JP4117033B2 - 化学物質の生合成による製造方法 - Google Patents
化学物質の生合成による製造方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP4117033B2 JP4117033B2 JP31553392A JP31553392A JP4117033B2 JP 4117033 B2 JP4117033 B2 JP 4117033B2 JP 31553392 A JP31553392 A JP 31553392A JP 31553392 A JP31553392 A JP 31553392A JP 4117033 B2 JP4117033 B2 JP 4117033B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- protein
- dna
- epidermin
- plasmid
- sequence
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/107—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides
- C07K1/113—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides without change of the primary structure
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/305—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Micrococcaceae (F)
- C07K14/31—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Micrococcaceae (F) from Staphylococcus (G)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
- C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
- C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/50—Fusion polypeptide containing protease site
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/55—Fusion polypeptide containing a fusion with a toxin, e.g. diphteria toxin
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/90—Fusion polypeptide containing a motif for post-translational modification
- C07K2319/92—Fusion polypeptide containing a motif for post-translational modification containing an intein ("protein splicing")domain
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Cephalosporin Compounds (AREA)
- Polymers With Sulfur, Phosphorus Or Metals In The Main Chain (AREA)
- Compounds Of Unknown Constitution (AREA)
- Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
- Epoxy Compounds (AREA)
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、化学物質の生合成、より具体的にはデヒドロアミノ酸残基、および／またはチオエーテル結合を含む化学物質の生合成に関する。また、本発明は、該化学物質の生合成に関する酵素を生産するための組み換え遺伝学の利用に関する。
【０００２】
【従来技術】
ニシン、ズブチリン、ズラマイシン、シナマイシン、アンコベニン、Ｒｏ０９−０１９８およびエピデルミン等のポリペプチド抗生物質は、デヒドロアミノ酸およびランチオニン結合を含んでいる。これらのポリペプチドは、種々の各微生物株から生産される。例えば、ニシンはストレプトコッカス ラクチン（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｎ）、ズブチリンは枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）を培養することにより生産しうる。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
今日まで、これらの抗生物質の生合成に関する遺伝学的基礎は明らかになっていない。すなわち、例えばこれらの抗生物質の生合成、特にこれらの中に見られる異常アミノ酸の生成がリボゾーム合成によるものか、多酵素複合体(complex) によるものかは分かっていない。
さらに、これらの抗生物質の前駆体タンパク質が明確な構造遺伝子にコードされているのか、または、より大きいタンパク質の分解産物なのかが分かっていない。
【０００４】
【発明が解決するための手段】
エピデルミンの構造遺伝子を特定する研究の過程で、意外なことに上述の各抗生物質、特にエピデルミンが明確な構造遺伝子によってコードされており、かつ、プレ配列ポリペプチドのプロセシングがデヒドロアミノ酸残基、および／またはチオエーテル結合の生成に関する酵素複合体によって起こることが明らかになった。
さらに、この多酵素複合体は、プレポリペプチドのプロセシングと同時に該タンパク質を細胞膜を通して培養上清に分泌する事にも関与している。この点に関して、これらの活性は、例えば、以下に説明するプレ・エピデルミンの−３０乃至−１の配列の場合のようにプレ・ポリペプチドが有するプレ・配列に関係している。
概して言うと、本発明の一つの特徴は、通常、宿主によって生産されないポリペプチドをコードするプラスミドを含む細菌宿主であって、培養に際して少なくとも１つのデヒドロアミノ酸、および／または、少なくとも１つのランチオニン結合を含むポリペプチドであって、該宿主にとって外来のポリペプチドを生産する多酵素複合体を提供する宿主を提供することにある。
適当な多酵素複合体とは、以下に示す機能、即ち、水脱離およびスルフィド結合形成の少なくとも１つを果たしうるものである。また、この多酵素複合体は、脱炭酸および二重結合形成も行いうる。
【０００５】
本発明の方法を実施するのに適した宿主は、その遺伝物質を修正すること無しにデヒドロアミノ酸残基および／またはランチオニン結合および／またはメチルランチオニン結合を含むポリペプチドを生産しうるものである。このような宿主の例には、ストレプトコッカス ラクチス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、ストレプトミセス シナモニウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｉｎｎａｍｏｎｅｕｓ）、ストレプトミセス ｓｐ．ストレプトベルチカラム グリセオベルチシカム（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．Ｓｔｒｅｐｔｏｖｅｒｔｉｃｕｌｌｕｍ ｇｒｉｓｅｏｖｅｒｔｉｃｉｌｌｕｍ）、スセフィロコッカス エピデルミス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｓ）、スタフィロコッカス エピデルミン ５株（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｎ ｓｔｒａｉｎ５）、スタフィロコッカス ガリナラム（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）およびこれらの変異株、例えばエピデルミンを生産しえないＳ．エピデルミン（Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｎ）ＤＳＭ３０９５の変異株がある。
特に興味深い株は、１９８８年５月１８日、ブダペスト協定に基づきドーシェ・サムラング・ホン・マイクロオーガニズメン（Ｄｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ）に、寄託番号ＤＳＭ４６１６−Ｔｕ３９２８として寄託されているスタフィロコッカス ガリナラム（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）（Ｆ１６／Ｐ５７）Ｔｕ３９２８、および１９８４年１０月２６日、ブダペスト協定に基づきドーシェ・サムラング・ホン・マイクロオーガニズメン（Ｄｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ）に本出願者により寄託されたスタフィロコッカス エピデルミス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｓ）ＤＳＭ３０９５である。
【０００６】
適当な宿主をトランスホームするために、適当なプラスミドを従来の遺伝子工学技術を用いて修正しうる。
プレポリペプチドをコードする遺伝子の修正または置換により、少なくとも１つのデヒドロアミノ酸残基および／または少なくとも１つのスルフィド結合を含むポリペプチドを生産する宿主由来のプラスミドを処理して該宿主にとって外来のポリペプチドをコードするプラスミドを提供し、この修正したプラスミドで該宿主をトランスホームすることが望ましい。
プレ・ポリペプチドをコードする遺伝子を置換または修正するには、様々な方法が使用される。
望ましい化合物のプレ・ポリペプチド配列をコードするＤＮＡは、化学合成で調製しうる。適当な化学合成法は、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１２１，３６５（１９８２）に報告されている。従来技術で、例えば６０−１００塩基のポリヌクレオチドの合成が可能である。
適当な保護ヌクレオチドは、ホスホトリエステル法（アガーワル（Ａｇａｒｗａｌ）等、Ａｇｎｅｗ，Ｃｈｅｍ．８４，４８９（１９７２））、ホスホトリエステル法（リーセム（Ｒｅｅｓｅｍ）．、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ ３９，３，（１９８３））またはホスファイトトリエステル法（レジンガー（Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ）等、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．９８，３６５５（１９７６））またはホスホアミダイト法で連結しうる。固相法がポリヌクレオチド合成を簡便にしている。
二本鎖ＤＮＡは、化学合成した短いが重複したセグメントから酵素的に構築しうる。
例えば、両ＤＮＡ鎖の重複ポリヌクレオチド配列を塩基対合で正しい配置を取らせ、ＤＮＡリガーゼにより化学的に結合させることが出来る（コラーナ（Ｋｈｏｒａｎａ）等、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５１，５６５（１９７６））。
【０００７】
別の可能性として、短い重複セグメントを有する２つのＤＮＡ鎖の各ポリヌクレオチド配列を必要とされるデオキシヌクレオシド三リン酸の存在下、ＤＮＡポリメラーゼ、例えば、ＤＮＡポリメラーゼＩ、ポリメラーゼＩのクレノーフラグメントまたはＴ４ＤＮＡポリメラーゼ、または逆転写酵素とインキュベーションする事が挙げられる。即ち、２つのポリヌクレオチド配列が塩基対合で正しい配置を取り、酵素により必要とされるヌクレオチドが補填されることによって完全な二本鎖ＤＮＡが提供される（ナラニー（Ｎａｒａｎｙ）等、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１２１，３６５（１９８２））。
ポリペプチドをコードするＤＮＡを得る別の適当な方法には、細胞を、例えばＳＤＳまたはプロテナーゼＫ、または望ましい場合は機械的に分解し、そのＤＮＡを繰り返しフェノールで抽出することにより除タンパクを行うことにより、組織または細胞培養物または微生物のゲノムＤＮＡからＤＮＡを単離する方法がある。
ＲＮＡはＲＮＡａｓｅで消化しうる。得られた粗ＤＮＡは、適当な制限酵素、例えばＨａｅIII およびＡｌｕＩで消化し、フラグメントを単離し、適当なファージまたはコスミド、例えばシャロン４ＡまたはＥＭＢＬ−３ファージ中で増幅した後、例えば、放射能ラベルしたＤＮＡプローブを用いて望ましい配列を検定する。
また、望ましいポリペプチドをコードするＤＮＡは、単離したｍＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写することにより得ることが出来る。この方法は、ＤＮＡの構造が分からない場合に有効である。この方法では、ｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡライブラリー中のゲノムＤＮＡからＤＮＡを得る。ｃＤＮＡライブラリーには、細胞から単離したｍＲＮＡに相補的な遺伝情報が含まれている。
ｃＤＮＡを得るために、ｍＲＮＡを望ましい基本（出来るだけ未修正の）タンパク質を発現する細胞から単離する。このｍＲＮＡを二本鎖ｃＤＮＡに変換する。
【０００８】
ｍＲＮＡの調製には、従来法を使用する。細胞膜を破壊し、放出される細胞内容物からｍＲＮＡを単離する。細胞膜は、物理的方法で破壊するか、またはＳＤＳ等の界面活性剤、クアニジンチオシアネート、限定塩条件またはホモゲナイゼーション、望ましくはミキシングにより分解する事が望ましい。ｍＲＮＡは、フェノール抽出、エタノール沈殿、遠心およびクロマトグラフィーを含む標準的方法、望ましくは幾つかの方法を組み合わせて単離される。遠心は、勾配、例えばＣｓＣｌ勾配をかけて行うことが望ましい。クロマトグラフィーに関しては、カラム、特にオリゴ−ｄＴカラムを使用することが望ましい。
全ｍＲＮＡは、従来法に従い直接Ｄｓ−ｃＤＮＡに変換しうる。さらに、望ましいポリペプチドをコードするｍＲＮＡは、電気泳動、クロマトグラフィーおよび遠心、望ましくはスクロース勾配遠心等の幾つかの技術を用いて濃縮することが望ましい。
望ましいポリペプチドをコードするｍＲＮＡを含むフラクションは、インビボまたはインビトロ・トランスレーションと関連活性の検定、またはヌクレオチド配列が既知の場合は、オリゴヌクレオチドプローブとのハイブリダゼーション等の種々の方法で検出しうる。
インビボ・トランスレーション・システムは、原核性または真核性システムで行いうる。望ましいインビボ・トランスレーション・システムは、ゼノパス レビス（Ｘｅｎｏｐｕｓ ｌａｅｖｉｓ）卵細胞系（マニアチス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）等、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｎｕａｌ，コールドスプリングハーバーラボラトリーズ、コールドスプリングハーバー、ＮＹ（１９８２））がある。インビトロ・システムには、例えば小麦胚芽およびウサギ網状赤血球溶解物があり、いずれも市販されている。
【０００９】
未分画または分画したｍＲＮＡ由来のｍＲＮＡプールから従来法にしたがってｄｓ−ｃＤＮＡを得ることが出来る（望ましい一般的方法は、マニアチス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）等（上述）、オカヤム（Ｏｋａｙａｍ）およびバーグ（Ｂｅｒｇ）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２，１６１−１７０（１９８２）およびハイデッカー（Ｈｅｉｄｅｃｋｅｒ），ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １１，４８９１−４９０６（１９８３））。一般に、先ず、ｍＲＮＡを逆転写酵素またはＤＮＡポリメラーゼ（クレノーフラグメント）を用いてｓｓ−ＤＮＡに変換する。ｄｓ−ＤＮＡの合成を開始させるには２つの方法のいずれかが使用される。第１の方法は、ｓｓ−ＤＮＡのナチュラル・ループ形成である。第２の方法は、ポリ−ｄＣまたはポリ−ｄＴ等のホモポリマー・テールをｓｓ−ｃＤＮＡに付加する方法である。
対応するポリペプチドが検出システムで高い活性を示すｍＲＮＡフラクションを従来法に従い相補的ｃＤＮＡに転写する。ｍＲＮＡおよびプライマーのオリゴ−ｄＴを混合し、開始物質としてｄＮＴＰを添加すると逆転写酵素によりｃＤＮＡ−ｍＲＮＡハイブリッド分子の合成が行われる。ＲＮＡ分子はＮａＯＨの添加により分解する。ＤＮＡポリメラーゼ、望ましくはＤＮＡポリメラーゼＩのクレノーフラグメントを混合し、その混合物を適当な温度、望ましくは１２−１５℃でインキュベートする。この混合物をヌクレアーゼＳ１とインキュベーションすることにより、目的のポリペプチドをコードするｍＲＮＡに対応するｄｓ−ｃＤＮＡが得られる。
得られたｄｓ−ｃＤＮＡを増幅するためには、これを適当なベクター、例えばプラスミドｐＵＣ−ＫＯにスプライスし、得られたハイブリッドベクターを適当な宿主、例えば大腸菌ＨＢ１０１を用いて増やすことが出来る。このハイブリッドベクターを再び単離し、そこから単離したｃＤＮＡを回収することにより、目的のポリペプチドをコードするＤＮＡの構造を決定することが出来る。
【００１０】
ハイブリッドベクターの調製
本発明のハイブリッドベクターは、目的の配列を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを適当なベクターにスプライスする事により調製しうる。
適当なベクターとは組み込んだパッセンジャーＤＮＡのキャリヤーであって、宿主微生物のトランスホームに使用しうるものである。
ベクターとして適当なものは、非トランスホーム状態でデヒドロアミノ酸および／またはスルフィド結合を含むポリペプチドを生産する微生物に由来するプラスミドである。適当なベクターは、決まった位置に挿入ＤＮＡを有している。
一般に、これらのベクターは、宿主細胞または使用される宿主細胞に適合する細胞種に由来するレプリコンおよびコントロール配列、即ちプロモーターを含んでいる。通常、このベクターはレプリコン部位を有し、かつトランスホーム細胞に発現型選択を可能にする配列（マーカー遺伝子）を含んでいる。適当なマーカー遺伝子は、抗生物質耐性または重金属耐性を提供するか、または宿主の遺伝的欠陥を補う。さらに、これらのベクターに有用な配列には、エンハンサーおよびアクチベーター配列がある。
適当な開始ベクターには、スタフィロコッカス エピデルミス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｓ）ＤＳＭ３０９５株由来の５４ kbpのプラスミドｐＥｐｉ３２があり、これはプラスミドｐＴｕ３２と同じである。以下に特徴を示すこのプラスミドは、テトラサイクリック２１−ペプチド・アミド抗生物質にプロセシングされる５２−プレペプチドをコードするｅｐｉＡ遺伝子を含んでいる。パッセンジャーＤＮＡを含むベクターをハイブリッドベクターと呼ぶ。
【００１１】
目的のＤＮＡは、従来法に従い開始ベクターにスプライスする。
例えば、先ず開始プラスミドを適当な制限酵素、例えばプラスミドｐＥｐｉ３２の場合はＨｉｎｄIII 、ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩで線状化し、ｄＧＴＰおよびターミナル・デオキシヌクレオチジル・トランスフェラーゼの存在下でｄＧテール化する。二本鎖ｃＤＮＡ挿入物は、ｄＣＴＰおよびターミナル・デオキシヌクレオチジル・トランスフェラーゼの存在下でｄＣテール化する。ｃＤＮＡおよびベクターを合わせることによりハイブリッドベクターが出来る。ゲノムライブラリーを構築するには、ラムダ等のバクテリオファージが望ましい。ラムダ・クローニング・システムについては、マニアチス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）等（上述）により報告されている。適当なベクターＤＮＡを適当な制限酵素で完全に消化し、速度勾配遠心またはゲル電気泳動により左右のアームと中央フラグメントを分離する。別の方法では、左右のアームに認識部位を欠くスタッファーフラグメントの一部を制限酵素で消化する。単離したゲノムＤＮＡを長さ１３−２０ kbpのフラグメントに部分分解する。その後、アームをアームの末端と適合する末端を有する外来ＤＮＡのフラグメントとライゲーションする。
最初のクローニングに使用したベクターから適当なＤＮＡ挿入物を適当な発現ベクターに再クローニングする。最後に、適当な制限酵素を、可能ならオキソヌクレオンと組み合わせて使用して目的のＤＮＡフラグメントを生成する。
ＤＮＡ挿入物は、従来の適当なプラスミドベクターの多くの部位、例えばｐＣ１９４、ｐＴ１８１およびｐＵＢ１１０のＨｉｎｄIII ／ＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩ制限部位にサブクローニングしうる。
【００１２】
このように、本発明の方法は、既知のペプチドおよびホルモンの誘導物であって、その未修正のペプチド内のシステイン残基をスルフィド結合アミノ酸に置換し、かつセリンおよびチアミンを対応するデヒドロアミノ酸残基に置換した誘導体を調製するのに使用しうる。
これらのフラグメントは、直接粘着末端を用いるか、または適当に化学合成されたオリゴヌクレオチド・ブリッジを付加することにより適当な発現ベクターに組み込まれる。末端の修正には、例えばＨｉｎｄIII およびＢｇｌIIを使用しうる。この方法は、制限酵素の種類に制限されることはない。適当な制限酵素と化学合成したオリゴヌクレオチドを組み合わせて使用することにより、発現ベクターとＤＮＡ挿入物とを結合することができる。
また、部位特異的突然変異を有するポリペプチドをコードする適当なＤＮＡ挿入物も得ることが出来る。
目的の変異体を得るために基本となるＤＮＡに突然変異を誘導するには、種々の方法を使用しうる。
１つの方法では、先ず、変異させる領域をコードする配列を含む天然の、または基本遺伝子のフラグメントをファージの複製型、例えばＭ１３ｍｐ８ＰＡを調製する場合のＭ１３ｍｐ８に挿入する。挿入する配列に相補的出るが、置換するアミノ酸をコードする１つ以上のヌクレオチドトリプレットを含む合成オリゴヌクレオチドをＭ１３ｍｐ８Ａの一本鎖にアニールし、二本鎖領域を作る。この領域は、残りの相補鎖のＤＮＡポリメラーゼＩ合成のプライマーの役割を果たす。複製および同定後、この変異配列をさらに修正するか、もしくは変異ポリペプチドを発現する適当なベクターの構築に用いる。
【００１３】
エピデルミンに関して行った研究では、エピデルミンに関して提唱されているプレ・配列の適当なペンタペプチドＬｙｓＰｈｅＣｙｓＴｈｒから誘導されるワブルＤＮＡプローブ５’−ＧＴＧ（Ａ）ＣＡＴ（Ｇ／Ａ）ＡＴＧ（Ａ）ＡＡＴ（Ｃ）ＴＴ−３’を合成した。このＤＮＡプローブをＳ．エピデルミン（ｅｐｉｄｅｒｍｉｎ）ＤＳＭ３０９５由来のプラスミドＤＮＡにハイブリダイズした。
単離したプラスミドの制限分析により、ＥｃｏＲＩで７個のフラグメント（１６，１１，１０，６．５，５．５，３．５および２．５ kbp）、ＨｉｎｄIII で９個のＤＮＡフラグメント（１７，１４，１０，５．３，２．８，１．８，０．８，０．６および０．５ kbp）およびＢａｍＨＩで５個のＤＮＡフラグメント（２０，１９，１０，３および１ kbp）が確認された。
５．４ kbpのＨｉｎｄIII フラグメントをサブクローン化し、リハイブリダゼーションする事により、構造遺伝子ｅｐｉＡは２．２ kbpＥｃｏＲＩ／ＢｇｌIIフラグメントに存在することが分かった。
ハイブリダゼーションプローブとして２４種の１４マーの混合物を使用した。
ノビク（Ｎｏｖｉｋ）等、Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１８２，２７９−２９４（１９７１）、サザン（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ）、Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．９８，５０３−５１７（１９７５）およびハインリッヒ（Ｈｅｉｎｒｉｃｈ）等、Ｍｏｌｅｃｕｌ．ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２０９，５６３−５６９（１９８７）に示されている技術に従い、シーケンシングプライマーとして３０倍過剰量のプローブを使用した。エピデルミンのペプチド配列で、オープン・リーディング・フレームを同定しえた。シャイン・ダルガルノ配列から適当な距離に単一のメチオニンコドンが存在している。プレ・エピデルミンの構造遺伝子はＴＡＡ停止コドンで終わっており、その結果、プレ・エピデルミンは５２個のアミノ酸を含み（第１図）、Ａｒｇ-1およびＩｌｅ+1の間でプロセシングされてエピデルミンとなる。以上のことから明らかなように、プレ・エピデルミンはより大きいタンパク質の分解産物ではなく、明確な構造遺伝子によりコードされている。
従って、意外にも抗生物質の前駆体タンパク質は、明確な構造遺伝子によってコードされていることが明らかになった。
【００１４】
二次構造（α、β）、フレキシビリティー、ハイドロパシー、親水性（第２図）およびヘリックス・ホイール・プロットに関する予測をハイコン（Ｈｙｃｏｎ）プログラムを用いて行った（第３図）。プレ・エピデルミン−３０乃至−８に関して高いα−ヘリックス含量の可能性が予測され、一方、プロ・エピデルミンに対応するＣ末端部分には高いターン含量の可能性が示された。さらに、予測プロットは、Ｎ末端−３０乃至−１が高い親水性、一方、Ｃ末端部分がより親油性であることを明確に示している。Ｎ末端部分−３０乃至−８は、部分的に折り畳んでおり、両親媒的α−ヘリックスとなっているようである。
プレ・エピデルミンのＮ末端セグメントはシステイン残基を含んでおらず、一方、Ｃ末端セグメント１−２２はスルフィド結合形成に関する４個のシステイン残基を含んでいる。配列−３０乃至−１はエンドプロテアーゼに対する多くの切断部位を含んでいるが、一方、プレ・エピデルミン状態でさえ、配列１−２２は蛋白分解に対して非常に耐性を有している。
成熟型抗生物質は部位１３のＬｙｓでのみトリプシンの攻撃を受ける。プロセシング部位Ａｒｇ-1−Ｉｌｅ+1は、ターン形成するＰｒｏ-2のために親水性で接近可能となっている。
【００１５】
エピデルミンなどの抗生物質の生産において発生する種々の酵素反応には、プロ・ポリペプチド部分１−２２の修飾、Ｎ末端プレペプチドフラグメント−３０乃至−１の切断および成熟型抗生物質の分泌が含まれる（第４図および第５図）。
酵素的修飾は、プレペプチドフラグメントの切断前に起こる。酵素的修飾には、デヒドロアラニンおよびデヒドロブチリン残基を生成する各々部位５、１６、１９および８、１４のＳｅｒおよびＴｈｒ残基からの水の脱離が含まれる。また、部位２、１１、２１および２２のＣｙｓ残基のチオール基のＣ＝Ｃ二重結合への付加も起こり、メソ−ランチオニンまたは（２Ｓ ３Ｓ，６Ｒ）−３−メチル−ランチオニン結合が生ずる。さらに、残基２２の脱炭酸および二重結合形成でＣ末端Ｓ−（２−アミノビニル）−Ｄ−システインが生ずる。Ｃ末端に存在するシステインのチオール基とＮ末端に存在するデヒドロアミノ酸との反応は、エピデルミン、ニシンおよびズブチリンにおいては完全な立体特異性を以て起こる。従って、修飾の際のこれらの脱離・付加反応は、プレ・エピデルミンの残基Ｌ−ＳｅｒおよびＬ−ＴｈｒのＣα炭素原子の配置を逆転させＤ型Ｃα原子とする事を意味している。
また、４個のスルフィド環が、結果的に同じ触媒部位に生成するが、この事はＮ末端の両親媒体性α−ヘリックスとの相互作用で支持される。Ｔｈｒ+14 のみが、システインとは無関係に脱水する。この部位（Ｌｙｓ+13 −Ｄｈｂ+14 ）は酵素切断部位を形成しており、ここでトリプシンがエピデルミンを失活させる。スルフィド環生成によりＣ末端のリジディティーおよび疎水性が増加して、脂質二重層とプロ・エピデルミンとの相互作用を促進され、かつ、トランスロケーションが誘導される。
最後に、親水性のα−ヘリックスＮ末端−３０乃至−１は、上述の特徴的切断部位で特異的プロテアーゼにより切断を受ける。
【００１６】
上述の技術を用い、ランチビオティクスをコードするプラスミドを各ポリペプチドをコードする遺伝子の突然変異または異なるポリペプチドをコードする遺伝子でそのような遺伝子を置換することにより修正し、本来の宿主、もしくは、天然の状態でそれらの宿主がランチビオティクス発現しうる場合には、別の宿主をトランスホームするのに使用しうる。
一般に、例えばエピデルミンの場合について上述したように、本来の機能的遺伝子がプレ・配列をコードしている場合、そのようなプレ・配列をコードしているＤＮＡ配列は、修正したプラスミドに保持しうる。この場合、新規の、または変異したプロ・ポリペプチドに関するＤＮＡ配列は、本来のプロ・ポリペプチド配列と同様にプレ・配列の直ぐ上流に位置することになる。
本発明の細菌宿主の培養は、例えば、１９８８年５月１８日の英国特許出願第８８１１７６０．１号およびヨーロッパ特許出願第０ １８１ ５７８号に示されているような従来の培養条件で行いうる。また、目的のタンパク質の精製および単離もエピデルミンおよびガリデルミンに関して先の特許出願に示されている、吸着剤、イオン交換樹脂および望ましい場合はＨＰＬＣを使用する方法または適当な修正法を用いて行いうる。
【００１７】
本発明の方法は、実験用の新規化合物の生成、または新規宿主中の既知化合物または既知化合物の誘導体の生成に応用しうる。例えば、エピデルミンをコードする遺伝子を含むプラスミドをストレプトコッカス ラクチス（Ｓｔｒｅｐｔｐｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）にトランスホームして該宿主からエピデルミンを生産しうるし、また、ガリデルミンをコードする遺伝子（先に示した英国特許出願参照）を、例えばプラスミドｐＥｐｉ３２におけるようにエピデルミンのプロ・ポリペプチドをコードする遺伝子と置換し、これを用いてスタフィロコッカスエピデルミス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｓ）ＤＳＭ３０９５をトランスホームして該宿主からガリデルミンを生産しうる。同様に、ヒトのインシュリンなどのホルモン、オキシトシン、バソプレシン、ペプチド抗生物質、エラスターゼインヒビター等のホルモンインヒビターおよびヒトの組織プラスミノーゲン活性化因子などの繊維素溶解剤等、デヒドロアミノ酸残基および／またはランチオニン結合および／またはメチルランチオニン結合を含む他の生物学的に活性なペプチド誘導体も生産しうる。親化合物の生物学的活性を保持すると同時に、これらの化合物の安定性を増し、寿命を延ばすことが出来る。
理想的には、目的のプロ・ポリペプチドをコードするＤＮＡは、チオエーテル結合を形成するためのシステインおよびセリン、および／またはシステインおよびスレオニンに対するコドンが含まれるべきである。
比較的短いポリペプチド鎖の場合には、通常、これらの各々のコドンはわずか８個、望ましくはわずか６個のコドンで分離してているが、もっとも最終的ポリペプチド分子の立体配置に応じてより以上の間隔も可能であることが想像される。
デヒドロアミノ酸の生成の関しては、通常、これらはセリンおよびスレオニンから誘導されることから、目的のプロ・ポリペプチドをコードするＤＮＡにはこのようなアミノ酸に対するコドンが含まれる。
【００１８】
本発明の方法にしたがって生産したポリペプチド中に存在する異常アミノ酸には、デヒドロアラニン、２，３−デヒドロ−２−アミノ酪酸、メソ−ランチオニン、（２Ｓ，３Ｓ，６Ｒ）−３−メチル−ランチオニン、Ｓ−（２−（Ｚ）−アミノビニル）−Ｄ−システイン、リシノアラニンおよびβ−ヒドロキシアスパラギン酸がある。これらの残基の構造を第６図に示す。
意外にも、プレ・エピデルミンの翻訳後の修飾に関する多酵素複合体が、スタフィロコッカス エピデルミン（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｎ）Ｔｕ３２９８／ＤＳＭ３０９５の５４ kbpのプラスミドｐＴｕ３２に存在することが分かった。
本明細書ではエピデルミンの生産を担っている６個の遺伝子（ＯＲＦ）をEpiA、Ｂ、Ｃ、Ｄ、ＱおよびＰと命名するが、これらは８ｋｂ内に集まっており、また、これらがコードするタンパク質をそれぞれEpiA、Ｂ、Ｃ、Ｄ、ＱおよびＰと命名した。EpiAは、５２アミノ酸残基長のプレ・エピデルミンである。以下に述べるように、EpiB、ＣおよびＤは、４個の酵素的修飾反応(i)セリン／スレオニン デヒドラターゼによる水脱離、(ii)ランチオニン シンテースによる硫黄付加、(iii) システイン脱炭酸酵素によるＣ末端脱炭酸および(iv)二重結合形成に関連する。ＥｐｉＰタンパク質は、セリンプロテアーゼの本質的ドメインとの著しい類似性に基づくＮ末端リーダーペプチドからの成熟型エピデルミンの切断を担うと考えられているが（コイデ（Ｋｏｉｄｅ）等、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６７：１１０−１１６（１９８６）；メロン（Ｍｅｌｏｕｎ）等、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．１８３：１９５−２００（１９８５）；およびストール（Ｓｔａｈｌ）等、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５８：４１１−４１８（１９８４））、一方、EpiQは、大腸菌のｐｈｏＢ遺伝子への明確な類似性（マキノ（Ｍａｋｉｎｏ）等、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９０：３７−４４（１９８６））、両タンパク質が２０５（EpiQ）および２２９（ｐｈｏＢ）アミノ酸残基長と同じサイズであるという事実、１５３個のＣ末端アミノ酸残基に渡る２４．２％の類似性および両タンパク質の親水性プロットに基づき、エピデルミンの整合性を調節する調節タンパク質であると考えられる。
ここで、上述したEpiB、C、D、PおよびQの各タンパク質の酵素活性は実施例５に記載したような相補性試験によって確認することができる。なお、エピデルミン生合成に関する相補性試験において不活性EpiBタンパク質を相補する酵素活性を有するタンパク質を本明細書において「エピデルミン生合成に関する相補性試験によって定義されるEpiB活性」と呼ぶことにする。EpiC、EpiD、Epi PおよびEpiQについても同様に「エピデルミン生合成に関する相補性試験によって定義されるEpiC活性」、「エピデルミン生合成に関する相補性試験によって定義されるEpiD活性」、「エピデルミン生合成に関する相補性試験によって定義されるEpiP活性」、「エピデルミン生合成に関する相補性試験によって定義されるEpiQ活性」を定義する。
【００１９】
エピデルミン生合成に関する全遺伝的情報の予想外の知見およびタンパク質ｅｐｉＢ、Ｃ、Ｄ、ＱおよびＰに対する遺伝子の解釈の結果から、これらのタンパク質をコードするＤＮＡを単離し、かつ、これらの遺伝子を１つ異常含むプラスミドを構築する事が出来、その結果、このようなプラスミドを含む宿主を培養することによりこれらのタンパク質のうちの１つ、または所定のタンパク質の組み合わせ物を発現し、単離することが可能となった。
従って、本発明には、タンパク質ＥｐｉＢまたはＥｐｉＣ、またはＥｐｉＤ、またはＥｐｉＰまたはＥｐｉＱをそれぞれコードするＤＮＡ配列が含まれる。これらの配列は、従来法によるｐＴｕ３２からの切断および単離、または化学合成または他の従来法で得ることが出来る。また、このＤＮＡはプラスミド、望ましくは発現プラスミドに組み込むことができ、これらの構築物で適当な宿主にトランスホームした後、その宿主を培養すると、プロモーターのコントロール下の該構築物はプラスミドにライゲーションしたＤＮＡにしたがってタンパク質ＥｐｉＢ、ＥｐｉＣ、ＥｐｉＤ、ＥｐｉＰまたはＥｐｉＱ、またはこれらのタンパク質の組み合わせ物を発現するであろう。別に、プラスミドｐＴｕ３２を適当な制限酵素で処理してＤＮＡ配列の１つまたは他の部分を切り捨て、目的のプラスミドの遊離末端に必要とする修正を施した後に再ライゲーションすることで、ｅｐｉＢ、Ｃ、Ｄ、ＰおよびＱの内の所定の１つをコードするＤＮＡ配列を含むプラスミドを作ることが出来る。
さらに、変異体には、ｐＴｕ３２中のエピデルミンをコードする遺伝子の所定のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列による置換が含まれ、この修正プラスミドを有する宿主の培養でエピデルミンとは異なるタンパク質が発現される。
従って、ｐＴｕ３２中のエピデルミンをコードする遺伝子をガリデルミン、またはエピデルミン変異体、または他のランチビオチック、または他のタンパク質をコードするＤＮＡ配列で置換することが出来、それにより生成したプラスミドを通常ランチビオチックまたはタンパク質ＥｐｉＢ、Ｃ、Ｄ、ＰまたはＱのいずれも生産しえない適当な宿主にトランスホームし、置換したＤＮＡ配列および遺伝子ｅｐｉＢ、Ｃ、Ｄ、ＰおよびＱが発現する条件下で宿主を培養する事により、ガリデルミン、エピデルミン変異体またはランチビオチックの構造的特徴を少なくとも１つ含む他のタンパク質を得ることが出来る。
【００２０】
一方、タンパク質ＥｐｉＢ、Ｃ、Ｄ、ＰまたはＱをコードする遺伝子を所定のアミノ酸配列をコードする遺伝子と共に適当なベクターに挿入し、Ｅｐｉタンパク質および所定のアミノ酸配列をコードする遺伝子を適当なプロモーターと機能的に結合させ、生成したプラスミドで通常ランチビオチックまたはタンパク質ＥｐｉＢ、Ｃ、Ｄ、ＰまたはＱのいずれも生産しえない適当な宿主をトランスホームして、この宿主を培養することで、挿入した遺伝子に所定のアミノ酸配列に由来するが、ガリデルミン、エピデルミン、エピデルミン変異体、またはその他のタンパク質に見られるランチビオチックの構造的特徴を含むタンパク質を発現することが出来る。
また、本発明は、望ましくはストリンジェント条件下、本明細書で示しているタンパク質ＥｐｉＢ、Ｃ、Ｄ、ＰまたはＱの活性を実質的に有しているタンパク質をコードするＤＮＡ配列とハイブリダイズしうるＤＮＡ配列を含む。ストリンジェント・ハイブリダゼーション条件では、８５％以上、望ましくは約９０％以上のホモロジーを有するＤＮＡ配列を選択する。ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングは、ヨーロッパ特許出願第８８ １１９ ６０２．９号およびカシマ（Ｋａｓｈｉｍａ）等、（Ｎａｔｕｒｅ ３１３：４０２−４０４（１９８５））の方法に従って高ストリンジェント条件で行った。ストリンジェント条件下で本出願で公開したＤＮＡ配列とハイブリダイズしうるＤＮＡ配列は、例えば、公開したＤＮＡ配列の対立遺伝子変異体、公開したＤＮＡ配列に関連するが特定の微生物中に天然に存在するもの、または他の生物種に由来するものがある。核酸のハイブリダゼーションに関する一般的技術は、参考として本出願に含まれるマニアチス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）、Ｔ．等、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｎｕａｌ，コールドスプリングハーバー、ＮＹ（１９８２）およびハイムス（Ｈａｙｍｅｓ），Ｂ．Ｄ．等、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ、ＩＲＬプレス、ワシントン、ＤＣ（１９８５）に示されている。タンパク質ＥｐｉＢ、Ｃ、Ｄ、ＰおよびＱは、デヒドロアラニン、デヒドロブチニン、メソ−ランチオニン、３−メチル−ランチオンおよびＳ−（２−アミノビニル）−Ｄ−システイン等の構造的特徴を含む新規なタンパク質またはその他の物質の製造に有用な高価値で、かつ興味深い新しい試薬である。
このように、これらは、単離型のタンパク質として、またはこれらの酵素による細胞外プロセシングを研究するための化学的合成操作における化学的触媒試薬として使用しうる。
【００２１】
また、本発明は、実質的に純粋なタンパク質ＥｐｉＢ、Ｃ、Ｄ、ＰまたはＱに関する。“実質的に純粋”とは、そのタンパク質が天然で会合している不純物を含まないことを意味している。実質的純粋性は、電気泳動による単一バンドで確認しうる。
本発明のポリペプチドは、抽出、沈殿化、クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、電気泳動等の従来法により上述の組み換え分子から単離・精製しうる。このタンパク質は、さらに補助タンパク質を含む融合タンパク質の一部として生産されることが望ましい。これらの補助タンパク質には、例えば、典型的分泌シグナル、大腸菌由来のマルトース結合タンパク質、またはプロテインＡ等が含まれる。プロテインＡを含む融合タンパク質の調製、イムノアフィニティー・クロマトグラフィーによるその精製、および目的タンパク質を放出するその切断に関する方法は、例えば、ＰＣＴ出願第Ｗ／Ｏ８４／０３２０３号（１９８４）に示されている。
融合タンパク質の切断を可能にする必要条件は、それが適当な切断手段で認識および切断される単一の切断部位を含むことである。このような切断部位は、化学的または酵素的手段で認識可能で、かつ、目的タンパク質と補助タンパク質の間にある単一のアミノ酸配列である。このような特異的アミノ酸配列が目的タンパク質または補助タンパク質の中にあってはならない。酵素的試薬の例には、アミノ酸配列ＮＨ2−Ｐｒｏ−Ｘ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−ＣＯＯＨ（式中、Ｘは任意のアミノ酸残基、例えばロイシン）を認識しうるコラゲナーゼ等のプロテアーゼ；Ｍｅｔ−Ｐｈｅ結合を切断するキモシン（レニン）；Ｘ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−ＹのＡｒｇのカルボキシル側を切断するカリクレインＢ；配列Ｘ−（Ａｓｐ）n−Ｌｙｓ−Ｙ（式中、ｎ＝２−４）を認識し、Ｌｙｓのカルボキシル側で切断するエンテロキナーゼ；特異的アルギニル結合を切断するトロンビン等がある。融合タンパク質を切断するのに使用しうる化学試薬の例には、Ａｓｎ−Ｚ結合（式中、ＺはＧｌｙ、ＬｅｕまたはＡｌａである）を切断するヒドロキシルアミン；高濃度で（約７０％）特異的にＡｓｐ−Ｐｒｏを切断する蟻酸等がある。
【００２２】
以上の説明を用いて、当業者が本発明を十分なまでに利用しうることは明白である。従って、以下に示す望ましい特定の態様は単なる例として解釈されるべきものであり、本出願を制限するものではない。
【００２３】
【実施例】
実施例１
１．ガリデルミンの過剰生産
ｐＣ１９４、ｐＥ１９４、ｐＵＢ１１０、ｐＴ１８１またはｐＭＫ１４８ガリデルミン等のメディアム・コピー・プラスミドを用いて、ガリデルミンのオープン・リーディング・フレームを含むＤＮＡフラグメントをエピデルミン生産株であるスタフィロコッカス エピデルミス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｓ）ＤＳＭ３０９５にクローニングしうる。通常、この遺伝子の増加は生産物の増加と相関する。但し、この相関は必ずしも線型ではない。ｐＣ１９４またはｐＴ１８１の高コピー数プラスミド誘導体もクローニングベヒクルとして使用しうる。
【００２４】
２．リーダー配列の交換
アミノ酸−１乃至−３０に相当するエピデルミンのリーダー配列は、エピデルミンの分泌に関する。この配列を用いて、ガリデルミン等、Ｓ．エピデルミジス（ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）中の他のタンパク質を分泌しうる。
このリーダー配列ＤＮＡは、その配列の前後に各リンカーを挿入することにより移動可能とすることが出来る。従って、このリーダー配列ＤＮＡは、プラスミドから大量に単離することが出来、かつ、他のペフチドおよびタンパク質の各位置に挿入することが出来る。また、このリーダー配列ＤＮＡは化学合成でも生成する事が出来る。
【００２５】
実施例２
宿主としてＳ．エピデルミス（ｅｐｉｄｅｒｍｉｓ）を用いたガリデルミンの生産
１．プラスミドの調製（第７図参照）
a)プラスミドｐＣＵＩは、ラルフ ローゼンシュタイン博士（Ｄｒ．ＲａｌｆＲｏｓｅｎｓｔｅｉｎ）の“Ｍｏｌｅｋｕｌａｒ ｇｅｎｅｔｉｓｃｈｅ Ｕｎｔｅｒｓｕｃｈｕｎｇｅｎ ｚｕｒ ｐｌａｓｍｉｄｋｏｄｉｅｒｔｅｎ Ａｒｓｅｎｉｔ ｕｎｄ Ａｒｓｅｎａｔｒｅｓｔｉｓｔｅｎｔ ｂｅｉ Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｅｎ”（ドイツ、ミュンヘン、技術大学から市販されている）の方法に従い、クレノーフラグメントを用いてＰｓｔＩ消化したｐＣＬＰ１００およびＮｄｅ１消化したｐＵＣ１８をライゲーションする事により調製した。ついで、このプラスミドをＥｃｏＲＩで消化した。
b)Ｓ．ガリナラム（ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）（ＤＭＳ４６１６）から染色体ＤＮＡを単離し、これをＥｃｏＲＩで消化した。ＨｉｎｄIII およびＥｃｏＲＩ認識部位の間にある２．４kb長のガリデルミン構造遺伝子を含む４．７kbのフラグメントを、以下の配列：
５’ＣＡＣ ＡＴＣ ＣＡＧ ＧＡＧ ＴＡＣ ３’
を有するプライマーを用いて単離した。
c)ステップa)の消化したｐＣＵＩプラスミドのＥｃｏＲＩ部位に４．７kbフラグメントをライゲーションして、プラスミドｐＣＵｇｄｍ１を得た。
【００２６】
２．宿主Ｓ．エピデルミス（ｅｐｉｄｅｒｍｉｓ）の調製
本実施例においては、エピデルミンを生産しえないＳ．エピデルミス（ｅｐｉｄｅｒｍｉｓ）ＤＳＭ３０９５の変異体を単離した。
突然変異誘発は、染色体にコードされているリファンピシン耐性（μg/ml）
によって特徴付けられる株について行った。
寒天プレートで増殖したＳ．エピデルミス（ｅｐｉｄｅｒｍｉｓ）ＤＳＭ３０９５を３０mlの基礎栄養培地に接種し、これを一晩培養した。この一晩培養物０．５mlを生産培地５０mlに接種し、これを３７℃で３時間振盪培養した。
培養培地から細胞を取り出し、保温した４．５mlＴＭバッファ（３０mMトリス−マレイン酸 ｐＨ７．４（生成した溶液を溶液Ａとする））。
溶液Ａの突然変異体および細胞数（１．２５×１０10細胞／ml）をチェックした。
４mlの溶液Ａを１mlのエチルメチルスルホネート（最終濃度４７μg/ml）と完全に混合し、３７℃で１時間振盪した。
それから細胞を培養培地から抽出し、ＴＭバッファで２度洗浄した後、５mlのＴＭバッファに懸濁した（この変異細胞を含む溶液を溶液Ｂと命名した）。
溶液Ｂは２×１０8 細胞／mlの濃度であり、これは１．６％の生存率に当たる。
５０mlの溶液Ｂを５mlの生産培地に添加し、３７℃で一晩培養した（発現型の発現）。この溶液を溶液Ｃとする。細胞数は７．３×１０8 細胞／mlを示した。
この溶液をＢＭ寒天プレートにプレーティングし、各コロニーを釣り上げた。これらをテストプレート（表面にマイクロコッカス ルテウス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ ｌｕｔｅｕｓ）を撒いたＢＭ寒天を含む）に接種した。Ｍ．ルテウス（ｌｕｔｅｕｓ）への阻害効果を示さないコロニーをエピデルミンの非生産株として選択した。
ＢＭ寒天（１リットル当たり）
１０ｇm ペプトンＮｏ．１４０
５ｇm イースト イクストラクト
１mg グルコース
５mg ＮａＣｌ
１mg Ｋ2ＨＰＯ4
ｐＨ７．５
約３％の変異率が測定された。
見つかった４５個の非生産株を２０回サブクローニングし、１６個の安定な非生産株を得た。
全ての安定な非生産株は、野生型のプラスミドｐＥｐｉ３２を含んでいることが分かった。制限パターンから、これが野生型株中のプラスミドと同じものであることが同定された。
【００２７】
非生産型Ｓ．エピデルミス（ｅｐｉｄｅｒｍｉｓ）のトランスホーメーション
安定な非生産型株の一晩培養から得た５mlの培地を７５０mlのＢＭ培地に接種し、この培地を２リットルフラスコ中、振盪速度１２０rpm、３７℃で振盪培養した。
接種したＢＭ培地の当初の光学密度は、０．０３−０．０４であった。光学密度が０．４５−０．５５に達したとき、細胞をＧＳ−３ローターを用いた８５００rpm、４℃、１５分の遠心で回収した。単離した細胞を順次、７５０、３５０、４０および１０mlの１０％グリセリンで洗浄し、ついで２−３mlの１０％グリセリンに懸濁した後、ＥＲＧ中１１０ml分を−７０℃で凍結した。細胞数は、１−５×１０10／mlであった。
凍結した細胞を室温、５分間で融解し、その細胞懸濁液５０μlをＥＲＧ中プラスミドｐＣＵｇｄｍ１のＴＥバッファ溶液２μlと共に室温で３０分間インキュベートした。この混合物を電極間隙０．２cmのエレクトロポレーション・キュベットに導入し、直ちにエレクトロポレーションした。その後、この細胞を迅速に９５０μlのＳＭＭＰ５０培地に懸濁し、２．５mlのＥＲＧに移して、３７℃で９０分間振盪した。ＥＲＧは、培地によく空気が溶けるように４５°に傾けた。
ＳＭＭＰ５０培地には、ｐｒｏ １００ml、２ＳＭＭ ５５ml、４ＰＡＢ ４０mlおよび５％ＢＳＡ ５mlが含まれる。２ＳＭＭには、１mol サッカロース、０．０４mol マレイン酸、０．０４mol ＭｇＣｌ2およびｐＨ６．５とするためのＮａＯＨが含まれている。４ＰＡＢは、７g/１００mlのギブコ抗生物質培地３溶液である。
ガリデルミンを生産する増殖株のテストは、Ｍ．ルテウス（ｌｕｔｅｕｓ）テストプレートからのコロニーの選択、および各選択されたコロニーの培養およびＨＰＬＣによるガリデルミンの検定によって行った。
ガリデルミンを生産しうる３個のｐＣＵｇｄｍ１トランスホーム変異体が確認された。
【００２８】
ｐＣＵｇｄｍ１でトランスホームしたＳ．エピデルミス（ｅｐｉｄｅｒｍｉｓ）により生産されるガリデルミンの検定
a)バイオアッセイ
ＦＰ寒天をＭ．ルテウス（ｌｕｔｅｕｓ）ＡＴＣＣ９３４１で接種し、３７℃で１８時間インキュベートした。生成した培養物の半分をループで取り出し１００mlのＦＰ培地に懸濁し、３６℃で８時間培養した。その光学密度が１．０に到達したときに培養を終えた。この懸濁液の０．５％をＦＰ寒天に接種し、各１０mlをシャーレに注いで４℃で３週間保存した。
ゾナー（Ｚａｈｎｅｒ）およびマス（Ｍａａｓ）“抗生物質の生化学”スプリンガー・バーラグ、ベルリン １９７２に示されている方法でプレート拡散テストを行った。トランスホームしたＳ．エビデルミン（ｅｐｉｄｅｒｍｉｎ）の培養由来の培養濾液１０μlを濾紙にしみ込ませ、乾燥した。この濾紙をテストプレートの上に置き、３７℃で２４時間インキュベートした。
【００２９】
b)ＨＰＬＣ
選択したトランスホーム株を生産培地中で２６時間培養した。培養培地を１３，０００rpmで１０分間遠心した。
単離した培養液を、移動相としてA)７０％過塩素酸を０．５％含むＨ2ＯおよびB)アセトニトリルを用いたＳＰ８．７００液体クロマトグラフィー（スペクトラ・フィジックス、ダルムスタット、ドイツ）によるＨＰＬＣで分析した。カラム系には、粒子径７μm およびカラムサイズ１２５mm×４．６mmＩ．Ｄ．のヌクレオシル−１００ Ｃ−１８と２０mm×４．６mmＩ．Ｄ．のプレカラムを使用した。
勾配を以下に示す。
クロマトグラフィーの結果を第８図に示す。７．５４分でガリデルミンの溶出を示す標準的曲線を第９図に示す。
【００３０】
培養培地には以下に示すものを使用した。
１．ＦＰ寒天
肉抽出物 ４g
ペプトン １０g
ＮａＣｌ ３g
Ｎａ2ＨＰＯ4 ５g
グルコース １０g
複合寒天 １５g
水 １リットル
ｐＨ ７．２
２．ＦＰ培地
肉抽出物 ４g
ペプトン １０g
ＮａＣｌ ３g
Ｎａ2ＨＰＯ4 ５g
グルコース １０g
水 １リットル
ｐＨ ７．２
３．生産培地
肉抽出物 ３３g
モルト抽出物 ３０g
ＮａＣｌ ４０g
水酸化カルシウム ３．８g
水 １リットル
ｐＨ ６．５
【００３１】
実施例３
プラスミドの単離
Ｓ．エピデルミス（ｅｐｉｄｅｒｍｉｓ）Ｔｕ３２９８のプラスミドＤＮＡをノリック（Ｎｏｒｉｃｋ）等、Ａｎｎ．ＮＹ−Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１８２：２７９−２９４（１９７１）の修正法に従って単離した。Ｓ．エピデルミス（ｅｐｉｄｅｒｍｉｓ）をＢＭ培地（１％ペプトン１４０、ギブコ、ニュウ・アイゼンバーグ、Ｆ．Ｒ．Ｇ．、０．５％酵母抽出物、ディフコ、デトロイト、ＵＳＡ、０．１％グルコース、０．５％ＮａＣｌおよび０．１％Ｋ2ＨＰＯ4×２Ｈ2Ｏ）で静止期まで培養した。細胞を遠心し、０．５M ＥＤＴＡで２回洗浄した。このペレットを８０ml ＮａＣｌバッファ（５０mM トリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）、５０mM ＥＤＴＡ、２．５M ＮａＣｌ）に再懸濁し、１．５mlのリゾスタフィン溶液（０．５mg/ml、シグマ、ハイデルベルグ、Ｆ．Ｒ．Ｇ．）を添加して、３７℃で２０分間インキュベートした。細胞は、８０mlの溶解バッファ（５０mM トリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、３００mM ＥＤＴＡ、５００mM ブリッジ、４０mM デオキシコレート酸ナトリウム）を添加し、氷水中で１時間放置することで溶解した。この溶解物を遠心し（３０分間、１３，０００rpm、４℃）、その上清を４分の１倍容の５０％ＰＥＧ６０００溶液と混合した。プラスミドＤＮＡを４℃、一晩で沈殿させた。このＤＮＡ懸濁液を遠心後（２０分、１３，０００rpm、４℃）、８mlのＴＥバッファに溶解し、さらに、５０μlのプテアーゼ溶液（２０mg/ml）を添加した。３７℃、１５分間のインキュベーション後、ＤＮＡをエタノールで沈殿させ、さらにＣｓＣｌ遠心（１g ＣｓＣｌ／ml、４０，０００rpm、４０h 、２０℃）で精製した。
【００３２】
ＲＮＡの単離と電気泳動
Ｓ．エピデルミン（ｅｐｉｄｅｒｍｉｎ）をＳＭＳ最小培地（タザジ（Ｔｅｒｚａｇｈｉ）等、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２９：８０７−８１３（１９７５））で増殖し、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＲＮＡに関して示された方法（ウルマネン（Ｕｌｍａｎｅｎ）等、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６２：１７６−１８２（１９８５））と同様の修正法を用い、そこからＲＮＡを単離した。プロトプラスティング・バッファ中のリゾスタフィンと３７℃でインキュベーションする事で細胞を溶解した。全ＲＮＡをグリオキシル化し（マクマスター（ＭｃＭａｓｔｅｒ）等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７４：４８３５−４８３９（１９７７））、電気泳動バッファとして１０mM Ｎａ2ＰＯ4 （ｐＨ７）を用いた１．２％アガロースゲルで分離した。ＲＮＡをエチジウム・ブロマイドを用いて染色し、２０×ＳＳＣ（０．１５M ＮａＣｌ、０．０１５M クエン酸三ナトリウム、ｐＨ９）を用いたキャピラリー・トランスファーによりニトロセルロースメンブレン（シーダー・アンド・シュエル、ダセル、Ｆ．Ｒ．Ｇ．）にブロッティングした。２３ＳｒＲＮＡおよび１６ＳｒＲＮＡをサイズマーカーとして用いた。
【００３３】
インビトロ・トランスレーション
ｐＳＰＴ１８／１９ベクターシステム（ベーリンガー・マンハイム、Ｆ．Ｒ．Ｇ．）に各フラグメントをクローニングする事により、一本鎖のＲＮＡプローブを得た。このプラスミドをＥｃｏＲＩまたはＨｉｎｄIII で線状にし、線状ＤＮＡテンプレートを得た。転写のためのメルトン（Ｍｅｌｔｏｎ）等、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１２：７０３５−７０５６（１９８４）の方法は、業者の説明書に従って修正した。α32Ｐ−ＣＴＰ（８００Ci/mMol）の存在下でＴ７−ＲＮＡポリメラーゼまたはＳＰ６−ＲＮＡポリメラーゼを使用した。取り込まれなかったリボヌクレオチドは、セファデックスＧ５０クロマトグラフィーでラベル化したＲＮＡと分離した。
【００３４】
ノーザン・ハイブリダゼーション
電気泳動後、ＲＮＡをトーマス（Ｔｈｏｍａｓ）、Ｐ．Ｓ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７：５２０１−５２０５（１９８０）の方法に従ってフィルターにトランスファーした。８０℃、２時間のインキュベーションの後、そのフィルターを２０ トリス−ＨＣｌ（ｐＨ８）中、１００℃で手短にインキュベーションして、グリコシル化を外した。その後、このフィルターを、そのフィルターを５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（０．１５M ＮａＣｌ、０．０１５M クエン酸三ナトリウム、ｐＨ９）、５０ ＮａＰＯ4 、ｐＨ６．５、０．１％フィコール４００（ファルマシア、フレイバーグ、Ｆ．Ｒ．Ｇ．）、０．１％ポリビニルピロリドン、０．１％ウシ血清アルブミンおよび０．２５mg/ml 変性サケ***ＤＮＡ溶液中、４２℃で２時間かけてプレハイブリダイズした。このフィルターを１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ溶液中、４２℃で１５分間かけて洗浄した後、これを用いて−７０℃で４時間かけてコダック−Ｘ オマットフィルムを感光させた。さらに、このフィルターを０．５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ溶液を用い、７０℃で１５分間かけて２回洗浄した後、−７０℃で１６時間かけてオートラジオグラムを作製した。翌日、７０℃、３０−６０分間の０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ溶液による洗浄を続け、その後再び、−７０℃、３日間のコダック−Ｘ オマットフィルムへの感光を行った。
【００３５】
サザン・ハイブリダゼーション
サザン・ハイブリダイゼーション（サザン（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ）、Ｅ．Ｍ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．９８：５０３−５１７（１９７５））には、プローブとしての５’ラベル化オリゴヌクレオチドを２３℃で使用した。オリゴヌクレオチドは、ガンマ32Ｐ−ＡＴＰとＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（ベーリンガー・マンハイム、マンハイム、Ｆ．Ｒ．Ｇ．）を用いてラベルした。オリゴヌクレオチドおよびプライマーは３９１ＤＮＡ合成機を用いて合成し、さらに精製すること無く使用した。
【００３６】
ＤＮＡシーケンシング
ＤＮＡは、Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼ（ファルマシア、フレイバーグ、Ｆ．Ｒ．Ｇ．）を用いたチェーン・ターミネーション法（サンガー（Ｓａｎｇｅｒ）等、Ｐｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７４：５４６３−５４６７（１９７７））により、放射能的および非放射能的にシーケンシングした。放射能プラスミドシーケンシングは、適当なプライマーを用い、ハットリ（Ｈａｔｔｏｒｉ）等、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１５２：２３２−２３８（１９８４）の方法で行った。３．６kbのＢａｍＨＩ／ＰｓｔＩフラグメントは、アプライド３７３Ａ ＤＮＡシークエネーター（アプライド・バイオシステムズ、ウェイタートタット、Ｆ．Ｒ．Ｇ．）を用い、非放射能的にシーケンシングした。各フラグメントは、ファージミドｐＢＳＤ-/+にクローニングした。この構築物をＢａｍＨＩおよびＳａｃＩで消化し、線状にしたＤＮＡをエクソヌクレアーゼIII （ベーリンガー・マンハイム、マンハイム、Ｆ．Ｒ．Ｇ．）を用いて５’末端から両方向に消化していき、一組のネステド欠失物とした後、ムング・ビーン・ヌクレアーゼ（ベーリンガー・マンハイム、マンハイム、Ｆ．Ｒ．Ｇ．）で処理して平滑末端とした。電気泳動後（１％アガローズゲル）、適当なサイズのフラグメントをゲルから単離し、再ライゲーションしてから大腸菌ＸＬ−１ブルー株にトランスホーメーションした。ヘルパーファージＣＳＭ１３を用いて一本鎖ＤＮＡを単離し、Ｔａｑポリメラーゼ（プロメガ、フレイバーグ、Ｆ．Ｒ．Ｇ．）を用い、市販業者の説明書にしたがってシーケンシングした。
【００３７】
プラスミドの構築
スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）のテトラサイクリン耐性プラスミドｐＴ１８１のシーケンシングで（カーン（Ｋａｈｎ）等、Ｐｌａｓｍｉｄ １０：２５１−２５９（１９８３）、プラスミドの複製に必要ではないプレ・遺伝子内に単一のＮｄｅＩ部位があることが分かった（ゲナロ（Ｇｅｎｎａｒｏ）等、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６９：２６０１−２６１０（１９８７））。大腸菌ベクターｐＵＣ１９（ヤニッシュ・ペラン（Ｙａｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎ）等、Ｇｅｎｅ ３３：１０３−１１９（１９８５））の多重クローニング部位（ｍｃｓ）をこのＮｄｅＩ部位に挿入し、ｐＴ１８１ｍｃｓを構築した（第２４図）。
スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）−大腸菌シャトルベクター、ｐＣＵＩ（第２０図）をスタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）のクロラムフェニコール耐性プラスミドｐＣ１９４の誘導体であるｐＣＬＰ１００および大腸菌ベクターｐＵＣ１９から構築した。ｐＣＵＩは、両宿主内で約６kbまでの挿入物を安定に維持する。ｐＴ１８１ｍｃｓおよびｐＣＵＩは、スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）に適合しており、これらをｐＴｕ３２由来のＤＮＡフラグメントをサブクローニングするのに使用した。ｐＴｕ３２のＨｉｎｄIII フラグメントをｐＵＣ１９にクローニングし、これをサザン・ハイブリダイゼーションのプローブとして使用して、さらにＨｉｎｄIII フラグメント付近の制限部位を同定した（第１０図Ｃ）。
Ｓ．Ｓ．エピデルミス（ｅｐｉｄｅｒｍｉｓ）由来の５４ kbpエピソーマル要素ｐＴｕ32の１３．５ kbpＢｇｌIIフラグメントをｐＴ１８１ｍｃｓにサブクローニングしてｐＴｅｐｉ１４を構築した（第１０図Ａ）。ＤＮＡシーケンス用に大腸菌ベクターｐＵＣ１９（ヤニッシュ・ペラン（Ｙａｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎ）等、Ｇｅｎｅ ３３：１０３−１１９（１９８５））およびｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔIIR （ストラタジーン、ハイデルベルグ、Ｆ．Ｒ．Ｇ．）にサブクローンを作製した。ベクターｐＳＰＴ１８／１９（ベーリンガー・マンハイム、マンハイム、Ｆ．Ｒ．Ｇ．）にクローニングしたＤＮＡから一本鎖ＲＮＡプローブを得た。
【００３８】
遺伝子解析
エピデルミン構造遺伝子、ｅｐｉＡに隣接するＤＮＡ領域をシーケンシングする事で、ｐＴｕ３２の１３．５ kbpＢｇｌIIフラグメントの内部にさらに５個の完全なオープン・リーディング・フレーム、ｅｐｉＢ、Ｃ、Ｄ、ＰおよびＱが存在することが明らかになった。
第１１図乃至第１９図から分かるように、ｅｐｉＡオーカーコドンから僅か５０ヌクレオチド離れた、ＥｐｉＡをコードする配列の直ぐ隣に、Ｓ／Ｄ配列に続く２，９７０bpの大きなオープン・リーディング・フレームが存在する。また、スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）の翻訳開始コドンとして働きうるロイシンのＴＴＧコドンもＳ／Ｄ配列から適当な距離に存在する。このオープン・リーディング・フレームをｅｐｉＢと呼ぶが、これは、本明細書で示すようにエピデルミンの生合成変異体の相補性やエピデルミン生合成における基本的役割において利用することが出来る。
ＴＴＧ（Ｌｅｕ）から開始する、ｅｐｉＢによってコードされるタンパク質は、分子量約１１５DaおよびｐＨ７における正味の電荷−３を有し、またカイト（Ｋｙｔｅ）等、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５７：１０５−１３２（１９８２）に従う親水性プロットからも予想されるように、中程度の疎水性（４１％疎水性残基）である。
ｅｐｉＢの３’末端には、転写停止に特徴的なパリンドローム構造は見られない。しかし、第１１図乃至第１９図からも分かるように、１塩基シフトして別のリーディング・フレームｅｐｉＣと１２２bpの重複がある。
本出願者は、２つの独立したプラスミドの単離物由来の各４７ kbpのＨｉｎｄIII フラグメントを独立に２回、クローニングおよびシーケンシングする事により、この事がアーテファクトではないことを確認した。また、このことは、本明細書で示すｅｐｉＣ含有フラグメントを用いた変異体の相補性によっても確認された。
ｅｐｉＢおよびｅｐｉＣのリーディング・フレームの重複領域の内側で、ＡＧＧＡ要素の３’側僅か３６bpの所にある最初のＴＴＧコドン（Ｌｅｕ）が翻訳開始コドンの役割を果たしており、このことは、両リーディング・フレームが約４０コドン重複していることを示している。ＥｐｉＣタンパク質の実際のアミノ末端は、Ｎ末端シーケンシングで決定した。リーディング・フレームｅｐｉＣは、開始コドンＴＴＧ（Ｌｅｕ）で始まる４４５アミノ酸残基のタンパク質をコードしている。リーディング・フレームｅｐｉＤは、ｅｐｉＣの３’側に直接続き、Ｓ／Ｄ配列ＡＧＧＡＧＧの３’側８６bpの所に開始コドンＡＴＧを有している。ｅｐｉＤの３’側には、古典的なロー因子依存の転写ターミネーター構造がある。ｅｐｉＤは、開始コドンＡＴＧ（Ｍｅｔ）を含む１８１アミノ酸残基のタンパク質である。
タンパク質ｅｐｉＢ、Ｃ、Ｄ、ＰおよびＱのいずれも、スイス・プロットおよびジーン・バンクのタンパク質データベースに登録されているタンパク質配列との類似性を示さず、したがって、これらは未知のタイプの酵素または調節タンパク質である。
【００３９】
生合成遺伝子の転写
先に示したように、目的のフラグメントをｐＳＰＴ１８／１９ベクターシステム（ベーリンガー・マンハイム、マンハイム、Ｆ．Ｒ．Ｇ．）にクローニングすることにより一本鎖ＲＮＡプローブを得た。
第２０図に示すように、サイズのかなり異なる２つの転写物が得られた。ｅｐｉＡに特異的なハイブリダイゼーション・プローブが、約３００bpの小さな転写物を同定した。また、同様のサイズの転写物が、ランチビオチックであるニシン（バックマン（Ｂｕｃｈｍａｎｎ）等、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３：１６２６０−１６２６６（１９８８））およびズブチリン（バネリー（Ｂａｎｅｒｊｅｅ）等、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３：９５０８−９５１４（１９８８））についても発見された。さらに、約５kbの大きい転写物もｅｐｉＢに特異的なハイブリダゼーション・プローブを用いて同定された。ｅｐｉＢの前に大腸菌様のプロモーター配列が無く、一方、ｅｐｉＡの５’側に適当な配列が存在することから、ｅｐｉＡプロモーターはポリシストロンｍＲＮＡのプロモーターとして働くと見ることが出来る。
【００４０】
下流のオープン・リーディング・フレーム
オープン・リーディング・フレームｅｐｉＰおよびｅｐｉＱは、ｅｐｉＢ、ＣおよびＤとは反対のＤＮＡに存在し、ｅｐｉＱは、６bpのループを含む完全なヘアピンであるターミネーション構造をｅｐｉＤと共有している。
このループ構造の中で、ｅｐｉＤおよびｅｐｉＱ両リーディング・フレームのＴＡＡ終止コドンは、３個のヌクレオチドの内の２個を共有している。
ｅｐｉＰのリーディング・フレームは、Ｓ／Ｄ配列と適当な距離（６bp）にあるＡＴＧコドンで開始している。このＡＴＧコドンをｅｐｉＰの翻訳開始コドンとすると、このタンパク質は４６１アミノ酸残基からなる分子量５１．８kDのタンパク質である。ｅｐｉＰは、セリン・プロテアーゼに保存されているアミノ酸モチーフ（図２１）に類似する特徴を有しており、このことは、ｅｐｉＰが修正されたプレペプチドからの成熟型リンチビオチックの切断に関係していることを示している。
また、ｅｐｉＱのリーディング・フレームも、ＡＴＧコドンから開始しており、これは２０５アミノ酸残基をコードしている（第１１図乃至第１９図）。Ｓ／Ｄ配列は、ＡＴＧ翻訳開始コドンから６bp離れて存在し、また、その分子量２４３kDはＤＮＡ配列から誘導した。ｅｐｉＱタンパク質は、大腸菌のリン酸調節に関するポジティブ調節因子であるＰｈｏＢに類似する特徴を有し（第２２図参照）、その結果、ｅｐｉＱはランチビオチック合成における調節因子と考えられる。
ｅｐｉＰに先行して、Ｓ／Ｄ配列の１２bp手前に大腸菌様の−１０領域（５’−ＴＡＴＡＡＡ）があり、これはスタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）においてプロモーターの役割を果たしている。第１１図乃至第１９図に示すように、ｅｐｉＰの終止コドンとｅｐｉＱのＡＴＧ翻訳開始コドンの距離は、僅か１０ヌクレオチドであり、また、ｅｐｉＱのＳ／Ｄ配列はｅｐｉＰの終止コドンと重複している。
ｅｐｉＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄの５’側に逆方向のリーディング・フレームがあり、これは潜在的に最高１４８アミノ酸残基をコードしている。特徴的なＳ／Ｄ配列は存在するが、先に示したスタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）の開始コドン（ＡＴＧ、ＴＴＧ、ＧＴＧ）はいずれも存在しない。−１のフレームシフトを持つリーディング・フレームが続くが、これは第１１図乃至第１９図に示したＢｇｌII単離フラグメントを越えている。
これら２個のリーディング・フレームは、ガリデルミンの構造遺伝子に隣接すると同定された単一のオープン・リーディング・フレームｇｄｍＹと相同的である（シュネル（Ｓｃｈｎｅｌｌ），Ｎ．，Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｅ ｄｅｒ Ｐｅｐｔｉｄ−Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｋａ Ｅｐｉｄｅｒｍｉｎ ｕｎｄ Ｇａｌｌｉｄｅｒｍｉｎ；博士論文、チュービンゲン大学、Ｆ．Ｒ．Ｇ．（１９８９））。Ｓ．Ｓ．エピデルミス（ｅｐｉｄｅｒｍｉｓ）プラスミド上の相同的リーディング・フレームをｅｐｉＹ’およびｅｐｉＹ”と命名した。
【００４１】
実施例４
先に示したように調製したプラスミドｐＴｅｐｉ１４を標準的技術を用いてＳ．カルノサス（ｃａｒｎｏｓｕｓ）にトランスホームした。ついで、このトランスホーム株をＢＭ培地で増殖した（上述）。
生成したトランスホーマントは、エピデルミン感受性テスト株マイクロコッカス リテウス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ ｌｕｔｅｕｓ）ＡＴＣＣ９３４１を阻害することが分かった。この検定では、Ｍ．ルテウス（ｌｕｔｅｕｓ）の一晩培養物１ml（ＯＤ578 を１．０に調整）を５００mlの融解ＢＭ寒天培地に添加した。通常、この寒天培地１０mlをシャーレに入れた。Ｓ．Ｓ．エピデルミス（ｅｐｉｄｅｒｍｉｓ）の培養希釈物をこの寒天培地の表面に拡げた。エピデルミン・ポジティブ・コロニーは、コロニーの回りのＭ．ルテウス（ｌｕｔｅｕｓ）の増殖阻害帯で検出した。
細胞を３％肉抽出物、３．８％モルト抽出物、０．６％ＣａＣｌ2×２Ｈ2Ｏおよび４．６％ＮａＣｌ（ｐＨ６．５）溶液で培養した。使用したトランスホーマントに応じて、テトラサイクリンまたはクロラムフェニコールを添加した。１つのイクステンションを有する５００mlの三角フラスコ中、１００mlの培地で２４時間インキュベートした後、両培養物をサーバル遠心機を用いて１０，０００rpmで１０分間遠心した。
トランスホーマントの液体培養物の上清を吸着クロマトグラフィーで精製し（ＸＡＤ１１８０、不純物は、水／メタノール（１：１）で溶出し、エピデルミンは、メタノール／０．１Ｎ ＨＣｌ（９：１）で溶出した。エバポレーション後、溶出液を３Ｎ ＮａＯＨでｐＨ３．５に調整し、水を加えて１０mlとした。）、ＨＰＬＣクロマトグラフィーで検出した。この阻害活性は、成熟型エピデルミンと共に溶出した（６．７５／６．７６分、第２３図Ａ及びＢ参照）。トランスホームしていないＳ．カルノサス（ｃａｒｎｏｓｕｓ）の培養培地を同様に処理したが、この溶出領域にはピークを示さなかった（第２３図Ｃ）。これらの結果は、Ｓ．カルノサス（ｃａｒｎｏｓｕｓ）における異種エピデルミンの生合成を明確に示すものであり、かつ、ｐＴｅｐｉ１４がエピデルミンの生合成に必要な全ての情報を含んでいることを示している。
ｐＴｅｐｉ１４は１３．５ kbpのＢｇｌIIフラグメントを含んでおり、かつ、ｅｐｉＹ’が翻訳開始コドンを欠き、また、ｅｐｉＹ”がこのフラグメント上で不完全なことから、ｅｐｉＹ’およびｅｐｉＹ”のリーディング・フレームがこの系におけるエピデルミンの生産に必ずしも必要ではないことを示している。
【００４２】
実施例５
Ｓ．エピデルミン（ｅｐｉｄｅｒｍｉｎ）Ｔｕ３２９８の多くのｅｐｉ変異体をエチルメタンスルホネート（ＥＭＳ）突然変異誘発法で調製した。この操作は、ミラー（Ｍｉｌｌｅｒ）、Ｊ．Ｈ．，Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｉｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｇｅｎｅｔｉｃｓ，コールド・スプリング・ハーバー、Ｎ．Ｙ．（１９７２）の方法にしたがって行った。変異体は、エピデルミンの生産、または上述のＭ．ルテウス（ｌｕｔｅｕｓ）を用いたエピデルミン生産の欠如でスクリーニングした。ｅｐｉ変異体を数回移し替えて安定性をテストした。単離した４０個のｅｐｉ変異体の内、安定なのは僅か１０個であった。不安定な変異体は、数回の移し替えの後、再びエピデルミンを生産した。全ての安定なｅｐｉ変異体は、プラスミドｐＴｕ３２を含んでおり、このプラスミドは、制限エンドヌクケアーゼ分析で明らかなように欠失、または再配列を起こしていなかった。この１０個のｅｐｉ変異体を相補性の実験に使用した。
プラスミドｐＴｕ３２の種々の制限フラグメントをＳ．カルノサス（ｃａｒｎｏｓｕｓ）にクローン化し、異種のエピデルミンの生産を検定した。先に述べたこのフラグメントをプラスミドベクターＴ１８１ｍｃｓおよびｐＣＵ１、および第２６図Ｂに示したように、サブクローニングした種々のＯＲＦＣに挿入した。先ず、Ｓ．カルノサス（ｃａｒｎｏｓｕｓ）（プロトプラスト・トランスホーメーション（ゴズ（Ｇｏｔｚ）等、ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，Ｌｅｔｔ．４０：２８５−２８８（１９８７）による）または大腸菌（ＣａＣｌ2を使用、コーエン（Ｃｏｈｅｎ）等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
６９：２１１０−２１１４（１９７２））を用いてクローニングを行い、ついで、その組み換えプラスミドを単離し、エレクトロポレーションを用いて種々のＳ．Ｓ．エピデルミス（ｅｐｉｄｅｒｍｉｓ）に移した（オーグスチン（Ａｕｇｕｓｔｉｎ）等、ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．６６：２０３−２０８（１９９０））。分子クローニングに使用した酵素は、ベーリンガー・マンハイム（マンハイム、Ｆ．Ｒ．Ｇ．）、ＢＲＬ（エゲンスタイン、Ｆ．Ｒ．Ｇ．）またはファルマシア（スウェーデン）から入手した。Ｓ．エピデルミン（ｅｐｉｄｅｒｍｉｎ）株のトランスホーメーションは、環状（ｃｃｃ）プラスミドでのみ旨く行き、即ち、ライゲーション産物を用いた場合、時々しかトランスホーマントが得られないことから、この間接的トランスホーメーション法が必要となった。
相補性実験の結果を表１に示した。
【表１】
【表２】
【００４３】
種々のｅｐｉ遺伝子（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、ＰおよびＱ）を含む一連のプラスミドを構築した（第２６図Ｂ）。２つのプラスミドｐＴｅｐｉ１４およびｐＴｅｐｉＡＢＣＤＱは、全てのｅｐｉ変異体を相補しえた。構築した他のプラスミドｐＣＵｅｐｉＡＢＣ、ｐＴｅｐｉＡＢ、ｐＣＵｅｐｉＣＤＱ、ｐＣＵｅｐｉＢ、ｐＣＵｅｐｉＡ1 、ｐＣＵｅｐｉＡ2 、ｐＣＵｅｐｉＤＱおよびｐＣＵｅｐｉＱは、指示された遺伝子を含んでいた。
種々のプラスミドは、以下のように分類される特定のクラスの変異体のみを相補しえた。
ＥＭＳ ５および６−ｅｐｉＡ変異体
ＥＭＳ １８、３３および４５−ｅｐｉＢ変異体
ＥＭＳ １２、１３、１９および３９−ｅｐｉＣ変異体
ＥＭＳ １１−ｅｐｉＤ変異体
以下に示す結果は、少なくともエピデルミンの生合成には４個のＯＲＦ、ｅｐｉＡ、Ｂ、ＣおよびＤが必要であることを示している。
【００４４】
プラスミドｐＣＵｅｐｉＡは、唯一の完全なＯＲＦとして構造遺伝子ｅｐｉＡ、および、さらにその上流に１４００bpおよび下流に６０２bpを有しており、この後者の配列はｅｐｉＢＮ末端の１９０個のアミノ酸をコードしている。ｐＣＵｅｐｉＡ1 を用いたトランスホーメーションでエピデルミン変異体ＥＭＳ５および６の相補性が示され、この事でこれらがｅｐｉＡの変異体であることが同定された。ｐＣＵｅｐｉＡ2 において両方向にクローニングされたより小さいｅｐｉＡ含有Ｓｃａ１フラグメントは、ｅｐｉ変異体によりｅｐｉＡプロモーターが切断されたためにｅｐｉ変異体を相補する事が出来なかった。
ｐＣＵｅｐｉＢは、完全なｅｐｉＢおよびｅｐｉＡの３’末端の７５bpを含む１００bpの上流領域を含むＢｓｔＮ１フラグメントを含んでいる。ｅｐｉＡプロモーターは含んでいない。ｐＣＵｅｐｉＢでのトランスホーメーションでは、いずれのＳ．エピデルミス（ｅｐｉｄｅｒｍｉｓ）変異体のエピデルミン生産も相補しえず、この事は、ｅｐｉＢが自分自身のプロモーターを欠いており、ｅｐｉＡのプロモーターから一緒に転写されているらしいことを示している。
この事は、ｅｐｉＡプロモーターと完全なｅｐｉＡおよびＢ遺伝子を含み、かつその使用がｅｐｉＡおよびｅｐｉＢ変異体の両方を相補するｐＴｅｐｉＡＢ（第２６図Ｂ、表１）で得られた結果と一致する。
プラスミドｐＣＵｅｐｉＣＤＱはｅｐｉＣおよびｅｐｉＤの両方を相補できるが、プラスミドｐＣＵｅｐｉＤＱはｅｐｉＤ変異体のみを相補しうる（表１）。この相補性は、クローン化したＤＮＡフラグメントの方向には依存しない。これらの結果は、ｅｐｉＣおよびｅｐｉＤの両方が自分のプロモーターを有していることを示している。
【００４５】
実施例６
ｅｐｉＡ変異ｐＴｕ３２誘導体をＥＭＳ５および６から単離し、各々のｅｐｉＡのＯＲＦをシーケンシングした。両プラスミドは、ｅｐｉＡ内に点突然変異を含んでいた。すなわち、プラスミドＥＭＳ５では、コドンＡＧＴ（Ｓｅｒ3 ）がＡＡＴ（Ａｓｎ3 ）に変化しており、プラスミドＥＭＳ６では、コドンＧＧＡ（Ｇｌｙ10）がＧＡＡ（Ｇｌｎ10）に変化していた。これらの変異は、未修正のエピデルミンにおいて重要な部位に位置していた。
【００４６】
実施例７
ｅｐｉＢ（ＢｓｔＮ１フラグメント中）をプラスミドｐＰＳ４上のプロモーターのコントロール下に置いた（第２７図）。生成したプラスミドｐＰＳ４ｅｐｉＢは、ｅｐｉＢ変異体ＥＭＳ１８、３３および４５を相補しえた。逆方向にｅｐｉＢを含むプラスミドは、これらの変異体を相補しえなかった。この事も、ｐＣＵｅｐｉＢがｅｐｉＡプロモーターを欠いている為にどのＥＭＳ変異体も相補しえないことを示している。
【００４７】
実施例８
先に示したように、ｐＴｅｐｉ４（第２６図Ａ）の存在によりＳ．カルノサス（ｃａｒｎｏｓｕｓ）中でエピデルミンの生合成が起こる。しかし、ｐＴｅｐｉＡＢＣＤＱで起こらない。Ｓ．カルノサス（ｃａｒｎｏｓｕｓ）中での異種エピデルミンの発現を誘導するのに必要な最小限のＤＮＡサイズが、末端に存在するＤＮＡによる相補によるＳ．カルノサス（ｐＴｅｐｉＡＢＣＤＱ）の相補により決定された（第２８図）。プラスミドｐＣＡ４４−９０、ｐＣＡ４４−９１およびｐＣＡ４４−９２によるＳ．カルノサス（ｃａｒｎｏｓｕｓ）（ｐＴｅｐｉＡＢＣＤＱ）のトランスホーメーションは、エピデルミンの生産を誘導するが、完全なｅｐｉＱおよびｅｐｉＰ ＯＲＦを含むｐＣＡ４４−９２は、エピデルミンの生産を相補しうる最小のＤＮＡフラグメントを含んでいる。これらの結果は、エピデルミン生合成遺伝子は、６個のＯＲＦ；ｅｐｉＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、ＱおよびＰを含む８kbのＤＮＡフラグメント内に集まっており、かつ、その他の遺伝子はエピデルミンの生合成に関与していないことを示している。
これらの実施例で使用したスタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）のプラスミドＤＮＡは、切断溶解法（マキノ（Ｍａｋｉｎｏ）等、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９０：３７−４４（１９８６））により調製した。細胞をリゾスタフィン（８μg/ml）の添加によって溶解し、そのＤＮＡをＣｓＣｌ遠心により単離した。大腸菌のプラスミドのスーパーコイルＤＮＡは、修正アルカリ溶解法（バーンボイム（Ｂｉｒｎｂｏｉｍ）等、Ｎｕｃｌ．Ａｃｅｄ．Ｒｅｓ．７：１５１３−１５１８（１９７９））で調製した。
ＰＣＲ増幅したｅｐｉＡ含有フラグメントおよびＳ．エピデルミス（ｅｐｉｄｅｒｍｉｓ）変異体ＥＭＳ５および６の２つの変異したｅｐｉＡ領域のＤＮＡ配列は、ダイデオキシ法、ファルマシアの“配列”リストおよびアマーシャムの（α−35Ｓ）−ｄＡＴＰを用いた二本鎖ＤＮＡシーケンシング（マクマスター（ＭｃＭａｓｔｅｒ）等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７４：４８３５−４８３９（１９７７））で決定した。ＤＮＡシーケンシングおよびＰＣＲ増幅に用いたプライマーは、アプライド・バイオシステムズのＤＮＡ合成機を用いて合成した。ｅｐｉＡのＰＣＲ増幅に用いた２つのプライマーの配列を以下に示す：
【表３】
a) 5'-GGGTTTTAGG(TA)ATCCTTTTTAATAAATTTTTAGGAG-3'
b) 5'-CCTCAAAATTAAGACG(A)GAT(G)CCTCTATTGAAGCCC-3'
【００４８】
プライマーa)は、ｅｐｉＡのＲＢＳの前に結合し、プライマーb)は、ｅｐｉＡの停止コドンの後に結合する。太字で示した塩基は（括弧内に示されている）、ｅｐｉＡの前後にＢａｍＨＩ部位を作るのに使用されることを示している。増幅したＤＮＡフラグメント内にはｅｐｉＡプロモーターは無い。
変異体ＥＭＳ５および６内の変異ｅｐｉＡのＤＮＡ配列を決定するために、プラスミドｐＴｕ３２を単離し、そのＤＮＡ領域を、推定されるｅｐｉＡプロモーター領域の上流（5'-GGTTTGGTTATTTTCC-3') および停止コドンの下流(5'-CCTCAAAATTAAGACAGAGCCTC-3') に結合する別のＤＮＡプライマー対を使用したＰＣＲで増幅した。ｅｐｉＡのＤＮＡ配列は、シュネル（Ｓｃｈｎｅｌｌ）等、Ｎａｔｕｒｅ（ロンドン）３３３：２７６−２７８（１９８８）にも示されている。
【００４９】
実施例９
プラスミドｐＴｅｐｉ１４からｅｐｉＤを単離し、これをＰＣＲで増幅して、“平滑末端”ライゲーションによりベクターｐＩＨ９０２（ニュー・イングランド・バイオラブ）のＳｔｕＩ制限部位にクローニングした。その結果、ｅｐｉＤがベクターｐＩＨ９０２の因子Ｘａ切断部位の隣に、介在塩基対無しに融合され、これを用いて大腸菌をトランスホーメーションした。
この大腸菌の培養により、大腸菌のマルトース結合タンパク質に融合したｅｐｉＤ酵素が発現された。この融合タンパク質をアミロース・カラム充填剤によるアフィニティー・クロマトグラフィーで精製した。
このｅｐｉＤ酵素は、因子Ｘａにより融合タンパク質から低収率で切断しうることが分かった。切断領域のアミノ酸配列の修正で切断速度を向上しうるであろう。
この融合タンパク質の融合部位からｅｐｉＤの３’末端までをＤＮＡレベルでシーケンシングした。このｅｐｉＤ配列は、Ｓ．エピデルミス（ｅｐｉｄｅｒｍｉｓ）の野生型配列に対応していた。プラスミドｐＣＡ４４は、スタフィロコッカス カルノサス（Staphylococcus carnosus)ＴＭ３００に入れて、the DSM Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 1b, D-3000 Braunschweig, ドイツに、寄託されている。寄託日は１９９１年１２月２３日、寄託番号は６８６３である。
またプラスミドｐＰＳ４もスタフィロコッカス カルノサスＴＭ３００に入れて同所に寄託されている。寄託日は１９９１年１２月２３日、寄託番号は６８６４である。
【００５０】
以上の説明から、当業者は、容易に本発明の基本的特徴を理解し、かつ、本発明の精神および範囲を逸脱すること無しに、本発明を種々に変化および修正して種々の用途および条件に適用しえるであろう。
【図面の簡単な説明】
【図１】 エピデルミンの構造遺伝子（ｅｐｉＡ）のヌクレオチド配列および誘導されるプレ・エピデルミンのアミノ酸配列を示している。サャイン・ダルガルノ配列はボックスで囲み、プロペプチドがプロセシングされる切断部位は矢印で示してある。インバーティド・リピートには下線を付し、潜在的停止コドンにはａｍ（アンバー）およびｏｃ（オーカー）と記した。
【図２】 ハイロン・プログラムを用いたプレ・エピデルミンに関する予測プロットを棒グラフで表したものである：(a) フレキシビリティー、(b) ハイドロパシー、(c) 親水性、(d) ターンの性質、(e) β−シートおよび(f) α−ヘリックス構造。
【図３】 プレ・エピデルミンのヘリックス・ホィール・プロットを表しており、そのＮ末端が適当な環境下で部分的に両親媒性のα−ヘリックス構造をとっていることを示している。
【図４】 エピデルミンに関して提唱されている成熟過程を示している。翻訳されたポリペプチド（プレ・エピデルミン）は、５２アミノ酸残基からなっている。構造予測は、Ｎ末端の部分的α−ヘリックスを示しており、そこから残基−３０乃至−１０が両親媒体性α−ヘリックス構造を形成している。指示されているＳｅｒおよびＴｈｒ残基から水の脱離が起こる(a) 。Ｔｈｒ+14 は例外として、水脱離に続いてスルフィド環の生成(b) およびＣ末端における脱炭酸(c) および二重結合形成(d) が起こり、プロ・エピデルミンが生産される。その後、このプロ・エピデルミンがタンパク質分解的切断によりプロセシングされ、エピデルミンが生成する。
【図５】 エピデルミンの構造を示している。環構造は、Ａ、Ｂ、Ｃ、ＤおよびＥと命名した。アミノ酸、メソランチオニンおよびトレオ・メチルランチオニンの構造も示した。
【図６】 ランチオン抗生物質中に存在し、かつ本発明の方法を用いたペプチド生産物中に生成しうる異常アミノ酸の例を示している。
【図７】 プラスミドｐＣＬＰ１００およびｐＵＣ１８からプラスミドｐＣＵＩを調製するための方法を図式で示したものである。
【図８】 実施例２で調製した培養培地単離物の溶出パターンを示している。
【図９】 ガリデルミンを含む標準物質の溶出パターンを示している。ガリデルミンは７．５４分に溶出する。
【図１０】 Ｓ．エピデルミス（ｅｐｉｄｅｒｍｉｓ）のプラスミドｐＴｕ３２のエピソームｐＴｕ３２の遺伝子解析を示しており、以下のものが含まれる：
Ａ：エピソームｐＴｕ３２の制限地図。
Ｂ：ｐＴｕ３２の１３．５kbのＢｇｌIIフラグメントの制限地図。黒矢印はｅｐｉＡの構造遺伝子に対応している。白矢印はシーディング・フレームｅｐｉＢ、Ｃ、Ｄ、ＰおよびＱを示している。
Ｃ：ｅｐｉＡに特異的な１５マー・オリゴヌクレオチド(5'cacatccaggagtac 3') を用いた、種々の制限酵素（ＥｃｏＲＩ、ＥｃｏＲＶ、ＢｇｌII、ＳｐｈＩ）で消化したｐＴｕ３２のサザン・ハイブダイゼーション。
【図１１】 リーディング・フレーム、ｅｐｉＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｐ、Ｑ、Ｙ’およびＹ”を含むｐＴｕ３２のＢｇｌII／ＨｐａIIフラグメントのヌクレオチド配列および誘導される各タンパク質のアミノ酸配列である。Ｓ／Ｄ配列およびターミネーション構造には上線を付した。ＩＲは、インバーティド・リピートを示している。ｅｐｉＹ、ｅｐｉＡ、ｅｐｉＢ、ｅｐｉＣ、ｅｐｉＤ、ｅｐｉＱ、およびｅｐｉＰのオープン・リーディング・フレームの開始は、太字で示してある。Ｎ末端アミノ酸残基（翻訳開始部位）は、ボックスで囲んである。図１１は、１〜８７００のヌクレオチド配列の１〜９００までを示す。
【図１２】 図１１に続くヌクレオチド配列９０１〜１９００を示す。
【図１３】 図１２に続くヌクレオチド配列１９０１〜２８００を示す。
【図１４】 図１３に続くヌクレオチド配列２８０１〜３８００を示す。
【図１５】 図１４に続くヌクレオチド配列３８０１〜４７００を示す。
【図１６】 図１５に続くヌクレオチド配列４７０１〜５７００を示す。
【図１７】 図１６に続くヌクレオチド配列５７０１〜６６００を示す。
【図１８】 図１７に続くヌクレオチド配列６６０１〜７６００を示す。
【図１９】 図１８に続くヌクレオチド配列７６０１〜８７００を示す。
【図２０】 Ｓ．エピデルミス（ｅｐｉｄｅｒｍｉｓ）におけるｅｐｉＡ（１０Ａ）およびｅｐｉＢ（１０Ｂ）の発現のノーザン・ブロット・ハイブリダイゼーションの結果を示しており、これは、１．２％アガロースゲルによる全ＲＮＡ（４０μg、レーン１、３および５、または２０μg、２、４および６）の分離およびアンチセンスＲＮＡプローブによるハイブリダゼーション（ＳＰ６転写物、ストリンジェンシーを上げながらフィルターを洗浄した。レーン１、２：１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、露光時間４時間；レーン３、４：０．５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、露光時間１６時間；レーン５、６：０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、露光時間３日）を行ったものである。サイズ標準物質として２３Ｓおよび１６Ｓ ＲＮＡを使用している。
【図２１】 ＥｐｉＰと種々のセリンプロテアーゼ（ＳＵＢＳＩ、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のズブチリシンＩ１６８前駆体（テルザジ（Ｔｅｒｚａｇｈｉ）等、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２９：８０７−８１３（１９７５）；枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）の主要細胞内セリンプロテアーゼ（マニアチス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）等、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｎｕａｌ，第２編、コールドスプリングハーバーラボラトリーズ（１９８０）；ＳＵＭＹＴＶ、サーモアクチモミセス バルガリス（Ｔｈｅｒｍｏａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ ｖｕｌｇａｒｉｓ）のサーミテース（ストール（Ｓｔａｈｌ）等、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５８：４１１−４１８（１９８４））の活性部位に関する配列のホモロジーを示している。保存性の高いスパラギン（ａｓｐ）、ヒスチジン（ｈｉｓ）およびセリン（ｓｅｒ）残基にはアステリスクを付した。同様のアミノ酸残基は点で示し、また同一のアミノ酸残基はコロンで示した。
【図２２】 ＥｐｉＱとＰｈｏＢ（マキノ（Ｍａｋｉｎｏ）等、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９０：３７−４４（１９８６））。同様のアミノ酸残基は点で示し、また同一のアミノ酸残基はコロンで示した。
【図２３】 Ｓ．カルノサス（ｃａｒｎｏｓｕｓ）で生産されたエピデルミンのＨＰＬＣの溶出プロフィールを示している。
Ａ：エピデルミン標準物質の溶出プロフィール（６．７５分、矢印で示した）。
Ｂ：Ｓ．エルノサス（ｃａｒｎｏｓｕｓ）ＴＭ３００ ｐＴｅｐｉ１４の培養濾液から単離したエピデルミン標準物質の溶出プロフィール（６．７５分、矢印で示した）。培養液をＸＡＤ１１８０に吸着し、メタノールで溶出後、最後にエバポレーションで濃縮した。
Ｃ：１９Ｂと同様に処理した非トランスホームＳ．エルノサス（ｃａｒｎｏｓｕｓ）ＴＭ３００の培養濾液溶出プロフィール。太線は、エピデルミンの溶出領域を示している。
【図２４】 ｐＴ１８１ｍｃｓの構築を示している。ｐＴ１８１のプレ内にある単一のＮｄｅＩ部位に、平滑末端ライゲーションによりｐＵＣ１９のＰｖｕII309 −ＰｖｕII631 フラグメント、ｌａｃＺの一部およびマルチクローニング部位（ｍｃｓ）を挿入した（ゲナロ（Ｇｅｎｎａｒｏ）等、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６９：２６０１−２６１０（１９８７）；カーン（Ｋａｈｎ）等、Ｐａｓｍｉｄ １０：２５１−２５９（１９８３））。ｌａｃＺは、プレに対して逆を向いている。黒棒はプレの切断を示しており、白棒はｐＵＣ１９フラグメントの挿入を示している。
【図２５】 ｐＣＵ１の構築を示している。ＰＣＬＰ１００は、単一のＰｓｔＩ部位を含むｐＣ１９４（ホリノウチ（Ｈｏｒｉｎｏｕｃｈｉ）等、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５０：８１５−８２５（１９８２））の誘導体であって、ＨｉｎｄIII 部位におけるｐＣ１９４の開環、Ｂａｌ３１による末端の削除（約９５０bp）および平滑末端ライゲーションによるＰｓｔＩリンカーの挿入により生成する。ｐＵＣ１は、各々単一のＰｓｔＩとＮｄｅＩ部位によるｐＣＰＬ１００とｐＵＣ１９との平滑末端ライゲーションで生成する（ビエイラ（Ｖｉｅｉｒａ）等、Ｇｅｎｅ １９：２５９−２６８（１９８２））。ｌａｃＺの前にあるマルチクローニング部位（ｍｃｓ）は、種々のｅｐｉ遺伝子含有フラグメントのクローニングに使用した。このシャトルベクターは、スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）および大腸菌の両方で複製する。
【図２６】 下記の事項を示している。
A)ｐＴ１８１ｍｃｓにおけるｐＴｕ３２の１４kbのＢｇｌIIフラグメントのクローニングによるｐＴｅｐｉ１４の生成。このフラグメントには、Ｓ．カルノサス（ｃａｒｎｏｓｕｓ）におけるエピデルミンの生産に必要な全遺伝子情報を含まれている。指示されているＯＲＦおよびその転写方向（矢印で示されている）は、このＤＮＡ配列に基づくものである。構造遺伝子ｅｐｉＡは、黒矢印で表されている。
B)ｐＴ１８１ｍｃｓ（ｐＴ．．．）またはｐＣＵ１（ｐＣＵ．．．）にサブクローニングされた種々のｐＴｅｐｉ１４フラグメント。各プラスミドは、Ｓ．エピデルミス（ｅｐｉｄｅｒｍｉｓ）Ｅｐｉ変異体の相補に使用した。プラスミド中に存在する完全なＯＲＦが示されている。
【図２７】 ｐＰＳｅｐｉＡおｐＰＳ４ｅｐｉＢの構築を示している。ｐＰＳ４は、ｐＬｉｐＰＳ１の誘導体である（リーブル（Ｌｉｅｂｌ）等、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２０４：１６６−１７３（１９８６））。強力なスタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）プロモーターの後ろに単一のＢａｍＨＩ部位が挿入された。通常、ＯＲＦ２プロモーターのコントロール下のＢａｍＨＩ部位に遺伝子をクローニングすると、スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）での発現が高くなる。ｅｐｉＡをＰＣＲ増幅してみると、ＢａｍＨＩ部位に隣接して含まれていた。ｅｐｉＢを含む３．２kbのＢｓｔＮＩフラグメントを平滑末端ライゲーションによりＢａｍＨＩ部位に挿入した。各ＥＭＳ変異体は、ｅｐｉＡおよびｅｐｉＢがＯＲＦ２プロモーターのコントロール下にあるときのみ相補された。ｌｉｐ，リパーゼ遺伝子；ｃａｔ、クロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼ遺伝子；ＯＲＦ２、Ｓ．カルノサス（ｃａｒｎｏｓｕｓ）特異的短縮型ＯＲＦ。
【図２８】 隣接するＤＮＡフラグメントによるＳ．カルノサス（ｃａｒｎｏｓｕｓ）（ｐＴｅｐｉＡＢＣＤＱ）におけるエピデルミン生産の相補性を示している。フラグメントは、適合するプラスミドｐＣＡ４４にサブクローニングした。
【産業上の利用分野】
本発明は、化学物質の生合成、より具体的にはデヒドロアミノ酸残基、および／またはチオエーテル結合を含む化学物質の生合成に関する。また、本発明は、該化学物質の生合成に関する酵素を生産するための組み換え遺伝学の利用に関する。
【０００２】
【従来技術】
ニシン、ズブチリン、ズラマイシン、シナマイシン、アンコベニン、Ｒｏ０９−０１９８およびエピデルミン等のポリペプチド抗生物質は、デヒドロアミノ酸およびランチオニン結合を含んでいる。これらのポリペプチドは、種々の各微生物株から生産される。例えば、ニシンはストレプトコッカス ラクチン（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｎ）、ズブチリンは枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）を培養することにより生産しうる。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
今日まで、これらの抗生物質の生合成に関する遺伝学的基礎は明らかになっていない。すなわち、例えばこれらの抗生物質の生合成、特にこれらの中に見られる異常アミノ酸の生成がリボゾーム合成によるものか、多酵素複合体(complex) によるものかは分かっていない。
さらに、これらの抗生物質の前駆体タンパク質が明確な構造遺伝子にコードされているのか、または、より大きいタンパク質の分解産物なのかが分かっていない。
【０００４】
【発明が解決するための手段】
エピデルミンの構造遺伝子を特定する研究の過程で、意外なことに上述の各抗生物質、特にエピデルミンが明確な構造遺伝子によってコードされており、かつ、プレ配列ポリペプチドのプロセシングがデヒドロアミノ酸残基、および／またはチオエーテル結合の生成に関する酵素複合体によって起こることが明らかになった。
さらに、この多酵素複合体は、プレポリペプチドのプロセシングと同時に該タンパク質を細胞膜を通して培養上清に分泌する事にも関与している。この点に関して、これらの活性は、例えば、以下に説明するプレ・エピデルミンの−３０乃至−１の配列の場合のようにプレ・ポリペプチドが有するプレ・配列に関係している。
概して言うと、本発明の一つの特徴は、通常、宿主によって生産されないポリペプチドをコードするプラスミドを含む細菌宿主であって、培養に際して少なくとも１つのデヒドロアミノ酸、および／または、少なくとも１つのランチオニン結合を含むポリペプチドであって、該宿主にとって外来のポリペプチドを生産する多酵素複合体を提供する宿主を提供することにある。
適当な多酵素複合体とは、以下に示す機能、即ち、水脱離およびスルフィド結合形成の少なくとも１つを果たしうるものである。また、この多酵素複合体は、脱炭酸および二重結合形成も行いうる。
【０００５】
本発明の方法を実施するのに適した宿主は、その遺伝物質を修正すること無しにデヒドロアミノ酸残基および／またはランチオニン結合および／またはメチルランチオニン結合を含むポリペプチドを生産しうるものである。このような宿主の例には、ストレプトコッカス ラクチス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、ストレプトミセス シナモニウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｉｎｎａｍｏｎｅｕｓ）、ストレプトミセス ｓｐ．ストレプトベルチカラム グリセオベルチシカム（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．Ｓｔｒｅｐｔｏｖｅｒｔｉｃｕｌｌｕｍ ｇｒｉｓｅｏｖｅｒｔｉｃｉｌｌｕｍ）、スセフィロコッカス エピデルミス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｓ）、スタフィロコッカス エピデルミン ５株（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｎ ｓｔｒａｉｎ５）、スタフィロコッカス ガリナラム（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）およびこれらの変異株、例えばエピデルミンを生産しえないＳ．エピデルミン（Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｎ）ＤＳＭ３０９５の変異株がある。
特に興味深い株は、１９８８年５月１８日、ブダペスト協定に基づきドーシェ・サムラング・ホン・マイクロオーガニズメン（Ｄｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ）に、寄託番号ＤＳＭ４６１６−Ｔｕ３９２８として寄託されているスタフィロコッカス ガリナラム（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）（Ｆ１６／Ｐ５７）Ｔｕ３９２８、および１９８４年１０月２６日、ブダペスト協定に基づきドーシェ・サムラング・ホン・マイクロオーガニズメン（Ｄｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ）に本出願者により寄託されたスタフィロコッカス エピデルミス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｓ）ＤＳＭ３０９５である。
【０００６】
適当な宿主をトランスホームするために、適当なプラスミドを従来の遺伝子工学技術を用いて修正しうる。
プレポリペプチドをコードする遺伝子の修正または置換により、少なくとも１つのデヒドロアミノ酸残基および／または少なくとも１つのスルフィド結合を含むポリペプチドを生産する宿主由来のプラスミドを処理して該宿主にとって外来のポリペプチドをコードするプラスミドを提供し、この修正したプラスミドで該宿主をトランスホームすることが望ましい。
プレ・ポリペプチドをコードする遺伝子を置換または修正するには、様々な方法が使用される。
望ましい化合物のプレ・ポリペプチド配列をコードするＤＮＡは、化学合成で調製しうる。適当な化学合成法は、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１２１，３６５（１９８２）に報告されている。従来技術で、例えば６０−１００塩基のポリヌクレオチドの合成が可能である。
適当な保護ヌクレオチドは、ホスホトリエステル法（アガーワル（Ａｇａｒｗａｌ）等、Ａｇｎｅｗ，Ｃｈｅｍ．８４，４８９（１９７２））、ホスホトリエステル法（リーセム（Ｒｅｅｓｅｍ）．、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ ３９，３，（１９８３））またはホスファイトトリエステル法（レジンガー（Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ）等、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．９８，３６５５（１９７６））またはホスホアミダイト法で連結しうる。固相法がポリヌクレオチド合成を簡便にしている。
二本鎖ＤＮＡは、化学合成した短いが重複したセグメントから酵素的に構築しうる。
例えば、両ＤＮＡ鎖の重複ポリヌクレオチド配列を塩基対合で正しい配置を取らせ、ＤＮＡリガーゼにより化学的に結合させることが出来る（コラーナ（Ｋｈｏｒａｎａ）等、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５１，５６５（１９７６））。
【０００７】
別の可能性として、短い重複セグメントを有する２つのＤＮＡ鎖の各ポリヌクレオチド配列を必要とされるデオキシヌクレオシド三リン酸の存在下、ＤＮＡポリメラーゼ、例えば、ＤＮＡポリメラーゼＩ、ポリメラーゼＩのクレノーフラグメントまたはＴ４ＤＮＡポリメラーゼ、または逆転写酵素とインキュベーションする事が挙げられる。即ち、２つのポリヌクレオチド配列が塩基対合で正しい配置を取り、酵素により必要とされるヌクレオチドが補填されることによって完全な二本鎖ＤＮＡが提供される（ナラニー（Ｎａｒａｎｙ）等、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１２１，３６５（１９８２））。
ポリペプチドをコードするＤＮＡを得る別の適当な方法には、細胞を、例えばＳＤＳまたはプロテナーゼＫ、または望ましい場合は機械的に分解し、そのＤＮＡを繰り返しフェノールで抽出することにより除タンパクを行うことにより、組織または細胞培養物または微生物のゲノムＤＮＡからＤＮＡを単離する方法がある。
ＲＮＡはＲＮＡａｓｅで消化しうる。得られた粗ＤＮＡは、適当な制限酵素、例えばＨａｅIII およびＡｌｕＩで消化し、フラグメントを単離し、適当なファージまたはコスミド、例えばシャロン４ＡまたはＥＭＢＬ−３ファージ中で増幅した後、例えば、放射能ラベルしたＤＮＡプローブを用いて望ましい配列を検定する。
また、望ましいポリペプチドをコードするＤＮＡは、単離したｍＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写することにより得ることが出来る。この方法は、ＤＮＡの構造が分からない場合に有効である。この方法では、ｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡライブラリー中のゲノムＤＮＡからＤＮＡを得る。ｃＤＮＡライブラリーには、細胞から単離したｍＲＮＡに相補的な遺伝情報が含まれている。
ｃＤＮＡを得るために、ｍＲＮＡを望ましい基本（出来るだけ未修正の）タンパク質を発現する細胞から単離する。このｍＲＮＡを二本鎖ｃＤＮＡに変換する。
【０００８】
ｍＲＮＡの調製には、従来法を使用する。細胞膜を破壊し、放出される細胞内容物からｍＲＮＡを単離する。細胞膜は、物理的方法で破壊するか、またはＳＤＳ等の界面活性剤、クアニジンチオシアネート、限定塩条件またはホモゲナイゼーション、望ましくはミキシングにより分解する事が望ましい。ｍＲＮＡは、フェノール抽出、エタノール沈殿、遠心およびクロマトグラフィーを含む標準的方法、望ましくは幾つかの方法を組み合わせて単離される。遠心は、勾配、例えばＣｓＣｌ勾配をかけて行うことが望ましい。クロマトグラフィーに関しては、カラム、特にオリゴ−ｄＴカラムを使用することが望ましい。
全ｍＲＮＡは、従来法に従い直接Ｄｓ−ｃＤＮＡに変換しうる。さらに、望ましいポリペプチドをコードするｍＲＮＡは、電気泳動、クロマトグラフィーおよび遠心、望ましくはスクロース勾配遠心等の幾つかの技術を用いて濃縮することが望ましい。
望ましいポリペプチドをコードするｍＲＮＡを含むフラクションは、インビボまたはインビトロ・トランスレーションと関連活性の検定、またはヌクレオチド配列が既知の場合は、オリゴヌクレオチドプローブとのハイブリダゼーション等の種々の方法で検出しうる。
インビボ・トランスレーション・システムは、原核性または真核性システムで行いうる。望ましいインビボ・トランスレーション・システムは、ゼノパス レビス（Ｘｅｎｏｐｕｓ ｌａｅｖｉｓ）卵細胞系（マニアチス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）等、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｎｕａｌ，コールドスプリングハーバーラボラトリーズ、コールドスプリングハーバー、ＮＹ（１９８２））がある。インビトロ・システムには、例えば小麦胚芽およびウサギ網状赤血球溶解物があり、いずれも市販されている。
【０００９】
未分画または分画したｍＲＮＡ由来のｍＲＮＡプールから従来法にしたがってｄｓ−ｃＤＮＡを得ることが出来る（望ましい一般的方法は、マニアチス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）等（上述）、オカヤム（Ｏｋａｙａｍ）およびバーグ（Ｂｅｒｇ）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２，１６１−１７０（１９８２）およびハイデッカー（Ｈｅｉｄｅｃｋｅｒ），ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １１，４８９１−４９０６（１９８３））。一般に、先ず、ｍＲＮＡを逆転写酵素またはＤＮＡポリメラーゼ（クレノーフラグメント）を用いてｓｓ−ＤＮＡに変換する。ｄｓ−ＤＮＡの合成を開始させるには２つの方法のいずれかが使用される。第１の方法は、ｓｓ−ＤＮＡのナチュラル・ループ形成である。第２の方法は、ポリ−ｄＣまたはポリ−ｄＴ等のホモポリマー・テールをｓｓ−ｃＤＮＡに付加する方法である。
対応するポリペプチドが検出システムで高い活性を示すｍＲＮＡフラクションを従来法に従い相補的ｃＤＮＡに転写する。ｍＲＮＡおよびプライマーのオリゴ−ｄＴを混合し、開始物質としてｄＮＴＰを添加すると逆転写酵素によりｃＤＮＡ−ｍＲＮＡハイブリッド分子の合成が行われる。ＲＮＡ分子はＮａＯＨの添加により分解する。ＤＮＡポリメラーゼ、望ましくはＤＮＡポリメラーゼＩのクレノーフラグメントを混合し、その混合物を適当な温度、望ましくは１２−１５℃でインキュベートする。この混合物をヌクレアーゼＳ１とインキュベーションすることにより、目的のポリペプチドをコードするｍＲＮＡに対応するｄｓ−ｃＤＮＡが得られる。
得られたｄｓ−ｃＤＮＡを増幅するためには、これを適当なベクター、例えばプラスミドｐＵＣ−ＫＯにスプライスし、得られたハイブリッドベクターを適当な宿主、例えば大腸菌ＨＢ１０１を用いて増やすことが出来る。このハイブリッドベクターを再び単離し、そこから単離したｃＤＮＡを回収することにより、目的のポリペプチドをコードするＤＮＡの構造を決定することが出来る。
【００１０】
ハイブリッドベクターの調製
本発明のハイブリッドベクターは、目的の配列を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを適当なベクターにスプライスする事により調製しうる。
適当なベクターとは組み込んだパッセンジャーＤＮＡのキャリヤーであって、宿主微生物のトランスホームに使用しうるものである。
ベクターとして適当なものは、非トランスホーム状態でデヒドロアミノ酸および／またはスルフィド結合を含むポリペプチドを生産する微生物に由来するプラスミドである。適当なベクターは、決まった位置に挿入ＤＮＡを有している。
一般に、これらのベクターは、宿主細胞または使用される宿主細胞に適合する細胞種に由来するレプリコンおよびコントロール配列、即ちプロモーターを含んでいる。通常、このベクターはレプリコン部位を有し、かつトランスホーム細胞に発現型選択を可能にする配列（マーカー遺伝子）を含んでいる。適当なマーカー遺伝子は、抗生物質耐性または重金属耐性を提供するか、または宿主の遺伝的欠陥を補う。さらに、これらのベクターに有用な配列には、エンハンサーおよびアクチベーター配列がある。
適当な開始ベクターには、スタフィロコッカス エピデルミス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｓ）ＤＳＭ３０９５株由来の５４ kbpのプラスミドｐＥｐｉ３２があり、これはプラスミドｐＴｕ３２と同じである。以下に特徴を示すこのプラスミドは、テトラサイクリック２１−ペプチド・アミド抗生物質にプロセシングされる５２−プレペプチドをコードするｅｐｉＡ遺伝子を含んでいる。パッセンジャーＤＮＡを含むベクターをハイブリッドベクターと呼ぶ。
【００１１】
目的のＤＮＡは、従来法に従い開始ベクターにスプライスする。
例えば、先ず開始プラスミドを適当な制限酵素、例えばプラスミドｐＥｐｉ３２の場合はＨｉｎｄIII 、ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩで線状化し、ｄＧＴＰおよびターミナル・デオキシヌクレオチジル・トランスフェラーゼの存在下でｄＧテール化する。二本鎖ｃＤＮＡ挿入物は、ｄＣＴＰおよびターミナル・デオキシヌクレオチジル・トランスフェラーゼの存在下でｄＣテール化する。ｃＤＮＡおよびベクターを合わせることによりハイブリッドベクターが出来る。ゲノムライブラリーを構築するには、ラムダ等のバクテリオファージが望ましい。ラムダ・クローニング・システムについては、マニアチス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）等（上述）により報告されている。適当なベクターＤＮＡを適当な制限酵素で完全に消化し、速度勾配遠心またはゲル電気泳動により左右のアームと中央フラグメントを分離する。別の方法では、左右のアームに認識部位を欠くスタッファーフラグメントの一部を制限酵素で消化する。単離したゲノムＤＮＡを長さ１３−２０ kbpのフラグメントに部分分解する。その後、アームをアームの末端と適合する末端を有する外来ＤＮＡのフラグメントとライゲーションする。
最初のクローニングに使用したベクターから適当なＤＮＡ挿入物を適当な発現ベクターに再クローニングする。最後に、適当な制限酵素を、可能ならオキソヌクレオンと組み合わせて使用して目的のＤＮＡフラグメントを生成する。
ＤＮＡ挿入物は、従来の適当なプラスミドベクターの多くの部位、例えばｐＣ１９４、ｐＴ１８１およびｐＵＢ１１０のＨｉｎｄIII ／ＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩ制限部位にサブクローニングしうる。
【００１２】
このように、本発明の方法は、既知のペプチドおよびホルモンの誘導物であって、その未修正のペプチド内のシステイン残基をスルフィド結合アミノ酸に置換し、かつセリンおよびチアミンを対応するデヒドロアミノ酸残基に置換した誘導体を調製するのに使用しうる。
これらのフラグメントは、直接粘着末端を用いるか、または適当に化学合成されたオリゴヌクレオチド・ブリッジを付加することにより適当な発現ベクターに組み込まれる。末端の修正には、例えばＨｉｎｄIII およびＢｇｌIIを使用しうる。この方法は、制限酵素の種類に制限されることはない。適当な制限酵素と化学合成したオリゴヌクレオチドを組み合わせて使用することにより、発現ベクターとＤＮＡ挿入物とを結合することができる。
また、部位特異的突然変異を有するポリペプチドをコードする適当なＤＮＡ挿入物も得ることが出来る。
目的の変異体を得るために基本となるＤＮＡに突然変異を誘導するには、種々の方法を使用しうる。
１つの方法では、先ず、変異させる領域をコードする配列を含む天然の、または基本遺伝子のフラグメントをファージの複製型、例えばＭ１３ｍｐ８ＰＡを調製する場合のＭ１３ｍｐ８に挿入する。挿入する配列に相補的出るが、置換するアミノ酸をコードする１つ以上のヌクレオチドトリプレットを含む合成オリゴヌクレオチドをＭ１３ｍｐ８Ａの一本鎖にアニールし、二本鎖領域を作る。この領域は、残りの相補鎖のＤＮＡポリメラーゼＩ合成のプライマーの役割を果たす。複製および同定後、この変異配列をさらに修正するか、もしくは変異ポリペプチドを発現する適当なベクターの構築に用いる。
【００１３】
エピデルミンに関して行った研究では、エピデルミンに関して提唱されているプレ・配列の適当なペンタペプチドＬｙｓＰｈｅＣｙｓＴｈｒから誘導されるワブルＤＮＡプローブ５’−ＧＴＧ（Ａ）ＣＡＴ（Ｇ／Ａ）ＡＴＧ（Ａ）ＡＡＴ（Ｃ）ＴＴ−３’を合成した。このＤＮＡプローブをＳ．エピデルミン（ｅｐｉｄｅｒｍｉｎ）ＤＳＭ３０９５由来のプラスミドＤＮＡにハイブリダイズした。
単離したプラスミドの制限分析により、ＥｃｏＲＩで７個のフラグメント（１６，１１，１０，６．５，５．５，３．５および２．５ kbp）、ＨｉｎｄIII で９個のＤＮＡフラグメント（１７，１４，１０，５．３，２．８，１．８，０．８，０．６および０．５ kbp）およびＢａｍＨＩで５個のＤＮＡフラグメント（２０，１９，１０，３および１ kbp）が確認された。
５．４ kbpのＨｉｎｄIII フラグメントをサブクローン化し、リハイブリダゼーションする事により、構造遺伝子ｅｐｉＡは２．２ kbpＥｃｏＲＩ／ＢｇｌIIフラグメントに存在することが分かった。
ハイブリダゼーションプローブとして２４種の１４マーの混合物を使用した。
ノビク（Ｎｏｖｉｋ）等、Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１８２，２７９−２９４（１９７１）、サザン（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ）、Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．９８，５０３−５１７（１９７５）およびハインリッヒ（Ｈｅｉｎｒｉｃｈ）等、Ｍｏｌｅｃｕｌ．ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２０９，５６３−５６９（１９８７）に示されている技術に従い、シーケンシングプライマーとして３０倍過剰量のプローブを使用した。エピデルミンのペプチド配列で、オープン・リーディング・フレームを同定しえた。シャイン・ダルガルノ配列から適当な距離に単一のメチオニンコドンが存在している。プレ・エピデルミンの構造遺伝子はＴＡＡ停止コドンで終わっており、その結果、プレ・エピデルミンは５２個のアミノ酸を含み（第１図）、Ａｒｇ-1およびＩｌｅ+1の間でプロセシングされてエピデルミンとなる。以上のことから明らかなように、プレ・エピデルミンはより大きいタンパク質の分解産物ではなく、明確な構造遺伝子によりコードされている。
従って、意外にも抗生物質の前駆体タンパク質は、明確な構造遺伝子によってコードされていることが明らかになった。
【００１４】
二次構造（α、β）、フレキシビリティー、ハイドロパシー、親水性（第２図）およびヘリックス・ホイール・プロットに関する予測をハイコン（Ｈｙｃｏｎ）プログラムを用いて行った（第３図）。プレ・エピデルミン−３０乃至−８に関して高いα−ヘリックス含量の可能性が予測され、一方、プロ・エピデルミンに対応するＣ末端部分には高いターン含量の可能性が示された。さらに、予測プロットは、Ｎ末端−３０乃至−１が高い親水性、一方、Ｃ末端部分がより親油性であることを明確に示している。Ｎ末端部分−３０乃至−８は、部分的に折り畳んでおり、両親媒的α−ヘリックスとなっているようである。
プレ・エピデルミンのＮ末端セグメントはシステイン残基を含んでおらず、一方、Ｃ末端セグメント１−２２はスルフィド結合形成に関する４個のシステイン残基を含んでいる。配列−３０乃至−１はエンドプロテアーゼに対する多くの切断部位を含んでいるが、一方、プレ・エピデルミン状態でさえ、配列１−２２は蛋白分解に対して非常に耐性を有している。
成熟型抗生物質は部位１３のＬｙｓでのみトリプシンの攻撃を受ける。プロセシング部位Ａｒｇ-1−Ｉｌｅ+1は、ターン形成するＰｒｏ-2のために親水性で接近可能となっている。
【００１５】
エピデルミンなどの抗生物質の生産において発生する種々の酵素反応には、プロ・ポリペプチド部分１−２２の修飾、Ｎ末端プレペプチドフラグメント−３０乃至−１の切断および成熟型抗生物質の分泌が含まれる（第４図および第５図）。
酵素的修飾は、プレペプチドフラグメントの切断前に起こる。酵素的修飾には、デヒドロアラニンおよびデヒドロブチリン残基を生成する各々部位５、１６、１９および８、１４のＳｅｒおよびＴｈｒ残基からの水の脱離が含まれる。また、部位２、１１、２１および２２のＣｙｓ残基のチオール基のＣ＝Ｃ二重結合への付加も起こり、メソ−ランチオニンまたは（２Ｓ ３Ｓ，６Ｒ）−３−メチル−ランチオニン結合が生ずる。さらに、残基２２の脱炭酸および二重結合形成でＣ末端Ｓ−（２−アミノビニル）−Ｄ−システインが生ずる。Ｃ末端に存在するシステインのチオール基とＮ末端に存在するデヒドロアミノ酸との反応は、エピデルミン、ニシンおよびズブチリンにおいては完全な立体特異性を以て起こる。従って、修飾の際のこれらの脱離・付加反応は、プレ・エピデルミンの残基Ｌ−ＳｅｒおよびＬ−ＴｈｒのＣα炭素原子の配置を逆転させＤ型Ｃα原子とする事を意味している。
また、４個のスルフィド環が、結果的に同じ触媒部位に生成するが、この事はＮ末端の両親媒体性α−ヘリックスとの相互作用で支持される。Ｔｈｒ+14 のみが、システインとは無関係に脱水する。この部位（Ｌｙｓ+13 −Ｄｈｂ+14 ）は酵素切断部位を形成しており、ここでトリプシンがエピデルミンを失活させる。スルフィド環生成によりＣ末端のリジディティーおよび疎水性が増加して、脂質二重層とプロ・エピデルミンとの相互作用を促進され、かつ、トランスロケーションが誘導される。
最後に、親水性のα−ヘリックスＮ末端−３０乃至−１は、上述の特徴的切断部位で特異的プロテアーゼにより切断を受ける。
【００１６】
上述の技術を用い、ランチビオティクスをコードするプラスミドを各ポリペプチドをコードする遺伝子の突然変異または異なるポリペプチドをコードする遺伝子でそのような遺伝子を置換することにより修正し、本来の宿主、もしくは、天然の状態でそれらの宿主がランチビオティクス発現しうる場合には、別の宿主をトランスホームするのに使用しうる。
一般に、例えばエピデルミンの場合について上述したように、本来の機能的遺伝子がプレ・配列をコードしている場合、そのようなプレ・配列をコードしているＤＮＡ配列は、修正したプラスミドに保持しうる。この場合、新規の、または変異したプロ・ポリペプチドに関するＤＮＡ配列は、本来のプロ・ポリペプチド配列と同様にプレ・配列の直ぐ上流に位置することになる。
本発明の細菌宿主の培養は、例えば、１９８８年５月１８日の英国特許出願第８８１１７６０．１号およびヨーロッパ特許出願第０ １８１ ５７８号に示されているような従来の培養条件で行いうる。また、目的のタンパク質の精製および単離もエピデルミンおよびガリデルミンに関して先の特許出願に示されている、吸着剤、イオン交換樹脂および望ましい場合はＨＰＬＣを使用する方法または適当な修正法を用いて行いうる。
【００１７】
本発明の方法は、実験用の新規化合物の生成、または新規宿主中の既知化合物または既知化合物の誘導体の生成に応用しうる。例えば、エピデルミンをコードする遺伝子を含むプラスミドをストレプトコッカス ラクチス（Ｓｔｒｅｐｔｐｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）にトランスホームして該宿主からエピデルミンを生産しうるし、また、ガリデルミンをコードする遺伝子（先に示した英国特許出願参照）を、例えばプラスミドｐＥｐｉ３２におけるようにエピデルミンのプロ・ポリペプチドをコードする遺伝子と置換し、これを用いてスタフィロコッカスエピデルミス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｓ）ＤＳＭ３０９５をトランスホームして該宿主からガリデルミンを生産しうる。同様に、ヒトのインシュリンなどのホルモン、オキシトシン、バソプレシン、ペプチド抗生物質、エラスターゼインヒビター等のホルモンインヒビターおよびヒトの組織プラスミノーゲン活性化因子などの繊維素溶解剤等、デヒドロアミノ酸残基および／またはランチオニン結合および／またはメチルランチオニン結合を含む他の生物学的に活性なペプチド誘導体も生産しうる。親化合物の生物学的活性を保持すると同時に、これらの化合物の安定性を増し、寿命を延ばすことが出来る。
理想的には、目的のプロ・ポリペプチドをコードするＤＮＡは、チオエーテル結合を形成するためのシステインおよびセリン、および／またはシステインおよびスレオニンに対するコドンが含まれるべきである。
比較的短いポリペプチド鎖の場合には、通常、これらの各々のコドンはわずか８個、望ましくはわずか６個のコドンで分離してているが、もっとも最終的ポリペプチド分子の立体配置に応じてより以上の間隔も可能であることが想像される。
デヒドロアミノ酸の生成の関しては、通常、これらはセリンおよびスレオニンから誘導されることから、目的のプロ・ポリペプチドをコードするＤＮＡにはこのようなアミノ酸に対するコドンが含まれる。
【００１８】
本発明の方法にしたがって生産したポリペプチド中に存在する異常アミノ酸には、デヒドロアラニン、２，３−デヒドロ−２−アミノ酪酸、メソ−ランチオニン、（２Ｓ，３Ｓ，６Ｒ）−３−メチル−ランチオニン、Ｓ−（２−（Ｚ）−アミノビニル）−Ｄ−システイン、リシノアラニンおよびβ−ヒドロキシアスパラギン酸がある。これらの残基の構造を第６図に示す。
意外にも、プレ・エピデルミンの翻訳後の修飾に関する多酵素複合体が、スタフィロコッカス エピデルミン（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｎ）Ｔｕ３２９８／ＤＳＭ３０９５の５４ kbpのプラスミドｐＴｕ３２に存在することが分かった。
本明細書ではエピデルミンの生産を担っている６個の遺伝子（ＯＲＦ）をEpiA、Ｂ、Ｃ、Ｄ、ＱおよびＰと命名するが、これらは８ｋｂ内に集まっており、また、これらがコードするタンパク質をそれぞれEpiA、Ｂ、Ｃ、Ｄ、ＱおよびＰと命名した。EpiAは、５２アミノ酸残基長のプレ・エピデルミンである。以下に述べるように、EpiB、ＣおよびＤは、４個の酵素的修飾反応(i)セリン／スレオニン デヒドラターゼによる水脱離、(ii)ランチオニン シンテースによる硫黄付加、(iii) システイン脱炭酸酵素によるＣ末端脱炭酸および(iv)二重結合形成に関連する。ＥｐｉＰタンパク質は、セリンプロテアーゼの本質的ドメインとの著しい類似性に基づくＮ末端リーダーペプチドからの成熟型エピデルミンの切断を担うと考えられているが（コイデ（Ｋｏｉｄｅ）等、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６７：１１０−１１６（１９８６）；メロン（Ｍｅｌｏｕｎ）等、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．１８３：１９５−２００（１９８５）；およびストール（Ｓｔａｈｌ）等、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５８：４１１−４１８（１９８４））、一方、EpiQは、大腸菌のｐｈｏＢ遺伝子への明確な類似性（マキノ（Ｍａｋｉｎｏ）等、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９０：３７−４４（１９８６））、両タンパク質が２０５（EpiQ）および２２９（ｐｈｏＢ）アミノ酸残基長と同じサイズであるという事実、１５３個のＣ末端アミノ酸残基に渡る２４．２％の類似性および両タンパク質の親水性プロットに基づき、エピデルミンの整合性を調節する調節タンパク質であると考えられる。
ここで、上述したEpiB、C、D、PおよびQの各タンパク質の酵素活性は実施例５に記載したような相補性試験によって確認することができる。なお、エピデルミン生合成に関する相補性試験において不活性EpiBタンパク質を相補する酵素活性を有するタンパク質を本明細書において「エピデルミン生合成に関する相補性試験によって定義されるEpiB活性」と呼ぶことにする。EpiC、EpiD、Epi PおよびEpiQについても同様に「エピデルミン生合成に関する相補性試験によって定義されるEpiC活性」、「エピデルミン生合成に関する相補性試験によって定義されるEpiD活性」、「エピデルミン生合成に関する相補性試験によって定義されるEpiP活性」、「エピデルミン生合成に関する相補性試験によって定義されるEpiQ活性」を定義する。
【００１９】
エピデルミン生合成に関する全遺伝的情報の予想外の知見およびタンパク質ｅｐｉＢ、Ｃ、Ｄ、ＱおよびＰに対する遺伝子の解釈の結果から、これらのタンパク質をコードするＤＮＡを単離し、かつ、これらの遺伝子を１つ異常含むプラスミドを構築する事が出来、その結果、このようなプラスミドを含む宿主を培養することによりこれらのタンパク質のうちの１つ、または所定のタンパク質の組み合わせ物を発現し、単離することが可能となった。
従って、本発明には、タンパク質ＥｐｉＢまたはＥｐｉＣ、またはＥｐｉＤ、またはＥｐｉＰまたはＥｐｉＱをそれぞれコードするＤＮＡ配列が含まれる。これらの配列は、従来法によるｐＴｕ３２からの切断および単離、または化学合成または他の従来法で得ることが出来る。また、このＤＮＡはプラスミド、望ましくは発現プラスミドに組み込むことができ、これらの構築物で適当な宿主にトランスホームした後、その宿主を培養すると、プロモーターのコントロール下の該構築物はプラスミドにライゲーションしたＤＮＡにしたがってタンパク質ＥｐｉＢ、ＥｐｉＣ、ＥｐｉＤ、ＥｐｉＰまたはＥｐｉＱ、またはこれらのタンパク質の組み合わせ物を発現するであろう。別に、プラスミドｐＴｕ３２を適当な制限酵素で処理してＤＮＡ配列の１つまたは他の部分を切り捨て、目的のプラスミドの遊離末端に必要とする修正を施した後に再ライゲーションすることで、ｅｐｉＢ、Ｃ、Ｄ、ＰおよびＱの内の所定の１つをコードするＤＮＡ配列を含むプラスミドを作ることが出来る。
さらに、変異体には、ｐＴｕ３２中のエピデルミンをコードする遺伝子の所定のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列による置換が含まれ、この修正プラスミドを有する宿主の培養でエピデルミンとは異なるタンパク質が発現される。
従って、ｐＴｕ３２中のエピデルミンをコードする遺伝子をガリデルミン、またはエピデルミン変異体、または他のランチビオチック、または他のタンパク質をコードするＤＮＡ配列で置換することが出来、それにより生成したプラスミドを通常ランチビオチックまたはタンパク質ＥｐｉＢ、Ｃ、Ｄ、ＰまたはＱのいずれも生産しえない適当な宿主にトランスホームし、置換したＤＮＡ配列および遺伝子ｅｐｉＢ、Ｃ、Ｄ、ＰおよびＱが発現する条件下で宿主を培養する事により、ガリデルミン、エピデルミン変異体またはランチビオチックの構造的特徴を少なくとも１つ含む他のタンパク質を得ることが出来る。
【００２０】
一方、タンパク質ＥｐｉＢ、Ｃ、Ｄ、ＰまたはＱをコードする遺伝子を所定のアミノ酸配列をコードする遺伝子と共に適当なベクターに挿入し、Ｅｐｉタンパク質および所定のアミノ酸配列をコードする遺伝子を適当なプロモーターと機能的に結合させ、生成したプラスミドで通常ランチビオチックまたはタンパク質ＥｐｉＢ、Ｃ、Ｄ、ＰまたはＱのいずれも生産しえない適当な宿主をトランスホームして、この宿主を培養することで、挿入した遺伝子に所定のアミノ酸配列に由来するが、ガリデルミン、エピデルミン、エピデルミン変異体、またはその他のタンパク質に見られるランチビオチックの構造的特徴を含むタンパク質を発現することが出来る。
また、本発明は、望ましくはストリンジェント条件下、本明細書で示しているタンパク質ＥｐｉＢ、Ｃ、Ｄ、ＰまたはＱの活性を実質的に有しているタンパク質をコードするＤＮＡ配列とハイブリダイズしうるＤＮＡ配列を含む。ストリンジェント・ハイブリダゼーション条件では、８５％以上、望ましくは約９０％以上のホモロジーを有するＤＮＡ配列を選択する。ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングは、ヨーロッパ特許出願第８８ １１９ ６０２．９号およびカシマ（Ｋａｓｈｉｍａ）等、（Ｎａｔｕｒｅ ３１３：４０２−４０４（１９８５））の方法に従って高ストリンジェント条件で行った。ストリンジェント条件下で本出願で公開したＤＮＡ配列とハイブリダイズしうるＤＮＡ配列は、例えば、公開したＤＮＡ配列の対立遺伝子変異体、公開したＤＮＡ配列に関連するが特定の微生物中に天然に存在するもの、または他の生物種に由来するものがある。核酸のハイブリダゼーションに関する一般的技術は、参考として本出願に含まれるマニアチス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）、Ｔ．等、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｎｕａｌ，コールドスプリングハーバー、ＮＹ（１９８２）およびハイムス（Ｈａｙｍｅｓ），Ｂ．Ｄ．等、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ、ＩＲＬプレス、ワシントン、ＤＣ（１９８５）に示されている。タンパク質ＥｐｉＢ、Ｃ、Ｄ、ＰおよびＱは、デヒドロアラニン、デヒドロブチニン、メソ−ランチオニン、３−メチル−ランチオンおよびＳ−（２−アミノビニル）−Ｄ−システイン等の構造的特徴を含む新規なタンパク質またはその他の物質の製造に有用な高価値で、かつ興味深い新しい試薬である。
このように、これらは、単離型のタンパク質として、またはこれらの酵素による細胞外プロセシングを研究するための化学的合成操作における化学的触媒試薬として使用しうる。
【００２１】
また、本発明は、実質的に純粋なタンパク質ＥｐｉＢ、Ｃ、Ｄ、ＰまたはＱに関する。“実質的に純粋”とは、そのタンパク質が天然で会合している不純物を含まないことを意味している。実質的純粋性は、電気泳動による単一バンドで確認しうる。
本発明のポリペプチドは、抽出、沈殿化、クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、電気泳動等の従来法により上述の組み換え分子から単離・精製しうる。このタンパク質は、さらに補助タンパク質を含む融合タンパク質の一部として生産されることが望ましい。これらの補助タンパク質には、例えば、典型的分泌シグナル、大腸菌由来のマルトース結合タンパク質、またはプロテインＡ等が含まれる。プロテインＡを含む融合タンパク質の調製、イムノアフィニティー・クロマトグラフィーによるその精製、および目的タンパク質を放出するその切断に関する方法は、例えば、ＰＣＴ出願第Ｗ／Ｏ８４／０３２０３号（１９８４）に示されている。
融合タンパク質の切断を可能にする必要条件は、それが適当な切断手段で認識および切断される単一の切断部位を含むことである。このような切断部位は、化学的または酵素的手段で認識可能で、かつ、目的タンパク質と補助タンパク質の間にある単一のアミノ酸配列である。このような特異的アミノ酸配列が目的タンパク質または補助タンパク質の中にあってはならない。酵素的試薬の例には、アミノ酸配列ＮＨ2−Ｐｒｏ−Ｘ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−ＣＯＯＨ（式中、Ｘは任意のアミノ酸残基、例えばロイシン）を認識しうるコラゲナーゼ等のプロテアーゼ；Ｍｅｔ−Ｐｈｅ結合を切断するキモシン（レニン）；Ｘ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−ＹのＡｒｇのカルボキシル側を切断するカリクレインＢ；配列Ｘ−（Ａｓｐ）n−Ｌｙｓ−Ｙ（式中、ｎ＝２−４）を認識し、Ｌｙｓのカルボキシル側で切断するエンテロキナーゼ；特異的アルギニル結合を切断するトロンビン等がある。融合タンパク質を切断するのに使用しうる化学試薬の例には、Ａｓｎ−Ｚ結合（式中、ＺはＧｌｙ、ＬｅｕまたはＡｌａである）を切断するヒドロキシルアミン；高濃度で（約７０％）特異的にＡｓｐ−Ｐｒｏを切断する蟻酸等がある。
【００２２】
以上の説明を用いて、当業者が本発明を十分なまでに利用しうることは明白である。従って、以下に示す望ましい特定の態様は単なる例として解釈されるべきものであり、本出願を制限するものではない。
【００２３】
【実施例】
実施例１
１．ガリデルミンの過剰生産
ｐＣ１９４、ｐＥ１９４、ｐＵＢ１１０、ｐＴ１８１またはｐＭＫ１４８ガリデルミン等のメディアム・コピー・プラスミドを用いて、ガリデルミンのオープン・リーディング・フレームを含むＤＮＡフラグメントをエピデルミン生産株であるスタフィロコッカス エピデルミス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｓ）ＤＳＭ３０９５にクローニングしうる。通常、この遺伝子の増加は生産物の増加と相関する。但し、この相関は必ずしも線型ではない。ｐＣ１９４またはｐＴ１８１の高コピー数プラスミド誘導体もクローニングベヒクルとして使用しうる。
【００２４】
２．リーダー配列の交換
アミノ酸−１乃至−３０に相当するエピデルミンのリーダー配列は、エピデルミンの分泌に関する。この配列を用いて、ガリデルミン等、Ｓ．エピデルミジス（ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）中の他のタンパク質を分泌しうる。
このリーダー配列ＤＮＡは、その配列の前後に各リンカーを挿入することにより移動可能とすることが出来る。従って、このリーダー配列ＤＮＡは、プラスミドから大量に単離することが出来、かつ、他のペフチドおよびタンパク質の各位置に挿入することが出来る。また、このリーダー配列ＤＮＡは化学合成でも生成する事が出来る。
【００２５】
実施例２
宿主としてＳ．エピデルミス（ｅｐｉｄｅｒｍｉｓ）を用いたガリデルミンの生産
１．プラスミドの調製（第７図参照）
a)プラスミドｐＣＵＩは、ラルフ ローゼンシュタイン博士（Ｄｒ．ＲａｌｆＲｏｓｅｎｓｔｅｉｎ）の“Ｍｏｌｅｋｕｌａｒ ｇｅｎｅｔｉｓｃｈｅ Ｕｎｔｅｒｓｕｃｈｕｎｇｅｎ ｚｕｒ ｐｌａｓｍｉｄｋｏｄｉｅｒｔｅｎ Ａｒｓｅｎｉｔ ｕｎｄ Ａｒｓｅｎａｔｒｅｓｔｉｓｔｅｎｔ ｂｅｉ Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｅｎ”（ドイツ、ミュンヘン、技術大学から市販されている）の方法に従い、クレノーフラグメントを用いてＰｓｔＩ消化したｐＣＬＰ１００およびＮｄｅ１消化したｐＵＣ１８をライゲーションする事により調製した。ついで、このプラスミドをＥｃｏＲＩで消化した。
b)Ｓ．ガリナラム（ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）（ＤＭＳ４６１６）から染色体ＤＮＡを単離し、これをＥｃｏＲＩで消化した。ＨｉｎｄIII およびＥｃｏＲＩ認識部位の間にある２．４kb長のガリデルミン構造遺伝子を含む４．７kbのフラグメントを、以下の配列：
５’ＣＡＣ ＡＴＣ ＣＡＧ ＧＡＧ ＴＡＣ ３’
を有するプライマーを用いて単離した。
c)ステップa)の消化したｐＣＵＩプラスミドのＥｃｏＲＩ部位に４．７kbフラグメントをライゲーションして、プラスミドｐＣＵｇｄｍ１を得た。
【００２６】
２．宿主Ｓ．エピデルミス（ｅｐｉｄｅｒｍｉｓ）の調製
本実施例においては、エピデルミンを生産しえないＳ．エピデルミス（ｅｐｉｄｅｒｍｉｓ）ＤＳＭ３０９５の変異体を単離した。
突然変異誘発は、染色体にコードされているリファンピシン耐性（μg/ml）
によって特徴付けられる株について行った。
寒天プレートで増殖したＳ．エピデルミス（ｅｐｉｄｅｒｍｉｓ）ＤＳＭ３０９５を３０mlの基礎栄養培地に接種し、これを一晩培養した。この一晩培養物０．５mlを生産培地５０mlに接種し、これを３７℃で３時間振盪培養した。
培養培地から細胞を取り出し、保温した４．５mlＴＭバッファ（３０mMトリス−マレイン酸 ｐＨ７．４（生成した溶液を溶液Ａとする））。
溶液Ａの突然変異体および細胞数（１．２５×１０10細胞／ml）をチェックした。
４mlの溶液Ａを１mlのエチルメチルスルホネート（最終濃度４７μg/ml）と完全に混合し、３７℃で１時間振盪した。
それから細胞を培養培地から抽出し、ＴＭバッファで２度洗浄した後、５mlのＴＭバッファに懸濁した（この変異細胞を含む溶液を溶液Ｂと命名した）。
溶液Ｂは２×１０8 細胞／mlの濃度であり、これは１．６％の生存率に当たる。
５０mlの溶液Ｂを５mlの生産培地に添加し、３７℃で一晩培養した（発現型の発現）。この溶液を溶液Ｃとする。細胞数は７．３×１０8 細胞／mlを示した。
この溶液をＢＭ寒天プレートにプレーティングし、各コロニーを釣り上げた。これらをテストプレート（表面にマイクロコッカス ルテウス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ ｌｕｔｅｕｓ）を撒いたＢＭ寒天を含む）に接種した。Ｍ．ルテウス（ｌｕｔｅｕｓ）への阻害効果を示さないコロニーをエピデルミンの非生産株として選択した。
ＢＭ寒天（１リットル当たり）
１０ｇm ペプトンＮｏ．１４０
５ｇm イースト イクストラクト
１mg グルコース
５mg ＮａＣｌ
１mg Ｋ2ＨＰＯ4
ｐＨ７．５
約３％の変異率が測定された。
見つかった４５個の非生産株を２０回サブクローニングし、１６個の安定な非生産株を得た。
全ての安定な非生産株は、野生型のプラスミドｐＥｐｉ３２を含んでいることが分かった。制限パターンから、これが野生型株中のプラスミドと同じものであることが同定された。
【００２７】
非生産型Ｓ．エピデルミス（ｅｐｉｄｅｒｍｉｓ）のトランスホーメーション
安定な非生産型株の一晩培養から得た５mlの培地を７５０mlのＢＭ培地に接種し、この培地を２リットルフラスコ中、振盪速度１２０rpm、３７℃で振盪培養した。
接種したＢＭ培地の当初の光学密度は、０．０３−０．０４であった。光学密度が０．４５−０．５５に達したとき、細胞をＧＳ−３ローターを用いた８５００rpm、４℃、１５分の遠心で回収した。単離した細胞を順次、７５０、３５０、４０および１０mlの１０％グリセリンで洗浄し、ついで２−３mlの１０％グリセリンに懸濁した後、ＥＲＧ中１１０ml分を−７０℃で凍結した。細胞数は、１−５×１０10／mlであった。
凍結した細胞を室温、５分間で融解し、その細胞懸濁液５０μlをＥＲＧ中プラスミドｐＣＵｇｄｍ１のＴＥバッファ溶液２μlと共に室温で３０分間インキュベートした。この混合物を電極間隙０．２cmのエレクトロポレーション・キュベットに導入し、直ちにエレクトロポレーションした。その後、この細胞を迅速に９５０μlのＳＭＭＰ５０培地に懸濁し、２．５mlのＥＲＧに移して、３７℃で９０分間振盪した。ＥＲＧは、培地によく空気が溶けるように４５°に傾けた。
ＳＭＭＰ５０培地には、ｐｒｏ １００ml、２ＳＭＭ ５５ml、４ＰＡＢ ４０mlおよび５％ＢＳＡ ５mlが含まれる。２ＳＭＭには、１mol サッカロース、０．０４mol マレイン酸、０．０４mol ＭｇＣｌ2およびｐＨ６．５とするためのＮａＯＨが含まれている。４ＰＡＢは、７g/１００mlのギブコ抗生物質培地３溶液である。
ガリデルミンを生産する増殖株のテストは、Ｍ．ルテウス（ｌｕｔｅｕｓ）テストプレートからのコロニーの選択、および各選択されたコロニーの培養およびＨＰＬＣによるガリデルミンの検定によって行った。
ガリデルミンを生産しうる３個のｐＣＵｇｄｍ１トランスホーム変異体が確認された。
【００２８】
ｐＣＵｇｄｍ１でトランスホームしたＳ．エピデルミス（ｅｐｉｄｅｒｍｉｓ）により生産されるガリデルミンの検定
a)バイオアッセイ
ＦＰ寒天をＭ．ルテウス（ｌｕｔｅｕｓ）ＡＴＣＣ９３４１で接種し、３７℃で１８時間インキュベートした。生成した培養物の半分をループで取り出し１００mlのＦＰ培地に懸濁し、３６℃で８時間培養した。その光学密度が１．０に到達したときに培養を終えた。この懸濁液の０．５％をＦＰ寒天に接種し、各１０mlをシャーレに注いで４℃で３週間保存した。
ゾナー（Ｚａｈｎｅｒ）およびマス（Ｍａａｓ）“抗生物質の生化学”スプリンガー・バーラグ、ベルリン １９７２に示されている方法でプレート拡散テストを行った。トランスホームしたＳ．エビデルミン（ｅｐｉｄｅｒｍｉｎ）の培養由来の培養濾液１０μlを濾紙にしみ込ませ、乾燥した。この濾紙をテストプレートの上に置き、３７℃で２４時間インキュベートした。
【００２９】
b)ＨＰＬＣ
選択したトランスホーム株を生産培地中で２６時間培養した。培養培地を１３，０００rpmで１０分間遠心した。
単離した培養液を、移動相としてA)７０％過塩素酸を０．５％含むＨ2ＯおよびB)アセトニトリルを用いたＳＰ８．７００液体クロマトグラフィー（スペクトラ・フィジックス、ダルムスタット、ドイツ）によるＨＰＬＣで分析した。カラム系には、粒子径７μm およびカラムサイズ１２５mm×４．６mmＩ．Ｄ．のヌクレオシル−１００ Ｃ−１８と２０mm×４．６mmＩ．Ｄ．のプレカラムを使用した。
勾配を以下に示す。
【００３０】
培養培地には以下に示すものを使用した。
１．ＦＰ寒天
肉抽出物 ４g
ペプトン １０g
ＮａＣｌ ３g
Ｎａ2ＨＰＯ4 ５g
グルコース １０g
複合寒天 １５g
水 １リットル
ｐＨ ７．２
２．ＦＰ培地
肉抽出物 ４g
ペプトン １０g
ＮａＣｌ ３g
Ｎａ2ＨＰＯ4 ５g
グルコース １０g
水 １リットル
ｐＨ ７．２
３．生産培地
肉抽出物 ３３g
モルト抽出物 ３０g
ＮａＣｌ ４０g
水酸化カルシウム ３．８g
水 １リットル
ｐＨ ６．５
【００３１】
実施例３
プラスミドの単離
Ｓ．エピデルミス（ｅｐｉｄｅｒｍｉｓ）Ｔｕ３２９８のプラスミドＤＮＡをノリック（Ｎｏｒｉｃｋ）等、Ａｎｎ．ＮＹ−Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１８２：２７９−２９４（１９７１）の修正法に従って単離した。Ｓ．エピデルミス（ｅｐｉｄｅｒｍｉｓ）をＢＭ培地（１％ペプトン１４０、ギブコ、ニュウ・アイゼンバーグ、Ｆ．Ｒ．Ｇ．、０．５％酵母抽出物、ディフコ、デトロイト、ＵＳＡ、０．１％グルコース、０．５％ＮａＣｌおよび０．１％Ｋ2ＨＰＯ4×２Ｈ2Ｏ）で静止期まで培養した。細胞を遠心し、０．５M ＥＤＴＡで２回洗浄した。このペレットを８０ml ＮａＣｌバッファ（５０mM トリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）、５０mM ＥＤＴＡ、２．５M ＮａＣｌ）に再懸濁し、１．５mlのリゾスタフィン溶液（０．５mg/ml、シグマ、ハイデルベルグ、Ｆ．Ｒ．Ｇ．）を添加して、３７℃で２０分間インキュベートした。細胞は、８０mlの溶解バッファ（５０mM トリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、３００mM ＥＤＴＡ、５００mM ブリッジ、４０mM デオキシコレート酸ナトリウム）を添加し、氷水中で１時間放置することで溶解した。この溶解物を遠心し（３０分間、１３，０００rpm、４℃）、その上清を４分の１倍容の５０％ＰＥＧ６０００溶液と混合した。プラスミドＤＮＡを４℃、一晩で沈殿させた。このＤＮＡ懸濁液を遠心後（２０分、１３，０００rpm、４℃）、８mlのＴＥバッファに溶解し、さらに、５０μlのプテアーゼ溶液（２０mg/ml）を添加した。３７℃、１５分間のインキュベーション後、ＤＮＡをエタノールで沈殿させ、さらにＣｓＣｌ遠心（１g ＣｓＣｌ／ml、４０，０００rpm、４０h 、２０℃）で精製した。
【００３２】
ＲＮＡの単離と電気泳動
Ｓ．エピデルミン（ｅｐｉｄｅｒｍｉｎ）をＳＭＳ最小培地（タザジ（Ｔｅｒｚａｇｈｉ）等、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２９：８０７−８１３（１９７５））で増殖し、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＲＮＡに関して示された方法（ウルマネン（Ｕｌｍａｎｅｎ）等、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６２：１７６−１８２（１９８５））と同様の修正法を用い、そこからＲＮＡを単離した。プロトプラスティング・バッファ中のリゾスタフィンと３７℃でインキュベーションする事で細胞を溶解した。全ＲＮＡをグリオキシル化し（マクマスター（ＭｃＭａｓｔｅｒ）等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７４：４８３５−４８３９（１９７７））、電気泳動バッファとして１０mM Ｎａ2ＰＯ4 （ｐＨ７）を用いた１．２％アガロースゲルで分離した。ＲＮＡをエチジウム・ブロマイドを用いて染色し、２０×ＳＳＣ（０．１５M ＮａＣｌ、０．０１５M クエン酸三ナトリウム、ｐＨ９）を用いたキャピラリー・トランスファーによりニトロセルロースメンブレン（シーダー・アンド・シュエル、ダセル、Ｆ．Ｒ．Ｇ．）にブロッティングした。２３ＳｒＲＮＡおよび１６ＳｒＲＮＡをサイズマーカーとして用いた。
【００３３】
インビトロ・トランスレーション
ｐＳＰＴ１８／１９ベクターシステム（ベーリンガー・マンハイム、Ｆ．Ｒ．Ｇ．）に各フラグメントをクローニングする事により、一本鎖のＲＮＡプローブを得た。このプラスミドをＥｃｏＲＩまたはＨｉｎｄIII で線状にし、線状ＤＮＡテンプレートを得た。転写のためのメルトン（Ｍｅｌｔｏｎ）等、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１２：７０３５−７０５６（１９８４）の方法は、業者の説明書に従って修正した。α32Ｐ−ＣＴＰ（８００Ci/mMol）の存在下でＴ７−ＲＮＡポリメラーゼまたはＳＰ６−ＲＮＡポリメラーゼを使用した。取り込まれなかったリボヌクレオチドは、セファデックスＧ５０クロマトグラフィーでラベル化したＲＮＡと分離した。
【００３４】
ノーザン・ハイブリダゼーション
電気泳動後、ＲＮＡをトーマス（Ｔｈｏｍａｓ）、Ｐ．Ｓ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７：５２０１−５２０５（１９８０）の方法に従ってフィルターにトランスファーした。８０℃、２時間のインキュベーションの後、そのフィルターを２０ トリス−ＨＣｌ（ｐＨ８）中、１００℃で手短にインキュベーションして、グリコシル化を外した。その後、このフィルターを、そのフィルターを５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（０．１５M ＮａＣｌ、０．０１５M クエン酸三ナトリウム、ｐＨ９）、５０ ＮａＰＯ4 、ｐＨ６．５、０．１％フィコール４００（ファルマシア、フレイバーグ、Ｆ．Ｒ．Ｇ．）、０．１％ポリビニルピロリドン、０．１％ウシ血清アルブミンおよび０．２５mg/ml 変性サケ***ＤＮＡ溶液中、４２℃で２時間かけてプレハイブリダイズした。このフィルターを１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ溶液中、４２℃で１５分間かけて洗浄した後、これを用いて−７０℃で４時間かけてコダック−Ｘ オマットフィルムを感光させた。さらに、このフィルターを０．５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ溶液を用い、７０℃で１５分間かけて２回洗浄した後、−７０℃で１６時間かけてオートラジオグラムを作製した。翌日、７０℃、３０−６０分間の０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ溶液による洗浄を続け、その後再び、−７０℃、３日間のコダック−Ｘ オマットフィルムへの感光を行った。
【００３５】
サザン・ハイブリダゼーション
サザン・ハイブリダイゼーション（サザン（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ）、Ｅ．Ｍ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．９８：５０３−５１７（１９７５））には、プローブとしての５’ラベル化オリゴヌクレオチドを２３℃で使用した。オリゴヌクレオチドは、ガンマ32Ｐ−ＡＴＰとＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（ベーリンガー・マンハイム、マンハイム、Ｆ．Ｒ．Ｇ．）を用いてラベルした。オリゴヌクレオチドおよびプライマーは３９１ＤＮＡ合成機を用いて合成し、さらに精製すること無く使用した。
【００３６】
ＤＮＡシーケンシング
ＤＮＡは、Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼ（ファルマシア、フレイバーグ、Ｆ．Ｒ．Ｇ．）を用いたチェーン・ターミネーション法（サンガー（Ｓａｎｇｅｒ）等、Ｐｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７４：５４６３−５４６７（１９７７））により、放射能的および非放射能的にシーケンシングした。放射能プラスミドシーケンシングは、適当なプライマーを用い、ハットリ（Ｈａｔｔｏｒｉ）等、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１５２：２３２−２３８（１９８４）の方法で行った。３．６kbのＢａｍＨＩ／ＰｓｔＩフラグメントは、アプライド３７３Ａ ＤＮＡシークエネーター（アプライド・バイオシステムズ、ウェイタートタット、Ｆ．Ｒ．Ｇ．）を用い、非放射能的にシーケンシングした。各フラグメントは、ファージミドｐＢＳＤ-/+にクローニングした。この構築物をＢａｍＨＩおよびＳａｃＩで消化し、線状にしたＤＮＡをエクソヌクレアーゼIII （ベーリンガー・マンハイム、マンハイム、Ｆ．Ｒ．Ｇ．）を用いて５’末端から両方向に消化していき、一組のネステド欠失物とした後、ムング・ビーン・ヌクレアーゼ（ベーリンガー・マンハイム、マンハイム、Ｆ．Ｒ．Ｇ．）で処理して平滑末端とした。電気泳動後（１％アガローズゲル）、適当なサイズのフラグメントをゲルから単離し、再ライゲーションしてから大腸菌ＸＬ−１ブルー株にトランスホーメーションした。ヘルパーファージＣＳＭ１３を用いて一本鎖ＤＮＡを単離し、Ｔａｑポリメラーゼ（プロメガ、フレイバーグ、Ｆ．Ｒ．Ｇ．）を用い、市販業者の説明書にしたがってシーケンシングした。
【００３７】
プラスミドの構築
スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）のテトラサイクリン耐性プラスミドｐＴ１８１のシーケンシングで（カーン（Ｋａｈｎ）等、Ｐｌａｓｍｉｄ １０：２５１−２５９（１９８３）、プラスミドの複製に必要ではないプレ・遺伝子内に単一のＮｄｅＩ部位があることが分かった（ゲナロ（Ｇｅｎｎａｒｏ）等、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６９：２６０１−２６１０（１９８７））。大腸菌ベクターｐＵＣ１９（ヤニッシュ・ペラン（Ｙａｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎ）等、Ｇｅｎｅ ３３：１０３−１１９（１９８５））の多重クローニング部位（ｍｃｓ）をこのＮｄｅＩ部位に挿入し、ｐＴ１８１ｍｃｓを構築した（第２４図）。
スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）−大腸菌シャトルベクター、ｐＣＵＩ（第２０図）をスタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）のクロラムフェニコール耐性プラスミドｐＣ１９４の誘導体であるｐＣＬＰ１００および大腸菌ベクターｐＵＣ１９から構築した。ｐＣＵＩは、両宿主内で約６kbまでの挿入物を安定に維持する。ｐＴ１８１ｍｃｓおよびｐＣＵＩは、スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）に適合しており、これらをｐＴｕ３２由来のＤＮＡフラグメントをサブクローニングするのに使用した。ｐＴｕ３２のＨｉｎｄIII フラグメントをｐＵＣ１９にクローニングし、これをサザン・ハイブリダイゼーションのプローブとして使用して、さらにＨｉｎｄIII フラグメント付近の制限部位を同定した（第１０図Ｃ）。
Ｓ．Ｓ．エピデルミス（ｅｐｉｄｅｒｍｉｓ）由来の５４ kbpエピソーマル要素ｐＴｕ32の１３．５ kbpＢｇｌIIフラグメントをｐＴ１８１ｍｃｓにサブクローニングしてｐＴｅｐｉ１４を構築した（第１０図Ａ）。ＤＮＡシーケンス用に大腸菌ベクターｐＵＣ１９（ヤニッシュ・ペラン（Ｙａｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎ）等、Ｇｅｎｅ ３３：１０３−１１９（１９８５））およびｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔIIR （ストラタジーン、ハイデルベルグ、Ｆ．Ｒ．Ｇ．）にサブクローンを作製した。ベクターｐＳＰＴ１８／１９（ベーリンガー・マンハイム、マンハイム、Ｆ．Ｒ．Ｇ．）にクローニングしたＤＮＡから一本鎖ＲＮＡプローブを得た。
【００３８】
遺伝子解析
エピデルミン構造遺伝子、ｅｐｉＡに隣接するＤＮＡ領域をシーケンシングする事で、ｐＴｕ３２の１３．５ kbpＢｇｌIIフラグメントの内部にさらに５個の完全なオープン・リーディング・フレーム、ｅｐｉＢ、Ｃ、Ｄ、ＰおよびＱが存在することが明らかになった。
第１１図乃至第１９図から分かるように、ｅｐｉＡオーカーコドンから僅か５０ヌクレオチド離れた、ＥｐｉＡをコードする配列の直ぐ隣に、Ｓ／Ｄ配列に続く２，９７０bpの大きなオープン・リーディング・フレームが存在する。また、スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）の翻訳開始コドンとして働きうるロイシンのＴＴＧコドンもＳ／Ｄ配列から適当な距離に存在する。このオープン・リーディング・フレームをｅｐｉＢと呼ぶが、これは、本明細書で示すようにエピデルミンの生合成変異体の相補性やエピデルミン生合成における基本的役割において利用することが出来る。
ＴＴＧ（Ｌｅｕ）から開始する、ｅｐｉＢによってコードされるタンパク質は、分子量約１１５DaおよびｐＨ７における正味の電荷−３を有し、またカイト（Ｋｙｔｅ）等、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５７：１０５−１３２（１９８２）に従う親水性プロットからも予想されるように、中程度の疎水性（４１％疎水性残基）である。
ｅｐｉＢの３’末端には、転写停止に特徴的なパリンドローム構造は見られない。しかし、第１１図乃至第１９図からも分かるように、１塩基シフトして別のリーディング・フレームｅｐｉＣと１２２bpの重複がある。
本出願者は、２つの独立したプラスミドの単離物由来の各４７ kbpのＨｉｎｄIII フラグメントを独立に２回、クローニングおよびシーケンシングする事により、この事がアーテファクトではないことを確認した。また、このことは、本明細書で示すｅｐｉＣ含有フラグメントを用いた変異体の相補性によっても確認された。
ｅｐｉＢおよびｅｐｉＣのリーディング・フレームの重複領域の内側で、ＡＧＧＡ要素の３’側僅か３６bpの所にある最初のＴＴＧコドン（Ｌｅｕ）が翻訳開始コドンの役割を果たしており、このことは、両リーディング・フレームが約４０コドン重複していることを示している。ＥｐｉＣタンパク質の実際のアミノ末端は、Ｎ末端シーケンシングで決定した。リーディング・フレームｅｐｉＣは、開始コドンＴＴＧ（Ｌｅｕ）で始まる４４５アミノ酸残基のタンパク質をコードしている。リーディング・フレームｅｐｉＤは、ｅｐｉＣの３’側に直接続き、Ｓ／Ｄ配列ＡＧＧＡＧＧの３’側８６bpの所に開始コドンＡＴＧを有している。ｅｐｉＤの３’側には、古典的なロー因子依存の転写ターミネーター構造がある。ｅｐｉＤは、開始コドンＡＴＧ（Ｍｅｔ）を含む１８１アミノ酸残基のタンパク質である。
タンパク質ｅｐｉＢ、Ｃ、Ｄ、ＰおよびＱのいずれも、スイス・プロットおよびジーン・バンクのタンパク質データベースに登録されているタンパク質配列との類似性を示さず、したがって、これらは未知のタイプの酵素または調節タンパク質である。
【００３９】
生合成遺伝子の転写
先に示したように、目的のフラグメントをｐＳＰＴ１８／１９ベクターシステム（ベーリンガー・マンハイム、マンハイム、Ｆ．Ｒ．Ｇ．）にクローニングすることにより一本鎖ＲＮＡプローブを得た。
第２０図に示すように、サイズのかなり異なる２つの転写物が得られた。ｅｐｉＡに特異的なハイブリダイゼーション・プローブが、約３００bpの小さな転写物を同定した。また、同様のサイズの転写物が、ランチビオチックであるニシン（バックマン（Ｂｕｃｈｍａｎｎ）等、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３：１６２６０−１６２６６（１９８８））およびズブチリン（バネリー（Ｂａｎｅｒｊｅｅ）等、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３：９５０８−９５１４（１９８８））についても発見された。さらに、約５kbの大きい転写物もｅｐｉＢに特異的なハイブリダゼーション・プローブを用いて同定された。ｅｐｉＢの前に大腸菌様のプロモーター配列が無く、一方、ｅｐｉＡの５’側に適当な配列が存在することから、ｅｐｉＡプロモーターはポリシストロンｍＲＮＡのプロモーターとして働くと見ることが出来る。
【００４０】
下流のオープン・リーディング・フレーム
オープン・リーディング・フレームｅｐｉＰおよびｅｐｉＱは、ｅｐｉＢ、ＣおよびＤとは反対のＤＮＡに存在し、ｅｐｉＱは、６bpのループを含む完全なヘアピンであるターミネーション構造をｅｐｉＤと共有している。
このループ構造の中で、ｅｐｉＤおよびｅｐｉＱ両リーディング・フレームのＴＡＡ終止コドンは、３個のヌクレオチドの内の２個を共有している。
ｅｐｉＰのリーディング・フレームは、Ｓ／Ｄ配列と適当な距離（６bp）にあるＡＴＧコドンで開始している。このＡＴＧコドンをｅｐｉＰの翻訳開始コドンとすると、このタンパク質は４６１アミノ酸残基からなる分子量５１．８kDのタンパク質である。ｅｐｉＰは、セリン・プロテアーゼに保存されているアミノ酸モチーフ（図２１）に類似する特徴を有しており、このことは、ｅｐｉＰが修正されたプレペプチドからの成熟型リンチビオチックの切断に関係していることを示している。
また、ｅｐｉＱのリーディング・フレームも、ＡＴＧコドンから開始しており、これは２０５アミノ酸残基をコードしている（第１１図乃至第１９図）。Ｓ／Ｄ配列は、ＡＴＧ翻訳開始コドンから６bp離れて存在し、また、その分子量２４３kDはＤＮＡ配列から誘導した。ｅｐｉＱタンパク質は、大腸菌のリン酸調節に関するポジティブ調節因子であるＰｈｏＢに類似する特徴を有し（第２２図参照）、その結果、ｅｐｉＱはランチビオチック合成における調節因子と考えられる。
ｅｐｉＰに先行して、Ｓ／Ｄ配列の１２bp手前に大腸菌様の−１０領域（５’−ＴＡＴＡＡＡ）があり、これはスタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）においてプロモーターの役割を果たしている。第１１図乃至第１９図に示すように、ｅｐｉＰの終止コドンとｅｐｉＱのＡＴＧ翻訳開始コドンの距離は、僅か１０ヌクレオチドであり、また、ｅｐｉＱのＳ／Ｄ配列はｅｐｉＰの終止コドンと重複している。
ｅｐｉＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄの５’側に逆方向のリーディング・フレームがあり、これは潜在的に最高１４８アミノ酸残基をコードしている。特徴的なＳ／Ｄ配列は存在するが、先に示したスタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）の開始コドン（ＡＴＧ、ＴＴＧ、ＧＴＧ）はいずれも存在しない。−１のフレームシフトを持つリーディング・フレームが続くが、これは第１１図乃至第１９図に示したＢｇｌII単離フラグメントを越えている。
これら２個のリーディング・フレームは、ガリデルミンの構造遺伝子に隣接すると同定された単一のオープン・リーディング・フレームｇｄｍＹと相同的である（シュネル（Ｓｃｈｎｅｌｌ），Ｎ．，Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｅ ｄｅｒ Ｐｅｐｔｉｄ−Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｋａ Ｅｐｉｄｅｒｍｉｎ ｕｎｄ Ｇａｌｌｉｄｅｒｍｉｎ；博士論文、チュービンゲン大学、Ｆ．Ｒ．Ｇ．（１９８９））。Ｓ．Ｓ．エピデルミス（ｅｐｉｄｅｒｍｉｓ）プラスミド上の相同的リーディング・フレームをｅｐｉＹ’およびｅｐｉＹ”と命名した。
【００４１】
実施例４
先に示したように調製したプラスミドｐＴｅｐｉ１４を標準的技術を用いてＳ．カルノサス（ｃａｒｎｏｓｕｓ）にトランスホームした。ついで、このトランスホーム株をＢＭ培地で増殖した（上述）。
生成したトランスホーマントは、エピデルミン感受性テスト株マイクロコッカス リテウス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ ｌｕｔｅｕｓ）ＡＴＣＣ９３４１を阻害することが分かった。この検定では、Ｍ．ルテウス（ｌｕｔｅｕｓ）の一晩培養物１ml（ＯＤ578 を１．０に調整）を５００mlの融解ＢＭ寒天培地に添加した。通常、この寒天培地１０mlをシャーレに入れた。Ｓ．Ｓ．エピデルミス（ｅｐｉｄｅｒｍｉｓ）の培養希釈物をこの寒天培地の表面に拡げた。エピデルミン・ポジティブ・コロニーは、コロニーの回りのＭ．ルテウス（ｌｕｔｅｕｓ）の増殖阻害帯で検出した。
細胞を３％肉抽出物、３．８％モルト抽出物、０．６％ＣａＣｌ2×２Ｈ2Ｏおよび４．６％ＮａＣｌ（ｐＨ６．５）溶液で培養した。使用したトランスホーマントに応じて、テトラサイクリンまたはクロラムフェニコールを添加した。１つのイクステンションを有する５００mlの三角フラスコ中、１００mlの培地で２４時間インキュベートした後、両培養物をサーバル遠心機を用いて１０，０００rpmで１０分間遠心した。
トランスホーマントの液体培養物の上清を吸着クロマトグラフィーで精製し（ＸＡＤ１１８０、不純物は、水／メタノール（１：１）で溶出し、エピデルミンは、メタノール／０．１Ｎ ＨＣｌ（９：１）で溶出した。エバポレーション後、溶出液を３Ｎ ＮａＯＨでｐＨ３．５に調整し、水を加えて１０mlとした。）、ＨＰＬＣクロマトグラフィーで検出した。この阻害活性は、成熟型エピデルミンと共に溶出した（６．７５／６．７６分、第２３図Ａ及びＢ参照）。トランスホームしていないＳ．カルノサス（ｃａｒｎｏｓｕｓ）の培養培地を同様に処理したが、この溶出領域にはピークを示さなかった（第２３図Ｃ）。これらの結果は、Ｓ．カルノサス（ｃａｒｎｏｓｕｓ）における異種エピデルミンの生合成を明確に示すものであり、かつ、ｐＴｅｐｉ１４がエピデルミンの生合成に必要な全ての情報を含んでいることを示している。
ｐＴｅｐｉ１４は１３．５ kbpのＢｇｌIIフラグメントを含んでおり、かつ、ｅｐｉＹ’が翻訳開始コドンを欠き、また、ｅｐｉＹ”がこのフラグメント上で不完全なことから、ｅｐｉＹ’およびｅｐｉＹ”のリーディング・フレームがこの系におけるエピデルミンの生産に必ずしも必要ではないことを示している。
【００４２】
実施例５
Ｓ．エピデルミン（ｅｐｉｄｅｒｍｉｎ）Ｔｕ３２９８の多くのｅｐｉ変異体をエチルメタンスルホネート（ＥＭＳ）突然変異誘発法で調製した。この操作は、ミラー（Ｍｉｌｌｅｒ）、Ｊ．Ｈ．，Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｉｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｇｅｎｅｔｉｃｓ，コールド・スプリング・ハーバー、Ｎ．Ｙ．（１９７２）の方法にしたがって行った。変異体は、エピデルミンの生産、または上述のＭ．ルテウス（ｌｕｔｅｕｓ）を用いたエピデルミン生産の欠如でスクリーニングした。ｅｐｉ変異体を数回移し替えて安定性をテストした。単離した４０個のｅｐｉ変異体の内、安定なのは僅か１０個であった。不安定な変異体は、数回の移し替えの後、再びエピデルミンを生産した。全ての安定なｅｐｉ変異体は、プラスミドｐＴｕ３２を含んでおり、このプラスミドは、制限エンドヌクケアーゼ分析で明らかなように欠失、または再配列を起こしていなかった。この１０個のｅｐｉ変異体を相補性の実験に使用した。
プラスミドｐＴｕ３２の種々の制限フラグメントをＳ．カルノサス（ｃａｒｎｏｓｕｓ）にクローン化し、異種のエピデルミンの生産を検定した。先に述べたこのフラグメントをプラスミドベクターＴ１８１ｍｃｓおよびｐＣＵ１、および第２６図Ｂに示したように、サブクローニングした種々のＯＲＦＣに挿入した。先ず、Ｓ．カルノサス（ｃａｒｎｏｓｕｓ）（プロトプラスト・トランスホーメーション（ゴズ（Ｇｏｔｚ）等、ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，Ｌｅｔｔ．４０：２８５−２８８（１９８７）による）または大腸菌（ＣａＣｌ2を使用、コーエン（Ｃｏｈｅｎ）等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
６９：２１１０−２１１４（１９７２））を用いてクローニングを行い、ついで、その組み換えプラスミドを単離し、エレクトロポレーションを用いて種々のＳ．Ｓ．エピデルミス（ｅｐｉｄｅｒｍｉｓ）に移した（オーグスチン（Ａｕｇｕｓｔｉｎ）等、ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．６６：２０３−２０８（１９９０））。分子クローニングに使用した酵素は、ベーリンガー・マンハイム（マンハイム、Ｆ．Ｒ．Ｇ．）、ＢＲＬ（エゲンスタイン、Ｆ．Ｒ．Ｇ．）またはファルマシア（スウェーデン）から入手した。Ｓ．エピデルミン（ｅｐｉｄｅｒｍｉｎ）株のトランスホーメーションは、環状（ｃｃｃ）プラスミドでのみ旨く行き、即ち、ライゲーション産物を用いた場合、時々しかトランスホーマントが得られないことから、この間接的トランスホーメーション法が必要となった。
相補性実験の結果を表１に示した。
【表１】
種々のｅｐｉ遺伝子（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、ＰおよびＱ）を含む一連のプラスミドを構築した（第２６図Ｂ）。２つのプラスミドｐＴｅｐｉ１４およびｐＴｅｐｉＡＢＣＤＱは、全てのｅｐｉ変異体を相補しえた。構築した他のプラスミドｐＣＵｅｐｉＡＢＣ、ｐＴｅｐｉＡＢ、ｐＣＵｅｐｉＣＤＱ、ｐＣＵｅｐｉＢ、ｐＣＵｅｐｉＡ1 、ｐＣＵｅｐｉＡ2 、ｐＣＵｅｐｉＤＱおよびｐＣＵｅｐｉＱは、指示された遺伝子を含んでいた。
種々のプラスミドは、以下のように分類される特定のクラスの変異体のみを相補しえた。
ＥＭＳ ５および６−ｅｐｉＡ変異体
ＥＭＳ １８、３３および４５−ｅｐｉＢ変異体
ＥＭＳ １２、１３、１９および３９−ｅｐｉＣ変異体
ＥＭＳ １１−ｅｐｉＤ変異体
以下に示す結果は、少なくともエピデルミンの生合成には４個のＯＲＦ、ｅｐｉＡ、Ｂ、ＣおよびＤが必要であることを示している。
【００４４】
プラスミドｐＣＵｅｐｉＡは、唯一の完全なＯＲＦとして構造遺伝子ｅｐｉＡ、および、さらにその上流に１４００bpおよび下流に６０２bpを有しており、この後者の配列はｅｐｉＢＮ末端の１９０個のアミノ酸をコードしている。ｐＣＵｅｐｉＡ1 を用いたトランスホーメーションでエピデルミン変異体ＥＭＳ５および６の相補性が示され、この事でこれらがｅｐｉＡの変異体であることが同定された。ｐＣＵｅｐｉＡ2 において両方向にクローニングされたより小さいｅｐｉＡ含有Ｓｃａ１フラグメントは、ｅｐｉ変異体によりｅｐｉＡプロモーターが切断されたためにｅｐｉ変異体を相補する事が出来なかった。
ｐＣＵｅｐｉＢは、完全なｅｐｉＢおよびｅｐｉＡの３’末端の７５bpを含む１００bpの上流領域を含むＢｓｔＮ１フラグメントを含んでいる。ｅｐｉＡプロモーターは含んでいない。ｐＣＵｅｐｉＢでのトランスホーメーションでは、いずれのＳ．エピデルミス（ｅｐｉｄｅｒｍｉｓ）変異体のエピデルミン生産も相補しえず、この事は、ｅｐｉＢが自分自身のプロモーターを欠いており、ｅｐｉＡのプロモーターから一緒に転写されているらしいことを示している。
この事は、ｅｐｉＡプロモーターと完全なｅｐｉＡおよびＢ遺伝子を含み、かつその使用がｅｐｉＡおよびｅｐｉＢ変異体の両方を相補するｐＴｅｐｉＡＢ（第２６図Ｂ、表１）で得られた結果と一致する。
プラスミドｐＣＵｅｐｉＣＤＱはｅｐｉＣおよびｅｐｉＤの両方を相補できるが、プラスミドｐＣＵｅｐｉＤＱはｅｐｉＤ変異体のみを相補しうる（表１）。この相補性は、クローン化したＤＮＡフラグメントの方向には依存しない。これらの結果は、ｅｐｉＣおよびｅｐｉＤの両方が自分のプロモーターを有していることを示している。
【００４５】
実施例６
ｅｐｉＡ変異ｐＴｕ３２誘導体をＥＭＳ５および６から単離し、各々のｅｐｉＡのＯＲＦをシーケンシングした。両プラスミドは、ｅｐｉＡ内に点突然変異を含んでいた。すなわち、プラスミドＥＭＳ５では、コドンＡＧＴ（Ｓｅｒ3 ）がＡＡＴ（Ａｓｎ3 ）に変化しており、プラスミドＥＭＳ６では、コドンＧＧＡ（Ｇｌｙ10）がＧＡＡ（Ｇｌｎ10）に変化していた。これらの変異は、未修正のエピデルミンにおいて重要な部位に位置していた。
【００４６】
実施例７
ｅｐｉＢ（ＢｓｔＮ１フラグメント中）をプラスミドｐＰＳ４上のプロモーターのコントロール下に置いた（第２７図）。生成したプラスミドｐＰＳ４ｅｐｉＢは、ｅｐｉＢ変異体ＥＭＳ１８、３３および４５を相補しえた。逆方向にｅｐｉＢを含むプラスミドは、これらの変異体を相補しえなかった。この事も、ｐＣＵｅｐｉＢがｅｐｉＡプロモーターを欠いている為にどのＥＭＳ変異体も相補しえないことを示している。
【００４７】
実施例８
先に示したように、ｐＴｅｐｉ４（第２６図Ａ）の存在によりＳ．カルノサス（ｃａｒｎｏｓｕｓ）中でエピデルミンの生合成が起こる。しかし、ｐＴｅｐｉＡＢＣＤＱで起こらない。Ｓ．カルノサス（ｃａｒｎｏｓｕｓ）中での異種エピデルミンの発現を誘導するのに必要な最小限のＤＮＡサイズが、末端に存在するＤＮＡによる相補によるＳ．カルノサス（ｐＴｅｐｉＡＢＣＤＱ）の相補により決定された（第２８図）。プラスミドｐＣＡ４４−９０、ｐＣＡ４４−９１およびｐＣＡ４４−９２によるＳ．カルノサス（ｃａｒｎｏｓｕｓ）（ｐＴｅｐｉＡＢＣＤＱ）のトランスホーメーションは、エピデルミンの生産を誘導するが、完全なｅｐｉＱおよびｅｐｉＰ ＯＲＦを含むｐＣＡ４４−９２は、エピデルミンの生産を相補しうる最小のＤＮＡフラグメントを含んでいる。これらの結果は、エピデルミン生合成遺伝子は、６個のＯＲＦ；ｅｐｉＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、ＱおよびＰを含む８kbのＤＮＡフラグメント内に集まっており、かつ、その他の遺伝子はエピデルミンの生合成に関与していないことを示している。
これらの実施例で使用したスタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）のプラスミドＤＮＡは、切断溶解法（マキノ（Ｍａｋｉｎｏ）等、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９０：３７−４４（１９８６））により調製した。細胞をリゾスタフィン（８μg/ml）の添加によって溶解し、そのＤＮＡをＣｓＣｌ遠心により単離した。大腸菌のプラスミドのスーパーコイルＤＮＡは、修正アルカリ溶解法（バーンボイム（Ｂｉｒｎｂｏｉｍ）等、Ｎｕｃｌ．Ａｃｅｄ．Ｒｅｓ．７：１５１３−１５１８（１９７９））で調製した。
ＰＣＲ増幅したｅｐｉＡ含有フラグメントおよびＳ．エピデルミス（ｅｐｉｄｅｒｍｉｓ）変異体ＥＭＳ５および６の２つの変異したｅｐｉＡ領域のＤＮＡ配列は、ダイデオキシ法、ファルマシアの“配列”リストおよびアマーシャムの（α−35Ｓ）−ｄＡＴＰを用いた二本鎖ＤＮＡシーケンシング（マクマスター（ＭｃＭａｓｔｅｒ）等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７４：４８３５−４８３９（１９７７））で決定した。ＤＮＡシーケンシングおよびＰＣＲ増幅に用いたプライマーは、アプライド・バイオシステムズのＤＮＡ合成機を用いて合成した。ｅｐｉＡのＰＣＲ増幅に用いた２つのプライマーの配列を以下に示す：
【表３】
a) 5'-GGGTTTTAGG(TA)ATCCTTTTTAATAAATTTTTAGGAG-3'
b) 5'-CCTCAAAATTAAGACG(A)GAT(G)CCTCTATTGAAGCCC-3'
【００４８】
プライマーa)は、ｅｐｉＡのＲＢＳの前に結合し、プライマーb)は、ｅｐｉＡの停止コドンの後に結合する。太字で示した塩基は（括弧内に示されている）、ｅｐｉＡの前後にＢａｍＨＩ部位を作るのに使用されることを示している。増幅したＤＮＡフラグメント内にはｅｐｉＡプロモーターは無い。
変異体ＥＭＳ５および６内の変異ｅｐｉＡのＤＮＡ配列を決定するために、プラスミドｐＴｕ３２を単離し、そのＤＮＡ領域を、推定されるｅｐｉＡプロモーター領域の上流（5'-GGTTTGGTTATTTTCC-3') および停止コドンの下流(5'-CCTCAAAATTAAGACAGAGCCTC-3') に結合する別のＤＮＡプライマー対を使用したＰＣＲで増幅した。ｅｐｉＡのＤＮＡ配列は、シュネル（Ｓｃｈｎｅｌｌ）等、Ｎａｔｕｒｅ（ロンドン）３３３：２７６−２７８（１９８８）にも示されている。
【００４９】
実施例９
プラスミドｐＴｅｐｉ１４からｅｐｉＤを単離し、これをＰＣＲで増幅して、“平滑末端”ライゲーションによりベクターｐＩＨ９０２（ニュー・イングランド・バイオラブ）のＳｔｕＩ制限部位にクローニングした。その結果、ｅｐｉＤがベクターｐＩＨ９０２の因子Ｘａ切断部位の隣に、介在塩基対無しに融合され、これを用いて大腸菌をトランスホーメーションした。
この大腸菌の培養により、大腸菌のマルトース結合タンパク質に融合したｅｐｉＤ酵素が発現された。この融合タンパク質をアミロース・カラム充填剤によるアフィニティー・クロマトグラフィーで精製した。
このｅｐｉＤ酵素は、因子Ｘａにより融合タンパク質から低収率で切断しうることが分かった。切断領域のアミノ酸配列の修正で切断速度を向上しうるであろう。
この融合タンパク質の融合部位からｅｐｉＤの３’末端までをＤＮＡレベルでシーケンシングした。このｅｐｉＤ配列は、Ｓ．エピデルミス（ｅｐｉｄｅｒｍｉｓ）の野生型配列に対応していた。プラスミドｐＣＡ４４は、スタフィロコッカス カルノサス（Staphylococcus carnosus)ＴＭ３００に入れて、the DSM Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 1b, D-3000 Braunschweig, ドイツに、寄託されている。寄託日は１９９１年１２月２３日、寄託番号は６８６３である。
またプラスミドｐＰＳ４もスタフィロコッカス カルノサスＴＭ３００に入れて同所に寄託されている。寄託日は１９９１年１２月２３日、寄託番号は６８６４である。
【００５０】
以上の説明から、当業者は、容易に本発明の基本的特徴を理解し、かつ、本発明の精神および範囲を逸脱すること無しに、本発明を種々に変化および修正して種々の用途および条件に適用しえるであろう。
【図面の簡単な説明】
【図１】 エピデルミンの構造遺伝子（ｅｐｉＡ）のヌクレオチド配列および誘導されるプレ・エピデルミンのアミノ酸配列を示している。サャイン・ダルガルノ配列はボックスで囲み、プロペプチドがプロセシングされる切断部位は矢印で示してある。インバーティド・リピートには下線を付し、潜在的停止コドンにはａｍ（アンバー）およびｏｃ（オーカー）と記した。
【図２】 ハイロン・プログラムを用いたプレ・エピデルミンに関する予測プロットを棒グラフで表したものである：(a) フレキシビリティー、(b) ハイドロパシー、(c) 親水性、(d) ターンの性質、(e) β−シートおよび(f) α−ヘリックス構造。
【図３】 プレ・エピデルミンのヘリックス・ホィール・プロットを表しており、そのＮ末端が適当な環境下で部分的に両親媒性のα−ヘリックス構造をとっていることを示している。
【図４】 エピデルミンに関して提唱されている成熟過程を示している。翻訳されたポリペプチド（プレ・エピデルミン）は、５２アミノ酸残基からなっている。構造予測は、Ｎ末端の部分的α−ヘリックスを示しており、そこから残基−３０乃至−１０が両親媒体性α−ヘリックス構造を形成している。指示されているＳｅｒおよびＴｈｒ残基から水の脱離が起こる(a) 。Ｔｈｒ+14 は例外として、水脱離に続いてスルフィド環の生成(b) およびＣ末端における脱炭酸(c) および二重結合形成(d) が起こり、プロ・エピデルミンが生産される。その後、このプロ・エピデルミンがタンパク質分解的切断によりプロセシングされ、エピデルミンが生成する。
【図５】 エピデルミンの構造を示している。環構造は、Ａ、Ｂ、Ｃ、ＤおよびＥと命名した。アミノ酸、メソランチオニンおよびトレオ・メチルランチオニンの構造も示した。
【図６】 ランチオン抗生物質中に存在し、かつ本発明の方法を用いたペプチド生産物中に生成しうる異常アミノ酸の例を示している。
【図７】 プラスミドｐＣＬＰ１００およびｐＵＣ１８からプラスミドｐＣＵＩを調製するための方法を図式で示したものである。
【図８】 実施例２で調製した培養培地単離物の溶出パターンを示している。
【図９】 ガリデルミンを含む標準物質の溶出パターンを示している。ガリデルミンは７．５４分に溶出する。
【図１０】 Ｓ．エピデルミス（ｅｐｉｄｅｒｍｉｓ）のプラスミドｐＴｕ３２のエピソームｐＴｕ３２の遺伝子解析を示しており、以下のものが含まれる：
Ａ：エピソームｐＴｕ３２の制限地図。
Ｂ：ｐＴｕ３２の１３．５kbのＢｇｌIIフラグメントの制限地図。黒矢印はｅｐｉＡの構造遺伝子に対応している。白矢印はシーディング・フレームｅｐｉＢ、Ｃ、Ｄ、ＰおよびＱを示している。
Ｃ：ｅｐｉＡに特異的な１５マー・オリゴヌクレオチド(5'cacatccaggagtac 3') を用いた、種々の制限酵素（ＥｃｏＲＩ、ＥｃｏＲＶ、ＢｇｌII、ＳｐｈＩ）で消化したｐＴｕ３２のサザン・ハイブダイゼーション。
【図１１】 リーディング・フレーム、ｅｐｉＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｐ、Ｑ、Ｙ’およびＹ”を含むｐＴｕ３２のＢｇｌII／ＨｐａIIフラグメントのヌクレオチド配列および誘導される各タンパク質のアミノ酸配列である。Ｓ／Ｄ配列およびターミネーション構造には上線を付した。ＩＲは、インバーティド・リピートを示している。ｅｐｉＹ、ｅｐｉＡ、ｅｐｉＢ、ｅｐｉＣ、ｅｐｉＤ、ｅｐｉＱ、およびｅｐｉＰのオープン・リーディング・フレームの開始は、太字で示してある。Ｎ末端アミノ酸残基（翻訳開始部位）は、ボックスで囲んである。図１１は、１〜８７００のヌクレオチド配列の１〜９００までを示す。
【図１２】 図１１に続くヌクレオチド配列９０１〜１９００を示す。
【図１３】 図１２に続くヌクレオチド配列１９０１〜２８００を示す。
【図１４】 図１３に続くヌクレオチド配列２８０１〜３８００を示す。
【図１５】 図１４に続くヌクレオチド配列３８０１〜４７００を示す。
【図１６】 図１５に続くヌクレオチド配列４７０１〜５７００を示す。
【図１７】 図１６に続くヌクレオチド配列５７０１〜６６００を示す。
【図１８】 図１７に続くヌクレオチド配列６６０１〜７６００を示す。
【図１９】 図１８に続くヌクレオチド配列７６０１〜８７００を示す。
【図２０】 Ｓ．エピデルミス（ｅｐｉｄｅｒｍｉｓ）におけるｅｐｉＡ（１０Ａ）およびｅｐｉＢ（１０Ｂ）の発現のノーザン・ブロット・ハイブリダイゼーションの結果を示しており、これは、１．２％アガロースゲルによる全ＲＮＡ（４０μg、レーン１、３および５、または２０μg、２、４および６）の分離およびアンチセンスＲＮＡプローブによるハイブリダゼーション（ＳＰ６転写物、ストリンジェンシーを上げながらフィルターを洗浄した。レーン１、２：１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、露光時間４時間；レーン３、４：０．５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、露光時間１６時間；レーン５、６：０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、露光時間３日）を行ったものである。サイズ標準物質として２３Ｓおよび１６Ｓ ＲＮＡを使用している。
【図２１】 ＥｐｉＰと種々のセリンプロテアーゼ（ＳＵＢＳＩ、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のズブチリシンＩ１６８前駆体（テルザジ（Ｔｅｒｚａｇｈｉ）等、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２９：８０７−８１３（１９７５）；枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）の主要細胞内セリンプロテアーゼ（マニアチス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）等、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｎｕａｌ，第２編、コールドスプリングハーバーラボラトリーズ（１９８０）；ＳＵＭＹＴＶ、サーモアクチモミセス バルガリス（Ｔｈｅｒｍｏａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ ｖｕｌｇａｒｉｓ）のサーミテース（ストール（Ｓｔａｈｌ）等、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５８：４１１−４１８（１９８４））の活性部位に関する配列のホモロジーを示している。保存性の高いスパラギン（ａｓｐ）、ヒスチジン（ｈｉｓ）およびセリン（ｓｅｒ）残基にはアステリスクを付した。同様のアミノ酸残基は点で示し、また同一のアミノ酸残基はコロンで示した。
【図２２】 ＥｐｉＱとＰｈｏＢ（マキノ（Ｍａｋｉｎｏ）等、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９０：３７−４４（１９８６））。同様のアミノ酸残基は点で示し、また同一のアミノ酸残基はコロンで示した。
【図２３】 Ｓ．カルノサス（ｃａｒｎｏｓｕｓ）で生産されたエピデルミンのＨＰＬＣの溶出プロフィールを示している。
Ａ：エピデルミン標準物質の溶出プロフィール（６．７５分、矢印で示した）。
Ｂ：Ｓ．エルノサス（ｃａｒｎｏｓｕｓ）ＴＭ３００ ｐＴｅｐｉ１４の培養濾液から単離したエピデルミン標準物質の溶出プロフィール（６．７５分、矢印で示した）。培養液をＸＡＤ１１８０に吸着し、メタノールで溶出後、最後にエバポレーションで濃縮した。
Ｃ：１９Ｂと同様に処理した非トランスホームＳ．エルノサス（ｃａｒｎｏｓｕｓ）ＴＭ３００の培養濾液溶出プロフィール。太線は、エピデルミンの溶出領域を示している。
【図２４】 ｐＴ１８１ｍｃｓの構築を示している。ｐＴ１８１のプレ内にある単一のＮｄｅＩ部位に、平滑末端ライゲーションによりｐＵＣ１９のＰｖｕII309 −ＰｖｕII631 フラグメント、ｌａｃＺの一部およびマルチクローニング部位（ｍｃｓ）を挿入した（ゲナロ（Ｇｅｎｎａｒｏ）等、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６９：２６０１−２６１０（１９８７）；カーン（Ｋａｈｎ）等、Ｐａｓｍｉｄ １０：２５１−２５９（１９８３））。ｌａｃＺは、プレに対して逆を向いている。黒棒はプレの切断を示しており、白棒はｐＵＣ１９フラグメントの挿入を示している。
【図２５】 ｐＣＵ１の構築を示している。ＰＣＬＰ１００は、単一のＰｓｔＩ部位を含むｐＣ１９４（ホリノウチ（Ｈｏｒｉｎｏｕｃｈｉ）等、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５０：８１５−８２５（１９８２））の誘導体であって、ＨｉｎｄIII 部位におけるｐＣ１９４の開環、Ｂａｌ３１による末端の削除（約９５０bp）および平滑末端ライゲーションによるＰｓｔＩリンカーの挿入により生成する。ｐＵＣ１は、各々単一のＰｓｔＩとＮｄｅＩ部位によるｐＣＰＬ１００とｐＵＣ１９との平滑末端ライゲーションで生成する（ビエイラ（Ｖｉｅｉｒａ）等、Ｇｅｎｅ １９：２５９−２６８（１９８２））。ｌａｃＺの前にあるマルチクローニング部位（ｍｃｓ）は、種々のｅｐｉ遺伝子含有フラグメントのクローニングに使用した。このシャトルベクターは、スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）および大腸菌の両方で複製する。
【図２６】 下記の事項を示している。
A)ｐＴ１８１ｍｃｓにおけるｐＴｕ３２の１４kbのＢｇｌIIフラグメントのクローニングによるｐＴｅｐｉ１４の生成。このフラグメントには、Ｓ．カルノサス（ｃａｒｎｏｓｕｓ）におけるエピデルミンの生産に必要な全遺伝子情報を含まれている。指示されているＯＲＦおよびその転写方向（矢印で示されている）は、このＤＮＡ配列に基づくものである。構造遺伝子ｅｐｉＡは、黒矢印で表されている。
B)ｐＴ１８１ｍｃｓ（ｐＴ．．．）またはｐＣＵ１（ｐＣＵ．．．）にサブクローニングされた種々のｐＴｅｐｉ１４フラグメント。各プラスミドは、Ｓ．エピデルミス（ｅｐｉｄｅｒｍｉｓ）Ｅｐｉ変異体の相補に使用した。プラスミド中に存在する完全なＯＲＦが示されている。
【図２７】 ｐＰＳｅｐｉＡおｐＰＳ４ｅｐｉＢの構築を示している。ｐＰＳ４は、ｐＬｉｐＰＳ１の誘導体である（リーブル（Ｌｉｅｂｌ）等、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２０４：１６６−１７３（１９８６））。強力なスタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）プロモーターの後ろに単一のＢａｍＨＩ部位が挿入された。通常、ＯＲＦ２プロモーターのコントロール下のＢａｍＨＩ部位に遺伝子をクローニングすると、スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）での発現が高くなる。ｅｐｉＡをＰＣＲ増幅してみると、ＢａｍＨＩ部位に隣接して含まれていた。ｅｐｉＢを含む３．２kbのＢｓｔＮＩフラグメントを平滑末端ライゲーションによりＢａｍＨＩ部位に挿入した。各ＥＭＳ変異体は、ｅｐｉＡおよびｅｐｉＢがＯＲＦ２プロモーターのコントロール下にあるときのみ相補された。ｌｉｐ，リパーゼ遺伝子；ｃａｔ、クロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼ遺伝子；ＯＲＦ２、Ｓ．カルノサス（ｃａｒｎｏｓｕｓ）特異的短縮型ＯＲＦ。
【図２８】 隣接するＤＮＡフラグメントによるＳ．カルノサス（ｃａｒｎｏｓｕｓ）（ｐＴｅｐｉＡＢＣＤＱ）におけるエピデルミン生産の相補性を示している。フラグメントは、適合するプラスミドｐＣＡ４４にサブクローニングした。
Claims (5)
- Epi A 、 Epi B 、 Epi C 、 Epi D 、 Epi P および Epi Q と命名するタンパク質を同一分子上にコードする組換え DNA 分子であって、
前記 Epi A と命名するタンパク質が下記のアミノ酸配列からなり：
MEAVKEKNDLFNLDVKVNAKESNDSGAE
PRIASKFICTPGCAKTGSFNSYCC、
前記 Epi B と命名するタンパク質が下記のアミノ酸配列からなり：
LDNIFVPSNIYMVRTPIFSIELYNQFLKSDNIDYDLILQNDIFKESIMTTTYNLYQSIGK
IDWEKDNKKTRNVKESLLKYLIRMSTRSTPYGMLSGVALGEFSENNNIKIKDSSFHKKDV
KIDGQWLYKLVHYLESDYTYYKDSFVIWNQQNYIYNNRLYLDNNSSITENKRNDVLSVKY
NSILVFIHENSKKNITYEELVQLISSKYSIENKEEVKVFVQELINKEIIFSDLRPTLENK
NPLDYIINSLNPKNSLVGTLINISNEITKYSKMPLGKGEYKYLDIVNLMSQLFVSKNYLQ
IDTYIDYSRNELKQSLADNISEAAYILWLLSPNHFGTKTIRNYHEFFMDKYGFEQLVNLK
QLLSDINGFGYPKKDSYSFSNNIAFLKEKYLLAIQNNSHIEITENDVKNLEKNNTVSKIN
APVSTEIYSEIYFGNSIKGYEDFAVISPILGSFNAGATFGRFTGNFNIKKKNQLQKEIVH
HYNNYMNENGLEISQLNEGPLNSRNVNLNNNRIYNTCLNLNLPKSDIDINDIFIGATFNK
LYLYSEKHDSRIVFVSNSMFNYEFGSELYKFLREISFEKTKFIQPITEEGIDSLPFCPRI
IYKNIILKPATWKINSEMFSETENWLNRFATIREKWHIPKDVIIAFGDNRLLLNLLNDKH
LIILKKELKKHGRIRILESFINESNNERMLEIVTPLYKKTSLKEQSFIIPKNRNKHFNNL
KDWFSIHLSIPKTYQDNFIQDYLLPFITELKVNNFINKFFYIKFKEDEDFIKLRLLREDE
DYSQIYSFIKNWKDYCLLNSELYDYSIVDYVPEVYRYGGPHVIEDIENFFMYDSLLSINI
IQSEFKIPKEFIVAISIDFLLDYLEINKSEKEEILINNAEDLYRSNDIREYKNLLAKLTN
PKNDYEILKKEFPNLHEFLFNKISILENLKKTLQKSLYTSRSRIIGSFIHMRCNRIFGIN
PEKEKFVLSIFNEITKTKKYWDGCD、
前記 Epi C と命名するタンパク質が下記のアミノ酸配列からなり：
LAVLYTCVVIEYSVLILKKKNLFYLFLMKLQKLKNIGMVVININNIKKILENKITFLSDI
EKATYIIENQSEYWDPYTLSHGYPGIILFLSASEKVFHKDLEKVIHQYIRKLGPYLESGI
DGFSLFSGLSGIGFALDIASDKQYSYQSILEQIDNLLVQYVFDFLNNDALEVTPTNYDII
QGFSGIGRYLLNRISYNYNAKKALKHILNYFKTIHYSKDNWLVSNEHQFLDIDKQNFPSG
NINLGLAHGILGPLSLTALSKMNGIEIEGHEEFLQDFTSFLLKPEFKNNNEWFDRYDILE
NYIPNYSVRNGWCYGDTGIMNTLLLSGKALNNEGLIKMSKNILINIIDKNNDDLISPTFC
HGLASHLTIIHQANKFFNLSQVSTYIDTIVRKIISHYSEESSFMFQDIEYSYGQKIYKNK
VGILEGELGVLLALLDYIDTQNQSRKNWKNMFLIT、
前記 Epi D と命名するタンパク質が下記のアミノ酸配列からなり：
MYGKLLICATASINVININHYIVELKQHFDEVNILFSPSSKNFINTDVLKLFCDNLYDEI
KDPLLNHINIVENHEYILVLPASANTINKIANGICDNLLTTVCLTGYQKLFIFPNMNIRM
WGNPFLQKNIDLLKNNDVKVYSPDMNKSFEISSGRYKNNITMPNIENVLNFVLNNEKRPL
D、
前記 Epi P と命名するタンパク質が下記のアミノ酸配列からなり：
MNKFKFFIVFLILSLVFLQNEYAFGSSLNEELSYYSVEYDNAKTFKESIKQKNIELTYKI
PELHTAQIKTSKSKLNSLIKSNKNVKFVNPTCSTCVVEKSVKTGKNLNNKKNGSHDLFDR
QWDMRKITNEGKSYKLSPDRKKAKVALVDSGVNSSHTDLKSINKIVNEVPKNGFRGSEND
ESGNKNFEEDKLNHGTLVAGQIGANGNLKGVNPGVEMNVYRVFGSKKSEMLWVSKGIIDA
ANDDNDVINVSLGNYLIKDNQNKKKLRDDEKVDYDALQKAINYAQKKGSIVVAAVGNDGI
NVKKVKEINKKRNLNSKTSKKVYDSPANLNNVMTVGSIDDNDYISEFSNYGNNFIDLMTI
GGSYKLLDKYGKDAWLEKGYMQKQSVLSTSSNGRYIYQSGTSLAAPKVSGALALEIDKYQ
LKDQPETAIELFKKKGIEKEKYMDKKHYGNGKLDVYKLLKE、
前記 Epi Q と命名するタンパク質が下記のアミノ酸配列からなる：
MISINIVGEVDSILIESILELDRRITINSSNIDPNFIIVYEKFDEYYTFLKEFIGKIPIV
IITGNTSYSRKCYFYSLGIDLYIIKNNESKSLILCRILNEIKKYIKYVNDDFIDFENHQF
VFNNYLVNLSNIELKILRCLYINLGRYVSKEELKKGVWDTEDFVDSNTINVYIHRLRDSL
KNCKEIEIINERKLGYKILIRKDLC、
前記 DNA 分子。 - 下記のヌクレオチド配列を含む、請求項１記載の組換え DNA 分子：
AGATCTTGTG TTATATAACT AAACAAATTT CTCCATTCGT ATTTAGAAAA TTGACTTTTA
TCAAGTTTAT CCAAATATAT ATTTCCAGTA TATTCTGTAT TTAACCCAGC TAATATATTT
AATAATGTAC TTTTTCCACA CCCACTTTCA CCTATAATAT TGTAGATATA ACCTTTATGA
AGATCCAAAC TTATAGAATT TATTATTTGT TTATTGTCTT TTGTGAAGTT CAAATCATTT
ATTTCCATTT TTTGAACAAA GTTATTGTAA GTTGTTTTAA TAGTTAATAC CTCTTCTGGT
TCTTTATTTA TTTTTAAAAT TCTATCTGAA GATCCAATTG CTCGTTGTAC TTCCGTCCAA
TAAGATGTAA TAGATACTAT TGGATTAATA ATTTGAAATA AATATAAAAC ATAAGCAAAC
ATATCTCCGC TTTTCATCAT ATTATTTTCC ATTAAGTAAT AACCCAAAAA TAAAATACCA
AAAATGTTAA TAAATAGAAT TAAGTTCATA ATTGGTTCGA AAAAAGATAA TACTTTGATC
TTATGTAACT CTATATCGAA TATATTTTTT AATAGGGTAT AGTTTTTTAT TTTTTCGATA
TTATATGTAC TTAAAGTTTT TATTAATTTT ATTGTAGATA ATCTATTACT ATAATAAGAA
GATAATTTAG CAGTAGCTTC TTGAGATTTA CTTGATACTC TTTTCATTAT ATTTCCTATA
GGTAGTATTA CAATTATCAA TATAGGTAAT GTACACACTA AATATAATGT CAAGGTTTTG
TTAATTATAT ATAAAAATAT TAGTGATACT ATAACTGAAA ATAAATTCTA CAGAAAAAAC
TCTAGTTATG TTCATAGTAT CGTTTACTAA CCTACTAGTT AAGTTACTTG CTGAGTTTTT
TAAGTGAAAA CTATAAGGTA ACTTTATCAC TTTATTCCAT GTAACACTTC TAATGTTTTG
TATTATTTTT TGACCTATAT ATCCAAGAAT ATAAGTAGAA ACACCAGAAA ATATTAAAGT
CAGACCAAAA CATATAATAA TGATTACAAT TTTATCTGTT GATAAGCTAG ATTTGTTTAA
GGCATTTCTA ATTATTAAAG GAATGTATAA TGAAAAACTA GTTCCAATCA AACTAAATAT
TAGTCCAATA CTTAAAAGTA GAGTGTTAGG TTTGGTTATT TTCCATAAAT CATATAGACC
TTTGATAATA TCATCACCTT TTAAACTTTA TATCATTAAT ATAATGTTTA GGAAAAGTAG
AAGAAAATTA CACTTTTGTA ATTTTCTGAA TATACATAGT ATTTATTTTG GGGGAGTACT
AAAATAATAA TTGAAAAGGG TTTTATAATC CTTTTTAATA AATTTTTAGG AGTGTTTAAA
ATGGAAGCAG TAAAAGAAAA AAATGATCTT TTTAATCTTG ATGTTAAAGT TAATGCAAAA
GAATCTAACG ATTCAGGAGC TGAACCAAGA ATTGCTAGTA AATTTATATG TACTCCTGGA
TGTGCAAAAA CAGGTAGTTT TAACAGTTAT TGTTGTTAAT TCAGAAGAAT TAGATTGGCA
GGGCTTCAAT AGAGGCTCTG TCTTAATTTT GAGGTGAAAT AGAATTGGAT AATATATTTG
TTCCATCGAA TATATATATG GTAAGAACTC CTATATTTTC AATTGAATTA TATAATCAAT
TCTTAAAATC TGACAATATA GATTATGACT TAATTTTACA AAACGATATT TTTAAAGAAT
CTATAATGAC AACGACATAT AATCTTTATC AAAGTATTGG CAAAATAGAC TGGGAAAAGG
ATAATAAAAA AACCAGAAAT GTAAAAGAAA GTTTATTAAA ATATCTCATA AGAATGAGTA
CTAGAAGTAC ACCATATGGA ATGCTAAGCG GTGTAGCTTT AGGGGAATTT AGTGAAAATA
ATAATATTAA AATTAAGGAC TCTTCGTTTC ATAAAAAAGA TGTAAAAATA GATGGGCAAT
GGTTATATAA ATTAGTCCAT TATTTAGAAA GCGATTACAC ATATTATAAA GACAGTTTTG
TCATATGGAA TCAACAAAAT TATATTTATA ACAATCGTTT ATATTTAGAT AATAATTCAT
CAATCACTGA AAATAAAAGA AATGATGTAT TATCTGTCAA ATACAATTCT ATATTAGTGT
TTATACATGA GAATTCTAAA AAAAATATTA CTTATGAAGA ACTTGTACAA TTGATATCTA
GTAAGTACAG TATAGAAAAT AAAGAAGAAG TAAAAGTATT TGTTCAAGAA CTCATAAATA
AAGAAATTAT ATTTTCTGAT TTGAGACCTA CATTAGAGAA TAAAAATCCT TTAGATTACA
TTATTAATAG TTTAAATCCA AAAAATAGTT TAGTTGGAAC ACTTATTAAT ATTTCTAATG
AAATTACAAA ATATTCTAAA ATGCCTTTAG GAAAAGGAGA ATATAAATAT TTAGATATTG
TTAATTTAAT GTCACAATTA TTTGTTTCTA AAAACTATTT GCAAATAGAT ACCTATATAG
ATTATTCAAG AAATGAATTA AAACAAAGTT TAGCTGATAA TATTAGTGAA GCAGCATATA
TTCTCTGGTT ATTATCTCCT AATCATTTTG GTACAAAAAC TATTAGGAAT TATCACGAAT
TTTTTATGGA TAAATATGGA TTTGAACAAC TAGTAAATTT AAAGCAATTG CTCTCAGATA
TAAATGGATT TGGCTATCCC AAAAAAGACA GTTATAGTTT TTCTAATAAC ATTGCATTTT
TAAAAGAAAA GTATTTGCTT GCAATTCAAA ATAACAGCCA TATTGAAATA ACAGAAAACG
ACGTTAAAAA TTTAGAAAAG AATAATACAG TTTCTAAAAT CAATGCGCCT GTTTCAACTG
AAATATATAG TGAGATATAT TTTGGAAATT CAATAAAAGG TTATGAGGAT TTTGCCGTGA
TAAGTCCAAT ATTAGGATCT TTTAATGCCG GTGCAACTTT TGGAAGGTTT ACGGGAAATT
TCAATATAAA GAAAAAAAAT CAATTACAAA AAGAAATAGT GCATCATTAC AATAATTACA
TGAATGAAAA TGGTTTAGAA ATAAGCCAAT TAAATGAAGG TCCTCTTAAC TCAAGAAATG
TAAATATTTT GAATAATAAT AGAATATATA ATACTTGTTT AAATTTAAAT TTACCTAAAA
GTGATATAGA TATAAATGAC ATATTTATTG GAGCTACATT TAACAAACTT TATCTATATT
CTGAAAAACA TGATTCAAGA ATTGTATTCG TATCTAATTC AATGTTTAAT TATGAGTTTG
GATCTGAATT ATACAAATTT TTAAGAGAAA TTTCATTTGA AAAAACAAAA TTTATACAAC
CTATAACTGA AGAAGGCATT GACTCATTAC CTTTTTGTCC AAGAATTATT TATAAAAATA
TTATTTTAAA ACCAGCTACT TGGAAAATAA ATTCAGAAAT GTTTTCTGAA ACTGAAAATT
GGTTAAATAG GTTCGCAACT ATTAGAGAAA AATGGCATAT TCCAAAAGAT GTAATTATTG
CTTTTGGAGA TAATCGATTG CTATTAAATT TATTAAATGA CAAGCATCTC ATTATACTAA
AAAAAGAACT AAAAAAACAT GGTAGGATTC GAATATTAGA AAGCTTTATC AATGAATCTA
ATAATGAGAG AATGTTAGAA ATTGTTACGC CATTATATAA AAAAACTAGT TTAAAAGAAC
AATCTTTCAT TATACCTAAA AATAGAAATA AGCACTTCAA TAATCTTAAA GATTGGTTTT
CAATTCATTT AAGTATTCCT AAAACATACC AAGATAATTT TATTCAAGAT TATCTATTAC
CATTTATAAC GGAATTAAAA GTTAATAATT TTATTAATAA ATTTTTTTAC ATAAAATTTA
AAGAAGATGA AGATTTTATA AAATTAAGAT TATTAAGAGA AGATGAAGAT TATTCTCAAA
TTTATTCTTT CATAAAAAAT TGGAAAGATT ATTGCTTATT AAATAGTGAA TTATATGACT
ATTCTATAGT TGATTATGTT CCTGAAGTAT ATAGATATGG TGGTCCACAC GTAATTGAAG
ATATTGAGAA TTTTTTTATG TATGATAGTC TATTATCAAT AAATATAATA CAATCAGAGT
TCAAAATTCC AAAAGAATTT ATCGTTGCTA TATCAATAGA TTTTTTATTA GATTATTTAG
AAATTAATAA AAGTGAGAAA GAAGAAATTT TAATTAATAA TGCGGAAGAT TTATATCGTA
GTAATGACAT AAGAGAATAT AAAAATTTAT TAGCTAAACT TACCAATCCT AAAAATGACT
ATGAAATTTT AAAAAAAGAA TTTCCGAATC TTCATGAATT TCTATTTAAT AAAATTAGTA
TTTTAGAAAA TCTTAAAAAG ACACTACAAA AAAGCTTATA TACTTCACGT TCTAGGATAA
TTGGCAGTTT TATACACATG CGTTGTAATA GAATATTCGG TATTAATCCT GAAAAAGAAA
AATTTGTTTT ATCTATTTTT AATGAAATTA CAAAAACTAA AAAATATTGG GATGGTTGTG
ATTAATATTA ATAACATTAA AAAAATTTTA GAAAATAAAA TCACCTTTTT GTCTGACATT
GAAAAAGCTA CATATATTAT AGAAAATCAA AGTGAGTATT GGGATCCTTA TACTCTATCT
CATGGTTATC CAGGTATAAT ACTTTTTTTA AGCGCATCAG AAAAAGTATT TCATAAAGAT
TTAGAAAAAG TAATACATCA ATATATTAGA AAACTAGGCC CTTATTTAGA AAGTGGTATT
GATGGATTTT CACTTTTTAG TGGTCTTTCC GGAATTGGAT TTGCGCTAGA CATTGCGTCT
GATAAACAGT ACTCTTATCA AAGTATCTTA GAACAAATTG ATAATTTACT TGTTCAATAT
GTTTTTGATT TTTTAAATAA CGATGCATTG GAAGTAACCC CTACTAACTA TGATATAATA
CAAGGATTTT CTGGTATAGG AAGGTACTTG TTAAATAGAA TATCGTATAA TTATAATGCA
AAAAAAGCAT TAAAGCATAT ACTTAATTAC TTCAAAACAA TTCATTACTC TAAAGACAAT
TGGTTAGTTT CAAATGAACA TCAATTTTTA GATATAGATA AGCAAAATTT TCCGTCAGGA
AATATAAATT TAGGATTAGC GCATGGTATT TTAGGTCCTC TATCATTAAC AGCTTTGAGT
AAAATGAATG GGATTGAAAT CGAAGGCCAT GAAGAGTTTT TACAAGACTT CACTTCATTT
TTGCTCAAAC CTGAATTCAA AAATAATAAT GAATGGTTCG ATCGCTATGA TATATTAGAA
AATTATATAC CTAATTATTC CGTCAGAAAC GGTTGGTGTT ACGGTGATAC AGGGATTATG
AATACATTAC TTTTGTCTGG TAAAGCCTTA AATAATGAAG GCTTAATTAA AATGTCTAAA
AATATTTTAA TTAACATAAT AGATAAGAAT AATGATGATT TAATCAGTCC AACCTTCTGT
CACGGACTAG CATCGCACTT AACCATTATT CATCAAGCGA ATAAATTCTT TAATCTATCT
CAAGTAAGCA CATATATCGA TACCATTGTC AGAAAAATTA TTAGTCATTA TTCTGAAGAA
AGTAGTTTTA TGTTCCAAGA CATAGAGTAC TCATACGGAC AAAAAATTTA TAAAAACAAA
GTGGGAATTC TAGAGGGTGA ATTAGGTGTT CTTTTAGCTT TACTAGATTA TATTGATACA
CAAAACCAAT CAAGGAAAAA TTGGAAAAAT ATGTTTTTAA TAACATAATA GGAGGAATAA
GATATGTATG GAAAATTATT GATATGCGCT ACAGCATCGA TAAATGTAAT TAATATTAAT
CACTACATAG TTGAGTTAAA GCAACATTTT GATGAAGTTA ATATATTATT TAGTCCTAGT
AGTAAAAATT TTATAAATAC TGATGTTCTC AAGTTATTTT GTGATAACTT GTACGATGAA
ATTAAAGATC CTCTTTTAAA TCATATCAAT ATTGTAGAAA ATCATGAATA TATTTTAGTA
TTACCTGCAT CAGCAAATAC TATTAATAAA ATAGCTAATG GTATATGTGA TAATCTTTTA
ACTACTGTAT GTTTAACCGG ATATCAAAAA TTATTTATAT TTCCAAATAT GAACATAAGA
ATGTGGGGAA ATCCATTTTT ACAAAAAAAT ATTGATTTAC TTAAAAATAA TGATGTGAAA
GTGTATTCCC CTGATATGAA TAAATCATTC GAAATATCTA GTGGCCGTTA CAAAAACAAT
ATCACAATGC CTAATATTGA AAATGTACTA AATTTTGTAT TAAATAACGA AAAAAGACCT
TTGGATTAAC AAAGGTCTTT TCTAATTAAA ATTTTATATC CGAGTTTACG TTCATTAATA
ATTTCTATCT CTTTACAATT TTTTAAACTA TCCCTTAATC GATGGATATA TACATTTATT
GTATTAGAAT CAACAAAGTC TTCTGTATCC CACACTCCCT TTTTTAATTC CTCTTTTGAT
ACATATCTTC CAAGATTAAT ATATAAGCAC CGTAGAATTT TTAATTCTAT ATTAGAAAGA
TTAACTAAGT AATTATTAAA CACAAATTGA TGGTTTTCAA AGTCTATAAA ATCATCATTA
ACATATTTAA TATACTTTTT TATTTCATTT AAAATTCTAC ATAATATTAA ACTTTTGCTT
TCATTATTTT TTATAATATA TAAATCTATG CCTAAACTAT AAAAATAACA CTTCCTACTA
TAGCTAGTAT TACCTGTTAT TATAACTATT GGAATTTTTC CTATAAATTC TTTTAAAAAC
GTATAATACT CATCAAACTT TTCATACACA ATTATAAAAT TTGGGTCTAT ATTTGAAGAA
TTAATTGTAA TTCTTCTATC TAATTCTAAA ATACTTTCAA TAAGAATAGA ATCTACCTCA
CCGACAATAT TAATAGAAAT CATTTTATTC CCTTCATTCT TTAAGTAATT TGTATACGTC
TAGTTTTCCA TTACCATAAT GTTTTTTATC CATATATTTT TCTTTTTCTA TCCCTTTTTT
CTTAAATAAC TCTATAGCTG TTTCGGGTTG GTCTTTTAAT TGATACTTAT CAATTTCTAG
TGCTAAAGCT CCAGAAACCT TGGGTGCAGC AAGTGATGTC CCTGATTGAT ATATGTATCT
TCCATTAGAA GAAGTACTTA AAACACTTTG TTTTTGCATA TATCCTTTTT CTAACCAAGC
ATCTTTTCCA TACTTATCTA AAAGTTTATA AGAACCTCCT ATCGTCATTA AATCTATAAA
ATTATTTCCA TAATTAGAAA ACTCAGAAAT ATAATCATTA TCATCGATGG ATCCTACAGT
CATAACATTA TTTAGATTTG CTGGGCTATC ATATACCTTT TTTGATGTTT TAGAATTTAG
ATTTCTTTTT TTATTTATTT CTTTTACTTT TTTTACATTG ATACCGTCAT TACCCACAGC
TGCAACAACA ATACTACCTT TTTTTTGAGC ATAGTTTATA GCTTTCTGTA GTGCATCGTA
ATCAACTTTT TCATCATCTC TTAATTTTTT TTTATTTTGA TTATCTTTAA TTAAATAATT
TCCTAAACTA ACGTTGATTA CATCATTGTC ATCATTTGCT GCATCAATAA TTCCTTTAGA
TACCCAAAGC ATTTCACTTT TCTTTGAGCC AAATACTCGG TATACATTCA TCTCTACTCC
AGGGTTTACA CCTTTTAAAT TACCGTTTGC TCCTATTTGT CCTGCTACTA ATGTACCATG
ATTCAATTTA TCTTCTTCAA AATTTTTATT TCCTGATTCA TCGTTTTCGC TACCTCTAAA
ACCATTTTTA GGCACTTCAT TAACTATCTT ATTTATACTC TTTAAATCTG TATGACTACT
ATTCACACCA GAATCTACTA AAGCAACTTT TGCTTTTTTT CTATCTGGAC TTAGCTTATA
ACTTTTACCT TCATTTGTTA TTTTTCGCAT ATCCCATTGT CTGTCAAATA AATCATGGCT
GCCATTTTTT TTATTATTTA AATTTTTTCC TGTCTTTACA GATTTTTCAA CTACACAAGT
GGAACAGGTA GGATTTACAA ACTTGACGTT TTTATTACTC TTTATTAGTG AATTTAATTT
TGATTTGCTA GTTTTAATTT GTGCTGTATG TAGTTCAGGA ATTTTATAAG TTAACTCGAT
ATTTTTTTGT TTAATGGATT CTTTAAAAGT TTTTGCATTA TCATATTCAA CACTATAATA
ACTTAATTCT TCATTTAGTG AACTTCCAAA AGCATACTCA TTTTGCAAAA AAACTAATGA
CAATATTAAA AAAACAATGA AAAATTTAAA TTTGTTCATA TAGCACCTCT AACATATTAT
TTATATTAAA CATTAATTTA ACACTTATGT TTTTACTTTT TTATTTATAT TATCTTTAAT
AATGTTCTGT TGCAAGATGA AAAATACGAG GTATCAAAGT ACCGATACAG CGAGTATTAC
ACTCAATTAA TTAAAAATAA AATATGTTGT GATTAAAATT TATTTTATAA AAGTATGGGC
AATTTATTAT TATTCAAGTT AAAACAAAGA GTCCGGGACA TAAAGTTTCA GCCTCTTCGT
CCTAATTACC AAAAAACTTA CTCCAAAATC CTTTTTTAGA TTGGTTTTTT CTAATTTTTT。 - 請求項１または２記載の組換え DNA 分子を含むプラスミド。
- 請求項３記載のプラスミドで形質転換された宿主細胞。
- S. カルノサスである、請求項４記載の宿主細胞。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US78423491A | 1991-10-31 | 1991-10-31 | |
| US07/784234 | 1991-10-31 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05292952A JPH05292952A (ja) | 1993-11-09 |
| JP4117033B2 true JP4117033B2 (ja) | 2008-07-09 |
Family
ID=25131778
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP31553392A Expired - Lifetime JP4117033B2 (ja) | 1991-10-31 | 1992-11-02 | 化学物質の生合成による製造方法 |
Country Status (18)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0543195B1 (ja) |
| JP (1) | JP4117033B2 (ja) |
| KR (1) | KR100242268B1 (ja) |
| AT (1) | ATE162852T1 (ja) |
| AU (1) | AU661054B2 (ja) |
| CA (1) | CA2081704C (ja) |
| CZ (2) | CZ286727B6 (ja) |
| DE (1) | DE69224269T2 (ja) |
| DK (1) | DK0543195T3 (ja) |
| ES (1) | ES2112289T3 (ja) |
| FI (1) | FI104498B (ja) |
| GR (1) | GR3026465T3 (ja) |
| HU (1) | HU215548B (ja) |
| IL (1) | IL103603A (ja) |
| MX (1) | MX9206265A (ja) |
| NO (1) | NO307474B1 (ja) |
| NZ (1) | NZ244976A (ja) |
| ZA (1) | ZA928397B (ja) |
Families Citing this family (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5639949A (en) * | 1990-08-20 | 1997-06-17 | Ciba-Geigy Corporation | Genes for the synthesis of antipathogenic substances |
| US5662898A (en) * | 1990-08-20 | 1997-09-02 | Ciba-Geigy Corporation | Genes for the synthesis of antipathogenic substances |
| US6117670A (en) * | 1994-06-08 | 2000-09-12 | Novartis Finance Corporation | Pyrrolnitrin biosynthesis genes and uses thereof |
| US6964760B2 (en) | 1997-06-10 | 2005-11-15 | University Of Florida Research Foundation | Antimicrobial polypeptide, nucleic acid, and methods of use |
| US5932469A (en) | 1997-06-10 | 1999-08-03 | University Of Florida | Antimicrobial polypeptide, nucleic acid, and methods of use |
| US6475771B1 (en) | 1997-06-10 | 2002-11-05 | University Of Florida Research Foundation | Antimicrobial polypeptides and methods of use |
| US6861236B2 (en) | 2002-05-24 | 2005-03-01 | Applied Nanosystems B.V. | Export and modification of (poly)peptides in the lantibiotic way |
| DE10261782A1 (de) * | 2002-12-19 | 2004-07-01 | Dr. Petry Genmedics Gmbh | Neue Gene und Genprodukte |
| DK1819816T3 (da) * | 2004-12-07 | 2009-01-26 | Applied Nanosystems Bv | Fremgangsmåder til fremstilling og udskillelse af modificerede peptider |
| CN117511763A (zh) * | 2022-08-05 | 2024-02-06 | 天康制药股份有限公司 | 一种表皮葡萄球菌高密度发酵培养基及其发酵方法和应用 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB8811761D0 (en) * | 1988-05-18 | 1988-06-22 | Thomae Gmbh Dr K | Biosynthetic process for preparation of chemical compounds |
-
1992
- 1992-10-29 KR KR1019920020041A patent/KR100242268B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1992-10-29 CA CA002081704A patent/CA2081704C/en not_active Expired - Lifetime
- 1992-10-29 FI FI924909A patent/FI104498B/fi not_active IP Right Cessation
- 1992-10-30 ZA ZA928397A patent/ZA928397B/xx unknown
- 1992-10-30 DE DE69224269T patent/DE69224269T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1992-10-30 AU AU27459/92A patent/AU661054B2/en not_active Expired
- 1992-10-30 DK DK92118598T patent/DK0543195T3/da active
- 1992-10-30 IL IL10360392A patent/IL103603A/en not_active IP Right Cessation
- 1992-10-30 EP EP92118598A patent/EP0543195B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1992-10-30 ES ES92118598T patent/ES2112289T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1992-10-30 HU HU9203434A patent/HU215548B/hu unknown
- 1992-10-30 MX MX9206265A patent/MX9206265A/es unknown
- 1992-10-30 CZ CS19923269A patent/CZ286727B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1992-10-30 NO NO924192A patent/NO307474B1/no not_active IP Right Cessation
- 1992-10-30 AT AT92118598T patent/ATE162852T1/de active
- 1992-10-30 CZ CZ963593A patent/CZ284861B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1992-11-02 JP JP31553392A patent/JP4117033B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1992-11-02 NZ NZ244976A patent/NZ244976A/en not_active IP Right Cessation
-
1998
- 1998-03-27 GR GR980400649T patent/GR3026465T3/el unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| ATE162852T1 (de) | 1998-02-15 |
| CZ359396A3 (cs) | 1999-03-17 |
| DE69224269D1 (de) | 1998-03-05 |
| AU2745992A (en) | 1993-05-27 |
| HU9203434D0 (en) | 1993-01-28 |
| HUT65492A (en) | 1994-06-28 |
| EP0543195B1 (en) | 1998-01-28 |
| FI104498B (fi) | 2000-02-15 |
| NO924192D0 (no) | 1992-10-30 |
| FI924909A0 (fi) | 1992-10-29 |
| DK0543195T3 (da) | 1998-09-23 |
| NO307474B1 (no) | 2000-04-10 |
| CZ326992A3 (en) | 1993-09-15 |
| MX9206265A (es) | 1994-05-31 |
| FI924909A (fi) | 1993-05-01 |
| CA2081704C (en) | 2007-05-01 |
| KR100242268B1 (ko) | 2000-02-01 |
| AU661054B2 (en) | 1995-07-13 |
| CZ286727B6 (cs) | 2000-06-14 |
| KR930008147A (ko) | 1993-05-21 |
| ES2112289T3 (es) | 1998-04-01 |
| CZ284861B6 (cs) | 1999-03-17 |
| IL103603A (en) | 1999-12-31 |
| NO924192L (no) | 1993-05-03 |
| ZA928397B (en) | 1994-05-02 |
| HU215548B (hu) | 1999-01-28 |
| GR3026465T3 (en) | 1998-06-30 |
| DE69224269T2 (de) | 1998-06-04 |
| JPH05292952A (ja) | 1993-11-09 |
| EP0543195A2 (en) | 1993-05-26 |
| EP0543195A3 (en) | 1994-06-08 |
| IL103603A0 (en) | 1993-03-15 |
| CA2081704A1 (en) | 1993-05-01 |
| NZ244976A (en) | 1995-07-26 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US5028530A (en) | AraB promoters and method of producing polypeptides, including cecropins, by microbiological techniques | |
| Lawlor et al. | Pleiotropic morphological and antibiotic deficiencies result from mutations in a gene encoding a tRNA-like product in Streptomyces coelicolor A3 (2). | |
| US4897348A (en) | Recombinant materials and methods for producing human connective tissue-activating peptide-III and analogs thereof | |
| US5206154A (en) | Method of producing cecropins by microbiological techniques | |
| GEIßLER et al. | Serine protease EpiP from Staphylococcus epidermidis catalyzes the processing of the epidermin precursor peptide | |
| CA2185343A1 (en) | Enhanced secretion of polypeptides | |
| US5591640A (en) | Functional DNA block and plasmid coding for hirudin, transformed yeast, method for preparing hirudin, hirudin obtained and its pharmaceutical use | |
| EP0460709B1 (en) | AraB promoters and method of producing polypeptides, including cecropins, by microbiological techniques | |
| JP4117033B2 (ja) | 化学物質の生合成による製造方法 | |
| JPS62500074A (ja) | バチルス スリンギエンシス 結晶タンパク質遺伝子毒素セグメント | |
| CA2983894A1 (en) | Uncoupling growth and protein production | |
| US5837485A (en) | DNA encoding and biosynthetic process for the preparation of chemical compounds, lantibiotics | |
| EP0342658B1 (en) | Biosynthetic process for the preparation of chemical compounds | |
| CA1275953C (en) | Recombinant materials and methods for producing human connective tissue-activating peptide-iii and analogs thereof | |
| KR102633804B1 (ko) | 재조합 바실러스 속 미생물 및 이를 이용한 모유올리고당 제조방법 | |
| US5962253A (en) | Oxidative decarboxylation of peptides catalyzed by flavoprotein EpiD | |
| EP0241546A1 (en) | Method for producing heterologous proteins | |
| JPS63102684A (ja) | 遺伝子およびその利用方法 | |
| JPH0213382A (ja) | グラムネガテイブ微生物での構造遺伝子の調節発現法 | |
| MXPA96004047A (en) | Increased secretion of polipepti |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20070528 |
|
| A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20070531 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20080229 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20080421 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20110425 Year of fee payment: 3 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20110425 Year of fee payment: 3 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20120425 Year of fee payment: 4 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20130425 Year of fee payment: 5 |
|
| EXPY | Cancellation because of completion of term | ||
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20130425 Year of fee payment: 5 |