JP4117033B2 - 化学物質の生合成による製造方法 - Google Patents
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Description
【産業上の利用分野】
本発明は、化学物質の生合成、より具体的にはデヒドロアミノ酸残基、および/またはチオエーテル結合を含む化学物質の生合成に関する。また、本発明は、該化学物質の生合成に関する酵素を生産するための組み換え遺伝学の利用に関する。
【0002】
【従来技術】
ニシン、ズブチリン、ズラマイシン、シナマイシン、アンコベニン、Ro09−0198およびエピデルミン等のポリペプチド抗生物質は、デヒドロアミノ酸およびランチオニン結合を含んでいる。これらのポリペプチドは、種々の各微生物株から生産される。例えば、ニシンはストレプトコッカス ラクチン(Streptococcus lactin)、ズブチリンは枯草菌(Bacillus subtilis)を培養することにより生産しうる。
【0003】
【発明が解決しようとする課題】
今日まで、これらの抗生物質の生合成に関する遺伝学的基礎は明らかになっていない。すなわち、例えばこれらの抗生物質の生合成、特にこれらの中に見られる異常アミノ酸の生成がリボゾーム合成によるものか、多酵素複合体(complex) によるものかは分かっていない。
さらに、これらの抗生物質の前駆体タンパク質が明確な構造遺伝子にコードされているのか、または、より大きいタンパク質の分解産物なのかが分かっていない。
【0004】
【発明が解決するための手段】
エピデルミンの構造遺伝子を特定する研究の過程で、意外なことに上述の各抗生物質、特にエピデルミンが明確な構造遺伝子によってコードされており、かつ、プレ配列ポリペプチドのプロセシングがデヒドロアミノ酸残基、および/またはチオエーテル結合の生成に関する酵素複合体によって起こることが明らかになった。
さらに、この多酵素複合体は、プレポリペプチドのプロセシングと同時に該タンパク質を細胞膜を通して培養上清に分泌する事にも関与している。この点に関して、これらの活性は、例えば、以下に説明するプレ・エピデルミンの−30乃至−1の配列の場合のようにプレ・ポリペプチドが有するプレ・配列に関係している。
概して言うと、本発明の一つの特徴は、通常、宿主によって生産されないポリペプチドをコードするプラスミドを含む細菌宿主であって、培養に際して少なくとも1つのデヒドロアミノ酸、および/または、少なくとも1つのランチオニン結合を含むポリペプチドであって、該宿主にとって外来のポリペプチドを生産する多酵素複合体を提供する宿主を提供することにある。
適当な多酵素複合体とは、以下に示す機能、即ち、水脱離およびスルフィド結合形成の少なくとも1つを果たしうるものである。また、この多酵素複合体は、脱炭酸および二重結合形成も行いうる。
【0005】
本発明の方法を実施するのに適した宿主は、その遺伝物質を修正すること無しにデヒドロアミノ酸残基および/またはランチオニン結合および/またはメチルランチオニン結合を含むポリペプチドを生産しうるものである。このような宿主の例には、ストレプトコッカス ラクチス(Streptococcus lactis)、枯草菌(Bacillus subtilis)、ストレプトミセス シナモニウス(Streptomyces cinnamoneus)、ストレプトミセス sp.ストレプトベルチカラム グリセオベルチシカム(Streptomyces sp.Streptoverticullum griseoverticillum)、スセフィロコッカス エピデルミス(Staphylococcus epidermis)、スタフィロコッカス エピデルミン 5株(Staphylococcus epidermin strain5)、スタフィロコッカス ガリナラム(Staphylococcusgallinarum)およびこれらの変異株、例えばエピデルミンを生産しえないS.エピデルミン(S.epidermin)DSM3095の変異株がある。
特に興味深い株は、1988年5月18日、ブダペスト協定に基づきドーシェ・サムラング・ホン・マイクロオーガニズメン(Deutsche Sammlung von Microorganismen)に、寄託番号DSM4616−Tu3928として寄託されているスタフィロコッカス ガリナラム(Staphylococcus gallinarum)(F16/P57)Tu3928、および1984年10月26日、ブダペスト協定に基づきドーシェ・サムラング・ホン・マイクロオーガニズメン(Deutsche Sammlung von Microorganismen)に本出願者により寄託されたスタフィロコッカス エピデルミス(Staphylococcus epidermis)DSM3095である。
【0006】
適当な宿主をトランスホームするために、適当なプラスミドを従来の遺伝子工学技術を用いて修正しうる。
プレポリペプチドをコードする遺伝子の修正または置換により、少なくとも1つのデヒドロアミノ酸残基および/または少なくとも1つのスルフィド結合を含むポリペプチドを生産する宿主由来のプラスミドを処理して該宿主にとって外来のポリペプチドをコードするプラスミドを提供し、この修正したプラスミドで該宿主をトランスホームすることが望ましい。
プレ・ポリペプチドをコードする遺伝子を置換または修正するには、様々な方法が使用される。
望ましい化合物のプレ・ポリペプチド配列をコードするDNAは、化学合成で調製しうる。適当な化学合成法は、Anal.Biochem.121,365(1982)に報告されている。従来技術で、例えば60−100塩基のポリヌクレオチドの合成が可能である。
適当な保護ヌクレオチドは、ホスホトリエステル法(アガーワル(Agarwal)等、Agnew,Chem.84,489(1972))、ホスホトリエステル法(リーセム(Reesem).、Tetrahedron 39,3,(1983))またはホスファイトトリエステル法(レジンガー(Letsinger)等、J.Am.Chem.Soc.98,3655(1976))またはホスホアミダイト法で連結しうる。固相法がポリヌクレオチド合成を簡便にしている。
二本鎖DNAは、化学合成した短いが重複したセグメントから酵素的に構築しうる。
例えば、両DNA鎖の重複ポリヌクレオチド配列を塩基対合で正しい配置を取らせ、DNAリガーゼにより化学的に結合させることが出来る(コラーナ(Khorana)等、J.Biol.Chem.251,565(1976))。
【0007】
別の可能性として、短い重複セグメントを有する2つのDNA鎖の各ポリヌクレオチド配列を必要とされるデオキシヌクレオシド三リン酸の存在下、DNAポリメラーゼ、例えば、DNAポリメラーゼI、ポリメラーゼIのクレノーフラグメントまたはT4DNAポリメラーゼ、または逆転写酵素とインキュベーションする事が挙げられる。即ち、2つのポリヌクレオチド配列が塩基対合で正しい配置を取り、酵素により必要とされるヌクレオチドが補填されることによって完全な二本鎖DNAが提供される(ナラニー(Narany)等、Anal.Biochem.121,365(1982))。
ポリペプチドをコードするDNAを得る別の適当な方法には、細胞を、例えばSDSまたはプロテナーゼK、または望ましい場合は機械的に分解し、そのDNAを繰り返しフェノールで抽出することにより除タンパクを行うことにより、組織または細胞培養物または微生物のゲノムDNAからDNAを単離する方法がある。
RNAはRNAaseで消化しうる。得られた粗DNAは、適当な制限酵素、例えばHaeIII およびAluIで消化し、フラグメントを単離し、適当なファージまたはコスミド、例えばシャロン4AまたはEMBL−3ファージ中で増幅した後、例えば、放射能ラベルしたDNAプローブを用いて望ましい配列を検定する。
また、望ましいポリペプチドをコードするDNAは、単離したmRNAをcDNAに逆転写することにより得ることが出来る。この方法は、DNAの構造が分からない場合に有効である。この方法では、mRNA由来のcDNAライブラリー中のゲノムDNAからDNAを得る。cDNAライブラリーには、細胞から単離したmRNAに相補的な遺伝情報が含まれている。
cDNAを得るために、mRNAを望ましい基本(出来るだけ未修正の)タンパク質を発現する細胞から単離する。このmRNAを二本鎖cDNAに変換する。
【0008】
mRNAの調製には、従来法を使用する。細胞膜を破壊し、放出される細胞内容物からmRNAを単離する。細胞膜は、物理的方法で破壊するか、またはSDS等の界面活性剤、クアニジンチオシアネート、限定塩条件またはホモゲナイゼーション、望ましくはミキシングにより分解する事が望ましい。mRNAは、フェノール抽出、エタノール沈殿、遠心およびクロマトグラフィーを含む標準的方法、望ましくは幾つかの方法を組み合わせて単離される。遠心は、勾配、例えばCsCl勾配をかけて行うことが望ましい。クロマトグラフィーに関しては、カラム、特にオリゴ−dTカラムを使用することが望ましい。
全mRNAは、従来法に従い直接Ds−cDNAに変換しうる。さらに、望ましいポリペプチドをコードするmRNAは、電気泳動、クロマトグラフィーおよび遠心、望ましくはスクロース勾配遠心等の幾つかの技術を用いて濃縮することが望ましい。
望ましいポリペプチドをコードするmRNAを含むフラクションは、インビボまたはインビトロ・トランスレーションと関連活性の検定、またはヌクレオチド配列が既知の場合は、オリゴヌクレオチドプローブとのハイブリダゼーション等の種々の方法で検出しうる。
インビボ・トランスレーション・システムは、原核性または真核性システムで行いうる。望ましいインビボ・トランスレーション・システムは、ゼノパス レビス(Xenopus laevis)卵細胞系(マニアチス(Maniatis)等、Molecular Cloning,A Laboratory Mannual,コールドスプリングハーバーラボラトリーズ、コールドスプリングハーバー、NY(1982))がある。インビトロ・システムには、例えば小麦胚芽およびウサギ網状赤血球溶解物があり、いずれも市販されている。
【0009】
未分画または分画したmRNA由来のmRNAプールから従来法にしたがってds−cDNAを得ることが出来る(望ましい一般的方法は、マニアチス(Maniatis)等(上述)、オカヤム(Okayam)およびバーグ(Berg)、Molecular and Cell Biology 2,161−170(1982)およびハイデッカー(Heidecker),NucleicAcid Research 11,4891−4906(1983))。一般に、先ず、mRNAを逆転写酵素またはDNAポリメラーゼ(クレノーフラグメント)を用いてss−DNAに変換する。ds−DNAの合成を開始させるには2つの方法のいずれかが使用される。第1の方法は、ss−DNAのナチュラル・ループ形成である。第2の方法は、ポリ−dCまたはポリ−dT等のホモポリマー・テールをss−cDNAに付加する方法である。
対応するポリペプチドが検出システムで高い活性を示すmRNAフラクションを従来法に従い相補的cDNAに転写する。mRNAおよびプライマーのオリゴ−dTを混合し、開始物質としてdNTPを添加すると逆転写酵素によりcDNA−mRNAハイブリッド分子の合成が行われる。RNA分子はNaOHの添加により分解する。DNAポリメラーゼ、望ましくはDNAポリメラーゼIのクレノーフラグメントを混合し、その混合物を適当な温度、望ましくは12−15℃でインキュベートする。この混合物をヌクレアーゼS1とインキュベーションすることにより、目的のポリペプチドをコードするmRNAに対応するds−cDNAが得られる。
得られたds−cDNAを増幅するためには、これを適当なベクター、例えばプラスミドpUC−KOにスプライスし、得られたハイブリッドベクターを適当な宿主、例えば大腸菌HB101を用いて増やすことが出来る。このハイブリッドベクターを再び単離し、そこから単離したcDNAを回収することにより、目的のポリペプチドをコードするDNAの構造を決定することが出来る。
【0010】
ハイブリッドベクターの調製
本発明のハイブリッドベクターは、目的の配列を有するポリペプチドをコードするDNAを適当なベクターにスプライスする事により調製しうる。
適当なベクターとは組み込んだパッセンジャーDNAのキャリヤーであって、宿主微生物のトランスホームに使用しうるものである。
ベクターとして適当なものは、非トランスホーム状態でデヒドロアミノ酸および/またはスルフィド結合を含むポリペプチドを生産する微生物に由来するプラスミドである。適当なベクターは、決まった位置に挿入DNAを有している。
一般に、これらのベクターは、宿主細胞または使用される宿主細胞に適合する細胞種に由来するレプリコンおよびコントロール配列、即ちプロモーターを含んでいる。通常、このベクターはレプリコン部位を有し、かつトランスホーム細胞に発現型選択を可能にする配列(マーカー遺伝子)を含んでいる。適当なマーカー遺伝子は、抗生物質耐性または重金属耐性を提供するか、または宿主の遺伝的欠陥を補う。さらに、これらのベクターに有用な配列には、エンハンサーおよびアクチベーター配列がある。
適当な開始ベクターには、スタフィロコッカス エピデルミス(Staphylococcus epidermis)DSM3095株由来の54 kbpのプラスミドpEpi32があり、これはプラスミドpTu32と同じである。以下に特徴を示すこのプラスミドは、テトラサイクリック21−ペプチド・アミド抗生物質にプロセシングされる52−プレペプチドをコードするepiA遺伝子を含んでいる。パッセンジャーDNAを含むベクターをハイブリッドベクターと呼ぶ。
【0011】
目的のDNAは、従来法に従い開始ベクターにスプライスする。
例えば、先ず開始プラスミドを適当な制限酵素、例えばプラスミドpEpi32の場合はHindIII 、BamHIおよびEcoRIで線状化し、dGTPおよびターミナル・デオキシヌクレオチジル・トランスフェラーゼの存在下でdGテール化する。二本鎖cDNA挿入物は、dCTPおよびターミナル・デオキシヌクレオチジル・トランスフェラーゼの存在下でdCテール化する。cDNAおよびベクターを合わせることによりハイブリッドベクターが出来る。ゲノムライブラリーを構築するには、ラムダ等のバクテリオファージが望ましい。ラムダ・クローニング・システムについては、マニアチス(Maniatis)等(上述)により報告されている。適当なベクターDNAを適当な制限酵素で完全に消化し、速度勾配遠心またはゲル電気泳動により左右のアームと中央フラグメントを分離する。別の方法では、左右のアームに認識部位を欠くスタッファーフラグメントの一部を制限酵素で消化する。単離したゲノムDNAを長さ13−20 kbpのフラグメントに部分分解する。その後、アームをアームの末端と適合する末端を有する外来DNAのフラグメントとライゲーションする。
最初のクローニングに使用したベクターから適当なDNA挿入物を適当な発現ベクターに再クローニングする。最後に、適当な制限酵素を、可能ならオキソヌクレオンと組み合わせて使用して目的のDNAフラグメントを生成する。
DNA挿入物は、従来の適当なプラスミドベクターの多くの部位、例えばpC194、pT181およびpUB110のHindIII /BamHI/EcoRI制限部位にサブクローニングしうる。
【0012】
このように、本発明の方法は、既知のペプチドおよびホルモンの誘導物であって、その未修正のペプチド内のシステイン残基をスルフィド結合アミノ酸に置換し、かつセリンおよびチアミンを対応するデヒドロアミノ酸残基に置換した誘導体を調製するのに使用しうる。
これらのフラグメントは、直接粘着末端を用いるか、または適当に化学合成されたオリゴヌクレオチド・ブリッジを付加することにより適当な発現ベクターに組み込まれる。末端の修正には、例えばHindIII およびBglIIを使用しうる。この方法は、制限酵素の種類に制限されることはない。適当な制限酵素と化学合成したオリゴヌクレオチドを組み合わせて使用することにより、発現ベクターとDNA挿入物とを結合することができる。
また、部位特異的突然変異を有するポリペプチドをコードする適当なDNA挿入物も得ることが出来る。
目的の変異体を得るために基本となるDNAに突然変異を誘導するには、種々の方法を使用しうる。
1つの方法では、先ず、変異させる領域をコードする配列を含む天然の、または基本遺伝子のフラグメントをファージの複製型、例えばM13mp8PAを調製する場合のM13mp8に挿入する。挿入する配列に相補的出るが、置換するアミノ酸をコードする1つ以上のヌクレオチドトリプレットを含む合成オリゴヌクレオチドをM13mp8Aの一本鎖にアニールし、二本鎖領域を作る。この領域は、残りの相補鎖のDNAポリメラーゼI合成のプライマーの役割を果たす。複製および同定後、この変異配列をさらに修正するか、もしくは変異ポリペプチドを発現する適当なベクターの構築に用いる。
【0013】
エピデルミンに関して行った研究では、エピデルミンに関して提唱されているプレ・配列の適当なペンタペプチドLysPheCysThrから誘導されるワブルDNAプローブ5’−GTG(A)CAT(G/A)ATG(A)AAT(C)TT−3’を合成した。このDNAプローブをS.エピデルミン(epidermin)DSM3095由来のプラスミドDNAにハイブリダイズした。
単離したプラスミドの制限分析により、EcoRIで7個のフラグメント(16,11,10,6.5,5.5,3.5および2.5 kbp)、HindIII で9個のDNAフラグメント(17,14,10,5.3,2.8,1.8,0.8,0.6および0.5 kbp)およびBamHIで5個のDNAフラグメント(20,19,10,3および1 kbp)が確認された。
5.4 kbpのHindIII フラグメントをサブクローン化し、リハイブリダゼーションする事により、構造遺伝子epiAは2.2 kbpEcoRI/BglIIフラグメントに存在することが分かった。
ハイブリダゼーションプローブとして24種の14マーの混合物を使用した。
ノビク(Novik)等、Ann.N.Y.Acad.Sci.182,279−294(1971)、サザン(Southern)、J.Molec.Biol.98,503−517(1975)およびハインリッヒ(Heinrich)等、Molecul.gen.Genet.209,563−569(1987)に示されている技術に従い、シーケンシングプライマーとして30倍過剰量のプローブを使用した。エピデルミンのペプチド配列で、オープン・リーディング・フレームを同定しえた。シャイン・ダルガルノ配列から適当な距離に単一のメチオニンコドンが存在している。プレ・エピデルミンの構造遺伝子はTAA停止コドンで終わっており、その結果、プレ・エピデルミンは52個のアミノ酸を含み(第1図)、Arg-1およびIle+1の間でプロセシングされてエピデルミンとなる。以上のことから明らかなように、プレ・エピデルミンはより大きいタンパク質の分解産物ではなく、明確な構造遺伝子によりコードされている。
従って、意外にも抗生物質の前駆体タンパク質は、明確な構造遺伝子によってコードされていることが明らかになった。
【0014】
二次構造(α、β)、フレキシビリティー、ハイドロパシー、親水性(第2図)およびヘリックス・ホイール・プロットに関する予測をハイコン(Hycon)プログラムを用いて行った(第3図)。プレ・エピデルミン−30乃至−8に関して高いα−ヘリックス含量の可能性が予測され、一方、プロ・エピデルミンに対応するC末端部分には高いターン含量の可能性が示された。さらに、予測プロットは、N末端−30乃至−1が高い親水性、一方、C末端部分がより親油性であることを明確に示している。N末端部分−30乃至−8は、部分的に折り畳んでおり、両親媒的α−ヘリックスとなっているようである。
プレ・エピデルミンのN末端セグメントはシステイン残基を含んでおらず、一方、C末端セグメント1−22はスルフィド結合形成に関する4個のシステイン残基を含んでいる。配列−30乃至−1はエンドプロテアーゼに対する多くの切断部位を含んでいるが、一方、プレ・エピデルミン状態でさえ、配列1−22は蛋白分解に対して非常に耐性を有している。
成熟型抗生物質は部位13のLysでのみトリプシンの攻撃を受ける。プロセシング部位Arg-1−Ile+1は、ターン形成するPro-2のために親水性で接近可能となっている。
【0015】
エピデルミンなどの抗生物質の生産において発生する種々の酵素反応には、プロ・ポリペプチド部分1−22の修飾、N末端プレペプチドフラグメント−30乃至−1の切断および成熟型抗生物質の分泌が含まれる(第4図および第5図)。
酵素的修飾は、プレペプチドフラグメントの切断前に起こる。酵素的修飾には、デヒドロアラニンおよびデヒドロブチリン残基を生成する各々部位5、16、19および8、14のSerおよびThr残基からの水の脱離が含まれる。また、部位2、11、21および22のCys残基のチオール基のC=C二重結合への付加も起こり、メソ−ランチオニンまたは(2S 3S,6R)−3−メチル−ランチオニン結合が生ずる。さらに、残基22の脱炭酸および二重結合形成でC末端S−(2−アミノビニル)−D−システインが生ずる。C末端に存在するシステインのチオール基とN末端に存在するデヒドロアミノ酸との反応は、エピデルミン、ニシンおよびズブチリンにおいては完全な立体特異性を以て起こる。従って、修飾の際のこれらの脱離・付加反応は、プレ・エピデルミンの残基L−SerおよびL−ThrのCα炭素原子の配置を逆転させD型Cα原子とする事を意味している。
また、4個のスルフィド環が、結果的に同じ触媒部位に生成するが、この事はN末端の両親媒体性α−ヘリックスとの相互作用で支持される。Thr+14 のみが、システインとは無関係に脱水する。この部位(Lys+13 −Dhb+14 )は酵素切断部位を形成しており、ここでトリプシンがエピデルミンを失活させる。スルフィド環生成によりC末端のリジディティーおよび疎水性が増加して、脂質二重層とプロ・エピデルミンとの相互作用を促進され、かつ、トランスロケーションが誘導される。
最後に、親水性のα−ヘリックスN末端−30乃至−1は、上述の特徴的切断部位で特異的プロテアーゼにより切断を受ける。
【0016】
上述の技術を用い、ランチビオティクスをコードするプラスミドを各ポリペプチドをコードする遺伝子の突然変異または異なるポリペプチドをコードする遺伝子でそのような遺伝子を置換することにより修正し、本来の宿主、もしくは、天然の状態でそれらの宿主がランチビオティクス発現しうる場合には、別の宿主をトランスホームするのに使用しうる。
一般に、例えばエピデルミンの場合について上述したように、本来の機能的遺伝子がプレ・配列をコードしている場合、そのようなプレ・配列をコードしているDNA配列は、修正したプラスミドに保持しうる。この場合、新規の、または変異したプロ・ポリペプチドに関するDNA配列は、本来のプロ・ポリペプチド配列と同様にプレ・配列の直ぐ上流に位置することになる。
本発明の細菌宿主の培養は、例えば、1988年5月18日の英国特許出願第8811760.1号およびヨーロッパ特許出願第0 181 578号に示されているような従来の培養条件で行いうる。また、目的のタンパク質の精製および単離もエピデルミンおよびガリデルミンに関して先の特許出願に示されている、吸着剤、イオン交換樹脂および望ましい場合はHPLCを使用する方法または適当な修正法を用いて行いうる。
【0017】
本発明の方法は、実験用の新規化合物の生成、または新規宿主中の既知化合物または既知化合物の誘導体の生成に応用しうる。例えば、エピデルミンをコードする遺伝子を含むプラスミドをストレプトコッカス ラクチス(Streptpcoccus lactis)にトランスホームして該宿主からエピデルミンを生産しうるし、また、ガリデルミンをコードする遺伝子(先に示した英国特許出願参照)を、例えばプラスミドpEpi32におけるようにエピデルミンのプロ・ポリペプチドをコードする遺伝子と置換し、これを用いてスタフィロコッカスエピデルミス(Staphylococcus epidermis)DSM3095をトランスホームして該宿主からガリデルミンを生産しうる。同様に、ヒトのインシュリンなどのホルモン、オキシトシン、バソプレシン、ペプチド抗生物質、エラスターゼインヒビター等のホルモンインヒビターおよびヒトの組織プラスミノーゲン活性化因子などの繊維素溶解剤等、デヒドロアミノ酸残基および/またはランチオニン結合および/またはメチルランチオニン結合を含む他の生物学的に活性なペプチド誘導体も生産しうる。親化合物の生物学的活性を保持すると同時に、これらの化合物の安定性を増し、寿命を延ばすことが出来る。
理想的には、目的のプロ・ポリペプチドをコードするDNAは、チオエーテル結合を形成するためのシステインおよびセリン、および/またはシステインおよびスレオニンに対するコドンが含まれるべきである。
比較的短いポリペプチド鎖の場合には、通常、これらの各々のコドンはわずか8個、望ましくはわずか6個のコドンで分離してているが、もっとも最終的ポリペプチド分子の立体配置に応じてより以上の間隔も可能であることが想像される。
デヒドロアミノ酸の生成の関しては、通常、これらはセリンおよびスレオニンから誘導されることから、目的のプロ・ポリペプチドをコードするDNAにはこのようなアミノ酸に対するコドンが含まれる。
【0018】
本発明の方法にしたがって生産したポリペプチド中に存在する異常アミノ酸には、デヒドロアラニン、2,3−デヒドロ−2−アミノ酪酸、メソ−ランチオニン、(2S,3S,6R)−3−メチル−ランチオニン、S−(2−(Z)−アミノビニル)−D−システイン、リシノアラニンおよびβ−ヒドロキシアスパラギン酸がある。これらの残基の構造を第6図に示す。
意外にも、プレ・エピデルミンの翻訳後の修飾に関する多酵素複合体が、スタフィロコッカス エピデルミン(Staphylococcus epidermin)Tu3298/DSM3095の54 kbpのプラスミドpTu32に存在することが分かった。
本明細書ではエピデルミンの生産を担っている6個の遺伝子(ORF)をEpiA、B、C、D、QおよびPと命名するが、これらは8kb内に集まっており、また、これらがコードするタンパク質をそれぞれEpiA、B、C、D、QおよびPと命名した。EpiAは、52アミノ酸残基長のプレ・エピデルミンである。以下に述べるように、EpiB、CおよびDは、4個の酵素的修飾反応(i)セリン/スレオニン デヒドラターゼによる水脱離、(ii)ランチオニン シンテースによる硫黄付加、(iii) システイン脱炭酸酵素によるC末端脱炭酸および(iv)二重結合形成に関連する。EpiPタンパク質は、セリンプロテアーゼの本質的ドメインとの著しい類似性に基づくN末端リーダーペプチドからの成熟型エピデルミンの切断を担うと考えられているが(コイデ(Koide)等、J.Bacteriol.167:110−116(1986);メロン(Meloun)等、FEBS Lett.183:195−200(1985);およびストール(Stahl)等、J.Bacteriol.158:411−418(1984))、一方、EpiQは、大腸菌のphoB遺伝子への明確な類似性(マキノ(Makino)等、J.Mol.Biol.190:37−44(1986))、両タンパク質が205(EpiQ)および229(phoB)アミノ酸残基長と同じサイズであるという事実、153個のC末端アミノ酸残基に渡る24.2%の類似性および両タンパク質の親水性プロットに基づき、エピデルミンの整合性を調節する調節タンパク質であると考えられる。
ここで、上述したEpiB、C、D、PおよびQの各タンパク質の酵素活性は実施例5に記載したような相補性試験によって確認することができる。なお、エピデルミン生合成に関する相補性試験において不活性EpiBタンパク質を相補する酵素活性を有するタンパク質を本明細書において「エピデルミン生合成に関する相補性試験によって定義されるEpiB活性」と呼ぶことにする。EpiC、EpiD、Epi PおよびEpiQについても同様に「エピデルミン生合成に関する相補性試験によって定義されるEpiC活性」、「エピデルミン生合成に関する相補性試験によって定義されるEpiD活性」、「エピデルミン生合成に関する相補性試験によって定義されるEpiP活性」、「エピデルミン生合成に関する相補性試験によって定義されるEpiQ活性」を定義する。
【0019】
エピデルミン生合成に関する全遺伝的情報の予想外の知見およびタンパク質epiB、C、D、QおよびPに対する遺伝子の解釈の結果から、これらのタンパク質をコードするDNAを単離し、かつ、これらの遺伝子を1つ異常含むプラスミドを構築する事が出来、その結果、このようなプラスミドを含む宿主を培養することによりこれらのタンパク質のうちの1つ、または所定のタンパク質の組み合わせ物を発現し、単離することが可能となった。
従って、本発明には、タンパク質EpiBまたはEpiC、またはEpiD、またはEpiPまたはEpiQをそれぞれコードするDNA配列が含まれる。これらの配列は、従来法によるpTu32からの切断および単離、または化学合成または他の従来法で得ることが出来る。また、このDNAはプラスミド、望ましくは発現プラスミドに組み込むことができ、これらの構築物で適当な宿主にトランスホームした後、その宿主を培養すると、プロモーターのコントロール下の該構築物はプラスミドにライゲーションしたDNAにしたがってタンパク質EpiB、EpiC、EpiD、EpiPまたはEpiQ、またはこれらのタンパク質の組み合わせ物を発現するであろう。別に、プラスミドpTu32を適当な制限酵素で処理してDNA配列の1つまたは他の部分を切り捨て、目的のプラスミドの遊離末端に必要とする修正を施した後に再ライゲーションすることで、epiB、C、D、PおよびQの内の所定の1つをコードするDNA配列を含むプラスミドを作ることが出来る。
さらに、変異体には、pTu32中のエピデルミンをコードする遺伝子の所定のアミノ酸配列をコードするDNA配列による置換が含まれ、この修正プラスミドを有する宿主の培養でエピデルミンとは異なるタンパク質が発現される。
従って、pTu32中のエピデルミンをコードする遺伝子をガリデルミン、またはエピデルミン変異体、または他のランチビオチック、または他のタンパク質をコードするDNA配列で置換することが出来、それにより生成したプラスミドを通常ランチビオチックまたはタンパク質EpiB、C、D、PまたはQのいずれも生産しえない適当な宿主にトランスホームし、置換したDNA配列および遺伝子epiB、C、D、PおよびQが発現する条件下で宿主を培養する事により、ガリデルミン、エピデルミン変異体またはランチビオチックの構造的特徴を少なくとも1つ含む他のタンパク質を得ることが出来る。
【0020】
一方、タンパク質EpiB、C、D、PまたはQをコードする遺伝子を所定のアミノ酸配列をコードする遺伝子と共に適当なベクターに挿入し、Epiタンパク質および所定のアミノ酸配列をコードする遺伝子を適当なプロモーターと機能的に結合させ、生成したプラスミドで通常ランチビオチックまたはタンパク質EpiB、C、D、PまたはQのいずれも生産しえない適当な宿主をトランスホームして、この宿主を培養することで、挿入した遺伝子に所定のアミノ酸配列に由来するが、ガリデルミン、エピデルミン、エピデルミン変異体、またはその他のタンパク質に見られるランチビオチックの構造的特徴を含むタンパク質を発現することが出来る。
また、本発明は、望ましくはストリンジェント条件下、本明細書で示しているタンパク質EpiB、C、D、PまたはQの活性を実質的に有しているタンパク質をコードするDNA配列とハイブリダイズしうるDNA配列を含む。ストリンジェント・ハイブリダゼーション条件では、85%以上、望ましくは約90%以上のホモロジーを有するDNA配列を選択する。cDNAライブラリーのスクリーニングは、ヨーロッパ特許出願第88 119 602.9号およびカシマ(Kashima)等、(Nature 313:402−404(1985))の方法に従って高ストリンジェント条件で行った。ストリンジェント条件下で本出願で公開したDNA配列とハイブリダイズしうるDNA配列は、例えば、公開したDNA配列の対立遺伝子変異体、公開したDNA配列に関連するが特定の微生物中に天然に存在するもの、または他の生物種に由来するものがある。核酸のハイブリダゼーションに関する一般的技術は、参考として本出願に含まれるマニアチス(Maniatis)、T.等、Molecular Cloning,A Laboratory Mannual,コールドスプリングハーバー、NY(1982)およびハイムス(Haymes),B.D.等、NucleicAcid Hybridization,a Practical Approach、IRLプレス、ワシントン、DC(1985)に示されている。タンパク質EpiB、C、D、PおよびQは、デヒドロアラニン、デヒドロブチニン、メソ−ランチオニン、3−メチル−ランチオンおよびS−(2−アミノビニル)−D−システイン等の構造的特徴を含む新規なタンパク質またはその他の物質の製造に有用な高価値で、かつ興味深い新しい試薬である。
このように、これらは、単離型のタンパク質として、またはこれらの酵素による細胞外プロセシングを研究するための化学的合成操作における化学的触媒試薬として使用しうる。
【0021】
また、本発明は、実質的に純粋なタンパク質EpiB、C、D、PまたはQに関する。“実質的に純粋”とは、そのタンパク質が天然で会合している不純物を含まないことを意味している。実質的純粋性は、電気泳動による単一バンドで確認しうる。
本発明のポリペプチドは、抽出、沈殿化、クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、電気泳動等の従来法により上述の組み換え分子から単離・精製しうる。このタンパク質は、さらに補助タンパク質を含む融合タンパク質の一部として生産されることが望ましい。これらの補助タンパク質には、例えば、典型的分泌シグナル、大腸菌由来のマルトース結合タンパク質、またはプロテインA等が含まれる。プロテインAを含む融合タンパク質の調製、イムノアフィニティー・クロマトグラフィーによるその精製、および目的タンパク質を放出するその切断に関する方法は、例えば、PCT出願第W/O84/03203号(1984)に示されている。
融合タンパク質の切断を可能にする必要条件は、それが適当な切断手段で認識および切断される単一の切断部位を含むことである。このような切断部位は、化学的または酵素的手段で認識可能で、かつ、目的タンパク質と補助タンパク質の間にある単一のアミノ酸配列である。このような特異的アミノ酸配列が目的タンパク質または補助タンパク質の中にあってはならない。酵素的試薬の例には、アミノ酸配列NH2−Pro−X−Gly−Pro−COOH(式中、Xは任意のアミノ酸残基、例えばロイシン)を認識しうるコラゲナーゼ等のプロテアーゼ;Met−Phe結合を切断するキモシン(レニン);X−Phe−Arg−YのArgのカルボキシル側を切断するカリクレインB;配列X−(Asp)n−Lys−Y(式中、n=2−4)を認識し、Lysのカルボキシル側で切断するエンテロキナーゼ;特異的アルギニル結合を切断するトロンビン等がある。融合タンパク質を切断するのに使用しうる化学試薬の例には、Asn−Z結合(式中、ZはGly、LeuまたはAlaである)を切断するヒドロキシルアミン;高濃度で(約70%)特異的にAsp−Proを切断する蟻酸等がある。
【0022】
以上の説明を用いて、当業者が本発明を十分なまでに利用しうることは明白である。従って、以下に示す望ましい特定の態様は単なる例として解釈されるべきものであり、本出願を制限するものではない。
【0023】
【実施例】
実施例1
1.ガリデルミンの過剰生産
pC194、pE194、pUB110、pT181またはpMK148ガリデルミン等のメディアム・コピー・プラスミドを用いて、ガリデルミンのオープン・リーディング・フレームを含むDNAフラグメントをエピデルミン生産株であるスタフィロコッカス エピデルミス(Staphylococcus epidermis)DSM3095にクローニングしうる。通常、この遺伝子の増加は生産物の増加と相関する。但し、この相関は必ずしも線型ではない。pC194またはpT181の高コピー数プラスミド誘導体もクローニングベヒクルとして使用しうる。
【0024】
2.リーダー配列の交換
アミノ酸−1乃至−30に相当するエピデルミンのリーダー配列は、エピデルミンの分泌に関する。この配列を用いて、ガリデルミン等、S.エピデルミジス(epidermidis)中の他のタンパク質を分泌しうる。
このリーダー配列DNAは、その配列の前後に各リンカーを挿入することにより移動可能とすることが出来る。従って、このリーダー配列DNAは、プラスミドから大量に単離することが出来、かつ、他のペフチドおよびタンパク質の各位置に挿入することが出来る。また、このリーダー配列DNAは化学合成でも生成する事が出来る。
【0025】
実施例2
宿主としてS.エピデルミス(epidermis)を用いたガリデルミンの生産
1.プラスミドの調製(第7図参照)
a)プラスミドpCUIは、ラルフ ローゼンシュタイン博士(Dr.RalfRosenstein)の“Molekular genetische Untersuchungen zur plasmidkodierten Arsenit und Arsenatrestistent bei Staphylococcen”(ドイツ、ミュンヘン、技術大学から市販されている)の方法に従い、クレノーフラグメントを用いてPstI消化したpCLP100およびNde1消化したpUC18をライゲーションする事により調製した。ついで、このプラスミドをEcoRIで消化した。
b)S.ガリナラム(gallinarum)(DMS4616)から染色体DNAを単離し、これをEcoRIで消化した。HindIII およびEcoRI認識部位の間にある2.4kb長のガリデルミン構造遺伝子を含む4.7kbのフラグメントを、以下の配列:
5’CAC ATC CAG GAG TAC 3’
を有するプライマーを用いて単離した。
c)ステップa)の消化したpCUIプラスミドのEcoRI部位に4.7kbフラグメントをライゲーションして、プラスミドpCUgdm1を得た。
【0026】
2.宿主S.エピデルミス(epidermis)の調製
本実施例においては、エピデルミンを生産しえないS.エピデルミス(epidermis)DSM3095の変異体を単離した。
突然変異誘発は、染色体にコードされているリファンピシン耐性(μg/ml)
によって特徴付けられる株について行った。
寒天プレートで増殖したS.エピデルミス(epidermis)DSM3095を30mlの基礎栄養培地に接種し、これを一晩培養した。この一晩培養物0.5mlを生産培地50mlに接種し、これを37℃で3時間振盪培養した。
培養培地から細胞を取り出し、保温した4.5mlTMバッファ(30mMトリス−マレイン酸 pH7.4(生成した溶液を溶液Aとする))。
溶液Aの突然変異体および細胞数(1.25×1010細胞/ml)をチェックした。
4mlの溶液Aを1mlのエチルメチルスルホネート(最終濃度47μg/ml)と完全に混合し、37℃で1時間振盪した。
それから細胞を培養培地から抽出し、TMバッファで2度洗浄した後、5mlのTMバッファに懸濁した(この変異細胞を含む溶液を溶液Bと命名した)。
溶液Bは2×108 細胞/mlの濃度であり、これは1.6%の生存率に当たる。
50mlの溶液Bを5mlの生産培地に添加し、37℃で一晩培養した(発現型の発現)。この溶液を溶液Cとする。細胞数は7.3×108 細胞/mlを示した。
この溶液をBM寒天プレートにプレーティングし、各コロニーを釣り上げた。これらをテストプレート(表面にマイクロコッカス ルテウス(Micrococcus luteus)を撒いたBM寒天を含む)に接種した。M.ルテウス(luteus)への阻害効果を示さないコロニーをエピデルミンの非生産株として選択した。
BM寒天(1リットル当たり)
10gm ペプトンNo.140
5gm イースト イクストラクト
1mg グルコース
5mg NaCl
1mg K2HPO4
pH7.5
約3%の変異率が測定された。
見つかった45個の非生産株を20回サブクローニングし、16個の安定な非生産株を得た。
全ての安定な非生産株は、野生型のプラスミドpEpi32を含んでいることが分かった。制限パターンから、これが野生型株中のプラスミドと同じものであることが同定された。
【0027】
非生産型S.エピデルミス(epidermis)のトランスホーメーション
安定な非生産型株の一晩培養から得た5mlの培地を750mlのBM培地に接種し、この培地を2リットルフラスコ中、振盪速度120rpm、37℃で振盪培養した。
接種したBM培地の当初の光学密度は、0.03−0.04であった。光学密度が0.45−0.55に達したとき、細胞をGS−3ローターを用いた8500rpm、4℃、15分の遠心で回収した。単離した細胞を順次、750、350、40および10mlの10%グリセリンで洗浄し、ついで2−3mlの10%グリセリンに懸濁した後、ERG中110ml分を−70℃で凍結した。細胞数は、1−5×1010/mlであった。
凍結した細胞を室温、5分間で融解し、その細胞懸濁液50μlをERG中プラスミドpCUgdm1のTEバッファ溶液2μlと共に室温で30分間インキュベートした。この混合物を電極間隙0.2cmのエレクトロポレーション・キュベットに導入し、直ちにエレクトロポレーションした。その後、この細胞を迅速に950μlのSMMP50培地に懸濁し、2.5mlのERGに移して、37℃で90分間振盪した。ERGは、培地によく空気が溶けるように45°に傾けた。
SMMP50培地には、pro 100ml、2SMM 55ml、4PAB 40mlおよび5%BSA 5mlが含まれる。2SMMには、1mol サッカロース、0.04mol マレイン酸、0.04mol MgCl2およびpH6.5とするためのNaOHが含まれている。4PABは、7g/100mlのギブコ抗生物質培地3溶液である。
ガリデルミンを生産する増殖株のテストは、M.ルテウス(luteus)テストプレートからのコロニーの選択、および各選択されたコロニーの培養およびHPLCによるガリデルミンの検定によって行った。
ガリデルミンを生産しうる3個のpCUgdm1トランスホーム変異体が確認された。
【0028】
pCUgdm1でトランスホームしたS.エピデルミス(epidermis)により生産されるガリデルミンの検定
a)バイオアッセイ
FP寒天をM.ルテウス(luteus)ATCC9341で接種し、37℃で18時間インキュベートした。生成した培養物の半分をループで取り出し100mlのFP培地に懸濁し、36℃で8時間培養した。その光学密度が1.0に到達したときに培養を終えた。この懸濁液の0.5%をFP寒天に接種し、各10mlをシャーレに注いで4℃で3週間保存した。
ゾナー(Zahner)およびマス(Maas)“抗生物質の生化学”スプリンガー・バーラグ、ベルリン 1972に示されている方法でプレート拡散テストを行った。トランスホームしたS.エビデルミン(epidermin)の培養由来の培養濾液10μlを濾紙にしみ込ませ、乾燥した。この濾紙をテストプレートの上に置き、37℃で24時間インキュベートした。
【0029】
b)HPLC
選択したトランスホーム株を生産培地中で26時間培養した。培養培地を13,000rpmで10分間遠心した。
単離した培養液を、移動相としてA)70%過塩素酸を0.5%含むH2OおよびB)アセトニトリルを用いたSP8.700液体クロマトグラフィー(スペクトラ・フィジックス、ダルムスタット、ドイツ)によるHPLCで分析した。カラム系には、粒子径7μm およびカラムサイズ125mm×4.6mmI.D.のヌクレオシル−100 C−18と20mm×4.6mmI.D.のプレカラムを使用した。
勾配を以下に示す。
クロマトグラフィーの結果を第8図に示す。7.54分でガリデルミンの溶出を示す標準的曲線を第9図に示す。
【0030】
培養培地には以下に示すものを使用した。
1.FP寒天
肉抽出物 4g
ペプトン 10g
NaCl 3g
Na2HPO4 5g
グルコース 10g
複合寒天 15g
水 1リットル
pH 7.2
2.FP培地
肉抽出物 4g
ペプトン 10g
NaCl 3g
Na2HPO4 5g
グルコース 10g
水 1リットル
pH 7.2
3.生産培地
肉抽出物 33g
モルト抽出物 30g
NaCl 40g
水酸化カルシウム 3.8g
水 1リットル
pH 6.5
【0031】
実施例3
プラスミドの単離
S.エピデルミス(epidermis)Tu3298のプラスミドDNAをノリック(Norick)等、Ann.NY−Acad.Sci.182:279−294(1971)の修正法に従って単離した。S.エピデルミス(epidermis)をBM培地(1%ペプトン140、ギブコ、ニュウ・アイゼンバーグ、F.R.G.、0.5%酵母抽出物、ディフコ、デトロイト、USA、0.1%グルコース、0.5%NaClおよび0.1%K2HPO4×2H2O)で静止期まで培養した。細胞を遠心し、0.5M EDTAで2回洗浄した。このペレットを80ml NaClバッファ(50mM トリス−HCl(pH7.0)、50mM EDTA、2.5M NaCl)に再懸濁し、1.5mlのリゾスタフィン溶液(0.5mg/ml、シグマ、ハイデルベルグ、F.R.G.)を添加して、37℃で20分間インキュベートした。細胞は、80mlの溶解バッファ(50mM トリス−HCl(pH8.0)、300mM EDTA、500mM ブリッジ、40mM デオキシコレート酸ナトリウム)を添加し、氷水中で1時間放置することで溶解した。この溶解物を遠心し(30分間、13,000rpm、4℃)、その上清を4分の1倍容の50%PEG6000溶液と混合した。プラスミドDNAを4℃、一晩で沈殿させた。このDNA懸濁液を遠心後(20分、13,000rpm、4℃)、8mlのTEバッファに溶解し、さらに、50μlのプテアーゼ溶液(20mg/ml)を添加した。37℃、15分間のインキュベーション後、DNAをエタノールで沈殿させ、さらにCsCl遠心(1g CsCl/ml、40,000rpm、40h 、20℃)で精製した。
【0032】
RNAの単離と電気泳動
S.エピデルミン(epidermin)をSMS最小培地(タザジ(Terzaghi)等、Appl.Microbiol.29:807−813(1975))で増殖し、枯草菌(Bacillus subtilis)RNAに関して示された方法(ウルマネン(Ulmanen)等、J.Bacteriol.162:176−182(1985))と同様の修正法を用い、そこからRNAを単離した。プロトプラスティング・バッファ中のリゾスタフィンと37℃でインキュベーションする事で細胞を溶解した。全RNAをグリオキシル化し(マクマスター(McMaster)等、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 74:4835−4839(1977))、電気泳動バッファとして10mM Na2PO4 (pH7)を用いた1.2%アガロースゲルで分離した。RNAをエチジウム・ブロマイドを用いて染色し、20×SSC(0.15M NaCl、0.015M クエン酸三ナトリウム、pH9)を用いたキャピラリー・トランスファーによりニトロセルロースメンブレン(シーダー・アンド・シュエル、ダセル、F.R.G.)にブロッティングした。23SrRNAおよび16SrRNAをサイズマーカーとして用いた。
【0033】
インビトロ・トランスレーション
pSPT18/19ベクターシステム(ベーリンガー・マンハイム、F.R.G.)に各フラグメントをクローニングする事により、一本鎖のRNAプローブを得た。このプラスミドをEcoRIまたはHindIII で線状にし、線状DNAテンプレートを得た。転写のためのメルトン(Melton)等、Nucl.Acid Res.12:7035−7056(1984)の方法は、業者の説明書に従って修正した。α32P−CTP(800Ci/mMol)の存在下でT7−RNAポリメラーゼまたはSP6−RNAポリメラーゼを使用した。取り込まれなかったリボヌクレオチドは、セファデックスG50クロマトグラフィーでラベル化したRNAと分離した。
【0034】
ノーザン・ハイブリダゼーション
電気泳動後、RNAをトーマス(Thomas)、P.S.、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:5201−5205(1980)の方法に従ってフィルターにトランスファーした。80℃、2時間のインキュベーションの後、そのフィルターを20 トリス−HCl(pH8)中、100℃で手短にインキュベーションして、グリコシル化を外した。その後、このフィルターを、そのフィルターを50%ホルムアミド、5×SSC(0.15M NaCl、0.015M クエン酸三ナトリウム、pH9)、50 NaPO4 、pH6.5、0.1%フィコール400(ファルマシア、フレイバーグ、F.R.G.)、0.1%ポリビニルピロリドン、0.1%ウシ血清アルブミンおよび0.25mg/ml 変性サケ***DNA溶液中、42℃で2時間かけてプレハイブリダイズした。このフィルターを1×SSC、0.1%SDS溶液中、42℃で15分間かけて洗浄した後、これを用いて−70℃で4時間かけてコダック−X オマットフィルムを感光させた。さらに、このフィルターを0.5×SSC、0.1%SDS溶液を用い、70℃で15分間かけて2回洗浄した後、−70℃で16時間かけてオートラジオグラムを作製した。翌日、70℃、30−60分間の0.1×SSC、0.1%SDS溶液による洗浄を続け、その後再び、−70℃、3日間のコダック−X オマットフィルムへの感光を行った。
【0035】
サザン・ハイブリダゼーション
サザン・ハイブリダイゼーション(サザン(Southern)、E.M.,J.Mol.Biol.98:503−517(1975))には、プローブとしての5’ラベル化オリゴヌクレオチドを23℃で使用した。オリゴヌクレオチドは、ガンマ32P−ATPとT4ポリヌクレオチドキナーゼ(ベーリンガー・マンハイム、マンハイム、F.R.G.)を用いてラベルした。オリゴヌクレオチドおよびプライマーは391DNA合成機を用いて合成し、さらに精製すること無く使用した。
【0036】
DNAシーケンシング
DNAは、T7DNAポリメラーゼ(ファルマシア、フレイバーグ、F.R.G.)を用いたチェーン・ターミネーション法(サンガー(Sanger)等、Poc.Natl.Acad.Sci.USA 74:5463−5467(1977))により、放射能的および非放射能的にシーケンシングした。放射能プラスミドシーケンシングは、適当なプライマーを用い、ハットリ(Hattori)等、Anal.Biochem.152:232−238(1984)の方法で行った。3.6kbのBamHI/PstIフラグメントは、アプライド373A DNAシークエネーター(アプライド・バイオシステムズ、ウェイタートタット、F.R.G.)を用い、非放射能的にシーケンシングした。各フラグメントは、ファージミドpBSD-/+にクローニングした。この構築物をBamHIおよびSacIで消化し、線状にしたDNAをエクソヌクレアーゼIII (ベーリンガー・マンハイム、マンハイム、F.R.G.)を用いて5’末端から両方向に消化していき、一組のネステド欠失物とした後、ムング・ビーン・ヌクレアーゼ(ベーリンガー・マンハイム、マンハイム、F.R.G.)で処理して平滑末端とした。電気泳動後(1%アガローズゲル)、適当なサイズのフラグメントをゲルから単離し、再ライゲーションしてから大腸菌XL−1ブルー株にトランスホーメーションした。ヘルパーファージCSM13を用いて一本鎖DNAを単離し、Taqポリメラーゼ(プロメガ、フレイバーグ、F.R.G.)を用い、市販業者の説明書にしたがってシーケンシングした。
【0037】
プラスミドの構築
スタフィロコッカス(Staphylococcus)のテトラサイクリン耐性プラスミドpT181のシーケンシングで(カーン(Kahn)等、Plasmid 10:251−259(1983)、プラスミドの複製に必要ではないプレ・遺伝子内に単一のNdeI部位があることが分かった(ゲナロ(Gennaro)等、J.Bacteriol.169:2601−2610(1987))。大腸菌ベクターpUC19(ヤニッシュ・ペラン(Yanisch−Perron)等、Gene 33:103−119(1985))の多重クローニング部位(mcs)をこのNdeI部位に挿入し、pT181mcsを構築した(第24図)。
スタフィロコッカス(Staphylococcus)−大腸菌シャトルベクター、pCUI(第20図)をスタフィロコッカス(Staphylococcus)のクロラムフェニコール耐性プラスミドpC194の誘導体であるpCLP100および大腸菌ベクターpUC19から構築した。pCUIは、両宿主内で約6kbまでの挿入物を安定に維持する。pT181mcsおよびpCUIは、スタフィロコッカス(Staphylococcus)に適合しており、これらをpTu32由来のDNAフラグメントをサブクローニングするのに使用した。pTu32のHindIII フラグメントをpUC19にクローニングし、これをサザン・ハイブリダイゼーションのプローブとして使用して、さらにHindIII フラグメント付近の制限部位を同定した(第10図C)。
S.S.エピデルミス(epidermis)由来の54 kbpエピソーマル要素pTu32の13.5 kbpBglIIフラグメントをpT181mcsにサブクローニングしてpTepi14を構築した(第10図A)。DNAシーケンス用に大腸菌ベクターpUC19(ヤニッシュ・ペラン(Yanisch−Perron)等、Gene 33:103−119(1985))およびpBluescriptIIR (ストラタジーン、ハイデルベルグ、F.R.G.)にサブクローンを作製した。ベクターpSPT18/19(ベーリンガー・マンハイム、マンハイム、F.R.G.)にクローニングしたDNAから一本鎖RNAプローブを得た。
【0038】
遺伝子解析
エピデルミン構造遺伝子、epiAに隣接するDNA領域をシーケンシングする事で、pTu32の13.5 kbpBglIIフラグメントの内部にさらに5個の完全なオープン・リーディング・フレーム、epiB、C、D、PおよびQが存在することが明らかになった。
第11図乃至第19図から分かるように、epiAオーカーコドンから僅か50ヌクレオチド離れた、EpiAをコードする配列の直ぐ隣に、S/D配列に続く2,970bpの大きなオープン・リーディング・フレームが存在する。また、スタフィロコッカス(Staphylococcus)の翻訳開始コドンとして働きうるロイシンのTTGコドンもS/D配列から適当な距離に存在する。このオープン・リーディング・フレームをepiBと呼ぶが、これは、本明細書で示すようにエピデルミンの生合成変異体の相補性やエピデルミン生合成における基本的役割において利用することが出来る。
TTG(Leu)から開始する、epiBによってコードされるタンパク質は、分子量約115DaおよびpH7における正味の電荷−3を有し、またカイト(Kyte)等、J.Mol.Biol.157:105−132(1982)に従う親水性プロットからも予想されるように、中程度の疎水性(41%疎水性残基)である。
epiBの3’末端には、転写停止に特徴的なパリンドローム構造は見られない。しかし、第11図乃至第19図からも分かるように、1塩基シフトして別のリーディング・フレームepiCと122bpの重複がある。
本出願者は、2つの独立したプラスミドの単離物由来の各47 kbpのHindIII フラグメントを独立に2回、クローニングおよびシーケンシングする事により、この事がアーテファクトではないことを確認した。また、このことは、本明細書で示すepiC含有フラグメントを用いた変異体の相補性によっても確認された。
epiBおよびepiCのリーディング・フレームの重複領域の内側で、AGGA要素の3’側僅か36bpの所にある最初のTTGコドン(Leu)が翻訳開始コドンの役割を果たしており、このことは、両リーディング・フレームが約40コドン重複していることを示している。EpiCタンパク質の実際のアミノ末端は、N末端シーケンシングで決定した。リーディング・フレームepiCは、開始コドンTTG(Leu)で始まる445アミノ酸残基のタンパク質をコードしている。リーディング・フレームepiDは、epiCの3’側に直接続き、S/D配列AGGAGGの3’側86bpの所に開始コドンATGを有している。epiDの3’側には、古典的なロー因子依存の転写ターミネーター構造がある。epiDは、開始コドンATG(Met)を含む181アミノ酸残基のタンパク質である。
タンパク質epiB、C、D、PおよびQのいずれも、スイス・プロットおよびジーン・バンクのタンパク質データベースに登録されているタンパク質配列との類似性を示さず、したがって、これらは未知のタイプの酵素または調節タンパク質である。
【0039】
生合成遺伝子の転写
先に示したように、目的のフラグメントをpSPT18/19ベクターシステム(ベーリンガー・マンハイム、マンハイム、F.R.G.)にクローニングすることにより一本鎖RNAプローブを得た。
第20図に示すように、サイズのかなり異なる2つの転写物が得られた。epiAに特異的なハイブリダイゼーション・プローブが、約300bpの小さな転写物を同定した。また、同様のサイズの転写物が、ランチビオチックであるニシン(バックマン(Buchmann)等、J.Biol.Chem.263:16260−16266(1988))およびズブチリン(バネリー(Banerjee)等、J.Biol.Chem.263:9508−9514(1988))についても発見された。さらに、約5kbの大きい転写物もepiBに特異的なハイブリダゼーション・プローブを用いて同定された。epiBの前に大腸菌様のプロモーター配列が無く、一方、epiAの5’側に適当な配列が存在することから、epiAプロモーターはポリシストロンmRNAのプロモーターとして働くと見ることが出来る。
【0040】
下流のオープン・リーディング・フレーム
オープン・リーディング・フレームepiPおよびepiQは、epiB、CおよびDとは反対のDNAに存在し、epiQは、6bpのループを含む完全なヘアピンであるターミネーション構造をepiDと共有している。
このループ構造の中で、epiDおよびepiQ両リーディング・フレームのTAA終止コドンは、3個のヌクレオチドの内の2個を共有している。
epiPのリーディング・フレームは、S/D配列と適当な距離(6bp)にあるATGコドンで開始している。このATGコドンをepiPの翻訳開始コドンとすると、このタンパク質は461アミノ酸残基からなる分子量51.8kDのタンパク質である。epiPは、セリン・プロテアーゼに保存されているアミノ酸モチーフ(図21)に類似する特徴を有しており、このことは、epiPが修正されたプレペプチドからの成熟型リンチビオチックの切断に関係していることを示している。
また、epiQのリーディング・フレームも、ATGコドンから開始しており、これは205アミノ酸残基をコードしている(第11図乃至第19図)。S/D配列は、ATG翻訳開始コドンから6bp離れて存在し、また、その分子量243kDはDNA配列から誘導した。epiQタンパク質は、大腸菌のリン酸調節に関するポジティブ調節因子であるPhoBに類似する特徴を有し(第22図参照)、その結果、epiQはランチビオチック合成における調節因子と考えられる。
epiPに先行して、S/D配列の12bp手前に大腸菌様の−10領域(5’−TATAAA)があり、これはスタフィロコッカス(Staphylococcus)においてプロモーターの役割を果たしている。第11図乃至第19図に示すように、epiPの終止コドンとepiQのATG翻訳開始コドンの距離は、僅か10ヌクレオチドであり、また、epiQのS/D配列はepiPの終止コドンと重複している。
epiA、B、C、Dの5’側に逆方向のリーディング・フレームがあり、これは潜在的に最高148アミノ酸残基をコードしている。特徴的なS/D配列は存在するが、先に示したスタフィロコッカス(Staphylococcus)の開始コドン(ATG、TTG、GTG)はいずれも存在しない。−1のフレームシフトを持つリーディング・フレームが続くが、これは第11図乃至第19図に示したBglII単離フラグメントを越えている。
これら2個のリーディング・フレームは、ガリデルミンの構造遺伝子に隣接すると同定された単一のオープン・リーディング・フレームgdmYと相同的である(シュネル(Schnell),N.,Biosynthese der Peptid−Antibiotika Epidermin und Gallidermin;博士論文、チュービンゲン大学、F.R.G.(1989))。S.S.エピデルミス(epidermis)プラスミド上の相同的リーディング・フレームをepiY’およびepiY”と命名した。
【0041】
実施例4
先に示したように調製したプラスミドpTepi14を標準的技術を用いてS.カルノサス(carnosus)にトランスホームした。ついで、このトランスホーム株をBM培地で増殖した(上述)。
生成したトランスホーマントは、エピデルミン感受性テスト株マイクロコッカス リテウス(Micrococcus luteus)ATCC9341を阻害することが分かった。この検定では、M.ルテウス(luteus)の一晩培養物1ml(OD578 を1.0に調整)を500mlの融解BM寒天培地に添加した。通常、この寒天培地10mlをシャーレに入れた。S.S.エピデルミス(epidermis)の培養希釈物をこの寒天培地の表面に拡げた。エピデルミン・ポジティブ・コロニーは、コロニーの回りのM.ルテウス(luteus)の増殖阻害帯で検出した。
細胞を3%肉抽出物、3.8%モルト抽出物、0.6%CaCl2×2H2Oおよび4.6%NaCl(pH6.5)溶液で培養した。使用したトランスホーマントに応じて、テトラサイクリンまたはクロラムフェニコールを添加した。1つのイクステンションを有する500mlの三角フラスコ中、100mlの培地で24時間インキュベートした後、両培養物をサーバル遠心機を用いて10,000rpmで10分間遠心した。
トランスホーマントの液体培養物の上清を吸着クロマトグラフィーで精製し(XAD1180、不純物は、水/メタノール(1:1)で溶出し、エピデルミンは、メタノール/0.1N HCl(9:1)で溶出した。エバポレーション後、溶出液を3N NaOHでpH3.5に調整し、水を加えて10mlとした。)、HPLCクロマトグラフィーで検出した。この阻害活性は、成熟型エピデルミンと共に溶出した(6.75/6.76分、第23図A及びB参照)。トランスホームしていないS.カルノサス(carnosus)の培養培地を同様に処理したが、この溶出領域にはピークを示さなかった(第23図C)。これらの結果は、S.カルノサス(carnosus)における異種エピデルミンの生合成を明確に示すものであり、かつ、pTepi14がエピデルミンの生合成に必要な全ての情報を含んでいることを示している。
pTepi14は13.5 kbpのBglIIフラグメントを含んでおり、かつ、epiY’が翻訳開始コドンを欠き、また、epiY”がこのフラグメント上で不完全なことから、epiY’およびepiY”のリーディング・フレームがこの系におけるエピデルミンの生産に必ずしも必要ではないことを示している。
【0042】
実施例5
S.エピデルミン(epidermin)Tu3298の多くのepi変異体をエチルメタンスルホネート(EMS)突然変異誘発法で調製した。この操作は、ミラー(Miller)、J.H.,Experiments in molecular genetics,コールド・スプリング・ハーバー、N.Y.(1972)の方法にしたがって行った。変異体は、エピデルミンの生産、または上述のM.ルテウス(luteus)を用いたエピデルミン生産の欠如でスクリーニングした。epi変異体を数回移し替えて安定性をテストした。単離した40個のepi変異体の内、安定なのは僅か10個であった。不安定な変異体は、数回の移し替えの後、再びエピデルミンを生産した。全ての安定なepi変異体は、プラスミドpTu32を含んでおり、このプラスミドは、制限エンドヌクケアーゼ分析で明らかなように欠失、または再配列を起こしていなかった。この10個のepi変異体を相補性の実験に使用した。
プラスミドpTu32の種々の制限フラグメントをS.カルノサス(carnosus)にクローン化し、異種のエピデルミンの生産を検定した。先に述べたこのフラグメントをプラスミドベクターT181mcsおよびpCU1、および第26図Bに示したように、サブクローニングした種々のORFCに挿入した。先ず、S.カルノサス(carnosus)(プロトプラスト・トランスホーメーション(ゴズ(Gotz)等、FEMS Microbiol,Lett.40:285−288(1987)による)または大腸菌(CaCl2を使用、コーエン(Cohen)等、Proc.Natl.Acad.Sci.USA
69:2110−2114(1972))を用いてクローニングを行い、ついで、その組み換えプラスミドを単離し、エレクトロポレーションを用いて種々のS.S.エピデルミス(epidermis)に移した(オーグスチン(Augustin)等、FEMS Microbiol.Lett.66:203−208(1990))。分子クローニングに使用した酵素は、ベーリンガー・マンハイム(マンハイム、F.R.G.)、BRL(エゲンスタイン、F.R.G.)またはファルマシア(スウェーデン)から入手した。S.エピデルミン(epidermin)株のトランスホーメーションは、環状(ccc)プラスミドでのみ旨く行き、即ち、ライゲーション産物を用いた場合、時々しかトランスホーマントが得られないことから、この間接的トランスホーメーション法が必要となった。
相補性実験の結果を表1に示した。
【表1】
【表2】
【0043】
種々のepi遺伝子(A、B、C、D、PおよびQ)を含む一連のプラスミドを構築した(第26図B)。2つのプラスミドpTepi14およびpTepiABCDQは、全てのepi変異体を相補しえた。構築した他のプラスミドpCUepiABC、pTepiAB、pCUepiCDQ、pCUepiB、pCUepiA1 、pCUepiA2 、pCUepiDQおよびpCUepiQは、指示された遺伝子を含んでいた。
種々のプラスミドは、以下のように分類される特定のクラスの変異体のみを相補しえた。
EMS 5および6−epiA変異体
EMS 18、33および45−epiB変異体
EMS 12、13、19および39−epiC変異体
EMS 11−epiD変異体
以下に示す結果は、少なくともエピデルミンの生合成には4個のORF、epiA、B、CおよびDが必要であることを示している。
【0044】
プラスミドpCUepiAは、唯一の完全なORFとして構造遺伝子epiA、および、さらにその上流に1400bpおよび下流に602bpを有しており、この後者の配列はepiBN末端の190個のアミノ酸をコードしている。pCUepiA1 を用いたトランスホーメーションでエピデルミン変異体EMS5および6の相補性が示され、この事でこれらがepiAの変異体であることが同定された。pCUepiA2 において両方向にクローニングされたより小さいepiA含有Sca1フラグメントは、epi変異体によりepiAプロモーターが切断されたためにepi変異体を相補する事が出来なかった。
pCUepiBは、完全なepiBおよびepiAの3’末端の75bpを含む100bpの上流領域を含むBstN1フラグメントを含んでいる。epiAプロモーターは含んでいない。pCUepiBでのトランスホーメーションでは、いずれのS.エピデルミス(epidermis)変異体のエピデルミン生産も相補しえず、この事は、epiBが自分自身のプロモーターを欠いており、epiAのプロモーターから一緒に転写されているらしいことを示している。
この事は、epiAプロモーターと完全なepiAおよびB遺伝子を含み、かつその使用がepiAおよびepiB変異体の両方を相補するpTepiAB(第26図B、表1)で得られた結果と一致する。
プラスミドpCUepiCDQはepiCおよびepiDの両方を相補できるが、プラスミドpCUepiDQはepiD変異体のみを相補しうる(表1)。この相補性は、クローン化したDNAフラグメントの方向には依存しない。これらの結果は、epiCおよびepiDの両方が自分のプロモーターを有していることを示している。
【0045】
実施例6
epiA変異pTu32誘導体をEMS5および6から単離し、各々のepiAのORFをシーケンシングした。両プラスミドは、epiA内に点突然変異を含んでいた。すなわち、プラスミドEMS5では、コドンAGT(Ser3 )がAAT(Asn3 )に変化しており、プラスミドEMS6では、コドンGGA(Gly10)がGAA(Gln10)に変化していた。これらの変異は、未修正のエピデルミンにおいて重要な部位に位置していた。
【0046】
実施例7
epiB(BstN1フラグメント中)をプラスミドpPS4上のプロモーターのコントロール下に置いた(第27図)。生成したプラスミドpPS4epiBは、epiB変異体EMS18、33および45を相補しえた。逆方向にepiBを含むプラスミドは、これらの変異体を相補しえなかった。この事も、pCUepiBがepiAプロモーターを欠いている為にどのEMS変異体も相補しえないことを示している。
【0047】
実施例8
先に示したように、pTepi4(第26図A)の存在によりS.カルノサス(carnosus)中でエピデルミンの生合成が起こる。しかし、pTepiABCDQで起こらない。S.カルノサス(carnosus)中での異種エピデルミンの発現を誘導するのに必要な最小限のDNAサイズが、末端に存在するDNAによる相補によるS.カルノサス(pTepiABCDQ)の相補により決定された(第28図)。プラスミドpCA44−90、pCA44−91およびpCA44−92によるS.カルノサス(carnosus)(pTepiABCDQ)のトランスホーメーションは、エピデルミンの生産を誘導するが、完全なepiQおよびepiP ORFを含むpCA44−92は、エピデルミンの生産を相補しうる最小のDNAフラグメントを含んでいる。これらの結果は、エピデルミン生合成遺伝子は、6個のORF;epiA、B、C、D、QおよびPを含む8kbのDNAフラグメント内に集まっており、かつ、その他の遺伝子はエピデルミンの生合成に関与していないことを示している。
これらの実施例で使用したスタフィロコッカス(Staphylococcus)のプラスミドDNAは、切断溶解法(マキノ(Makino)等、J.Mol.Biol.190:37−44(1986))により調製した。細胞をリゾスタフィン(8μg/ml)の添加によって溶解し、そのDNAをCsCl遠心により単離した。大腸菌のプラスミドのスーパーコイルDNAは、修正アルカリ溶解法(バーンボイム(Birnboim)等、Nucl.Aced.Res.7:1513−1518(1979))で調製した。
PCR増幅したepiA含有フラグメントおよびS.エピデルミス(epidermis)変異体EMS5および6の2つの変異したepiA領域のDNA配列は、ダイデオキシ法、ファルマシアの“配列”リストおよびアマーシャムの(α−35S)−dATPを用いた二本鎖DNAシーケンシング(マクマスター(McMaster)等、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 74:4835−4839(1977))で決定した。DNAシーケンシングおよびPCR増幅に用いたプライマーは、アプライド・バイオシステムズのDNA合成機を用いて合成した。epiAのPCR増幅に用いた2つのプライマーの配列を以下に示す:
【表3】
a) 5'-GGGTTTTAGG(TA)ATCCTTTTTAATAAATTTTTAGGAG-3'
b) 5'-CCTCAAAATTAAGACG(A)GAT(G)CCTCTATTGAAGCCC-3'
【0048】
プライマーa)は、epiAのRBSの前に結合し、プライマーb)は、epiAの停止コドンの後に結合する。太字で示した塩基は(括弧内に示されている)、epiAの前後にBamHI部位を作るのに使用されることを示している。増幅したDNAフラグメント内にはepiAプロモーターは無い。
変異体EMS5および6内の変異epiAのDNA配列を決定するために、プラスミドpTu32を単離し、そのDNA領域を、推定されるepiAプロモーター領域の上流(5'-GGTTTGGTTATTTTCC-3') および停止コドンの下流(5'-CCTCAAAATTAAGACAGAGCCTC-3') に結合する別のDNAプライマー対を使用したPCRで増幅した。epiAのDNA配列は、シュネル(Schnell)等、Nature(ロンドン)333:276−278(1988)にも示されている。
【0049】
実施例9
プラスミドpTepi14からepiDを単離し、これをPCRで増幅して、“平滑末端”ライゲーションによりベクターpIH902(ニュー・イングランド・バイオラブ)のStuI制限部位にクローニングした。その結果、epiDがベクターpIH902の因子Xa切断部位の隣に、介在塩基対無しに融合され、これを用いて大腸菌をトランスホーメーションした。
この大腸菌の培養により、大腸菌のマルトース結合タンパク質に融合したepiD酵素が発現された。この融合タンパク質をアミロース・カラム充填剤によるアフィニティー・クロマトグラフィーで精製した。
このepiD酵素は、因子Xaにより融合タンパク質から低収率で切断しうることが分かった。切断領域のアミノ酸配列の修正で切断速度を向上しうるであろう。
この融合タンパク質の融合部位からepiDの3’末端までをDNAレベルでシーケンシングした。このepiD配列は、S.エピデルミス(epidermis)の野生型配列に対応していた。プラスミドpCA44は、スタフィロコッカス カルノサス(Staphylococcus carnosus)TM300に入れて、the DSM Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 1b, D-3000 Braunschweig, ドイツに、寄託されている。寄託日は1991年12月23日、寄託番号は6863である。
またプラスミドpPS4もスタフィロコッカス カルノサスTM300に入れて同所に寄託されている。寄託日は1991年12月23日、寄託番号は6864である。
【0050】
以上の説明から、当業者は、容易に本発明の基本的特徴を理解し、かつ、本発明の精神および範囲を逸脱すること無しに、本発明を種々に変化および修正して種々の用途および条件に適用しえるであろう。
【図面の簡単な説明】
【図1】 エピデルミンの構造遺伝子(epiA)のヌクレオチド配列および誘導されるプレ・エピデルミンのアミノ酸配列を示している。サャイン・ダルガルノ配列はボックスで囲み、プロペプチドがプロセシングされる切断部位は矢印で示してある。インバーティド・リピートには下線を付し、潜在的停止コドンにはam(アンバー)およびoc(オーカー)と記した。
【図2】 ハイロン・プログラムを用いたプレ・エピデルミンに関する予測プロットを棒グラフで表したものである:(a) フレキシビリティー、(b) ハイドロパシー、(c) 親水性、(d) ターンの性質、(e) β−シートおよび(f) α−ヘリックス構造。
【図3】 プレ・エピデルミンのヘリックス・ホィール・プロットを表しており、そのN末端が適当な環境下で部分的に両親媒性のα−ヘリックス構造をとっていることを示している。
【図4】 エピデルミンに関して提唱されている成熟過程を示している。翻訳されたポリペプチド(プレ・エピデルミン)は、52アミノ酸残基からなっている。構造予測は、N末端の部分的α−ヘリックスを示しており、そこから残基−30乃至−10が両親媒体性α−ヘリックス構造を形成している。指示されているSerおよびThr残基から水の脱離が起こる(a) 。Thr+14 は例外として、水脱離に続いてスルフィド環の生成(b) およびC末端における脱炭酸(c) および二重結合形成(d) が起こり、プロ・エピデルミンが生産される。その後、このプロ・エピデルミンがタンパク質分解的切断によりプロセシングされ、エピデルミンが生成する。
【図5】 エピデルミンの構造を示している。環構造は、A、B、C、DおよびEと命名した。アミノ酸、メソランチオニンおよびトレオ・メチルランチオニンの構造も示した。
【図6】 ランチオン抗生物質中に存在し、かつ本発明の方法を用いたペプチド生産物中に生成しうる異常アミノ酸の例を示している。
【図7】 プラスミドpCLP100およびpUC18からプラスミドpCUIを調製するための方法を図式で示したものである。
【図8】 実施例2で調製した培養培地単離物の溶出パターンを示している。
【図9】 ガリデルミンを含む標準物質の溶出パターンを示している。ガリデルミンは7.54分に溶出する。
【図10】 S.エピデルミス(epidermis)のプラスミドpTu32のエピソームpTu32の遺伝子解析を示しており、以下のものが含まれる:
A:エピソームpTu32の制限地図。
B:pTu32の13.5kbのBglIIフラグメントの制限地図。黒矢印はepiAの構造遺伝子に対応している。白矢印はシーディング・フレームepiB、C、D、PおよびQを示している。
C:epiAに特異的な15マー・オリゴヌクレオチド(5'cacatccaggagtac 3') を用いた、種々の制限酵素(EcoRI、EcoRV、BglII、SphI)で消化したpTu32のサザン・ハイブダイゼーション。
【図11】 リーディング・フレーム、epiA、B、C、D、P、Q、Y’およびY”を含むpTu32のBglII/HpaIIフラグメントのヌクレオチド配列および誘導される各タンパク質のアミノ酸配列である。S/D配列およびターミネーション構造には上線を付した。IRは、インバーティド・リピートを示している。epiY、epiA、epiB、epiC、epiD、epiQ、およびepiPのオープン・リーディング・フレームの開始は、太字で示してある。N末端アミノ酸残基(翻訳開始部位)は、ボックスで囲んである。図11は、1〜8700のヌクレオチド配列の1〜900までを示す。
【図12】 図11に続くヌクレオチド配列901〜1900を示す。
【図13】 図12に続くヌクレオチド配列1901〜2800を示す。
【図14】 図13に続くヌクレオチド配列2801〜3800を示す。
【図15】 図14に続くヌクレオチド配列3801〜4700を示す。
【図16】 図15に続くヌクレオチド配列4701〜5700を示す。
【図17】 図16に続くヌクレオチド配列5701〜6600を示す。
【図18】 図17に続くヌクレオチド配列6601〜7600を示す。
【図19】 図18に続くヌクレオチド配列7601〜8700を示す。
【図20】 S.エピデルミス(epidermis)におけるepiA(10A)およびepiB(10B)の発現のノーザン・ブロット・ハイブリダイゼーションの結果を示しており、これは、1.2%アガロースゲルによる全RNA(40μg、レーン1、3および5、または20μg、2、4および6)の分離およびアンチセンスRNAプローブによるハイブリダゼーション(SP6転写物、ストリンジェンシーを上げながらフィルターを洗浄した。レーン1、2:1×SSC、0.1%SDS、露光時間4時間;レーン3、4:0.5×SSC、0.1%SDS、露光時間16時間;レーン5、6:0.1×SSC、0.1%SDS、露光時間3日)を行ったものである。サイズ標準物質として23Sおよび16S RNAを使用している。
【図21】 EpiPと種々のセリンプロテアーゼ(SUBSI、枯草菌(Bacillus subtilis)のズブチリシンI168前駆体(テルザジ(Terzaghi)等、Appl.Microbiol.29:807−813(1975);枯草菌(Bacillus subtilis)の主要細胞内セリンプロテアーゼ(マニアチス(Maniatis)等、MolecularCloning,A Laboratory Mannual,第2編、コールドスプリングハーバーラボラトリーズ(1980);SUMYTV、サーモアクチモミセス バルガリス(Thermoactinomyces vulgaris)のサーミテース(ストール(Stahl)等、J.Bacteriol.158:411−418(1984))の活性部位に関する配列のホモロジーを示している。保存性の高いスパラギン(asp)、ヒスチジン(his)およびセリン(ser)残基にはアステリスクを付した。同様のアミノ酸残基は点で示し、また同一のアミノ酸残基はコロンで示した。
【図22】 EpiQとPhoB(マキノ(Makino)等、J.Mol.Biol.190:37−44(1986))。同様のアミノ酸残基は点で示し、また同一のアミノ酸残基はコロンで示した。
【図23】 S.カルノサス(carnosus)で生産されたエピデルミンのHPLCの溶出プロフィールを示している。
A:エピデルミン標準物質の溶出プロフィール(6.75分、矢印で示した)。
B:S.エルノサス(carnosus)TM300 pTepi14の培養濾液から単離したエピデルミン標準物質の溶出プロフィール(6.75分、矢印で示した)。培養液をXAD1180に吸着し、メタノールで溶出後、最後にエバポレーションで濃縮した。
C:19Bと同様に処理した非トランスホームS.エルノサス(carnosus)TM300の培養濾液溶出プロフィール。太線は、エピデルミンの溶出領域を示している。
【図24】 pT181mcsの構築を示している。pT181のプレ内にある単一のNdeI部位に、平滑末端ライゲーションによりpUC19のPvuII309 −PvuII631 フラグメント、lacZの一部およびマルチクローニング部位(mcs)を挿入した(ゲナロ(Gennaro)等、J.Bacteriol.169:2601−2610(1987);カーン(Kahn)等、Pasmid 10:251−259(1983))。lacZは、プレに対して逆を向いている。黒棒はプレの切断を示しており、白棒はpUC19フラグメントの挿入を示している。
【図25】 pCU1の構築を示している。PCLP100は、単一のPstI部位を含むpC194(ホリノウチ(Horinouchi)等、J.Bacteriol.150:815−825(1982))の誘導体であって、HindIII 部位におけるpC194の開環、Bal31による末端の削除(約950bp)および平滑末端ライゲーションによるPstIリンカーの挿入により生成する。pUC1は、各々単一のPstIとNdeI部位によるpCPL100とpUC19との平滑末端ライゲーションで生成する(ビエイラ(Vieira)等、Gene 19:259−268(1982))。lacZの前にあるマルチクローニング部位(mcs)は、種々のepi遺伝子含有フラグメントのクローニングに使用した。このシャトルベクターは、スタフィロコッカス(Staphylococcus)および大腸菌の両方で複製する。
【図26】 下記の事項を示している。
A)pT181mcsにおけるpTu32の14kbのBglIIフラグメントのクローニングによるpTepi14の生成。このフラグメントには、S.カルノサス(carnosus)におけるエピデルミンの生産に必要な全遺伝子情報を含まれている。指示されているORFおよびその転写方向(矢印で示されている)は、このDNA配列に基づくものである。構造遺伝子epiAは、黒矢印で表されている。
B)pT181mcs(pT...)またはpCU1(pCU...)にサブクローニングされた種々のpTepi14フラグメント。各プラスミドは、S.エピデルミス(epidermis)Epi変異体の相補に使用した。プラスミド中に存在する完全なORFが示されている。
【図27】 pPSepiAおpPS4epiBの構築を示している。pPS4は、pLipPS1の誘導体である(リーブル(Liebl)等、Mol.Gen.Genet.204:166−173(1986))。強力なスタフィロコッカス(Staphylococcus)プロモーターの後ろに単一のBamHI部位が挿入された。通常、ORF2プロモーターのコントロール下のBamHI部位に遺伝子をクローニングすると、スタフィロコッカス(Staphylococcus)での発現が高くなる。epiAをPCR増幅してみると、BamHI部位に隣接して含まれていた。epiBを含む3.2kbのBstNIフラグメントを平滑末端ライゲーションによりBamHI部位に挿入した。各EMS変異体は、epiAおよびepiBがORF2プロモーターのコントロール下にあるときのみ相補された。lip,リパーゼ遺伝子;cat、クロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼ遺伝子;ORF2、S.カルノサス(carnosus)特異的短縮型ORF。
【図28】 隣接するDNAフラグメントによるS.カルノサス(carnosus)(pTepiABCDQ)におけるエピデルミン生産の相補性を示している。フラグメントは、適合するプラスミドpCA44にサブクローニングした。
Claims (5)
- Epi A 、 Epi B 、 Epi C 、 Epi D 、 Epi P および Epi Q と命名するタンパク質を同一分子上にコードする組換え DNA 分子であって、
前記 Epi A と命名するタンパク質が下記のアミノ酸配列からなり:
MEAVKEKNDLFNLDVKVNAKESNDSGAE
PRIASKFICTPGCAKTGSFNSYCC、
前記 Epi B と命名するタンパク質が下記のアミノ酸配列からなり:
LDNIFVPSNIYMVRTPIFSIELYNQFLKSDNIDYDLILQNDIFKESIMTTTYNLYQSIGK
IDWEKDNKKTRNVKESLLKYLIRMSTRSTPYGMLSGVALGEFSENNNIKIKDSSFHKKDV
KIDGQWLYKLVHYLESDYTYYKDSFVIWNQQNYIYNNRLYLDNNSSITENKRNDVLSVKY
NSILVFIHENSKKNITYEELVQLISSKYSIENKEEVKVFVQELINKEIIFSDLRPTLENK
NPLDYIINSLNPKNSLVGTLINISNEITKYSKMPLGKGEYKYLDIVNLMSQLFVSKNYLQ
IDTYIDYSRNELKQSLADNISEAAYILWLLSPNHFGTKTIRNYHEFFMDKYGFEQLVNLK
QLLSDINGFGYPKKDSYSFSNNIAFLKEKYLLAIQNNSHIEITENDVKNLEKNNTVSKIN
APVSTEIYSEIYFGNSIKGYEDFAVISPILGSFNAGATFGRFTGNFNIKKKNQLQKEIVH
HYNNYMNENGLEISQLNEGPLNSRNVNLNNNRIYNTCLNLNLPKSDIDINDIFIGATFNK
LYLYSEKHDSRIVFVSNSMFNYEFGSELYKFLREISFEKTKFIQPITEEGIDSLPFCPRI
IYKNIILKPATWKINSEMFSETENWLNRFATIREKWHIPKDVIIAFGDNRLLLNLLNDKH
LIILKKELKKHGRIRILESFINESNNERMLEIVTPLYKKTSLKEQSFIIPKNRNKHFNNL
KDWFSIHLSIPKTYQDNFIQDYLLPFITELKVNNFINKFFYIKFKEDEDFIKLRLLREDE
DYSQIYSFIKNWKDYCLLNSELYDYSIVDYVPEVYRYGGPHVIEDIENFFMYDSLLSINI
IQSEFKIPKEFIVAISIDFLLDYLEINKSEKEEILINNAEDLYRSNDIREYKNLLAKLTN
PKNDYEILKKEFPNLHEFLFNKISILENLKKTLQKSLYTSRSRIIGSFIHMRCNRIFGIN
PEKEKFVLSIFNEITKTKKYWDGCD、
前記 Epi C と命名するタンパク質が下記のアミノ酸配列からなり:
LAVLYTCVVIEYSVLILKKKNLFYLFLMKLQKLKNIGMVVININNIKKILENKITFLSDI
EKATYIIENQSEYWDPYTLSHGYPGIILFLSASEKVFHKDLEKVIHQYIRKLGPYLESGI
DGFSLFSGLSGIGFALDIASDKQYSYQSILEQIDNLLVQYVFDFLNNDALEVTPTNYDII
QGFSGIGRYLLNRISYNYNAKKALKHILNYFKTIHYSKDNWLVSNEHQFLDIDKQNFPSG
NINLGLAHGILGPLSLTALSKMNGIEIEGHEEFLQDFTSFLLKPEFKNNNEWFDRYDILE
NYIPNYSVRNGWCYGDTGIMNTLLLSGKALNNEGLIKMSKNILINIIDKNNDDLISPTFC
HGLASHLTIIHQANKFFNLSQVSTYIDTIVRKIISHYSEESSFMFQDIEYSYGQKIYKNK
VGILEGELGVLLALLDYIDTQNQSRKNWKNMFLIT、
前記 Epi D と命名するタンパク質が下記のアミノ酸配列からなり:
MYGKLLICATASINVININHYIVELKQHFDEVNILFSPSSKNFINTDVLKLFCDNLYDEI
KDPLLNHINIVENHEYILVLPASANTINKIANGICDNLLTTVCLTGYQKLFIFPNMNIRM
WGNPFLQKNIDLLKNNDVKVYSPDMNKSFEISSGRYKNNITMPNIENVLNFVLNNEKRPL
D、
前記 Epi P と命名するタンパク質が下記のアミノ酸配列からなり:
MNKFKFFIVFLILSLVFLQNEYAFGSSLNEELSYYSVEYDNAKTFKESIKQKNIELTYKI
PELHTAQIKTSKSKLNSLIKSNKNVKFVNPTCSTCVVEKSVKTGKNLNNKKNGSHDLFDR
QWDMRKITNEGKSYKLSPDRKKAKVALVDSGVNSSHTDLKSINKIVNEVPKNGFRGSEND
ESGNKNFEEDKLNHGTLVAGQIGANGNLKGVNPGVEMNVYRVFGSKKSEMLWVSKGIIDA
ANDDNDVINVSLGNYLIKDNQNKKKLRDDEKVDYDALQKAINYAQKKGSIVVAAVGNDGI
NVKKVKEINKKRNLNSKTSKKVYDSPANLNNVMTVGSIDDNDYISEFSNYGNNFIDLMTI
GGSYKLLDKYGKDAWLEKGYMQKQSVLSTSSNGRYIYQSGTSLAAPKVSGALALEIDKYQ
LKDQPETAIELFKKKGIEKEKYMDKKHYGNGKLDVYKLLKE、
前記 Epi Q と命名するタンパク質が下記のアミノ酸配列からなる:
MISINIVGEVDSILIESILELDRRITINSSNIDPNFIIVYEKFDEYYTFLKEFIGKIPIV
IITGNTSYSRKCYFYSLGIDLYIIKNNESKSLILCRILNEIKKYIKYVNDDFIDFENHQF
VFNNYLVNLSNIELKILRCLYINLGRYVSKEELKKGVWDTEDFVDSNTINVYIHRLRDSL
KNCKEIEIINERKLGYKILIRKDLC、
前記 DNA 分子。 - 下記のヌクレオチド配列を含む、請求項1記載の組換え DNA 分子:
AGATCTTGTG TTATATAACT AAACAAATTT CTCCATTCGT ATTTAGAAAA TTGACTTTTA
TCAAGTTTAT CCAAATATAT ATTTCCAGTA TATTCTGTAT TTAACCCAGC TAATATATTT
AATAATGTAC TTTTTCCACA CCCACTTTCA CCTATAATAT TGTAGATATA ACCTTTATGA
AGATCCAAAC TTATAGAATT TATTATTTGT TTATTGTCTT TTGTGAAGTT CAAATCATTT
ATTTCCATTT TTTGAACAAA GTTATTGTAA GTTGTTTTAA TAGTTAATAC CTCTTCTGGT
TCTTTATTTA TTTTTAAAAT TCTATCTGAA GATCCAATTG CTCGTTGTAC TTCCGTCCAA
TAAGATGTAA TAGATACTAT TGGATTAATA ATTTGAAATA AATATAAAAC ATAAGCAAAC
ATATCTCCGC TTTTCATCAT ATTATTTTCC ATTAAGTAAT AACCCAAAAA TAAAATACCA
AAAATGTTAA TAAATAGAAT TAAGTTCATA ATTGGTTCGA AAAAAGATAA TACTTTGATC
TTATGTAACT CTATATCGAA TATATTTTTT AATAGGGTAT AGTTTTTTAT TTTTTCGATA
TTATATGTAC TTAAAGTTTT TATTAATTTT ATTGTAGATA ATCTATTACT ATAATAAGAA
GATAATTTAG CAGTAGCTTC TTGAGATTTA CTTGATACTC TTTTCATTAT ATTTCCTATA
GGTAGTATTA CAATTATCAA TATAGGTAAT GTACACACTA AATATAATGT CAAGGTTTTG
TTAATTATAT ATAAAAATAT TAGTGATACT ATAACTGAAA ATAAATTCTA CAGAAAAAAC
TCTAGTTATG TTCATAGTAT CGTTTACTAA CCTACTAGTT AAGTTACTTG CTGAGTTTTT
TAAGTGAAAA CTATAAGGTA ACTTTATCAC TTTATTCCAT GTAACACTTC TAATGTTTTG
TATTATTTTT TGACCTATAT ATCCAAGAAT ATAAGTAGAA ACACCAGAAA ATATTAAAGT
CAGACCAAAA CATATAATAA TGATTACAAT TTTATCTGTT GATAAGCTAG ATTTGTTTAA
GGCATTTCTA ATTATTAAAG GAATGTATAA TGAAAAACTA GTTCCAATCA AACTAAATAT
TAGTCCAATA CTTAAAAGTA GAGTGTTAGG TTTGGTTATT TTCCATAAAT CATATAGACC
TTTGATAATA TCATCACCTT TTAAACTTTA TATCATTAAT ATAATGTTTA GGAAAAGTAG
AAGAAAATTA CACTTTTGTA ATTTTCTGAA TATACATAGT ATTTATTTTG GGGGAGTACT
AAAATAATAA TTGAAAAGGG TTTTATAATC CTTTTTAATA AATTTTTAGG AGTGTTTAAA
ATGGAAGCAG TAAAAGAAAA AAATGATCTT TTTAATCTTG ATGTTAAAGT TAATGCAAAA
GAATCTAACG ATTCAGGAGC TGAACCAAGA ATTGCTAGTA AATTTATATG TACTCCTGGA
TGTGCAAAAA CAGGTAGTTT TAACAGTTAT TGTTGTTAAT TCAGAAGAAT TAGATTGGCA
GGGCTTCAAT AGAGGCTCTG TCTTAATTTT GAGGTGAAAT AGAATTGGAT AATATATTTG
TTCCATCGAA TATATATATG GTAAGAACTC CTATATTTTC AATTGAATTA TATAATCAAT
TCTTAAAATC TGACAATATA GATTATGACT TAATTTTACA AAACGATATT TTTAAAGAAT
CTATAATGAC AACGACATAT AATCTTTATC AAAGTATTGG CAAAATAGAC TGGGAAAAGG
ATAATAAAAA AACCAGAAAT GTAAAAGAAA GTTTATTAAA ATATCTCATA AGAATGAGTA
CTAGAAGTAC ACCATATGGA ATGCTAAGCG GTGTAGCTTT AGGGGAATTT AGTGAAAATA
ATAATATTAA AATTAAGGAC TCTTCGTTTC ATAAAAAAGA TGTAAAAATA GATGGGCAAT
GGTTATATAA ATTAGTCCAT TATTTAGAAA GCGATTACAC ATATTATAAA GACAGTTTTG
TCATATGGAA TCAACAAAAT TATATTTATA ACAATCGTTT ATATTTAGAT AATAATTCAT
CAATCACTGA AAATAAAAGA AATGATGTAT TATCTGTCAA ATACAATTCT ATATTAGTGT
TTATACATGA GAATTCTAAA AAAAATATTA CTTATGAAGA ACTTGTACAA TTGATATCTA
GTAAGTACAG TATAGAAAAT AAAGAAGAAG TAAAAGTATT TGTTCAAGAA CTCATAAATA
AAGAAATTAT ATTTTCTGAT TTGAGACCTA CATTAGAGAA TAAAAATCCT TTAGATTACA
TTATTAATAG TTTAAATCCA AAAAATAGTT TAGTTGGAAC ACTTATTAAT ATTTCTAATG
AAATTACAAA ATATTCTAAA ATGCCTTTAG GAAAAGGAGA ATATAAATAT TTAGATATTG
TTAATTTAAT GTCACAATTA TTTGTTTCTA AAAACTATTT GCAAATAGAT ACCTATATAG
ATTATTCAAG AAATGAATTA AAACAAAGTT TAGCTGATAA TATTAGTGAA GCAGCATATA
TTCTCTGGTT ATTATCTCCT AATCATTTTG GTACAAAAAC TATTAGGAAT TATCACGAAT
TTTTTATGGA TAAATATGGA TTTGAACAAC TAGTAAATTT AAAGCAATTG CTCTCAGATA
TAAATGGATT TGGCTATCCC AAAAAAGACA GTTATAGTTT TTCTAATAAC ATTGCATTTT
TAAAAGAAAA GTATTTGCTT GCAATTCAAA ATAACAGCCA TATTGAAATA ACAGAAAACG
ACGTTAAAAA TTTAGAAAAG AATAATACAG TTTCTAAAAT CAATGCGCCT GTTTCAACTG
AAATATATAG TGAGATATAT TTTGGAAATT CAATAAAAGG TTATGAGGAT TTTGCCGTGA
TAAGTCCAAT ATTAGGATCT TTTAATGCCG GTGCAACTTT TGGAAGGTTT ACGGGAAATT
TCAATATAAA GAAAAAAAAT CAATTACAAA AAGAAATAGT GCATCATTAC AATAATTACA
TGAATGAAAA TGGTTTAGAA ATAAGCCAAT TAAATGAAGG TCCTCTTAAC TCAAGAAATG
TAAATATTTT GAATAATAAT AGAATATATA ATACTTGTTT AAATTTAAAT TTACCTAAAA
GTGATATAGA TATAAATGAC ATATTTATTG GAGCTACATT TAACAAACTT TATCTATATT
CTGAAAAACA TGATTCAAGA ATTGTATTCG TATCTAATTC AATGTTTAAT TATGAGTTTG
GATCTGAATT ATACAAATTT TTAAGAGAAA TTTCATTTGA AAAAACAAAA TTTATACAAC
CTATAACTGA AGAAGGCATT GACTCATTAC CTTTTTGTCC AAGAATTATT TATAAAAATA
TTATTTTAAA ACCAGCTACT TGGAAAATAA ATTCAGAAAT GTTTTCTGAA ACTGAAAATT
GGTTAAATAG GTTCGCAACT ATTAGAGAAA AATGGCATAT TCCAAAAGAT GTAATTATTG
CTTTTGGAGA TAATCGATTG CTATTAAATT TATTAAATGA CAAGCATCTC ATTATACTAA
AAAAAGAACT AAAAAAACAT GGTAGGATTC GAATATTAGA AAGCTTTATC AATGAATCTA
ATAATGAGAG AATGTTAGAA ATTGTTACGC CATTATATAA AAAAACTAGT TTAAAAGAAC
AATCTTTCAT TATACCTAAA AATAGAAATA AGCACTTCAA TAATCTTAAA GATTGGTTTT
CAATTCATTT AAGTATTCCT AAAACATACC AAGATAATTT TATTCAAGAT TATCTATTAC
CATTTATAAC GGAATTAAAA GTTAATAATT TTATTAATAA ATTTTTTTAC ATAAAATTTA
AAGAAGATGA AGATTTTATA AAATTAAGAT TATTAAGAGA AGATGAAGAT TATTCTCAAA
TTTATTCTTT CATAAAAAAT TGGAAAGATT ATTGCTTATT AAATAGTGAA TTATATGACT
ATTCTATAGT TGATTATGTT CCTGAAGTAT ATAGATATGG TGGTCCACAC GTAATTGAAG
ATATTGAGAA TTTTTTTATG TATGATAGTC TATTATCAAT AAATATAATA CAATCAGAGT
TCAAAATTCC AAAAGAATTT ATCGTTGCTA TATCAATAGA TTTTTTATTA GATTATTTAG
AAATTAATAA AAGTGAGAAA GAAGAAATTT TAATTAATAA TGCGGAAGAT TTATATCGTA
GTAATGACAT AAGAGAATAT AAAAATTTAT TAGCTAAACT TACCAATCCT AAAAATGACT
ATGAAATTTT AAAAAAAGAA TTTCCGAATC TTCATGAATT TCTATTTAAT AAAATTAGTA
TTTTAGAAAA TCTTAAAAAG ACACTACAAA AAAGCTTATA TACTTCACGT TCTAGGATAA
TTGGCAGTTT TATACACATG CGTTGTAATA GAATATTCGG TATTAATCCT GAAAAAGAAA
AATTTGTTTT ATCTATTTTT AATGAAATTA CAAAAACTAA AAAATATTGG GATGGTTGTG
ATTAATATTA ATAACATTAA AAAAATTTTA GAAAATAAAA TCACCTTTTT GTCTGACATT
GAAAAAGCTA CATATATTAT AGAAAATCAA AGTGAGTATT GGGATCCTTA TACTCTATCT
CATGGTTATC CAGGTATAAT ACTTTTTTTA AGCGCATCAG AAAAAGTATT TCATAAAGAT
TTAGAAAAAG TAATACATCA ATATATTAGA AAACTAGGCC CTTATTTAGA AAGTGGTATT
GATGGATTTT CACTTTTTAG TGGTCTTTCC GGAATTGGAT TTGCGCTAGA CATTGCGTCT
GATAAACAGT ACTCTTATCA AAGTATCTTA GAACAAATTG ATAATTTACT TGTTCAATAT
GTTTTTGATT TTTTAAATAA CGATGCATTG GAAGTAACCC CTACTAACTA TGATATAATA
CAAGGATTTT CTGGTATAGG AAGGTACTTG TTAAATAGAA TATCGTATAA TTATAATGCA
AAAAAAGCAT TAAAGCATAT ACTTAATTAC TTCAAAACAA TTCATTACTC TAAAGACAAT
TGGTTAGTTT CAAATGAACA TCAATTTTTA GATATAGATA AGCAAAATTT TCCGTCAGGA
AATATAAATT TAGGATTAGC GCATGGTATT TTAGGTCCTC TATCATTAAC AGCTTTGAGT
AAAATGAATG GGATTGAAAT CGAAGGCCAT GAAGAGTTTT TACAAGACTT CACTTCATTT
TTGCTCAAAC CTGAATTCAA AAATAATAAT GAATGGTTCG ATCGCTATGA TATATTAGAA
AATTATATAC CTAATTATTC CGTCAGAAAC GGTTGGTGTT ACGGTGATAC AGGGATTATG
AATACATTAC TTTTGTCTGG TAAAGCCTTA AATAATGAAG GCTTAATTAA AATGTCTAAA
AATATTTTAA TTAACATAAT AGATAAGAAT AATGATGATT TAATCAGTCC AACCTTCTGT
CACGGACTAG CATCGCACTT AACCATTATT CATCAAGCGA ATAAATTCTT TAATCTATCT
CAAGTAAGCA CATATATCGA TACCATTGTC AGAAAAATTA TTAGTCATTA TTCTGAAGAA
AGTAGTTTTA TGTTCCAAGA CATAGAGTAC TCATACGGAC AAAAAATTTA TAAAAACAAA
GTGGGAATTC TAGAGGGTGA ATTAGGTGTT CTTTTAGCTT TACTAGATTA TATTGATACA
CAAAACCAAT CAAGGAAAAA TTGGAAAAAT ATGTTTTTAA TAACATAATA GGAGGAATAA
GATATGTATG GAAAATTATT GATATGCGCT ACAGCATCGA TAAATGTAAT TAATATTAAT
CACTACATAG TTGAGTTAAA GCAACATTTT GATGAAGTTA ATATATTATT TAGTCCTAGT
AGTAAAAATT TTATAAATAC TGATGTTCTC AAGTTATTTT GTGATAACTT GTACGATGAA
ATTAAAGATC CTCTTTTAAA TCATATCAAT ATTGTAGAAA ATCATGAATA TATTTTAGTA
TTACCTGCAT CAGCAAATAC TATTAATAAA ATAGCTAATG GTATATGTGA TAATCTTTTA
ACTACTGTAT GTTTAACCGG ATATCAAAAA TTATTTATAT TTCCAAATAT GAACATAAGA
ATGTGGGGAA ATCCATTTTT ACAAAAAAAT ATTGATTTAC TTAAAAATAA TGATGTGAAA
GTGTATTCCC CTGATATGAA TAAATCATTC GAAATATCTA GTGGCCGTTA CAAAAACAAT
ATCACAATGC CTAATATTGA AAATGTACTA AATTTTGTAT TAAATAACGA AAAAAGACCT
TTGGATTAAC AAAGGTCTTT TCTAATTAAA ATTTTATATC CGAGTTTACG TTCATTAATA
ATTTCTATCT CTTTACAATT TTTTAAACTA TCCCTTAATC GATGGATATA TACATTTATT
GTATTAGAAT CAACAAAGTC TTCTGTATCC CACACTCCCT TTTTTAATTC CTCTTTTGAT
ACATATCTTC CAAGATTAAT ATATAAGCAC CGTAGAATTT TTAATTCTAT ATTAGAAAGA
TTAACTAAGT AATTATTAAA CACAAATTGA TGGTTTTCAA AGTCTATAAA ATCATCATTA
ACATATTTAA TATACTTTTT TATTTCATTT AAAATTCTAC ATAATATTAA ACTTTTGCTT
TCATTATTTT TTATAATATA TAAATCTATG CCTAAACTAT AAAAATAACA CTTCCTACTA
TAGCTAGTAT TACCTGTTAT TATAACTATT GGAATTTTTC CTATAAATTC TTTTAAAAAC
GTATAATACT CATCAAACTT TTCATACACA ATTATAAAAT TTGGGTCTAT ATTTGAAGAA
TTAATTGTAA TTCTTCTATC TAATTCTAAA ATACTTTCAA TAAGAATAGA ATCTACCTCA
CCGACAATAT TAATAGAAAT CATTTTATTC CCTTCATTCT TTAAGTAATT TGTATACGTC
TAGTTTTCCA TTACCATAAT GTTTTTTATC CATATATTTT TCTTTTTCTA TCCCTTTTTT
CTTAAATAAC TCTATAGCTG TTTCGGGTTG GTCTTTTAAT TGATACTTAT CAATTTCTAG
TGCTAAAGCT CCAGAAACCT TGGGTGCAGC AAGTGATGTC CCTGATTGAT ATATGTATCT
TCCATTAGAA GAAGTACTTA AAACACTTTG TTTTTGCATA TATCCTTTTT CTAACCAAGC
ATCTTTTCCA TACTTATCTA AAAGTTTATA AGAACCTCCT ATCGTCATTA AATCTATAAA
ATTATTTCCA TAATTAGAAA ACTCAGAAAT ATAATCATTA TCATCGATGG ATCCTACAGT
CATAACATTA TTTAGATTTG CTGGGCTATC ATATACCTTT TTTGATGTTT TAGAATTTAG
ATTTCTTTTT TTATTTATTT CTTTTACTTT TTTTACATTG ATACCGTCAT TACCCACAGC
TGCAACAACA ATACTACCTT TTTTTTGAGC ATAGTTTATA GCTTTCTGTA GTGCATCGTA
ATCAACTTTT TCATCATCTC TTAATTTTTT TTTATTTTGA TTATCTTTAA TTAAATAATT
TCCTAAACTA ACGTTGATTA CATCATTGTC ATCATTTGCT GCATCAATAA TTCCTTTAGA
TACCCAAAGC ATTTCACTTT TCTTTGAGCC AAATACTCGG TATACATTCA TCTCTACTCC
AGGGTTTACA CCTTTTAAAT TACCGTTTGC TCCTATTTGT CCTGCTACTA ATGTACCATG
ATTCAATTTA TCTTCTTCAA AATTTTTATT TCCTGATTCA TCGTTTTCGC TACCTCTAAA
ACCATTTTTA GGCACTTCAT TAACTATCTT ATTTATACTC TTTAAATCTG TATGACTACT
ATTCACACCA GAATCTACTA AAGCAACTTT TGCTTTTTTT CTATCTGGAC TTAGCTTATA
ACTTTTACCT TCATTTGTTA TTTTTCGCAT ATCCCATTGT CTGTCAAATA AATCATGGCT
GCCATTTTTT TTATTATTTA AATTTTTTCC TGTCTTTACA GATTTTTCAA CTACACAAGT
GGAACAGGTA GGATTTACAA ACTTGACGTT TTTATTACTC TTTATTAGTG AATTTAATTT
TGATTTGCTA GTTTTAATTT GTGCTGTATG TAGTTCAGGA ATTTTATAAG TTAACTCGAT
ATTTTTTTGT TTAATGGATT CTTTAAAAGT TTTTGCATTA TCATATTCAA CACTATAATA
ACTTAATTCT TCATTTAGTG AACTTCCAAA AGCATACTCA TTTTGCAAAA AAACTAATGA
CAATATTAAA AAAACAATGA AAAATTTAAA TTTGTTCATA TAGCACCTCT AACATATTAT
TTATATTAAA CATTAATTTA ACACTTATGT TTTTACTTTT TTATTTATAT TATCTTTAAT
AATGTTCTGT TGCAAGATGA AAAATACGAG GTATCAAAGT ACCGATACAG CGAGTATTAC
ACTCAATTAA TTAAAAATAA AATATGTTGT GATTAAAATT TATTTTATAA AAGTATGGGC
AATTTATTAT TATTCAAGTT AAAACAAAGA GTCCGGGACA TAAAGTTTCA GCCTCTTCGT
CCTAATTACC AAAAAACTTA CTCCAAAATC CTTTTTTAGA TTGGTTTTTT CTAATTTTTT。 - 請求項1または2記載の組換え DNA 分子を含むプラスミド。
- 請求項3記載のプラスミドで形質転換された宿主細胞。
- S. カルノサスである、請求項4記載の宿主細胞。
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