JP2651060B2 - 同時較正不均質イムノアツセイ用装置 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】本発明は、被検体を含有する疑いのある試
料中の該被検体を定量するための装置及び該被検体の定
量法に関する。

【０００２】試料中の被検体の存在を検知し且つ測定す
るため新規で簡単且つ迅速な技術を開発することには、
連続して興味がもたれている。この被検体は広い種類の
物質、例えば薬剤、天然産の生理学的化合物、汚染物、
化学薬品、不純物などのいずれかである。多くの場合、
特にある種の生理学的に活性な物質の場合には、測定の
速度が重要である。他の状態においては、簡便さが主に
考慮される。

【０００３】広い用途が発見されている１つの簡便で迅
速な技法は、一般に試料中に浸し、続いて元々の試料中
の被検体の量に基づく信号を発しせしめることのできる
固体棒又はフイルムを含んでなる「浸漬棒(dip stic
k)」法である。固体表面に結合した化合物の信号、例え
ば吸光、反射又は蛍光を測定するには多くの装置があ
る。また棒浸漬法は、取り扱い、移動、分離などが簡便
である。

【０００４】そのような技法は、簡便であるけれど、現
像時間、温度、干渉因子、試薬安定性及び観測される信
号の量に影響しうる他の条件に対して非常に敏感であ
る。観測された信号を標準物と比較する定量分析の場合
には、試験条件を注意深く制御して標準物の条件を適合
させることが必要である。しかしながら、そのような注
意深い制御は、浸漬棒法の簡便さを減じ、分析を行なう
時間及び費用を増加させ、結果の不安定性を増巾する。
更に試料中の干渉因子の存在及び試薬の不安定性は最大
の注意を払ってさえも克服することが困難である。

【０００５】それ故に、試料中の被検体の正確な検知を
与え且つ現像時間、温度、試料中の干渉因子、試薬の安
定性などに対して非常に敏感でない新規な分析法を開発
することが望ましい。

【０００６】種々の固定化試薬及び異なる種類の試験片
を用いることと関連する特許は、米国特許第３９９３４
５１号、第４０３８４８５号、第４０４６５１４号、第
４１２９４１７号、第４１３３６３９号及び第４１６０
００８号；及び独国公開特許第２６３６２４４号を含
む。結合した及び結合してない抗原の分離を含む種々の
方法を開示する特許は、米国特許第Ｒｅ．２９１６９
号、第３９４９０６４号、第３９８４５３３号、第３９
８５８６７号、第４０２０１５１号、第４０３９６５２
号、第４０６７９５９号、第４１０８９７２号、第４１
４５４０６号及び第４１６８１４６号を含む。

【０００７】本発明では、被検体を含有する疑いのある
試料中の被検体の存在を定量するための装置及び方法が
提供される。この方法及び装置は、測定及び較正表面と
して言及される第１及び第２表面を含む。この各々は望
ましくは少くとも１つの触媒及び１つの基質を有する信
号発生系を含む。双方の系は実質的に同一であり且つ信
号発生系の少くとも１つの共通員を含む。

【０００８】測定表面は特異的に結合する対複合体の生
成手段による共役体(conjugate)の表面への結合を含
み、一方共役体は特異的結合対の１員に結合する信号発
生系の員（「sps 員」）を含んでなる。表面に結合す
る共役体の量は分析媒体中の被検体の量に関係する。

【０００９】較正表面は、共有結合的に又は非共有結合
的に、直接に又は特定的結合対複合体の生成を介して表
面に結合するsps員を有する。この場合、特定的結合対
は測定表面の結合対と異なる。

【００１０】各表面における信号発生化合物の量を比較
すれば、被検体の量が較正表面から発生する信号でしめ
される予じめ決めた量より多いか、少ないかを決定する
ことができる。

【００１１】本発明によれば、少くとも２つの異なる表
面を液体分析媒体中へ一緒に導入することによつて被検
体を含有する疑いのある試料中の被検体を定量するため
の方法と装置が提供される。この時１つの表面は測定表
面と呼ばれ、他の表面は較正表面として言及される。分
析は望ましくは少くとも１つの触媒、普通酵素、及び少
くとも１つの基質を有する信号発生系の使用を含む。

【００１２】信号を増巾させるためには、被検体のその
同族結合対員への各結合事象（ｅｖｅｎｔ）に対して複
数の信号発生事象の存在することが望ましい。この複数
は動的及び静的系の結果として存在していてよい。動的
系では、触媒は普通酵素が使用され、信号発生系は少く
とも１つの基質、普通補酵素を含む。この場合、酵素又
は基質のいずれかは特異的結合対員に結合していてよ
い。基質がサイクルできない場合、普通複数の基質分子
が中心（ｈｕｂ）に結合して単一の結合事象に関して複
数の基質分子を提供するであろう。他に、検知しうる信
号を中心に与える非触媒的分子を複数で結合させること
ができる。そのような分子は普通分光学的に検知できる
であろう。光を吸収する染料はいくつかの場合に有用で
あるかもしれないけれど、蛍光及び化学発光を、通常存
在する装置でより正確に測定しうる信号を発生するもの
として使用する。

【００１３】sps員の共役体及び特異的結合対複合体を
通して測定表面に結合する特異的結合対員として存在す
るsps員の量は、媒体中に存在する被検体の量に関係す
る。分析中に較正表面に結合するsps員の量は少くとも
１つ、普通１つの予じめ決められた被検体の濃度に対し
て、有利な範囲の信号量を与えるようなものであろう。
較正表面におけるsps員は、試料を含む分析溶液へ浸す
前に或いは分析中に共有又は非共有結合の結果として存
在しうる。但し非触媒的sps員の場合には、結合は非共
有的であり、引き続いて分析溶液へ浸される。

【００１４】本方法及び装置は、各個々の試験を行なっ
ている際に、分析系の較正を同時に行なう。信号発生系
は、検知しうる信号の２つの表面での発生と関連し、観
測される信号に影響する多くの条件に関して同一の条件
に供される。従つて検知しうる信号の、条件の変化、試
料の内因的物質などによる変動は、２つの表面での検知
しうる信号発生に平行的に影響し、較正表面の信号量は
測定表面の信号量の評価に対する標準として役立ちう
る。

【００１５】本発明は、それぞれ検知しうる生成物を生
成する信号発生系を用いる２つの表面を使用することに
依存する。測定表面に結合するsps員の量は媒体中の被
検体の量に関係する。表面で信号を発生する検知しうる
生成物の生成は測定表面に対するsps員の量に直接関係
するであろう。対照的に較正表面に対して結合するsps
員の量は媒体中の被検体の量にだけ依存しないであろう
し、普通それに無関係である。較正表面に対して存在す
るsps員の量は、較正表面に予じめ結合してない時でさ
え、普通分析媒体中の被検体の量に無関係であるあろ
う。

【００１６】sps員分子が１度表面に結合すると、２つ
の表面での信号発生系は同一の環境に供され、従つて較
正表面での検知しうる信号の発生は媒体中の被検体の濃
度の定性的又は定量的分析に対する基準として使用する
ことができる。多くの部分に対し、肉眼での分析の場
合、較正表面は特異的濃度を分析するために使用されな
く、むしろ意図する被検体が予じめ決められた量より多
い量で存在するか又は存在しないかを決定するために使
用されよう。

【００１７】分析を行なう場合には、多くの測定手順及
び組合せが使用でき、２つの表面に結合する物質を変化
させることができる。２つの表面と関係して、２つより
も多い表面を使用する、即ち測定及び較正表面の１方又
は両方が装置中に複数で存在していてもよいということ
を理解すべきである。

【００１８】較正表面は非触媒的系を除いてsps員が表
面へ最初に結合することを含み、この時予じめ決められ
た量の触媒が表面に結合する。他に、特異的結合対員は
sps員に結合する較正表面に使用でき或いはsps員に結合
した特異的結合対員に使用しうる。そのような特異的結
合対員は、被検体の、被検体に同族の特異的結合対員へ
の結合に含まれる決定点(determinant site)以外の決定
点に結合する。

【００１９】測定及び較正表面は、いずれかの簡便な材
料から製造でき、いずれか簡便な構造を有することがで
きる。但しその表面は分析中にその構造保全性を実質的
に保持していることが前提である。２つの表面は、両表
面におけるｓｐｓ員が実質的に同一の態様で環境条件に
応答することを補償するように同一の環境条件に供され
るように、通常並置される。

【００２０】ある被検体又はある状態に即用しうる種々
の信号発生系が使用できる。各々の場合、信号発生系は
検知しうる信号を与えうる少くとも１つの機能体、望ま
しくは少くとも１つの触媒、普通少くとも１つの酵素、
及び触媒spsとの少くとも１つの基質を含有するであろ
う。この場合、sps員は特異的結合対員に結合して少く
とも測定表面に結合する共役体を生成するであろうし、
測定表面及び較正表面の双方に結合していてもよい。

【００２１】２つの表面を含む装置は、被検体及び共役
体が測定表面に且つ適当としては較正表面に結合する機
会を有していた１つ又はそれ以上の溶液と一緒に接触せ
しめられよう。触媒系の場合、必要に応じて２つの表面
は信号発生系に対して必要な基質及び共因子を有する試
薬溶液中へ導入される。しかしながらある状態において
は、例えば２つの触媒を用いる場合には、信号発生系の
すべてを、単一の分析媒体中において試料と一緒に組合
せることができる。予じめ決めた時間の後、表面を現像
溶液から取り出し、測定表面及び較正表面上の検知しう
る信号を比較する。

【００２２】今や本発明を更に詳細に記述しよう。しか
しながら、本発明を詳細に記述する前に、多くの術語を
定義する。

【００２３】定 義 被検体−配位体であつてよいモノ−又はポリ−エピトー
プ性の（ｅｐｉｔｏｐｉｃ）、普通、抗原又はハプテン
性である測定すべき化合物又は組成物。単一化合物又は
複数の化合物は少くとも１つの共通のエピトピツク点
（エピトープ部位）又は決定点（決定基部位）或いは受
体を共有する。

【００２４】特異的結合対（「ｍｉｐ」）−分子の一方
が他の分子の特別な空間的及び極性組織に特異的に結合
する領域を表面又は空洞中に有する２つの異なった分
子。特異的結合対の各員は配位体及び受体（抗配位体）
として言及される。これらは普通免疫学的対の各員であ
るが、他の特異的結合対例えばビオチン−アビジン、ホ
ルモン−ホルモン受体などは免疫学的対ではない。同族
（または同類）体の又は相補的物質は配位体及び受体で
あり、一方同種の物質はある状態において区別された、
例えば標識をつけた配位体又は受体のいずれかである。

【００２５】配位体−受体が天然に存在する又は製造で
きる有機化合物。

【００２６】受体（抗配位体）−分子の特別な空間及び
極性組織、即ちエピトピツク点又は決定点を認識しうる
化合物又は組成物。受体の例は天然に存在する受体例え
ばチロキシを結合するグロブリン、抗体、酵素、Ｆabフ
ラグメント、レクチン、核酸などを含む。

【００２７】配位体同族体−受体に対して同族体配位体
と競合することのできる修飾された配位体。この修飾は
配位体同族体を他の分子に結合するための手段を提供す
る。配位体同族体は普通１つより多い水素を、配位体同
族体を中心又は標識に連結する結合で置換することによ
つて配位体と異なるであろうが、これを必ずしも必要と
しない。

【００２８】ポリ（配位体同族体）−普通中心核に対し
て一緒に共有結合する複数の配位体又は配位体同族体。
中心核は普通複数の官能基例えばヒドロキシ、アミノ、
メルカプト、エチレン基などを結合点として有する多官
能性の、通常重合体の物質である。この中心核は普通水
溶性又は少くとも分散性であり、普通少くとも約３５０
００ダルトンであり、一般に約６０００００ダルトンを
越えないであろう。中心核の例は、多糖類、ポリペプチ
ド、例えば蛋白質、核酸、イオン交換樹脂などを含む。

【００２９】表面−測定及び較正表面は、それぞれ非分
散性であり、普通共通の支持体上に存在して少くとも約
５０μｍ²、一般にそれ以上、しばしば少くとも約１m
m²、特に約０.５cm²以下の表面積が存在し、且つ水に不
溶であつて、所望の信号量を与えるmip及び検知しうる
信号発生化合物の結合にとつて必要な性質を提供するい
ずれかの物質であつてよい。望ましくは表面はゼラチン
性、透過性、吸湿性、多孔性であり、或いは一般に全容
積と比較して実質的な空隙容量を有するチヤンネル又は
同等物であつてよい粗い又は不規則な構造を有するであ
ろう。検知しうる信号発生化合物の性質に依存して、表
面は吸収性又は非吸収性であり、好ましくは弱い吸収性
又は非吸収性である。表面は透明又は不透明であり、単
一の物質又は複数の物質、混合物又は積層物であつてよ
い。多種類の物質及び形態が使用できる。表面は分析の
条件下にその全一性を実質的に保持することができ、従
つて表面に結合する物質は表面に拘束されたままで、溶
液中へ拡散しない。測定及び較正表面の双方の下地の構
造は実質的に同一であることが望ましい。

【００３０】触媒−結合−mip−mipに共役した触媒、普
通酵素。触媒は信号発生系の１員であり、mipは特別な
工程順序に応じて測定表面に結合するように選択され
る。

【００３１】信号発生系（「sps」）−信号発生系は触
媒又は非触媒的、好ましくは触媒的であり、更に好まし
くは酵素触媒を有しうる；望ましくは、一方の酵素の生
成物が他の酵素の基質である２つの酵素が使用される；
更に触媒的信号発生系には、少くとも１つの基質、適当
なものとして補酵素が包含されよう。信号発生系は、媒
体中に存在する被検定の量に関連した検知しうるシグナ
ルを測定表面で発し、一方較正表面において少くとも１
つの配位体−受体対、例えば配位体及び天然受体又は抗
体、酵素及び基質又は酵素を含む。信号発生系は、全体
で又は部分的に、表面に結合し且つ検知しうる信号を発
する「信号発生化合物」によつて検知しうる信号を較正
表面で発する。較正表面における検知しうる信号の量は
被検体の量に関係なく、少くとも１つの因子に依存す
る。信号発生系に包含されうる他の物質は、少くとも２
つの酵素が使用される場合蛍光体に対する光、化学発光
に対する反応物及び中間体生成物に対する捕捉剤であ
る。

【００３２】簡略化して、信号発生系の１員は「ｓｐｓ
員」として言及されるであろう。ｓｐｓ員は基質という
術語が補酵素を含む場合、蛍光体、化学発光体、酵素又
は基質であつてよい。

【００３３】方 法 本分析は水性域又は媒体中で行なわれる。但し最終分析
媒体は、反応物又は反応物の組合せ物の予じめの各々の
添加及び培養、表面の水性媒体からの除去及び１つ又は
それ以上の反応物を有する異なる水性媒体への移行を含
む予じめの分離、或いはこれらの組合せ物の結果のもの
であつてよい。本方法は結合していない標識した共役体
を、１方又は双方の表面にmip複合体を通して結合した
ものから分離する必要がないけれど、多くの工程におい
ては、結合してない触媒が実質的に存在しない現像剤溶
液が使用されるであろう。分析に含まれる種々の媒体
は、測定及び較正「表面」を限定する液相及び固相から
なる。

【００３４】分析を行なう場合には、表面を水性媒体中
において試料と、信号発生系と及び補助物質と、同時に
又は段階的に接触させて表面と関連した検知しうる信号
を得る。測定表面での検知しうる信号はその表面に結合
した標識された共役体の量に関連し、これが試料中の被
検体の量に相当する。信号発生系の性質及び所望の信号
の検知法に依存して、表面を分析媒体中で読むことがで
き、或いは分析媒体から分離して読むことができる。

【００３５】分析を行なう場合には、普通水性媒体が使
用されよう。他の極性溶媒、普通アルコール、エーテル
などを含めて炭素数１〜６、更に普通１〜４の酸素化有
機溶媒も含有せしめうる。普通これらの共溶媒は約４０
重量％以下、更に約２０重量％以下で存在するであろ
う。

【００３６】媒体に対するｐＨは普通約４〜１１、更に
普通には約５〜１０、好ましくは約６.５〜９.５の範囲
にあるであろう。ｐＨは信号発生系を最適化しつつ、受
体による特異的結合のかなりの量を維持しうるように選
択される。いくつかの場合にはこれらの２つの考慮すべ
き点の間で妥協が行なわれよう。所望のｐＨを達成し、
そのｐＨを分析中に維持するために種々の緩衝剤が使用
できる。緩衝剤の例はホウ酸塩、燐酸塩、炭酸塩、トリ
ス、バルビタルなどを含む。用いる特別な緩衝剤は本発
明にとつて厳密でないが、個々の分析においてある緩衝
剤は他のものより好適なこともある。

【００３７】分析を行なうためには、適度な温度が通常
使用される。測定期間中の一定温度は一般に必要でない
が、急速で大きい変動は望ましくない。分析の温度は一
般に約１０〜５０℃、更に普通には約１５〜４５℃であ
る。

【００３８】分析しうる被検体の濃度は一般に約１０^-4
〜１０^-15Ｍ、更に普通には約１０^-6〜１０^-13Ｍにある
であろう。分析が定性的、半定量的又は定量的であるか
どうかに依存して、用いる検知方法及び問題の被検体の
濃度は通常他の試薬の濃度を決定するであろう。

【００３９】種々の試薬の濃度は、用いる工程手順、被
検体の性質、表面に結合したmip及び触媒に結合したmi
p、要求される分析感度などに依存して広く変化する。
いくつかの場合にはmipの一方及び他方を大過剰で使用
し、一方他の工程では分析の感度をmipの比における変
化に呼応させるであろう。

【００４０】本発明の較正された分析を行なう場合、測
定及び較正表面の双方は試料及び信号発生系と同時に接
触させることが必要である。また両表面は、媒体中の局
所的変化に基因するかも知れない相違を最小にするため
に互いに近くに位置させることが望ましい。便宜上、こ
れは両表面を共通の棒又は支持体上に配置させることに
よつて達成しうる。しかしながら、本発明の方法を実施
する場合、表面を共通の支持体上に配置することが必要
ではなくて、表面を信号発生系の種々の成分中に浸し、
これを同時に且つ同一の長さの時間で取りだすというこ
とだけが必要である。さもなければ表面は分析の性能に
悪影響を及ぼさずに独立に取り扱つてもよい。

【００４１】表面に対する共通の支持体は、従来法の棒
浸漬で使用される如き棒又はプラスチツクフイルムが簡
便である。そのような浸漬する棒の正確な性質及び寸法
は厳密でなく、分析系の他の因子、代表的には種々の試
薬容器の寸法と適合するように選択される。両表面は長
い浸漬棒の１端に位置し、それを比較的少量の、典型的
には１００μ１〜２mlの試料中に容易に浸すことのでき
ることが望ましい。表面を互いに隣つて位置させれば、
最終決定を行なうための表面の肉眼による比較を容易に
する。表面は垂直に又は水平に位置していてよい。

【００４２】すでに示したように、一方又は双方の、複
数の測定表面及び複数の較正表面を含めて２つより多い
表面を使用することができる。例えば、複数の被検体を
同時に分析することができ及び／又は複数の較正表面
を、異なる被検体に対する測定表面の各々と関連した異
なる較正表面或いは更に定量的結果を与えるために配置
してもよい。

【００４３】１つ又はそれ以上の溶液を用いる種々の工
程手順が用いられる。溶液との接触は撹拌又は接触を含
む。保温工程も含むが、これは一般に約０.５分〜１時
間、更に普通には約２分〜３０分間で変わりうる。

【００４４】工程手順は、信号発生系並びに被検体の性
質、及び経済性、効率及び精度の考慮と共に変化するで
あろう。信号発生系の試薬は別々の溶液として与えても
よく或いは溶解して非共役的に表面に結合して試料溶液
中へ拡散させてもよい。

【００４５】信号発生系の試薬を別々に与える場合に
は、試薬のすべてを試料と一緒にすることができ：或い
は１つ又は複数のsps員を試料と一緒にし、次いで信号
発生系の残りの員を含む第２の溶液と一緒にしてもよ
い。例えば、酵素−標識−mipは試料溶液と一緒にする
ことができる。このとき基質及びいずれかの補酵素は試
料溶液及び現像剤溶液として言及される第２の溶液或い
は第２の溶液として添加されるすべての残りのsps員の
間に分布する。他にsps員は非共役的に溶解して表面に
結合し、試料溶液との接触時に試料溶液中へ急速に溶解
しうる。

【００４６】複数の溶液を用いる場合には、表面を溶液
から溶液へ移行させるであろう。普通中間の洗浄工程は
偶発的な特異的結合を除去するために必要とされないで
あろう。 本発明の方法及び系は検知しうる信号を発す
る標識を用いることにより、被検体のいずれかの分析に
関して使用しうる。競争的及び非競争的工程手順が使用
しうる：被検体及びｓｐｓで標識した被検定は測定表面
上において同族体ｍｉｐに対して競合し或いはそれらは
連続的に結合するかもしれない。或いは被検体が複数の
結合点を有する場合、それは測定表面に結合したｍｉｐ
及びｓｐｓ−標識−ｍｉｐのｍｉｐ間の橋かけとして役
立ちうる。表面上の及びｓｐｓ共役体に含まれる種々の
ｍｉｐ並びに表面が接触する溶液の数及び信号発生系の
員を変えることにより、所望の定量性の程度、使用者の
素養、及び存在する装置に依存して工程手順を広く変え
ることができる。更に同一の考慮のいくつか又はすべて
は較正表面の性質及びｓｐｓ員が較正表面に結合してい
る様子に影響するであろう。

【００４７】信号発生系は非触媒的又は触媒的であつて
よい。非触媒的系は中心又は粒子に結合した信号発生標
識、例えば蛍光体又は化学発光体を複数で含み、単一結
合の場合に単一結合から比較的大きい信号を得ることが
できる。被検体の性質に従つて選択されるｍｉｐは中心
又は粒子に結合して存在するであろう。ハプテン性の被
検体の場合、ハプテン（抗ハプテン）に対する抗体が測
定表面に結合されていてよい。次いでこの測定表面を試
料溶液に浸す。被検体は結合点の部分に結合し、これを
満す。この時粒子−ハプテン共役体は残りの利用可能な
抗ハプテン部位に結合する。また、粒子−ハプテン共役
体は試料溶液と一緒になり、測定表面にの利用可能な結
合点に対して被検体と競合する。

【００４８】触媒系はｍｉｐに結合した基質上の触媒を
含んでいてもよい。基質がｍｉｐに結合している場合に
は、通常中心（ｈｕｂ）が非触媒系におけるように多量
で、複数の基質及び１種又はそれ以上のｍｉｐと共に使
用されよう。基質の１つが補酵素である場合には、補酵
素を、２つの酵素系を用いることによつて再循環してよ
い。この場合、結果は単一の補酵素の存在のために複数
の信号発生化合物の生産をもたらす。これらの系は文献
に詳細に報告されている。基質を循環しないときには、
基質は普通蛍光体に対する前駆体であるであろうし或い
は化学発光をもたらそう。

【００４９】ｍｉｐに結合した単一の触媒、普通酵素を
含む触媒系において、触媒−結合−ｍｉｐ及び被検体
は、触媒−結合−ｍｉｐが測定表面において同時に又は
連続して同族体ｍｉｐに対して競争するような競合様式
で用いることができる。即ち被検体を含有する試料を、
触媒−結合−ｍｉｐと組合せて表面と接触させてもよ
く、或いは続いて触媒−結合−ｍｉｐと接触させること
ができる。前者の場合、触媒−結合−ｍｉｐは比較的限
られた量で存在し、測定表面に存在するｍｉｐ結合点に
対して被検体と直接競合する。後者の場合、接触−結合
−ｍｉｐは、被検体の測定表面への結合後に残存する結
合点を満し、それ故に前者の状態におけるよりも大過剰
の、問題の被検体の濃度で存在することができる。ｍｉ
ｐが測定表面に結合する十分な時間の後、表面を、表面
に結合し且つ検知しうる信号を与えるであろう生成物に
帰せられる化合物を含む、共因子を包含した適当な基質
と接触させてよい。

【００５０】他の具体例においては、特に少くとも１つ
の酵素を有する触媒の組合せ物が使用される。この場
合、触媒の１つは他の触媒の基質である生成物を生成す
る。これは特に２つの酵素の場合、それが試薬溶液の必
要数及び／又は洗浄必要条件を最小にし且つ表面におけ
る信号発生化合物を急速に生成するという点で好適な具
体例である。この具体例において、測定表面はｍｉｐば
かりでなく、２つの酵素の１つ、好ましくは系の第一の
酵素を含む。酵素−結合−ｍｉｐは好ましくは系の第２
の酵素である。第１の酵素の生成物は第２の酵素に対し
て必須の基質であり、従つて信号発生系に必要な種々の
基質及び共因子は水性媒体中における予備熟成反応に関
して関係することなしに第２の酵素と一緒にしてよい。
第１の酵素の基質は、表面と組合わさつた時にだけ繰返
して第２の酵素の基質である生成物を与える。

【００５１】前述したような同様の工程順序も使用しう
るが、触媒−標識−ｍｉｐを含有する溶液から分離した
基質溶液を用いることの所望性は実質的に減ぜられる。
好適な工程手順は、信号発生系のすべての員を試料に添
加し：次いで得られた溶液に表面を導入し；表面におい
て検知しうる信号の変化を与えるのに十分な時間に亘つ
て反応を起こさせ；そして表面を取り出し、次いで表面
の各々における検知しうる信号量を媒体中の被検体の量
の尺度として比較する、ことを含む。

【００５２】他に、最初に試料を被検体と接触させ、次
いで酵素−結合−ｍｉｐを基質及び共因子と同時に又は
連続して添加してもよい。前述したように、過剰の酵素
−結合−ｍｉｐは競争状態で使用することができる。こ
の時、被検体は最初に表面上のその相補的ｍｉｐに結合
する。被検体が橋かけとして役立つ場合には、特に異な
るモノクロナルな抗体（ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔ
ｉｂｏｄｙ）を酵素−結合−ｍｉｐに対比される如く表
面において使用する場合には、酵素−結合−ｍｉｐを被
検体と同時に或いは被検体に連続して添加するかどうか
と関係なく、過剰量の酵素−結合−ｍｉｐを使用しても
よい。基質及び共因子の濃度は好ましくは酵素の繰返し
速度に関して限界因子となるほど実質的に過剰量で存在
するであろう。即ち、それは酵素に対するミハエリス定
数を越えるであろう。

【００５３】較正表面は、所望の感度及び較正表面と測
定表面との間で平行化される因子数に依存して変化しよ
う。

【００５４】較正表面は、少くとも１つ、好ましくは２
つの結合事象、即ち同族体ｍｉｐ又は酵素−基質（補酵
素を含む）の結合を含む結合事象において測定表面に平
行であろう。非触媒的信号発生系の場合、ｍｉｐ測定表
面に結合したｍｉｐと異なつて、較正表面に結合しよ
う。望ましくは、較正表面に結合したｍｉｐは測定表面
に結合したｍｉｐと同様の性質のものであり、２つの表
面はハプテン、抗原又は受体を適当なものとして有する
であろう。

【００５５】触媒的信号発生系の場合、較正表面はｍｉ
ｐを含む必要がない。最も簡単な触媒的較正表面は表面
に共有的に又は非共有的に結合した触媒であり、この時
触媒的活性が予じめ決められた値で付与される。即ち、
分析測定中、触媒は測定表面に結合した触媒と同一の外
来の因子及び条件に較正表面上で供される。即ち、温度
条件、試薬安定性、外来の非特異的な干渉物、並びに特
異的干渉物、条件及び濃度の局所的変動、などはすべて
が２つの表面において同様に、検知しうる生成物の生成
に影響するであろう。従つて信号発生化合物の生成にお
ける変動の主な原因は測定表面及び較正表面において平
行的に影響されよう。

【００５６】平行的関係は、較正表面上でｍｉｐ複合体
を形成させることによつても更に高めることができる。
これは種々の方法で達成できる。１つの方法は、酵素活
性に重大なほど影響しない酵素触媒に対する受体を付与
することである。酵素−結合−ｍｉｐが問題の被検体の
濃度範囲において測定表面に結合する量よりも実質的に
過剰量である場合、較正表面に結合する酵素の量は実質
的に一定になるであろう。しかしながら、酵素のその受
体、特に抗体に対する結合は、被検体のその同族体ｍｉ
ｐに対する結合と同様の具合に影響されよう。

【００５７】ｍｉｐを、触媒に結合した被検体と異なる
共役させることによつて更に平行にすることができる。
配位体被検体の場合、異なる配位体を触媒に結合させる
ことができる。このとき、そのような異なる又は第２の
配位体は被検体と同一の触媒分子に或いは異なる触媒分
子に結合していてもよい。２つの配位体が同一の触媒に
結合している場合には、触媒−結合−ｍｉｐに対して測
定表面及び較正表面間で競合が起きよう。触媒−結合−
ｍｉｐが実質的過剰量で存在する場合、較正表面に結合
する触媒−結合−ｍｉｐの量は被検体の濃度によつて重
大なほど影響されない。いくつかの事例において、触媒
−結合−ｍｉｐは限られた量で、即ち測定表面及び較正
表面の双方に存在する全結合点よりも実質的過剰量でな
くて存在していてよい。較正表面に結合する触媒の量は
被検体の濃度と共に変化しよう。さもなければ、較正表
面に結合した触媒の量における唯一の変動は、ｍｉｐ複
合体の生成に影響する条件の変動の結果としてであろ
う。

【００５８】非触媒的ｓｐｓ員又は基質標識を用いる場
合、中心又は粒子に結合した２つの配位体（被検体及び
較正配位体）を有していてもよい。即ち共役体の濃度に
依存して、２つの配位体が同一の又は異なる共役体上に
存在する及び両配位体が同一の共役体上にあるとき共役
体が限られた量で又は実質的な過剰量で存在するという
競争的又は非競争的様式が使用しうる。ここに実質的な
過剰量とは、共役体の濃度が分析中に重大なほど変化し
ないことを意味する。

【００５９】通常、較正表面は、分析媒体中の被検体の
量に実質的依存しないで信号を発する。較正表面に結合
した成分を適当に選択することにより、予じめ決められ
た濃度量を与える検知しうる信号が付与される。測定表
面からの検知しうる信号は、測定表面での検知しうる信
号の発生と同一の具合におおよその影響を受けるであろ
う。従つて較正表面で観察される検知しうる信号は被検
体の一定の濃度量を規定しよう。

【００６０】被検体の量を決定する場合には、測定及び
較正表面での信号量を比較し、その対比を予じめ決めら
れた量以上の被検体の存在を支持するものとして使用す
ることができる。他に、測定表面での信号量を較正表面
での信号量で割ることによつて半定量的又は定量的に分
析することができる。この方法では、分析媒体の信号発
生に及ぼす非特異的影響が実質的に消去される。

【００６１】ｓｐｓ員−結合−ｍｉｐにおけるｍｉｐが
受体である場合には、ｓｐｓ員−結合−受体の受体部分
上の抗原決定基に結合する較正表面上に受体を付与する
更なる機会を持つことができる。表面上の受体が抗体で
ある場合には、抗体のある適当な抗原決定基に結合して
いてよい抗（抗体）を用いることができる。この方法で
は、ｓｐｓ員−結合−ｍｉｐのｍｉｐは測定表面に結合
した相補的ｍｉｐに結合する際の受体として且つ較正表
面に結合した相補的ｍｉｐに結合する際の配位体として
作用しうる。

【００６２】多くの場合、本発明の装置の使用者はでき
るだけ少ない測定とできるだけ少ない移行（transfer）
とを可能にすることが望ましいであろう。即ち、本方法
は、試料の測定もさることながら、すべてではないが殆
んどの試薬の測定を可能にしよう。第２に、効率を高め
且つ誤差の入り込む余地を減ずるばかりでなく、試験の
ための全時間を減ずるために、移行操作の数ができる限
り少ないことが望ましい。

【００６３】最も簡単な工程では、すべての試薬を表面
に供給し或いは適当な処方物、簡便には凍結乾燥した粉
末処方物中で一緒にする。

【００６４】試薬を例えば含浸、カプセル化、水溶性接
着剤などによる接着などによつて表面に供給する場合、
装置は試料溶液中に置くことだけが必要である。測定及
び較正表面は、溶液の速度が非常に速い限りにおいて同
一の効果に供される。

【００６５】凍結乾燥した粉末処方物は、試料を含有す
る測定量の水性媒体中に溶解せしめられる。溶液が均一
になる十分な時間の後、表面を試料溶液中へ導入する。
非触媒的信号発生系に対しては、ｍｉｐを適当に選択す
ることにより、１回だけ表面を浸漬すればよい。触媒的
系の場合には、信号発生系が２つの酵素を含み、一方の
酵素が他の酵素の基質である生成物を生成するという単
一の処方物を使用することができる。第１の酵素が測定
表面及び較正表面の双方に結合している場合には、予め
の熟成反応と関係なしに第２の酵素を第１の酵素に対す
る基質と組合せることができる。その理由は、第１の酵
素が第２の酵素に対して必要な基質を生成するまで反応
が起こらないからである。

【００６６】信号発生系に１つだけの触媒を用いる場合
には、溶液の一方が触媒に対する基質を有し且つ他の溶
液が触媒−結合−ｍｉｐを有する少くとも２つの溶液を
用いて、表面を２つの溶液と別々に接触させるか、或い
は触媒−結合−ｍｉｐを表面に溶解的に結合させ、単一
の基質を含む試薬溶液を使用する。

【００６７】信号発生化合物は、観察される信号の増減
と関係する。信号発生化合物は触媒によつて発生する場
合表面に優先的に結合し、そして肉眼的に検知しうる或
いは反射光計又は蛍光計により検知しうる信号を与え
る。信号発生化合物は通常それが生成される媒体中に実
質的に不溶であり、また触媒生成物に直接的に又は間接
的に由来するであろう。信号発生化合物が表面に結合し
た触媒により表面に隣つて生成すれば、信号発生化合物
の表面への結合に由来する全信号発生化合物の溶液から
の割合が最小になるであろう。

【００６８】多くの状態において、捕捉剤が望ましい。
例えば２つの酵素を信号発生系に用いる場合、第１の酵
素に対する捕捉剤をバルク溶液に用いれば、バルク媒体
中での信号発生化合物の生成は更に減ずることができ
る。また信号発生化合物をバルク媒体中において結合し
ない酵素−結合−ｍｉｐの存在下に生成せしめる場合に
は、信号発生化合物に対する捕捉剤がバルク媒体中に有
用である。他に、溶媒中の酵素を選択的に不活性化する
が、表面に結合した酵素に対しては実質的に不活性であ
る酵素禁止剤を用いてもよい。これは粒子に結合した禁
止剤の、表面に結合した酵素の結合点への接近を禁止す
る大きい有孔粒子に結合している可逆的禁止剤又は自滅
禁止剤を用いることによつて達成することができる。

【００６９】多くの場合、信号発生化合物は表面におい
て信号を高めるであろう。しかしながら、表面において
信号を減ずる可能性もある。例えば表面が蛍光性である
場合、表面の蛍光を減ずる消光剤を生成させることがで
きる。他に、異なる染料の表面上への沈殿時に観察され
る色が変化するある染料で着色した表面を使用してもよ
い。他に、第１の酵素が信号発生化合物を生成し且つ第
２の酵素が信号発生化合物を破壊する或いは必須の中間
体を破壊するという酵素の組合せを用いてもよい。例え
ばグルコース・オキシダーゼ及び西洋ワサビのペルオキ
シダーゼを表面に用い、カタラーゼをｍｉｐに結合させ
る場合、表面に結合するカタラーゼが多くなればなるほ
ど、生成する染料が少なくなる。即ち第３の酵素が酵素
−結合−ｍｉｐとして存在することにより、表面に結合
する酵素−結合−ｍｉｐの量は信号発生化合物の観察さ
れる生成を減ずることと関連しよう。

【００７０】定量分析のためには、較正表面上の信号量
に対する測定表面上での信号量の比を明確にするとよ
い。即ち信号発生化合物の生成の開始から信号発生化合
物の更なる生成の終了に至る特定の期間を設定すること
により、測定表面及び較正表面からの信号の比を、被検
体の量を定量化するための標準値に関連づけることがで
きる。信号発生化合物が一定の速度で生成する場合に
は、測定表面及び較正表面の両方において信号の十分な
変化が起こる限りにおいて時間は厳密な因子でないが、
信号の変化が表面において最早や観察されなくなる程時
間を長くはしない。即ち比は時間、温度及び内因的干渉
物に対して比較的鈍感な結果をもたらす。他に、２つの
較正表面を用いる場合、これらの表面における信号の比
は時間の測定の代りに使用することができる。

【００７１】次のものは、単一の酵素及び組合せ酵素を
用いることによる２つの工程順序の例である。被検体は
配位体であり、２つの表面は異なる配位体に対する受体
を有する。この時第２の配位体は較正配位体として言及
される。酵素は被検体同族及び較正配位体の両方と共役
する。試料を得、これを予じめ決められた容量まで水性
緩衝媒体に溶解する。酵素−結合−ジ配位体（被検体及
び較正配位体）、安定剤、賦形剤、及び随時緩衝剤を含
む凍結乾燥した混合物を試料に添加して、被検体及び酵
素−結合−ジ配位体を含有する溶液を、測定表面におい
て受体に対して被検体と競争するのに十分な量である
が、依然限られた程度で較正表面に結合する量で付与す
る。２つの表面を同時に溶液中に導入し、理にかなつた
時間に亘つて放置する。これによつて被検体は測定表面
に結合し、酵素−結合−ジ配位子は分析媒体中の被検体
の量に関連して測定表面及び較正表面間に分布する。

【００７２】結合のための十分な時間、一般に約１〜１
０分の後、２つの表面を分析媒体から分離し、現像溶液
中へ導入する。十分な信号発生化合物が表面上に生成す
る適度の時間の後、表面を取り出し、２つの表面上での
信号を肉眼で比較する。較正表面におけるｍｉｐの量を
適当に選択することにより、較正表面からの信号が例え
ば測定表面からの信号よりも大きい、例えば暗いなら
ば、被検体が予じめ決められた量以下で存在するという
ことがわかる。２つの表面からのシグナルを測定し、次
いで比を決定することにより、この比を存在する被検体
の実際の量を指示する標準物に対して対比することがで
きる。従つて肉眼的観察によつて半定量的結果を得るこ
とができ、また定量的結果を望むならば２つの表面にお
ける信号を注意深く測定し且つ標準物と比較することに
より定量的結果が得られる。

【００７３】次の工程順序では、酵素の組合せ物が使用
され、信号発生化合物の生成のために、１回の処方と試
料及び試薬溶液の表面との１回の接触を必要とする。過
去の順序と比較する目的で、この場合には２つの（酵素
−結合−配合体）を用い、同一の酵素と２つの異なるハ
プテン、即ち被検体であるハプテン及び較正ハプテンと
して言及される他のハプテンとを使用する。測定表面は
被検体ハプテンに対する抗体を有し、一方較正表面は較
正ハプテンに対する抗体を有するであろう。２つのハプ
テンは交叉反応すべきでないけれど、それは各々の結合
複合体の生成が条件及び内因的物質における変動に対し
て同様に影響されるように、望ましくは性質が同様であ
るべきである。較正表面上の受体は、分析媒体中の被検
体の量に依存しないで信号発生化合物を生成する予じめ
決められた量で存在する。表面は受体の他に、酵素−結
合−配位体の酵素に対する基質である生成物を生成する
第１の酵素も対比しうる量で有しよう。

【００７４】工程順序を例示する。２つの酵素−結合−
配位体は各々の測定及び較正表面上において受体に対し
て競争しない。それ故に、較正表面に結合する酵素−結
合−較正配位体の量は媒体中の被検体の量の関数でない
であろう。（酵素−結合−配位体）は表面に結合した酵
素の生成物の不存在下に分析媒体に対して与えられた基
質と反応しないであろうから、すべての試薬を単一の処
方で一緒にでき、次いでこれを試料と組合せることがで
きる。測定表面上においてｍｉｐに対し、被検体と競争
する酵素−結合−配位体は、媒体中に存在する被検体の
量と関連して測定表面に結合する酵素−結合−配位体の
量を変化させるために限られた量で存在する。前述した
ように、処方物は（酵素−結合−配位体）及び基質の他
に緩衝剤、安定剤、賦形剤などを含んでいてよい。

【００７５】処方物を最初に水性媒体に溶解して試薬を
適当な濃度で有する溶液とすることができる。予じめ決
めた容量の溶液の一部分を採取し、試料を溶液中へ秤り
入れる。第１の酵素は酵素反応の進行に必須である。表
面を溶液中へ導入し、信号発生化合物が表面で生成する
のに十分な時間をかけ、この時点において表面を取り出
し、表面を肉眼的に観察するか、或いは適当な装置によ
つて信号発生量を定量する。

【００７６】較正表面の信号量は被検体濃度に無関係で
あるから、測定表面における信号量が較正表面における
信号量よりも小さい場合、被検体は予じめ決められた量
よりも多量で存在すると言うことができる。他に、測定
表面及び較正表面の信号量の比を用い且つこれらを公知
の量の被検体を用いて調製した標準物に対して比べるこ
とにより、試料中に存在する被検体の量を定量化するこ
とができる。

【００７７】本発明の適用と関連する種々の技術に関す
る記述に対しては、米国特許第４,２９９,９１６号の第
７〜１６欄を参照のこと。この記述は本明細書に参考文
献として引用される。

【００７８】通常では好適でない更なる別の具体例は、
各々がｍｉｐに結合し且つ各々が分析媒体中に存在する
被検体の量に比例して測定表面に結合する酵素の組合せ
物を使用することである。次いで同一の酵素組合せ物
を、最初に或いはｍｉｐ複合体の結合を介して較正表面
に結合させる。この時ｍｉｐは２つの酵素の各々に対す
る受体となりうる。或いは２つの酵素に対して共通の配
位体を用いることにより酵素組合せ物を結合させてもよ
い。但しこの場合には酵素分子は被検体が結合する同一
の又は異なる酵素分子であつてよい。

【００７９】材料 本分析に用いる成分は、被検体、測定及び較正表面、信
号発生系及び適当なものとしてポリ（配位体同族体）又
は多価の受体である。信号発生系は少くとも１つの触媒
−結合−ｍｉｐ及び触媒に対する基質である溶質を含
む。信号発生系はしばしば更なる員を含む。

【００８０】被検体 本発明の配位体被検体はモノエピトピツク又はポリエピ
トピツクであることが特色である。ポリエピトピツクな
配位体被検体は普通ポリ（アミノ酸）、即ちポリペプチ
ド及び蛋白質、多糖類、核酸、及びこれらの組合せ物で
ある。そのような組合せ物はバクテリヤ、ビールス、ク
ロモゾーム、遺伝子、ミトコンドリヤ、核、細胞膜など
を含む。

【００８１】被検体の正確な性質及びその多くの例は L
itman らの米国特許第４,２９９,９１６号、特に第１６
〜２３欄に開示されている。この開示は本明細書に参考
文献として引用される。

【００８２】測定及び較正表面 ｍｉｐ及び／触媒を固定化して測定表面及び較正表面と
するための下地の表面は広く変えることができる。一般
に下地の構造は、両表面に対して同一であり、信号発生
系を強く吸着しないで分析の妨害を最小にするように選
択される。表面の下地構造は異なる形体をとり、異なる
組成を有することができ、組成物の混合物又は積層物或
いはこれらの組合せであつてよい。表面に対して選択さ
れる材料は、信号発生化合物の不溶化或いは表面に結合
した他の化合物の複合体化反応又は相互作用によつて信
号発生化合物と相互作用できて、信号発生化合物を生成
し、破壊し又はそれと相互作用しなければならない。

【００８３】表面は種々の型及び形を取つていてよく、
使用及び測定法に依存して種々の寸法をとることができ
る。表面の例は、平形、凹形又は凸形であつてよいパツ
ド、円板又は細片であつてよい。厚さは厳密でなく一般
に約０.１〜２ｍｍであるが、便宜的な寸法又は他の寸
法であつてよい。典型的には、表面は共通の員、例えば
棒、管、キヤピラリー、繊維、ストリツプ、円板、平
板、キユベツト（cuvette）などに支持されるが、本発
明は各表面を別々の機械的支持体上に支持することも意
図している。表面は支持体の合体部分を形成し又は支持
体からはつきりしていてもよく、典型的には支持体上に
或いは支持体から空間を置き且つ２つ又はそれ以上のス
ペーサーで支持させて層を適用する。

【００８４】表面は典型的には有孔である。系の性質に
依存して種々の孔径が使用される。表面は多官能性であ
り或いはｍｉｐの共有結合を可能にするために並びに信
号発生系の一部を形成する他の化合物の結合を可能にす
るために多官能性化することができる。表面の正確な性
質は、本明細書に参考文献として引用される Litmanら
の米国特許第４,２９９,９１６号に議論されている。

【００８５】ｍｉｐの表面材料への結合による測定及び
較正表面の生成は通常文献に示されている十分公知の技
術であつてよい。参照、例えば Ichiro Chibata 著、
“Immobilized Enzymes”、Halsted Press、New York
（１９７８）及び Cuatrecases、J.Biol・hem.、２４
５、３０５９（１９７０）。

【００８６】天然及び合成の、及びその組合せであつて
よい多種類の有機及び無機重合体が固体表面に対する材
料として使用しうる。重合体の例は、ポリエチレン、ポ
リプロピレン、ポリ（４−メチルブテン）、ポリスチレ
ン、ポリメタクリレート、ポリ（エチレンテレフタレー
ト）、レーヨン、ナイロン、ポリ（ビニルブチレー
ト）、シリコーン、ポリホルムアミド、セルロース、酢
酸セルロース、ニトロセルロースなどを含む。使用しう
る他の材料は、紙、ガラス、セラミツクス、金属、非金
属、半導体材料、セルメツト、シリケートなどを含む。
更にゲルを形成する物質、例えば蛋白質例えばゼラチ
ン、リポポリサツカライド、シリケート、アガロース；
及びポリアクリルアミド又はいくつかの水性相を形成す
る重合体、例えばデキストラン、ポリアルキレングリコ
ール（アルキレンの炭素数２〜３）又は表面活性剤、例
えば両性化合物例えばリン脂質、長鎖（炭素数１２〜２
４）アルキルアンモニウム塩なども含有させうる。

【００８７】信号発生系 信号発生系は非触媒的又は触媒的であり、各々の場合各
ｍｉｐ結合事象に対して信号量を増巾する。

【００８８】非触媒的系において、増巾は中心（ｈｕ
ｂ）又は粒子に結合した信号発生官能基を複数で有しせ
しめる結果起こる。中心又は粒子がｍｉｐ結合を通して
表面に結合するとき、多数の信号発生官能基も結合され
るようになる。従つて一定の増巾比が存在する。

【００８９】用いる通常の官能基体は蛍光体及び化学発
光体或いはその前駆体である。その化合物の例は前述の
米国特許に見出すことができる。

【００９０】中心又は粒子はいずれか簡単な有機又は無
機核、例えばラテツクス粒子、ガラスなどであつてよ
い。これらも文献に良く記述されている。粒子の寸法は
一般に直径が約１０〜１００μで変化しよう。

【００９１】触媒的信号発生系は、普通には信号発生化
合物である化合物を生成するが、いくつかの場合には表
面に結合した他の化合物と反応して信号発生化合物を生
成し、高性能化し又は分解してもよい。酵素的及び非酵
素的触媒の双方を使用しうるけれど、普通触媒的信号発
生系には少くとも１つの酵素触媒が使用されるであろ
う。１つの触媒だけが存在する場合、この触媒は複合体
形成によつて測定表面に結合するためにｍｉｐに共役す
る。触媒の他に、測定表面において検知しうる信号の変
化をもたらす変形を受ける溶質が存在しなければならな
い。

【００９２】多くの場合、触媒−結合−ｍｉｐによつて
促進された変換に由来する生成物は信号発生化合物であ
るであろう。それ故に、１つの触媒だけ、普通酵素が存
在する場合には、信号発生系は触媒−結合−ｍｉｐ及び
その基質を含有しよう。いくつかの場合には表面に「カ
プラー」を結合させることが望ましく、触媒生成物は
「カプラー」化合物と反応して信号発生化合物を生成す
る。

【００９３】好ましくは、２つの触媒、例えば酵素及び
非酵素触媒の組合せ或いは一方の生成物が他方の基質で
あるという点で２つの触媒が相互に関係している２つの
酵素が使用される。この系においては、触媒によつて促
進される連続的な変化を受ける１つの溶質又は基質だけ
が必要であり、検知しうる信号の生成に必要な化合物が
生成する。しかしながら、多くの場合、通常には系にお
いて第１の酵素に対する基質及び信号の生成に必要な化
合物に対する前駆体として役立つ、通常信号を与える化
合物を与える第２の化合物が存在するであろう。即ち第
１の酵素の生成物は信号発生化合物に対する前駆体と反
応して信号発生化合物を与える。 殆んどの場合、包含
される反応は加水分解又はレドツクス反応である。加水
分解の場合、２つの酵素による工程が不溶性染料生成物
を与えるのに必要とされる酵素的に変化しやすい結合で
連結された水に溶解する化合物での染料の置換はこの種
の系の例である。対比して、レドツクス反応の場合に
は、第１の酵素が第２の酵素に対する必須の基質を生成
することができ、この時第２の酵素は第１の酵素の生成
物と染料前駆体との間の反応を促進する。

【００９４】酵素反応は、他の酵素の基質である生成物
への溶質の改変或いは酵素基質として役立つ溶質の必須
部分を含まない化合物の生成を伴つてもよい。第１の態
様はアルカリ性ホスフアターゼによつてグルコースに触
媒的に加水分解されるグルコース−６−ホスフエートが
例であり、この時グルコースはグルコースオキシダーゼ
に対する基質である。第２の態様は、信号発生前駆体と
酵素的に反応して信号発生剤を生成する過酸化水素を与
えるグルコースオキシダーゼによつて酸化されるグルコ
ースにより例示しうる。

【００９５】組合せ触媒は酵素を非酵素的触媒と共に含
むことができる。酵素は非酵素的触媒によつて接触され
る反応を受ける反応を生成することができ、或いは非酵
素的触媒は酵素に対する基質（補酵素を含む）を生成し
うる。例えばメルドラ青（Meldola blue）はＮＡＤ及び
ヒドロキノンのＮＡＤＨへの転化を接触することがで
き、これが長鎖アルデヒドの存在下にＦＭＮオキシドレ
ダクターゼ及びバクテリヤ・ルシフエラーゼと反応して
光を発する。本発明で使用しうる多種類の非酵素的触媒
は、１９７９年７月１０日付けの米国特許第４,１６０,
６４５号に見出される。この特許の関連部分は本明細書
に参考文献として引用される。非酵素的触媒は１電子移
行で反応する第１の化合物及び２電子移行で反応する第
２の化合物反応物として用いる。この時２つの反応物は
触媒の不存在下において起こつたとしてもゆつくりしか
互いに反応することができない。

【００９６】表面において信号発生化物を付与するため
には、種々の酵素の組合せが使用しうる。特にヒドロラ
ーゼの組合せは不溶な信号発生剤を生成するため用いる
ことができる。他にヒドロラーゼ及びオキシドリダクタ
ーゼの組合せも信号発生化合物を与えることができる。
またオキシドリダクターゼの組合せは不溶な信号発生化
合物を生成するために使用しうる。次の表は表面におい
て信号発生化合物を優先的に生成するために使用しうる
種々の組合せの例である。普通前述したように、表面に
おいて触媒を適当に選択することにより、多数の試薬が
単一の処方法で一緒にすることができる。

【００９７】次の表において第１の酵素は表面に結合さ
れることが第２の酵素をｍｉｐに結合されることが意図
され、特別な場合にはその位置を保持することが望まし
い。

【００９８】

【表１】

【００９９】

【表２】

【０１００】全く明らかなことであるが、上述の染料は
適当な溶解性の必要条件を有する或いは本発明に対して
適当な溶解性の必要条件を有するように改良することが
できる他の染料で代替しうる。更に、高局在化した染料
濃度により、染料は急速に表面に結合するということを
理解すべきである。更に、バルク溶液から表面へ拡散す
る染料の増加量は表面上に沈殿する染料の量に重大なほ
ど影響しないであろう。染料の性質に依存して、染料に
よる光の吸収或いは蛍光ならば光の発生が測定しうる。

【０１０１】信号発生化合物を製造するための酵素生成
物への化学反応の代りに、酵素生成物の環境は信号発生
化合物を生成するために、表面へ結合する時に選択的に
改変することができる。例えばエステル又はエーテルを
加水分解して電荷に敏感な染料の不溶性の無色形を表面
において生成することができる。表面における局所的な
電荷は表面に荷電基を有しせしめることによつてバルク
溶液と実質的に異なるようにしうる。プロトンの濃度に
敏感である信号発生化合物を用いることにより、表面に
結合した生成物から観察される信号はバルク溶液又は液
相における生成物のそれと非常に異なる。溶質が不溶性
の消光生成物を生成する場合には、蛍光体消光剤対も使
用しうる。

【０１０２】捕助的材料 本分析には、種々の捕助的材料がしばしば使用される。
特に、分析媒体には酵素基質、共因子、活性化剤、捕捉
剤、禁止剤などが包含せしめうる。

【０１０３】更に、緩衝剤並びに安定剤も通常には存在
しよう。しばしばこれらの添加剤の他に、更なる蛋白質
例えばアルブミン或いは表面活性剤、特に非イオン性表
面活性剤例えばポリアルキレングリコールなども包含せ
しめうる。

【０１０４】実験結果 次の実施例は例示するものであつて、制限するものでな
い。

【０１０５】すべてのパーセント及び部は断わらない限
り重量によるものとする。但し液体の混合物に対しては
容量部によるものとする。溶媒を指定しない場合には、
それは水である。すべての温度は断らない限りセツ氏で
ある。次の略号が使用される：ＣＭＭ---Ｏ³カルボキシ
メチルモルヒネ；ＨＲＰ---西洋ワサビペルオキシダー
ゼ；ＮＨＳ---Ｎ−ヒドロキシサクシニミド；ＥＤＣＩ-
--Ｎ−エチル−Ｎ′−（３−ジメチルアミノプロピル）
カルボジイミド；ＤＭＦ---Ｎ,Ｎ′−ジメチルホルムア
ミド；ＴＨＦ---テトラヒドロフラン；ＢＳＡ---子牛の
血清アルブミン；ＧＯ−ＡＭＩＮＥ---グルコース・オ
キシダーゼーアミン；Tvifon ＱＳ４４---アニオン性表
面活性剤（Rohm and Haas 社）；ＮａＡＺ---ナトリウ
ムアジド；ＭＯＰＳ---３−Ｎ−モルフオリノプロパン
スルホン酸（Calbiochem）；ＣＤＩ---１,１′−カルボ
ニルジイミダゾール。

【０１０６】

【実施例】実施例１ 抗モルヒネ紙の製造 次の実験は次のようにバルクで製造した紙支持体に結合
させた抗モルヒネを使用した。Whatman １Ｃ紙（１６フ
イート×１０.６３インチ）を、隣る紙の層を分離して
試薬を浸透せしめる２つのスクリーンを用いて直径１イ
ンチの糸巻きに巻きつけた。得られたカートリツジを反
応器に挿入し、そこでそれを夜通し真空下に凍結乾燥し
た。ＣＤＩ（８５ｇ、Polysciences、ロツト番号１２０
８７、カタログ番号１５７５０）をジクロメタン２.５
Ｌに溶解した。この溶液を遠心ポンプにより約４Ｌ／分
の流速で２時間反応器中を再循環させた。次いで紙をジ
クロルメタン（２.５Ｌ）で３回洗浄し、窒素（約７Ｌ
／分）で３時間乾燥し、室温で夜通し乾燥した。

【０１０７】モルヒネに対する抗体（０.２ｍｇ／ｍ
ｌ）及びＧＯ−ＡＭＩＮＥ（０.１ｍｇ／ｍｌ）の燐酸
塩緩衝剤（２.８Ｌ）中混合物を、２４℃で４時間、約
２Ｌ／分で反応器中を再循環させた。次いで紙を燐酸塩
緩衝剤（４Ｌ）で４回洗浄し、スクローズ（１５％）及
びＢＳＡ（２ｍｇ／ｍｌ）を含有する溶液２.５Ｌで安
定化させた。過剰の流体を窒素（４０ｐｓｉで１分間、
８０ｐｓｉで１５秒間）で除去した。次いで紙を８９.
５時間窒素流（２５０ｍｌ／分）下に真空乾燥した。

【０１０８】実施例２ 抗ＨＲＰ紙の製造 次のようにＨＲＰを用いて２巻きの濾紙を製造した：Wh
atman １Ｃ紙（１２フイート×１０.６３インチ）の第
１のロールを隣る層を分離する１対の針金のスクリーン
を用いて直径２インチの糸巻きに巻きつけた。Whatman
１Ｃ紙（１６フイート×１０.６３インチ）の第２のロ
ールを、これも隣る層を１対の針金のスクリーンを用い
て分離して直径１インチの糸巻きつけた。第１のロール
を第１の反応器中に置き、第２のロールを第２の反応器
中に置いた。そして両ロールを窒素を流して水分を除去
しながら夜通し真空下に乾燥した。

【０１０９】ＣＤＩ（１７０ｇ）をジクロルメタン５.
０Ｌに溶解し、これをシリーズに連結された反応器中を
４Ｌ／分で再循環した。次いで紙をジクロルメタン４.
５Ｌで３回洗浄し、次いで窒素（６Ｌ／分）で３時間及
び２００ｍｌ／分で夜通し乾燥した。

【０１１０】第２の反応器からの紙を、１.０ＭＮａＯ
ＨでｐＨ６.９４に調節した燐酸緩衝剤中のＨＲＰに対
する抗体（２９.５６μｇ／ｍｌ）、非免疫性のひつじ
の１ｇＧ（２２μｇ／ｍｌ）及びＱＳ４４（２％、ｗ／
ｖ）の混合物で処理した。この混合物を撹拌しながら夜
通し保温した。この溶液にＧＯ−ＡＭＩＮＥ（５００ｍ
ｇ）（製造法は下記を参照）をＮａＡＺと共に添加し
た。最終の容量は２.５Ｌに等しかつた。ＧＯ−アミン
の最終濃度は０.２ｍｇ／分であつた。

【０１１１】この溶液を第２の反応器を通して５時間
（２Ｌ／分）再循環した。次いで反応器を燐酸塩緩衝剤
（４Ｌ）で４回洗浄し、スクローズ（１５％）及びＢＳ
Ａ（２ｍｇ／ｍｌ）の２.５Ｌで安定化させた。過剰の
流体を加圧下に除去し、紙を窒素流（２.５Ｌ／分）下
に真空乾燥した。

【０１１２】グルコース・オキシダーゼ（Sogma、Ｅ.
Ｃ.１.１.３.４）を、３０ｐｓｉ以下の圧力において A
micon ＰＭ１０の膜を用いて、３６０ｍｌから６０ｍｌ
に濃縮した。このグルコース・オキシダーゼを４℃下に
水４Ｌに対して２回透析し、濾過した。これは分光学的
に３２ｍｇ／ｍｌの濃度を有することがわかつた。この
グルコース・オキシダーゼ溶液５１.５ｍｌに０.２Ｍ過
ヨウ素酸ナトリウム５.１５ｍｌを滴々に添加し、反応
を２５分間起こさせた。生成物を、ｐＨ４.５の２ｍＭ
酢酸ナトリウムを用いる Sephadex Ｇ−５０の２.５×
６０ｃｍのカラムクロマトグラフイーで処理し、グルコ
ース・オキシダーゼの主ピークを集めてアルデヒド誘導
体を含有する溶液９１.５ｍｌを得た。この溶液に、ｐ
Ｈ９.５の０.２Ｍ炭酸ナトリウム中３Ｍエチレンジアミ
ン６ｍｌを滴々に添加し、反応を３時間進行させた。次
いでこの混合物に１０ｍｇ／ｍｌの水素化ホウ素ナトリ
ウム約３.９ｍｌを添加し、混合物を夜通し保温し、次
いでクロマトグラフイーにかけて水素化ホウ素ナトリウ
ムを除去した。

【０１１３】実施例３ モルヒネのＨＲＰへの共役 反応フラスコ中において、ＣＭＭ（３５.９ｍｇ）、Ｎ
ＨＳ（１２.６５ｍｇ）及びＥＰＣＩ（２１.１２ｍｇ）
をＤＭＦ（１.１ｍｌ）中で一緒にした。次いで混合物
を窒素でフラツシユし、室温で夜通し撹拌してＣＭＭの
活性化エステルを製造した。炭酸塩緩衝剤（ｐＨ９.
５）２１ｍｌ中ＨＲＰオキシアミン（１.９ｍｇ／ｍ
ｌ）（製造法は下記参照）の混合物に、反応混合物を４
℃に維持しながら、活性化エステルを１０μｌで増量で
１.５時間に亘り、ＣＭＭ：ＨＲＰ＝５０：１のモル比
終点まで添加した。次いで反応混合物をＧ５０ Sephade
x の２×３０ｃｍのカラムに適用し、０.１Ｍ燐酸塩、
０.２Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７.０緩衝剤で流出させ、蛋白
質を監視した。次いで蛋白質画分を集めた。

【０１１４】ｐＨ４.５の緩衝剤の酢酸ナトリウム５ｍ
Ｍ中１０ｍｇ／ｍｌ ＨＲＰの５ｍｌに０.２Ｍヨウ素酸
ナトリウム５０ｍｌを添加し、混合物を３０分間撹拌
し、次いでＧ−５０ Sephadex のカラムクロマトグラフ
イーにかけ、ｐＨ４.５の２ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝剤
で流出させた。蛋白質画分を２９ｍｌまで集め、混合物
を４℃まで冷却し、ｐＨ９.５の０.５Ｍ炭酸塩緩衝剤中
の、４℃の０.２Ｍ２,２′−オキシ−ビス−エチルアミ
ン２.９ｍｌを添加した。この混合物のｐＨを、添加さ
れる１Ｎ水素化ホウ素ナトリウム−水溶液で９.５に調
節し、混合物を３.５時間反応させ、Sephadex Ｇ−５０
のカラムクロマトグラフイーにかけた。

【０１１５】ＨＲＰ４００ｍｇ及び２,２′−オキシ−
ビス−エチルアミン３.５ｇを用いて上記工程を繰返し
た。元のアミンと約４つの更なるアミノ基を有する改変
アミンとの間で酵素活性の重大な変化は観察されなかつ
た。

【０１１６】実施例４ 浸漬棒の製造 分析に用いるために、実施例１の抗モルヒネ紙及び実施
例２の抗ＨＲＰ紙に１／４インチの円板の孔をあけた。
次いで円板をプラスチツク製の棒の一端に並行して接着
し、浸漬棒とした。

【０１１７】実施例５ モルヒネの濃度の関数としての標準曲線 ０.１Ｍ燐酸塩緩衝剤、０.２Ｍ ＮａＣｌ（２ｍｌ、ｐ
Ｈ７.０）の標準溶液に、デユプリケート（duplicate）
中０、１００、３００及び１０００ｎｇ／ｍｌのモルヒ
ネを添加した。実施例４における如く製造した浸漬棒を
各溶液に室温で１分間浸した。洗浄せずに、浸漬棒をそ
れぞれ現像剤溶液２ｍｌ中に置き、５秒間振とうし、９
分間保温した。この現像剤はＭＯＰＳ（５０ｍＭ、ｐＨ
６.８）、ＢＳＡ（２ｍｇ／ｍｌ）、４−Ｃｌ−１−ナ
フトール（０.２ｍｇ／ｍｌ）及び実施例３で製造した
ＨＲＰ−モルヒネ共役体（２００ｎｇ／ｍｌ）を含有し
た。９分間保温した後、浸漬棒を取り出し、着色した紙
の円板を MacBeth シリーズ１５００反射分光光度計で
読んだ。この結果を第１表に示す。ここにＲＣは較正円
板の反射に関し、ＲＭはモルヒネの円板の反射に関する
ものである。ＲＣ及びＲＭを MacBeth の反射分光光度
計で与えられる色差単位で表わす。

【０１１８】

【表３】

【０１１９】結果は較正円板の示す反射度が試験試料の
モルヒネの濃度に独立であり、一方モルヒネ円板の反射
度がモルヒネの濃度が増大するにつれて減少することを
示す。測定及び較正円板からの２つの値の比を用いるこ
とにより、モルヒネの定量化のための標準曲線ができ
た。

【０１２０】実施例６ モルヒネの濃度及び現像時間の関数としての標準曲線 モルヒネ及び燐酸塩緩衝剤の標準溶液を、各濃度におい
て全体で４０の試料に対し８つのレプリカを製造する以
外、実施例５におけるように製造した。浸漬棒を試験試
料の各々中に１分間浸し、次いで表示する時間の現像剤
溶液（実施例５）中に置いた。結果を第２表に要約す
る。

【０１２１】

【表４】

【０１２２】実施例７ 再現性 各々異なる供給者からの尿の１６の試料をそれぞれ２ml
の４つの部分に分割した。次いで各試料の２つの部分に
モルヒネを最終濃度３００ng／mlまで添加した。浸漬棒
（実施例４）を各部分に入れ、１分間保温した。次いで
浸漬棒を取り出し、実施例５における如く製造した現像
剤溶液（２ml）中に入れた。各浸漬棒を９分間現像し、
結果を第３表に示す。

【０１２３】

【表５】

【０１２４】実施例８ 現像溶液中のＨＲＰ−モルヒネ共役体の濃度を変えるこ
との影響 最初の溶液がＨＲＰ−モルヒネ共役体を含有する以外実
施例５における如く２つの現像剤溶液を製造した：濃度
１５０ｎｇ／ｍｌ、及び第２の溶液３００ｎｇ／ｍｌ。

【０１２５】結果を第４表に示す。

【０１２６】

【表６】

【０１２７】結果は、本方法及び装置が定性的にも定量
的にも媒体中の被検体の存在を決定するための簡単で精
度のよい方法を与えることを示す。非常に高められた分
析の精度は、信号を与え且つ被検体濃度に依存した表面
の信号の発生と同一の影響及び変動に供される較正表面
を用いることによつて得られる。即ち、予じめ決めた量
以上の被検体の存在を肉眼的に決定することができ、或
いは表面の各々からの信号量の比を用いることにより観
察された結果を、公知の量の被検体で得られた比に関し
て且つ信号量の比の変化を濃度変化と共にグラフにし
て、定量化することができる。

【０１２８】本方法及び装置は競争的蛋白質結合分析を
用いることに関して多くの利点を提供する。操作は簡単
で、迅速であり、比較的熟練してない人間でも行なうこ
とができる。更に本方法は工程が少なく、被検体試料の
測定以外の誤差が測定表面及び較正表面に同様に影響す
るという点で安全係数が組込まれている。従つて誤差は
効果的に相殺される。

【０１２９】本発明を明確に理解する目的で例示及び実
施例によつていくらか詳細に記述してきたけれど、その
ある種の変化及び改変は特許請求の範囲内で実施しうる
ことは明らかである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 エドウイン・フツシヤー・ウルマン アメリカ合衆国カリフオルニア州94025 アサートン・セルビーレイン135 (56)参考文献 特開 昭57−63454（ＪＰ，Ａ) 実公 昭55−33251（ＪＰ，Ｙ２)

Claims (2)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 単一の支持体、多孔質材料の測定第１表
   面；該第１表面の近傍の多孔質材料の較正第２表面；該
   第１表面に非拡散的に結合した特異的結合対（ｍｉｐ）
   の１員；及び該第２表面に非拡散的に結合した少なくと
   も１種の信号発生系に関与する酵素又は該酵素を直接結
   合できる特異的結合対を含んでなり、該第２表面が所定
   量の被検体に対応した信号量を与えるものであり、そし
   て被検体が配位体と受体（抗配位体）とからなる特異的
   結合対の１員であることを特徴とする被検体を測定する
   ための内部較正式の診断装置。
2. 【請求項２】 該第１及び第２表面の双方がそれらの表
   面に非拡散的に結合した同一の信号発生系に関与する基
   質形成用酵素を有する請求項１記載の装置。