JPH0716438B2 - 化学ルミネッセンス分析でのオキシダ−ゼ酵素系の使用 - Google Patents

化学ルミネッセンス分析でのオキシダ−ゼ酵素系の使用

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JPH0716438B2
JPH0716438B2 JP62197256A JP19725687A JPH0716438B2 JP H0716438 B2 JPH0716438 B2 JP H0716438B2 JP 62197256 A JP62197256 A JP 62197256A JP 19725687 A JP19725687 A JP 19725687A JP H0716438 B2 JPH0716438 B2 JP H0716438B2
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Description

【発明の詳細な説明】 〔発明の背景〕 本発明は、イムノアッセイ及びDNAプローブ分析を含
む、化学ルミネッセンス分析法におけるキサンチンオキ
シダーゼ（XO）酵素反応の利用に関するものである。
イムノアッセイに於ては生物ルミネッセンス又は化学ル
ミネッセンスが様々の物質の検出について利用されてい
る（Kingler,W.,Strasburger C.J.,and Wood W.G.,Tren
ds in Analytical Chem−istry2:132−136.,1983,Krich
a L.J.,及びThorpe G.H.G.,Analyst 108:1274−1296,19
83）。
化学ルミネッセンス分析は、概して二つのカテゴリーに
分類される。
ａ） 定量化の可能な現象が、反応溶液中に反応開始試
薬添加後得られる数秒程度の非常に短時間の発色乃至信
号（signal）からなるものであるもの。これには、トレ
ーサーとしてルミノールのカップリング誘導体（Schroe
der H.R.,et al:Methods Enz−ymology 57:427−445,19
78）を用いる反応や、アクリジニウムエステルのカップ
リング誘導体（Wee−ks I.and Woodbead J.S.in Analyt
ical Applications of Bioluminescence and Chemilumi
nesce−nce,Academic Press,pp.185−188,1984）を用い
る反応がある。反応における発色が短命であるという不
便さはさておき、この種の方法では測定室に試薬を注入
する装置が必要である。結果として、マイクロタイトレ
ーションプレートを利用することが困難となり、さらに
他の検出用容器も比較的複雑かつ高価なものが要求され
る。
ｂ） 定量化の可能が現象が、長時間にわたる発色から
なるものであって、測定時間が大幅に延長されかつ適切
な測定のくりかえし及び蛍光測定装置外でのサンプルの
調製ができるもの。このシステムでは注入装置が不要
で、これにより蛍光測定装置の設計の単純化を図ること
ができ、またマイクロタイトレーション用プレートの使
用も可能となる。
現時点では、比較的安定かつ強い化学ルミネッセンスを
生じさせる方法がひとつだけ報告されている。この方法
は、サイクリック・ジアシルハイドラジドのペルオキシ
ダーゼ依存酸化反応の合成ルシフェリンのような物質に
よる増強効果を基本とするものである（Whitehead T.
P.,Thorpe G.H.G.,Carter T.J.N.et al.,Nature（Londo
n）305:158−159,1983;Thorpe G.H.G.,Kricha L.J.et a
l.,Anal.Biochem.145:97−100,1985;Thorpe G.H.G.,Kri
cha L.J.et al.,Clin.Chem 31:1335−1341,1985）。こ
の方法は現在、様々な物質の検出に利用されている。し
かし、その発色の時間及び安定性は比較的なものであ
る。測定はわずか30〜40分程度の間しか行なうことがで
きないからである。
発色系に於るキサンチンオキシダーゼの利用はこれまで
に、例えばBozuspashi（米国特許4,363,759号）やMolec
ular Biosystems Inc,（WO−Ａ−85 03356号）によっ
て検討されてきた。しかしながらこれらには、より長時
間の発色を生じさせたという証拠も明確な指標も記載さ
れていない。しかも、キサンチンオキシダーゼは、その
他の多くの全体として過酸化水素も超酸化物陰イオンラ
ジカルも生じさせないその他の多くの酵素システムと一
緒に論じられている。
〔発明の概要〕
ある種のオキシダーゼ酵素システム（例えば、キサンチ
ンオキシダーゼ、コリンオキシダーゼ、サルコシンオキ
シダーゼおよびフマレートオキシダーゼ）は、これらは
酸素含有フリーラジカル（例えば、超酸化物陰イオンＯ
・、水酸基ラジカルOH゜）および過酸化物（H2O2:過
酸化水素）を発生させるものであるが、化学ルミネッセ
ンス試薬（例えばルミノールやその誘導体）を用いた反
応で長期間にわたる化学ルミネッセンス検出可能産物を
生じることが判明した。ここで発生したこれらの化学ル
ミネッセンス産物は時間的に非常に安定で、数時間にわ
たって、時には数日間にわたって測定可能な発色を生じ
る。この発色の安定性及び長寿命は、現在知られている
いずれの方法によるものよりもきわめてすぐれている。
本発明のオキシダーゼ酵素システムは、イムノアッセ
イ、イムノブロッティング又はヌクレオチドプローブ分
析に於て、被検物に化学ルミネッセンス試薬によって認
識されうる長寿命の特性を付与するトレーサーとして特
に有用である。
一般的にいって、本発明の化学ルミネッセンスオキシダ
ーゼシステムは、適切なオキシダーゼ酵素に結合した被
検出物又はリガンドからなるトレーサーを提供するもの
である。このトレーサーは信号試薬の添加による化学ル
ミネッセンス反応によって検出される。信号試薬は、オ
キシダーゼの基質及び増感剤（例えば遷移金属錯体）及
び化学ルミネッセンス試薬を、強イオン濃度の有機塩基
含有のアルカリ側望ましくはおよそpH9.5から10.5の間
で働く緩衝液（例えばバルビタール、ホウ酸又は炭酸緩
衝液）に溶解したものである。
オキシダーゼ酵素システムに用いる基質は、当該酵素に
特異的なものであればいずれでも可能である。例えば、
キサンチンオキシダーゼの場合、本発明の酵素システム
に於てキサンチンオキシダーゼと結合しうる基質にはヒ
ポキサンチン、キサンチン、アセトアルデヒド又はプリ
ンがある。ヒポキサンチンは基質としてもっともすぐれ
ている。
本発明では、化学ルミネッセンス試薬としてアクリジニ
ウムエステル、ルシジェニン又はその誘導体、ルミノー
ル又はその誘導体のいずれかが用いられる。ルミノール
およびその誘導体は、2,3−ジヒドロ−1,4−フタラジン
ジオン化合物であり、いくつかの先行特許（例えば、米
国特許第4,598,044号、同第 4,478,817号及び同第 4,363,759号各明細書）に明示されている。アクリジニ
ウムエステル、ルシジェニンとその誘導体は、米国特許
第4,478,817号明細書に明示されている。
さらに、本発明は前述のようにまた後述するように、本
発明の化学ルミネッセンスオキシダーゼシステムを用い
た種々の分析方法（免疫定量、競合結合、イムノブロッ
ティング、ヌクレオチドプローブ分析法など）で用いる
ことができることが特徴である。
本発明の化学ルミネッセンスオキシダーゼシステムは、
特に免疫酸素分析、例えば免疫定量分析、拮抗結合分析
に有用である。こうした免疫定量技術は現在、よくしら
れた技術である。例えば、Davidらは米国特許第4,486,5
30号明細書の“発明の背景”に於て免疫分析に用いる酵
素についての各種の手法を論じている。
本発明のオキシダーゼ酵素システムは、アビジン・ビオ
チンシステムを用いる免疫分析手法に於ても利用できる
（Laboratory Technique,in Bio−chemistry and Molec
uler Biology,Vol.15,R.H.Burdon他編Elsevier Press参
照）。この場合には、酵素−ビオチン共役体は、安定な
ビオチン化酵素・アビジン複合体を作るためにアビジン
−ビオチン相互反応の強い親和性を利用することができ
る。この複合体は、両タイプの免疫分析反応、すなわち
免疫定量分析及び拮抗結合分析、に於て用いることがで
きる普遍的なトレーサーとなるものである。実際、最適
化により遊離アビジン結合部位を提供することができ
（アビジン分子１個当り４ケのビオチン分子を結合させ
ることができる）、その部位にさらに他のビオチン化分
子を結合させることができる。
さらに、本発明の化学ルミネッセンスオキシダーゼシス
テムは、ヌクレオチドプローブ分析における化学ルミネ
ッセンス検出システムとしても有用である。ヌクレオチ
ドプローブハイブリダイゼシーション法についての一般
的な記述はFalkowらの米国特許第4,358,535号明細書に
記載されている。
かくして、一般的にいえば、本発明の化学ルミネッセン
スオキシダーゼシステムは、酵素トレーサー又は基質ト
レーサーと特異的な結合対リガンドによって結合する物
質を検出するために設計された広範囲の分析法に応用す
ることができる。
当該技術分野に於て一般的にうけいれられている用語に
したがつて、本発明の開示に於ては以下の用語は次のよ
うに定義される。
本発明でいう被検出物とは、特異的な結合可能物質であ
って、その存在または量を決定しようとしているものを
言う。被検出物の例を挙げれば、抗原、ハプテン、抗
体、糖蛋白、炭水化物およびオリゴヌクレオチドがあ
る。
本発明でいうリガンドとは、被検出物の特異的な結合相
手であり、他の物質を排除して被検出物と特異的に結合
する親和性を有するものをいう。リガンドの例を挙げれ
ば、抗体、レクチンおよびヌクレオチドがある。
〔発明の具体的説明〕
以下の記載は、この出願の時点に於て出願人の知る最も
好ましい実施例に関するものである。
化学ルミネッセンスキサンチンオキシダーゼ酵素システ
ム使用の設計法には、以下のものがある。
被検出物としてハプテン又は抗原を検出する場合には、
以下の操作手順からなる拮抗免疫分析法を用いることが
できる。
ａ） 当該検出物に特異的な抗体又はレクチンのような
リガンドを付加した試験管、マイクロタイター穴、ビー
ズのような固相支持体を用意する。
ｂ） ビオチン化酵素とビオチン化被検出物の間の直接
的共有結合又はアビジンブリッジによってキサンチンオ
キシダーゼを結合させた被検出物（所定量の、被検出物
と同一の化学物質からなるトレーサーを用意する。
ｃ） 操作手順ａ）で用意した固相支持体と手順ｂ）で
用意したトレーサーの存在下で被検出物、すなわち抗原
又はハプテン、を含むサンプルを反応（incubation）さ
せる。
ｄ） 当該支持体を洗浄する。
ｅ） キサンチンオキシダーゼと結合した基質、鉄錯体
増感剤及び化学ルミネッセンス試薬を含む信号試薬を添
加する。
ｆ） 当該化学ルミネッセンス試薬の化学ルミネッセン
ス応答を測定し、得られた測定値から抗原又はハプテン
濃度を演繹する。
この方法を実施するために必要な試薬キットは、これは
本発明の主題を構成するものでもあるが、以下のものを
含む。
ａ） 被検出物である抗原又はハプテンに対して特異的
な抗体又はレクチンのようなリガンドで被覆した試験
管、マイクロタイタープレート、又はビーズのような固
相支持体。
ｂ） 被検出物（所定量の、被検出物と同一の化学物質
とキサンチンオキシダーゼとの結合産物。
ｃ） キサンチンオキシダーゼと結合した基質。
ｄ） 化学ルミネッセンス試薬。
ｅ） 鉄錯体増感剤。
ヌクレオチドプローブハイブリダイゼーション法につい
ては、本発明の化学ルミネッセンスキサンチンオキシダ
ーゼシステムは以下の通りにハイブリダイゼーションに
よって形成されたデュープレックスを検出するために用
いることができる。
ａ） フィルター試薬管又はマイクロタイタープレート
のような固相支持体に被検出物の遺伝物質を沈積させ
る。
ｂ） 被検出物の遺伝物質を実質的に相補的なヌクレオ
チド配列をもつオリゴヌクレオチドプローブと結合させ
たキサンチンオキシダーゼからなるトレーサーをハイブ
リダイゼーションをおこす条件下で反応（incubation）
させる。
ｃ） 当該支持体を洗浄する。
ｄ） キサンチンオキシダーゼと結合した基質、鉄錯体
増感剤及び化学ルミネッセンス試薬を添加する。
ｅ） 化学ルミネッセンス応答を測定して、形成された
デュープレックスの濃度又は存在を決定する。
この方法を実施するための試薬キットは、以下のものを
含む。
ａ） フィルター、試験管、又はマイクロタイタープレ
ートのような固相支持体。
ｂ） キサンチンオキシダーゼと結合したオリゴヌクレ
オチドプローブ。
ｃ） キサンチンオキシダーゼと結合した基質。
ｄ） 化学ルミネッセンス試薬。
ｅ） 鉄錯体増感剤。
最後に、当然のことであるが、本発明は生物学的サンプ
ル中のキサンチンオキシダーゼを検出する分析にも用い
ることができる。そのようなものには分析には、以下の
ような例が挙げられる。
ａ） キサンチンオキシダーゼに対する抗体を被覆した
試験のような固相支持体を用意する。
ｂ） 手順ａ）で調製した固相支持体の存在下で、分析
すべきキサンチンオキシダーゼを含むサンプルを反応
（incubation）させる。
ｃ） 当該支持体を洗浄する。
ｄ） キサンチンオキシダーゼと結合した基質、鉄錯体
増感剤及び化学ルミネッセンス試薬を手順ｃ）で調製し
た支持体に添加する。
ｅ） 当該化学ルミネッセンス試薬の化学ルミネッセン
ス応答を測定し、得られた測定値よりキサンチンオキシ
ダーゼの濃度を演繹する。
この方法を実施するために必要な試薬キットは、これは
本発明の主題を構成するものでもあるが、以下のものを
含む。
ａ） キサンチンオキシダーゼに対して特異性を有する
抗体で被覆した試験管のような固相支持体。
ｂ） キサンチンオキシダーゼと結合した基質。
ｃ） 化学ルミネッセンス試薬。
ｄ） 鉄錯体増感剤。
化学ルミネッセンス試薬としては、ルミノール、イソル
ミノール、Ｎ−（４−アミノブチル）−Ｎ−エチルイソ
ルミノール、又はルシジェニンが用いられる。ルミノー
ルが好ましい。
以下の諸例は、免疫分析反応におけるキサンチンオキシ
ダーゼシステムの利点と応用範囲を実際の実験結果に基
づいて述べるものである。
例1:液相におけるキサンチンオキシダーゼの分析 液相中のキサンチンオキシダーゼ（XO）活性分析のため
の最適方法の例は、下記の通りである。
ａ）方 法 分析するべきキサンチンオキシダーゼサンプル（50μ
）をウシ・アルブミン（0.2％）およびエチレンジア
ミンテトラ酢酸二ナトリウム塩（EDTA）（1mM）を含む
0.1Mナトリウムバルビタール溶液で希釈して、50μの
溶液（ヒポキサンチン基質（10mM）およびルミノール
（0.5×10-4M）を蒸留水に溶かしたもの）と混合した。
発色測定を、蛍光測定装置（luminometer）（「Picolit
e6500」、Pachard Instrument Co.）の光増幅器（photo
multiplier）の前で行なった。光量子の放射は、室温で
一秒間測定した。得られた値は、バックグラウンド（キ
サンチンオキシダーゼの存在しない溶液で生じる発光の
カウント／秒）を差引いて、カウント／秒であらわされ
る。
この方法は、測定の自動化の可能性と共に測定の簡便さ
と迅速性が特徴であった。
ｂ）反応の速度論 この反応の主たる重要性は得られる化学ルミネッセンス
発光の絶大な安定性と長寿命にある。ルミノールのキサ
ンチンオキシダーゼ依存酸化の他の異なった酵素サンプ
ルに対する速度論は第１図に示されている。実験条件は
上に述べた通りである。８時間以上の間隔で１秒間ずつ
行なう測定の結果はこの発光の安定性を示している。１
フェムトモル（f mol）以下のキサンチンオキシダーゼ
サンプルで、完全に安定した発光は反応開始後10分で得
られるということは明記されるべきである。他方サンプ
ル当り10から100fmolのより高い濃度領域では、発光は
徐々に増加し、安定した発光は１時間で得られる。実際
には発光の変動は、測定可能時間が長いという点に於
て、軽視できるものである。
この化学ルミネッセンス応答の速度論と、これまで記載
されてきた他の安定な系における速度論とを比較すれ
ば、免疫分析に於るキサンチンオキシダーゼの価値が実
証される。すなわち非常に長期間にわたって、感度の損
失を生じることなく測定をくりかえすことができる。
他の結果によれば少なくとも20時間の間発光信号を測定
することができる。
光量子の放射の安定性はキサンチンオキシダーゼ反応の
触媒特性に従って説明することができる。すなわちその
安定性はＯ ・の不均化により生じる過酸化水素が徐々
に蓄積するということと関連している。この反応の流れ
は、水酸基ラジカルの形成とその後の発光をおこすルミ
ノールの酸化に必要なHarber−Woiss反応へ至るもので
ある（Henry J.P.,Michelson A.M.（1977）,Superoxide
and Su−peroxide Dismutases,Michelson A.M.,McCord
J.and Fridovich I.編、p.283〜p.290,Academic Pres
s.）。
〔化学ルミネッセンス反応の一般的特性〕
本発明の発光の安定性とは別に、XO反応の一般的な特性
は以下の通りである。
ａ）媒質のモル濃度の影響 0.025Mから0.25Mの間でのバルビタールの種々の濃度で
得られた化学ルミネッセンス応答は、モル濃度が高けれ
ばより強い応答がおこることを示した。0.25Mのバルビ
タールの最終濃度を、その後ずっとルーチンの方法とし
て用いた。
ｂ）媒質のpHの影響 XO系の化学ルミネッセンス応答はアルカリ側の緩衝液の
使用により最適化された。およそpH9.5から10.5の間の
緩衝液の使用により発光は、より低いpHの緩衝液を使用
した時と比較して10〜100倍に増加した。有効な緩衝液
にはリン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、炭酸緩衝液、バルビ
タール緩衝液及びトリス緩衝液がある。
ｃ）化学ルミネッセンス化合物の性状の影響 ルミノールはXO系に於てその酸化により光量子を放射す
る唯一の物質ではない。ルシジェニン（Ｎ−メチル・ア
クリジニウム）も又、この特性を有する。23ng（77fmo
l）のXOサンプルに対する最大の化学ルミネッセンス応
答を与えるルシジェニンの濃度とルミノールの濃度を決
定する実験を行ない、ルシジェニンの濃度は10-5M、ル
ミノールの濃度は0.5×10-4Mと決定した。
ルミノールの使用によりルシノジェンの場合とくらべて
きわめて高い感度（＜0.3fmol）が得られた。この事実
はおそらく、XO反応によって産生される酸素含有ラジカ
ルに関してルミノールは特別な反応性を有していること
に関連がある。一方ルシノジェンは過酸化物陰シオンに
対してより特異的である。この場合、過酸化水素及び水
酸基ラジカルによってもたらされる情報は考慮されてい
ない。
0.5×10-4Mのルミノールの最終濃度をその後ルーチンの
キサンチンオキシダーゼ分析法に於て使用した。
ｄ）基質の特性の影響 第２図には、２通りのキサンチンオキシダーゼ濃度に於
いて、２種類の基質、ヒポキサンチンとアセトアルデヒ
ドを用いた時のルミノールのキサンチンオキシダーゼ依
存酸化反応の時間に関して、光放射の曲線を比較したも
のを示す。
ヒポキサンチンを用いたときの発光の安定性は、アセト
アルデヒドを用いた場合よりはるかに顕著であった。ア
セトアルデヒドの場合には、事実上、反応開始後20分で
減少が生じる。
150分後にはアセトアルデヒドでの発光強度はヒポキサ
ンチンで得られる最大応答のわずか４％である。ヒポキ
サンチンの場合、この時間までには減少はみとめられな
かった。これにより、安定かつ高い光量子の放射を得る
ための基質として、ヒポキサンチンをルーチンに使用す
ることが正当化される。
ｅ）鉄・EDTA錯体によるルミノールのXO依存酸化の強化
鉄・EDTA錯体は以下のメカニズムによりHarber−Weiss
反応のための効果的な触媒として働くということは一般
にうけいれられている（Winterbourn C.C.et al.Archiv
es of Biochem−istry and Biophysics,244,1.27−34,1
986）。
第３図には鉄・EDTA錯体の存在下及び非存在下で得られ
た、XOによる反応開始後15分で測定した化学ルミネッセ
ンス曲線を示す。
鉄錯体は蒸留水でそれぞれ溶解したFeCl2（1mM）とEDTA
−Na2（100mM）とを等量混合して調製した。少なくとも
30分経過後、この溶液はヒポキサンチン／ルミノール混
合物で1/100に希釈された。XO反応のための反応（incub
ation）媒質中の錯体の最終濃度はそれゆえ５μＭであ
る。
この鉄・EDTA錯体はルミノールのXO誘発酸化に関連した
化学ルミネッセンス反応を10倍ずつ増加させる。したが
ってこの錯体の使用によりXO活性検出の閾値をさげるこ
とができる。
さらに第４図には、この錯体の存在下で生じる発光は、
非存在下で生じるそれと比べてわずかに不安定であった
ことが示されている。しかしながら反応開始後７時間30
分では化学ルミネッセンスとして測定された光量子放射
は鉄/EDTA存在下では非存在下でのそれと比べてはるか
に高い値を維持していた。
第４図の説明 キサンチンオキシダーゼ濃度0.8fmol及び80fmolにおけ
る鉄/EDTA存在下 非存在下 でのルミノールのキサンチンオキシダーゼ依存酸化の速
度論。
こうした特性は、鉄/EDTA錯体は当該反応のためのすぐ
れた増強物質の代表であり、ルーチンの分析手順で使用
が望ましいということを示している。
例2:アビジンの固相分析 1.XO−ビオチン共役体の調製 XO（Boehringer Mannheim社製）を3.2Mの（NH4）2SO4に
20mg/mlの濃度に浮遊してなる懸濁液を5000gで10分間遠
心分離させ、ペレットを50mMのNaClを含む20mMのホウ酸
緩衝液（pH8.5）1mlに溶解し、ビオチン×NHS（ビオチ
ンε−アミノカプロン酸Ｎヒドロキシスクシンイミドエ
ステル、Calbiochem社製）（1.2mg/12μｌ無水ジメチル
ホルムアミド）を添加した。この溶液をボルテックスミ
キサーで、２分間攪拌し、外気温中に１時間放置し、そ
の後0.13Mの塩化ナトリウムと0.1％のアジ化ナトリウム
を含む0.07M、pH7.4のリン酸ナトリウム緩衝液（PBS）
に対して透析した。このXO−ビオチン共役体は無菌状態
で４℃で保存した。
2.牛血清アルブミン・ビオチン共役体 50mgの牛血清アルブミン（BSA）（フラクションＶ、Flu
ba社製）をpH8.5で50mMの塩化ナトリウムを含む20mMの
ホウ酸緩衝液に溶解し、その後ビオチン×NHS（20mg/20
0μ無水ジメチルホルムアミド）溶液を添加した。そ
の後の操作手順はビオチン化XOの調製のために述べたも
のと同一であった。
3.BSA−ビオチン被覆試験管 pH9.6、0.1Mの炭酸緩衝液に溶解したビオチン化BSA（５
μg/ml）の150μをポリスチレンの試験管（Sarstedt
製、3.5ml、55×12mm）に添加した。試験管を４℃、16
時間インキュベート（incubate）しその後２度、蒸留水
で洗浄し試験管に残存する蛋白結合部位を0.1％アジ化
ナトリウムを含む、蒸留水に溶解した0.3％BSA溶液500
μで飽和した。
4.アビジン分析 BSAビオチン被覆試験管を0.1％のBSAを含むリン酸緩衝
液食塩水（PBS）の1mlで２度洗浄し、その後種々の濃度
の卵アビジン（Cal−biochem製）を含む溶液200μを
添加した。この試験管を外気温で30分インキュベートし
た。
0.1％BSA含有PBS（PBS BSA）で試験管を２度洗浄した後
XOビオチン（２μ/200mlPBS BSA）をこの試験管に添
加して、再び外気温で２時間インキュベートした。試験
管を洗浄してから、発光試薬（200μ）を添加した。
発光試薬の組成は下の通りである。
0.5×10-4Mルミノール 0.25Mバルビタールナトリウム緩衝液、 pH10.2 5mMヒポキサンチン 0.25mM EDTA二ナトリウム ５μＭ塩化第一鉄 試験管を蛍光測定装置（lumiinometa）におき、５秒間
カウントした。第５図はこの方法で行なったアビジン分
析の代表的な実験例を示す。
第５図の説明 横軸：アビジン濃度 μg/ml（ログスケール） 縦軸：アビジン存在下及び非存在下のカウント／秒（ロ
グスケール） かくしてXO依存化学ルミネッセンス系によって生じる光
の強度は特異的な結合反応混合液に存在するアビジンの
量の関数であることが明らかとなった。本発明はかくし
て固相分析によって溶液中のリガンドを決定するのに有
用な共役体（ビオチン化XO）を提供する。
例3:固相拮抗ビオチン分析 ビオチン結合拮抗分析（biotin competitive hinding a
ssay）の手順は以下の通りであった。
既形成複合体ビオチン化XO（10μg/ml）／ストレプトア
ビジン（0.3μg/ml）をPBS BSA中で調製し、外気温で3
0分インキュベートした。これをBSA−ビオチン被覆をほ
どこした試験管に加えた。BSA−ビオチン被覆試験管は
先きに述べた通りであった。すなわち−種々の濃度のビ
オチンを含む溶液100μ−既形成錯体100μ その後外気温で２時間（又は＋４℃で１晩）試験管をイ
ンキュベートし、さらにPBS BSA1mlで２度洗浄した。
化学ルミネッセンス発光試薬（200μ）をその後添加
し蛍光測定装置（lumiinameter）で試験管を５秒間カウ
ントした。
第６図はこの方法で行なわれた拮抗分析の代表的な実験
例を示している。この分析の感度はおよそ5pg（20fmo
l）である。
第６図の説明 横軸：ビオチン濃度（pg/サンプル直線スケール） 縦軸：カウント／秒（直線スケール） XO依存化学ルミネッセンス系によって生じる光の強度は
特異的な反応混合物中のビオチンの量の逆の関数であっ
た。本発明はかくして拮抗固相分析による液体媒質中の
リガンドの決定のためのトレーサーとして有用な複合体
を提供する。
例4:キソプラズマ抗体の検出 ａ）ビオチン化抗ヒトIgGの調製 0.25Mの塩化ナトリウム、0.02MでpH7.6のリン酸緩衝液
に溶解した抗ヒトIgGウサギ抗体（2.5mg/ml）（Jachson
Lahozatory）の0.71mlをビオチン×NHS（10mg/100μ
ジメチルホルムアミド）溶液８μに添加した。その後
の手順はXOのビオチン化のために述べたものと同一であ
った。
ｂ）トキソプラズマ抗原被覆試験管 トキソプラズマ抗原調製物はIusfifute Virion（チュー
リッヒ、スイス）から購入し、同調製物とともに提供さ
れた指示に従って再構成した。ポリスチレン試験管を再
構成した抗原調製物の150μで被覆し、外気温で１晩
インキュベートした。この試験管はPBS BSA緩衝液で洗
浄後、−20℃で乾燥した状態で保存した。
ｃ）既形成ビオチン化XO/ストレプトアビジン／ビオチ
ン化抗IgG複合体 ビオチン化XO/ストレプトアジビン／ビオチン化ウサギI
gG複合体をPBS BSA中でビオチン化XO（10μg/ml）をス
トレプトアビジン（0.5μg/ml）と共に15分間外気温で
インキュベートし、その後ビオチン化ウサギIgG（最終
濃度1.4μg/ml）を添加することによって調製した。
ｄ）抗トキソプラズマ分析 トキソプラズマ抗体分析の手順は以下の通りであった。
被覆した試験管をトキソプラズマ陽性又は陰性の対照血
清200μと共に−37℃で１時間インキュベートした。
トキソプラズマ対照血清はBiotrol Lahoratoriesから購
入した。その後試験管をPBS BSA緩衝液で洗浄しｃ）で
調製した既形成複合体（200μ）を添加した。
この試験管を３時間外気温で（又は４℃で１晩）インキ
ュベートし、PBS BSAで２度洗浄した。その後化学ルミ
ネッセンス発光試薬200μを上に述べたように添加
し、試験管を蛍光測定装置で５秒間カウントした。
第７図に２通りの異なった濃度のトキソプラズマ陽性の
対照血清を用いて得られた化学ルミネッセンス発光の速
度論の実験例が示されている。信号試薬の添加後30分以
内に最大発光が出現した。この発光は30時間の半減期で
減少する。
第７図の説明 横軸：時間（直線スケール） 縦軸：カウント／秒（ログスケール） 第８図は陽性及び陰性血清の各段階希釈について得られ
た化学ルミネッセンス応答を示している。
第８図の説明 横軸：マイクロリーター、コントロール血清（ログスケ
ール） 縦軸：希釈血清存在下及び非存在下のカウント／秒の比
率（ログスケール） ビオチン化XO/ストレプトアビジン／ビオチン化抗ヒトI
gG抗体複合体によって生じる化学ルミネッセンス発光の
強度は分析されるべきサンプル中のトキソプラズマに対
するヒトIgGの量に直接相関していた（ここに於て該複
合体は対応する抗原で被覆された固相に固定される）。
さらに得られた発光は日の単独で長期間の光放射を示し
ていた。
トキソプラズマ抗体分析と同様の手法でヒト血清中のク
ラミジア抗体の検出に於て類似の結果が得られた。
例5:プロラクチン免疫分析 この免疫分析に使用したプロラクチン分子のそれぞれ独
立した部位に対してつくられた２種のモノクローナル抗
体はイムノテック（Immunotech,Luming,France）から贈
与されたものである。
ａ）ビオチン化抗プロラクチンモノクローナル抗体の調
製 0.15mMの塩化ナトリウムを含む20mMのホウ酸緩衝液（pH
8.6）の0.75mlに溶解した抗プロラクチンモノクローナ
ル抗対IgG1/mgをジメチルホルムアミド20μに溶解し
た40μｇのビオチン×NHSで処理したその後の手順はビ
オチン化XOの調製のために上で述べた手順と同一であっ
た。
ｂ）抗プロラクチン抗体被覆試験管 ポリスチレン試験管を、0.1Mの炭酸緩衝液（pH9.6）150
μに19.5μｇのモノクローナル抗体IgG2を溶解したも
ので被覆した。被覆は外気温で１晩行ない、試験管を蒸
留水で１度洗浄し、残存する蛋白結合部位を500μの
0.3％BSA蒸留水溶液で飽和した。被覆した試験管を４℃
で保存した。
ｃ）プロラクチン免疫分析 プロラクチン免疫分析の手順は以下の通りであった。
−被覆試験管をPBS BSAで100倍希釈したビオチン化抗
プロラクチン抗体150μと50μの血清とで外気温で
１晩インキュベートした。
−この試験管をPBS BSAで２度洗浄した。
−PBS BSAで調製された既形成ビオチン化XO（10μg/m
l）／ストレプトアビジン（0.5μg/ml）複合体200μ
を添加し外気温２時間インキュベートした。
−PBS BSAで２度試験管を洗浄した。
−200μの信号試薬を添加した。
−各試験管を蛍光測定装置で５秒間カウントした。
200μg/mlの濃度の場合の化学ルミネッセンス発光の半
減期は30時間であった。信号試薬の添加後30分、21時
間、140時間で得られた標準曲線の比較は、これ以後の
タイムコースで化学ルミネッセンス判定の結果得られる
標準曲線は実質的には同一であることを示した。
比較例により急速にバックグラウンドが減少していくの
で感度は時間と共に上昇するようであった。
第９図の説明 横軸：プロラクチンng/ml（直線スケール） 縦軸：異なった標準血清で得られるカウント／秒の最大
濃度（200ng/ml）で得られるカウント／秒に対する比率
（直線スケール） このことは、相補的なモノクローナル抗体で被覆された
固相上に抗原によって固定されたビオチン化XO/ストレ
プトアビジン／ビオチン化モノクローナル複合体によっ
て生じた化学ルミネッセンス発光の大きさはサンプル中
の抗原量に直接関連しているということを証明した。
例6:トリヨードチロニン（T3）免疫分析 ａ）トレーサーの調製 1.19mgのビオチン化BSAをpH9.6、0.1Mの炭酸緩衝液（3m
l）で希釈した。12mlの0.04Mのバルビタール緩衝液（pH
9.4）を添加し、その後で先きに1mlのジメチルホルム
アミドに溶解された2.5mgのT3を添加した。共役反応は5
0μの0.04Mグルタールアルデヒド水溶液（蒸留水）を
添加することにより開始させた。混合物は外気温で３時
間インキュベートし、それから200μの0.1Mグリシン
水溶液（蒸留水）を添加して反応をとめた。さらにもう
１時間インキュベートしてから、37.5mMのSodium Boroh
ydride溶液を加え、混合物を４℃で1.5時間おいた。こ
の溶液を1.5mlに濾過濃縮し（Amicon B15）、その後で
共役体をゲル濾過カラムクロマトグラフィーにより精製
した（Ultrogel AcA44,Industrie Biolog−ique Franca
ise）（カラムの大きさ:60×0.9cm）。免疫活性及び酵
素活性のある分画はラジオイムノアッセイとヒポキサン
チン、ルミノール系に於いて化学ルミネッセンスによっ
てそれぞれ位置を決定し、これらの分画をプールした
（pool）。
ｂ）被覆試験管 0.1M炭酸緩衝液（pH9.6）に溶解したヤギ抗ウサギIgG
（ARGG）（Jackson Lab−oratories）の150μ（1.95
μg/150μ）でポリスチレン試験管を被覆した。これ
を外気温で１晩インキュベートし、その後試験管を洗浄
して、未反応の蛋白結合部位を0.3％ BSA水溶液（蒸留水）500μで飽和した。これらの被覆
試験管は４℃で保存した。
ｃ）抗T3抗体 抗T3抗体はカルボジイミドで誘導したT3BSA共役体でウ
サギを免疫して得られた。免疫グロブリンは30％硫安沈
澱を行ないさらにDEAE Sephacel（Pharmacia,Uppsala,S
weden）クロマトグラフィーを行なうことによって精製
された。
ｄ）T3免疫分析 T3分析の手順は以下の通りに行なった。
−ARGG被覆試験管を種々の濃度のT3（０〜12.4pmol）、
一定の濃度のT3ビオチン化 BSA共役体及び抗T3抗体
（最終希釈:1/15000）でインキュベート。すべての希釈
はPBS BSAで行ない、インキュベーション時の最終容積
は300μ。
−この試験管を0.05％のトリトン×100を含むPBS BSA
で洗浄。
−この試験管を既形成複合体（ビオチン化XO（10μg/m
l）／ストレプトアビジン（0.5μg/ml）とともにインキ
ュベート。
−PBS BSAで試験管を洗浄。
−信号試薬200μを添加。
−蛍光測定装置で５秒間各試験管をカウント。
表Ｉは２通りの希釈（10-3、10-4）のT3ビオチン化BSA
共役体を用いて得られた結果を示す。CPSはカウント／
秒（Counts/second）をあらわし、B/BOはT3非存在下で
結合したCPSで除した濃度Ｂで結合したCPSをあらわす。
免疫学的に固相に固定された複合体（ビオチン化XO/ス
トレプトアビジン／ハプテン−ビオチン化BSA）によっ
て生じた化学ルミネッセンス発光の強度はサンプル中の
ハプテン量に反比例した。
例7:T3−XO共役体を用いるトリヨードチロニン免疫分析 ハプテンXO共役体を用いる免疫分析に於ける化学ルミネ
ッセンスシステムの応用例はトリヨードチロニンの拮抗
免疫分析によって提供される。
ａ）T3−XO共役体の調製 XO調製物（Boehringer）とT3（Fluka）の共役はYamamot
oの方法（Clinical Chemistry,27−10,1721−1723ペー
ジ、1981）に従って行なった。
XOはSephadey G−25カラム（Pharmacia PD−10）で２度
連続してクロマトグラフィーを行なうことにより、0.1M
リン酸緩衝液（pH7）で平衡させた。得られた調製物の2
80nmと450nmに於ける吸収比率は5.8＋／−0.2に等しか
った。
T3のジメチルホルムアミド溶液600μ（T3 1mg/ml）
を60μの４−（マレイミドメチル）シクロヘキサン−
１カルボン酸コハク酸イミドエステル（SMCC）のジメチ
ルホルムアミド（DMF）溶液（2mg/ml）で処理しその後
1.2mlのリン酸緩衝液を添加した。混合物は５分おきに
ボーテックスミキサーではげしく攪拌しながら90分間30
℃でインキュベートした。
活性化反応は0.1Mグリシン（120μ）を添加すること
により停止させた。実際のT3−XO共役は、リン酸緩衝液
で平衡させたXOの100μｇを、上記の活性化T3溶液150μ
と、混合することにより行なった。混合物を30℃で30
分間インキュベートし、その後反応はリン酸緩衝液に溶
解した0.1Mのメルカプトエチルアミンを添加することに
より停止させた。
この反応媒質はその後溶離液として0.2％BSAを含む0.1M
リン酸緩衝液（pH7）を用いてUltrogel AcA34（Industr
ie Biologeque Francaise）カラムで精製された。XO酵
素活性は各分画について測定した。共役誘導体（T3−X
O）を含む分画は、ウサギから得られたIgGを用いて調製
した抗T3抗体で被覆した試験管にT3−XOを結合させてか
ら決定された。各被覆試験管に0.1％BSA含有0.1Mのバル
ビタール緩衝液（pH8.6）で希釈した分画100μを添加
してから、37℃で１時間インキュベートした。この試験
管を蒸留水で洗浄し固定されたXO活性を200μの信号
試薬を添加することにより決定した。
第10図はUltrogel AcA34カラムに共役媒質を通してから
抗T3固相に結合する分画をしらべた結果を示す。免疫活
性ピークの位置を決定し、該当する分画をまとめた。
第10図の説明 ｘ ｘ 全XO活性 ・ ・ 抗T3固相に結合したXO活性 ｂ）拮抗結合法によるT3の分析 上で得られたトレーサーをT3の免疫分析の実施に用い
た。第11図は該当する測定曲線を示す。
第11図の説明 ・ ・ 反応開始後15分で行なった１秒間のカウン
ト ｘ ｘ 反応開始後16時間で行なった１秒間のカウ
ント 横軸:T3（pmol）（ログスケール） 縦軸：カウント／秒×10-2（直線スケール） この分析には上で述べた抗T3IgGで被覆した試験管を用
いた。反応媒質（incubation medi−um）はトレーサー
を含む100μの10〜0.1pmolの各種濃度のT3によって構
成された。
すべたの希釈は0.1％BSAを含む0.1Mバルビタール緩衝液
（pH8.6）で行なった。反応（incubation）は37℃で１
時間行なった。固定されたXO活性の決定は上に述べたよ
うに行なった。
反応後16時間のXO中介化学ルミネッセンス反応によって
生じた光の量は反応後15分で測定した光量と比較してほ
んのわずかの減少しか示さなかった。したがってXO依存
化学ルミネッセンス反応の安定性は、固相に於ても液相
に於ても、推断されうる。
本発明の上述の記載は、説明と例証のために、特定の具
体化例についてなされている。しかしながら当該技術分
野に熟達した人々にとって、ここに記載された具体例を
準備し、実施するための手法における様々な修正や変更
が本発明の本質をはなれることなしになされうることは
明白である。出願人は本発明の範囲内に入るすべての同
等の修正及び変更をカバーするために前記の特許請求の
範囲を志向する。
【図面の簡単な説明】
第１図はルミノールのキサンチンオキシダーゼ依存酸化
の速度論を示す図表である。 第２図は基質の違いによる発光の安定性を示す図表であ
る。 第３図は鉄EDTA錯体によるルミノールのXO依存酸化の強
化を示す図表である。 第４図は鉄EDTA錯体のルミノールのキサンチンオキシダ
ーゼ依存酸化の速度論に対する影響を示す図表である。 第５図はアビジンの固相分析の結果を示す図表である。 第６図は固相拮抗ビオチン分析の結果を示す図表であ
る。 第７図はトキソプラズマ抗体を用いた時の化学ルミネッ
センス発光の速度論を示す図表である。 第８図は抗トキソプラズマ抗体検出の結果を示す図表で
ある。 第９図はプロラクチン免疫分析の結果を示す図表であ
る。 第10図はトリヨードチロニン−キサンチンオキシダーゼ
共役体を用いるトリヨードチロニン免疫分析の結果を示
す図表である。 第11図は固相に於けるキサンチンオキシダーゼ依存化学
ルミネッセンス反応の安定性を示す図表である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｊ 8310−2Ｊ Ｍ 8310−2Ｊ Ｕ 8310−2Ｊ

Claims (27)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】H2O2および超酸化物陰イオンの両者を生ず
    ることができるオキシダーゼと被分析物と同一の化学物
    質又はリガンドとの結合産物であるトレーサー（１）、
    ならびにオキシダーゼの基質、化学ルミネッセンス試薬
    及び鉄−EDTA錯体増感剤をpHおよそ9.5から10.5の範囲
    で含む信号試薬（２）からなり、約20時間より長く測定
    可能で化学ルミネッセンス分析に有用な長期間にわたる
    発光を生じさせ得るものであることを特徴とする、被分
    析物の分析試薬。
  2. 【請求項２】オキシダーゼがキサンチンオキシダーゼ、
    コリンオキシダーゼ、フマレートオキシダーゼ又はサル
    コシンオキシダーゼである、特許請求の範囲第１項に記
    載された分析試薬。
  3. 【請求項３】オキシダーゼがキサンチンオキシダーゼで
    ある、特許請求の範囲第１項に記載された分析試薬。
  4. 【請求項４】キサンチンオキシダーゼの基質がキサンチ
    ン、ヒポキサンチン、アセトアルデヒド又はプリンであ
    る、特許請求の範囲第３項に記載された分析試薬。
  5. 【請求項５】キサンチンオキシダーゼの基質がヒポキサ
    ンチンである、特許請求の範囲第３項に記載された分析
    試薬。
  6. 【請求項６】ルミネッセンス試薬がルミノールである、
    特許請求の範囲第１項に記載された分析試薬。
  7. 【請求項７】増感剤が遷移金属複合体である、特許請求
    の範囲第１項に記載された分析試薬。
  8. 【請求項８】信号試薬が、炭酸緩衝液、バルビタール緩
    衝液、ホウ酸緩衝液、リン酸緩衝液又はトリス緩衝液あ
    るいは類似するpHおよそ9.5から10.5の領域をつくる緩
    衝液に溶解した鉄−EDTA錯体増感剤、ヒポキサンチン及
    びルミノールからなる、特許請求の範囲第１項に記載さ
    れた分析試薬。
  9. 【請求項９】被分析物の拮抗化学ルミネッセンス分析法
    において、H2O2および超酸化物陰イオンの両者を生ずる
    ことができるオキシダーゼと被分析物と同一の化学物質
    又はリガンドとの結合産物であるトレーサー（１）、な
    らびにオキシダーゼの基質、化学ルミネッセンス試薬及
    び鉄−EDTA錯体増感剤をpHおよそ9.5から10.5の範囲で
    含む信号試薬（２）を用い、約20時間より長く測定可能
    な長期間にわたる発光を生じさせることを特徴とする方
    法。
  10. 【請求項１０】被分析物がハプテン又は抗原である、特
    許請求の範囲第９項に記載された方法。
  11. 【請求項１１】被分析物がトリヨードチロニンである、
    特許請求の範囲第10項に記載された方法。
  12. 【請求項１２】被分析物が抗体である、特許請求の範囲
    第９項に記載された方法。
  13. 【請求項１３】トレーサーが所定量の、被分析物と同一
    の化学物質にビオチン−アビジン結合を介して又は直接
    共有結合したオキシダーゼからなる、特許請求の範囲第
    ９〜12項のいずれか１項に記載された方法。
  14. 【請求項１４】リガンドが、リガンドに特異的な結合相
    手で固相支持体表面に被膜をつくり、リガンドをこれと
    反応させることにより当該支持体表面にリガンドの被膜
    をほどこしたものである、特許請求の範囲第９〜13項の
    いずれか１項に記載された方法。
  15. 【請求項１５】被分析物のサンドイッチ化学ルミネッセ
    ンス分析法又はイムノブロッティング法において、H2O2
    および超酸化物陰イオンの両者を生ずることができるオ
    キシダーゼと被分析物と同一の化学物質又はリガンドと
    の結合産物であるトレーサー（１）、ならびにオキシダ
    ーゼの基質、化学ルミネッセンス試薬及び鉄−EDTA錯体
    増感剤をpHおよそ9.5から10.5の範囲で含む信号試薬
    （２）を用い、約20時間より長く測定可能な長期間にわ
    たる発光を生じさせることを特徴とする方法。
  16. 【請求項１６】被分析物が抗原又は抗体である、特許請
    求の範囲第15項に記載された方法。
  17. 【請求項１７】被分析物がプロラクチン、抗トキソプラ
    ズマ抗体又は抗クラミジア抗体である、特許請求の範囲
    第16項に記載された方法。
  18. 【請求項１８】被分析物がモノクローナル抗体である、
    特許請求の範囲第15項に記載された方法。
  19. 【請求項１９】トレーサーが相補的リガンドとビオチン
    −アビジン結合を介して又は直接共有結合したオキシダ
    ーゼからなる、特許請求の範囲第15項に記載された方
    法。
  20. 【請求項２０】以下のａ）〜ｅ）の操作手順からなり、
    約20時間より長く測定可能な長期間にわたる発光を生じ
    させる、オキシダーゼによるイムノアッセイのための方
    法。 ａ） 当該オキシダーゼに対する抗体で被覆した固相支
    持体を用意すること。 ｂ） 固相支持体の存在下に分析すべきオキシダーゼを
    含むサンプルを反応（incubation）させること。 ｃ） 固相支持体を洗浄すること。 ｄ） オキシダーゼの基質、化学ルミネッセンス試薬お
    よび鉄−EDTA錯体増感剤をpHおよそ9.5から10.5の範囲
    で含む信号試薬を固相支持体に添加すること。 ｅ） 化学ルミネッセンス応答を測定し、サンプル中の
    オキシダーゼ量を演繹すること。
  21. 【請求項２１】オリゴヌクレオチド被分析物を検出する
    ための化学ルミネッセンス法において、H2O2および超酸
    化物陰イオンの両者を生ずることができるオキシダーゼ
    と被分析物と同一の化学物質又はリガンドとの結合産物
    であるトレーサー（１）、ならびにオキシダーゼの基
    質、化学ルミネッセンス試薬及び鉄−EDTA錯体増感剤を
    pHおよそ9.5から10.5の範囲で含む信号試薬（２）を用
    い、約20時間より長く測定可能な長期間にわたる発光を
    生じさせることを特徴とする方法。
  22. 【請求項２２】以下のａ）〜ｅ）の操作手順からなり、
    約20時間より長く測定可能な長期間にわたる発光を利用
    する、オリゴヌクレオチド被分析物を検出するための化
    学ルミネッセンス法。 ａ） オリゴヌクレオチド被分析物を一本鎖の状態で固
    相支持体に沈積させること。 ｂ） 操作手順ａ）のオリゴヌクレオチド被分析物を、
    該被分析物に対する相補的なオリゴヌクレオチド結合相
    手であるリガンドとオキシダーゼとを結合させたものか
    らなるトレーサーとハイブリダイゼーションをおこす条
    件下で反応（incubatai−on）させること。 ｃ） 固相支持体を洗浄すること。 ｄ） オキシダーゼの基質、化学ルミネッセンス試薬お
    よび鉄−EDTA錯体増感剤をpHおよそ9.5から10.5の範囲
    で含む信号試薬をこの固相支持体に添加すること。 ｅ） 化学ルミネッセンス応答を測定し、サンプル中の
    オキシダーゼの量を演繹すること。
  23. 【請求項２３】トレーサーがビオチン−アビジン結合を
    介して又は直接共有結合でリガンドと結合したオキシダ
    ーゼからなる、特許請求の範囲第22項に記載された方
    法。
  24. 【請求項２４】それぞれ別々の容器に封入した以下の
    ａ）〜ｃ）の試薬からなり、約20時間より長く測定可能
    な長期間にわたる発光を利用して拮抗方式又はサンドイ
    ッチ方式による化学ルミネッセンス分析法で被分析物を
    検出するために使用するキット。 ａ） 被分析物に特異的な結合相手であるリガンドで被
    覆した固相支持体。 ｂ） オキシダーゼと所定量の、被分析物と同一の化学
    物質又はリガンドのいずれかとの結合産物からなるトレ
    ーサー。 ｃ） オキシダーゼの基質、化学ルミネッセンス試薬お
    よび鉄−EDTA錯体増感剤をpHおよそ9.5から10.5の範囲
    で含む信号試薬。
  25. 【請求項２５】トレーサーが所定量の、被分析物と同一
    の化学物質にビオチン−アビジン結合を介して又は直接
    共有結合したオキシダーゼからなる、特許請求の範囲第
    24項に記載されたキット。
  26. 【請求項２６】それぞれ別々の容器に封入した下記の
    ａ）〜ｃ）の試薬からなり、約20時間より長く測定可能
    な長期間にわたる発光を利用してオリゴヌクレオチド被
    分析物を検出する化学ルミネッセンス分析法に使用する
    キット。 ａ） 被分析物を沈積させるための固相支持体。 ｂ） オキシダーゼと被分析物に対して相補的なヌクレ
    オチド結合相手であるリガンドとの結合産物からなるト
    レーサー。 ｃ） オキシダーゼの基質、化学ルミネッセンス試薬お
    よび鉄−EDTA錯体増感剤をpHおよそ9.5から10.5の範囲
    で含む信号試薬。
  27. 【請求項２７】トレーサーがビオチン−アビジン結合を
    介して又は直接共有結合で被分析物に結合したキサンチ
    ンオキシダーゼからなる、特許請求の範囲第26項に記載
    されたキット。
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