescent, à du perborate.
11 - Procédé selon l'une des revendications 5 à 10, caractérisé par le fait que l'on choisit, comme réactif
chimiluminescent, le luminol ou la lucigénine.
12 - Coffret des réactifs nécessaires pour la mise en oeuvre du procédé tel que défini à la revendication 5, caractérisé par le fait qu'il comprend: - un support solide, tel qu'un tube, pourvu d'un anticorps spécifique de l'antigène ou de l'haptène à 30 doser; - un produit de couplage ou bien de l'antigène ou de l'haptène à doser et de la xanthineoxydase; ou bien de l'antigène ou de l'haptène à doser et 35 d'un réactif chimiluminescent; - un substrat associé à la xanthine-oxydase; - ou bien de la xanthine oxydase, suivant que le dérivé de couplage comprend respectivement de la xanthineoxydase ou un réactif chimiluminescent; et éventuellement un système potentialisateur du système 5 enzymatique xanthine-oxydase, tel qu'un complexe feracide éthylènediaminetétracétique éventuellement associé, lorsque le produit de couplage comprend le
réactif chimiluminescent, à du perborate.
13 - Coffret des réactifs nécessaires pour la mise 10 en oeuvre du procédé tel que défini à la revendication 6, caractérisé par le fait qu'il comprend: - un support solide,.tel qu'un tube, pourvu d'un anticorps spécifique de l'antigène à doser; - un produit de couplage - ou bien d'un autre anticorps spécifique dudit antigène et de la xanthine- oxydase; - ou bien d'un autre anticorps spécifique dudit antigène et d'un réactif chimiluminescent; - un substrat associé à la xanthine-oxydase; - - ou bien un réactif chimiluminescent ou bien de la xanthine-oxydase, suivant que le dérivé de couplage comprend respectivement de la xanthine- oxydase ou un réactif chimiluminescent;et - éventuellement un système potentialisateur du système 25 enzymatique xanthine-oxydase, tel qu'un complexe feracide éthylènediaminetétracétique éventuellement associé, lorsque le produit de couplage comprend le
réactif chimiluminescent, à du perborate.
14 - Coffret des réactifs nécessaires pour la mise 30 en oeuvre du procédé tel que défini à la revendication 7, carctérisé par le fait qu'il comprend: - un support solide, tel qu'un tube, pourvu d'un anticorps présentant une spécificité anti-xanthineoxydase; - un substrat associé à la xanthine-oxydase; - un réactif chimiluminescent; et
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- éventuellement un système potentialisateur du système
enzymatique xanthine-oxydase, tel qu'un complexe feracide éthylènediaminetétracétique.
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