JP2611206B2 - 遺伝子およびその利用方法 - Google Patents
遺伝子およびその利用方法Info
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- dna
- plasmid
- polypeptide
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- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
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- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
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- C12N9/52—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from bacteria or Archaea
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- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
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- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
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- C12N15/625—DNA sequences coding for fusion proteins containing a sequence coding for a signal sequence
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Description
【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、医薬品等として有用なセラペプターゼ（Se
rrapeptase,国際一般的名称）またはセラペプターゼ様
抗炎症作用を有用するポリペプチドをコードするDNAお
よびその利用方法に関する。
rrapeptase,国際一般的名称）またはセラペプターゼ様
抗炎症作用を有用するポリペプチドをコードするDNAお
よびその利用方法に関する。
従来の技術 抗炎症剤などの医薬として有用なセラペプターゼの製
造法としては、たとえばセラチア属菌の培養による方法
が挙げられる（特公昭41−10193号公報，米国特許第3,6
91,014号公報参照）。しかしセラペプターゼ遺伝子のク
ローニングは未だなされていないため、遺伝子光学技術
によるセラペプターゼの生産は、実施されていない。
造法としては、たとえばセラチア属菌の培養による方法
が挙げられる（特公昭41−10193号公報，米国特許第3,6
91,014号公報参照）。しかしセラペプターゼ遺伝子のク
ローニングは未だなされていないため、遺伝子光学技術
によるセラペプターゼの生産は、実施されていない。
発明が解決しようとする問題点 セラチア属菌の培養によりセラペプターゼを生産する
場合、遺伝子増巾によって、セラペプターゼの生産量を
より増大させることが期待される。また、セラチア属菌
によってセラペプターゼと同時に産生されるDNaseなど
の蛋白質の産生を減少させることにより、セラペプター
ゼの精製が簡略化され得ることが予想される。
場合、遺伝子増巾によって、セラペプターゼの生産量を
より増大させることが期待される。また、セラチア属菌
によってセラペプターゼと同時に産生されるDNaseなど
の蛋白質の産生を減少させることにより、セラペプター
ゼの精製が簡略化され得ることが予想される。
問題点を解決するための手段 本発明者らは、セラペプターゼを産生するセラチア属
菌の染色体DNAからセラペプターゼ遺伝子を含むDNA領域
をクローニングし、このクローン化したDNAを含むプラ
スミドで形質転換体を製造すると、該形質転換体は、著
量のセラペプターゼを産生すること、さらにセラペプタ
ーゼ様抗炎症作用を有するポリペプチドを産生すること
を見出した。
菌の染色体DNAからセラペプターゼ遺伝子を含むDNA領域
をクローニングし、このクローン化したDNAを含むプラ
スミドで形質転換体を製造すると、該形質転換体は、著
量のセラペプターゼを産生すること、さらにセラペプタ
ーゼ様抗炎症作用を有するポリペプチドを産生すること
を見出した。
本発明者らは、これらの知見に基づいてさらに研究し
た結果本発明を完成した。
た結果本発明を完成した。
本発明は、セラペプターゼポリペプチドまたはセラペ
プターゼ様抗炎症作用を有するポリペプチドをコードす
るDNA,該DNAが組み込まれたプラスミド，および該プラ
スミドで形質転換された形質転換体を提供するものであ
る。
プターゼ様抗炎症作用を有するポリペプチドをコードす
るDNA,該DNAが組み込まれたプラスミド，および該プラ
スミドで形質転換された形質転換体を提供するものであ
る。
上記セラペプターゼポリペプチドまたはセラペプター
ゼ様抗炎症作用を有するポリペプチドをコードするDNA
としては、そのＮ末端にMetを有していてもよい第３図
の第（１）番目から第（470）番目のアミノ酸配列「VI
I」を有するポリペプチドをコードするDNAや、第３図の
第（−33）番目から第（470）番目のアミノ酸配列「V
I」で表わされるポリペプチドをコードするDNAなどが例
示される。
ゼ様抗炎症作用を有するポリペプチドをコードするDNA
としては、そのＮ末端にMetを有していてもよい第３図
の第（１）番目から第（470）番目のアミノ酸配列「VI
I」を有するポリペプチドをコードするDNAや、第３図の
第（−33）番目から第（470）番目のアミノ酸配列「V
I」で表わされるポリペプチドをコードするDNAなどが例
示される。
またその５′末端にATGを、３′末端にTAA,TAGおよび
TGAのコドンのうち一つまたはこれらの二つの連続した
ものを有する第３図の第731番目から第2236番目で表わ
される塩基配列［III］を含有するDNA, その５′末端にATGもしくは水素原子を、３′末端にT
AA,TAGおよびTGAのコドンのうちの一つまたはこれらの
二つの連続したものを有する第３図の第827番目から第2
236番目で表わされる塩基配列［IV］であるDNA,および 第３図の第１番目から第2570番目で表わされる塩基配
列［Ｖ］またはその部分配列を含有するDNAなどが挙げ
られる。
TGAのコドンのうち一つまたはこれらの二つの連続した
ものを有する第３図の第731番目から第2236番目で表わ
される塩基配列［III］を含有するDNA, その５′末端にATGもしくは水素原子を、３′末端にT
AA,TAGおよびTGAのコドンのうちの一つまたはこれらの
二つの連続したものを有する第３図の第827番目から第2
236番目で表わされる塩基配列［IV］であるDNA,および 第３図の第１番目から第2570番目で表わされる塩基配
列［Ｖ］またはその部分配列を含有するDNAなどが挙げ
られる。
なお、本明細書においては、セラペプターゼポリペプ
チドまたはセラペプターゼ様抗炎症作用を有するポリペ
プチドを「セラペプターゼ類」と称することもある。
チドまたはセラペプターゼ様抗炎症作用を有するポリペ
プチドを「セラペプターゼ類」と称することもある。
また、セラペプターゼポリペプチドまたはセラペプタ
ーゼ様抗炎症作用を有するポリペプチドをコードするDN
Aを「セラペプターゼ類遺伝子」と称することもある。
ーゼ様抗炎症作用を有するポリペプチドをコードするDN
Aを「セラペプターゼ類遺伝子」と称することもある。
本発明のセラペプターゼポリペプチドまたはセラペプ
ターゼ様抗炎症作用を有するポリペプチドをコードする
DNAは、たとえばプロテアーゼを産生するセラチア（Ser
ratia）属菌の染色体DNAから得ることができる。
ターゼ様抗炎症作用を有するポリペプチドをコードする
DNAは、たとえばプロテアーゼを産生するセラチア（Ser
ratia）属菌の染色体DNAから得ることができる。
上記セラチア属菌としては、たとえばセラチア・マル
セッセンス（Serratia marcescens）が挙げられる。具
体的には、たとえば、セラチア・マルセッセンスATCC21
074,セラチア・マルセッセンスIFO3046,セラチア・マル
セッセンスIFO3735などが挙げられる。
セッセンス（Serratia marcescens）が挙げられる。具
体的には、たとえば、セラチア・マルセッセンスATCC21
074,セラチア・マルセッセンスIFO3046,セラチア・マル
セッセンスIFO3735などが挙げられる。
上記ATCC21074株は、昭和42年（1967年）５月15日に
ジ・アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション
（The American Type Culture Collection,ATCC）に寄
託され、該ATCC発行のアメリカン・タイプ・カルチャー
・コレクション・カタログ・オブ・バクテリア・ファー
ジズ・アンド・アールディーエヌエイ・ベクターズ（Am
erican Type Culture Collection Catalogue of Bacter
ia,Phages and rDNA Vectors）第16版,1985年に掲載さ
れている。
ジ・アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション
（The American Type Culture Collection,ATCC）に寄
託され、該ATCC発行のアメリカン・タイプ・カルチャー
・コレクション・カタログ・オブ・バクテリア・ファー
ジズ・アンド・アールディーエヌエイ・ベクターズ（Am
erican Type Culture Collection Catalogue of Bacter
ia,Phages and rDNA Vectors）第16版,1985年に掲載さ
れている。
上記IFO3046株およびIFO3735株は財団法人発酵研究所
（IFO）発行のインスティテュート・フォー・ファーメ
ンテーション・リスト・オフ・カルチャーズ（Institut
e For Fermentation Osaka List of Cultures）1984年
第７版に掲載されている。
（IFO）発行のインスティテュート・フォー・ファーメ
ンテーション・リスト・オフ・カルチャーズ（Institut
e For Fermentation Osaka List of Cultures）1984年
第７版に掲載されている。
セラチア属菌の菌体からの染色体DNAの調製法はそれ
自体公知であり、たとえば、Lovettらの方法［メソッズ
・イン・エンジーモロジー（Methods in Enzymolog
y），68,342（1979）］などに従って行われる。
自体公知であり、たとえば、Lovettらの方法［メソッズ
・イン・エンジーモロジー（Methods in Enzymolog
y），68,342（1979）］などに従って行われる。
このようにして得られた染色体DNAを制限酵素で切断
する。染色体DNAは、制限酵素による部分分解物も利用
できる。
する。染色体DNAは、制限酵素による部分分解物も利用
できる。
次に、このようにして得られた染色体DNA断片をベク
ターDNAにDNAリガーゼを用いて連結する。
ターDNAにDNAリガーゼを用いて連結する。
上記ベクターとしては、たとえば、ColE I由来のプラ
スミドpBR322［ジーン（Gene），２,95（1977）参照］,
pBR325［ジーン，４,121（1978）参照］,pUC12［Vieir
a,J.およびMessing J.,ジーン，19,259（1982）参照］,
pUC13［ジーン，19,259（1982）参照］などが最もよく
利用されるが、その他のプラスミドであっても、宿主内
で複製保持されるものであれば、いずれをも用いること
ができる。
スミドpBR322［ジーン（Gene），２,95（1977）参照］,
pBR325［ジーン，４,121（1978）参照］,pUC12［Vieir
a,J.およびMessing J.,ジーン，19,259（1982）参照］,
pUC13［ジーン，19,259（1982）参照］などが最もよく
利用されるが、その他のプラスミドであっても、宿主内
で複製保持されるものであれば、いずれをも用いること
ができる。
上記連結は、まず、ベクターDNAを制限酵素で切断す
る。なお、一般的には、ベクターDNAは、それを一個所
切断する制限酵素で切断するのが便利である。該切断
は、自体公知の方法に従って行われる。
る。なお、一般的には、ベクターDNAは、それを一個所
切断する制限酵素で切断するのが便利である。該切断
は、自体公知の方法に従って行われる。
上記ベクターDNAに、該染色体DNA断片をDNAリガーゼ
を用いて連結するには、自体公知の方法に従って行われ
る。
を用いて連結するには、自体公知の方法に従って行われ
る。
このようにして得られた組み換えDNAの中から、目的
とする組み換えDNAを選択する。すなわち用いられる宿
主−ベクター系としては、染色体DNA断片をベクターに
連結したのち、形質転換することによって、その断片上
にセラペプターゼ類遺伝子の存在が確認できるものであ
ればいかなるものであってもよく、具体的には大腸菌宿
主−ベクター系が挙げられる。さらに具体的には、上記
で得られたベクターに染色体DNA断片を連結した組み換
えDNAを用いて、自体公知の方法、たとえばプロシーデ
ィグス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サ
イエンシズ・オブ・ザ・ユナイテッド・スティツ・オブ
・アメリカ（Proceedings of the National Academy of
Sciences of the United States of America（以下、P
roc.Nat.Acad.Sci.U.S.A.と略称することもある。），6
9,2110（1972）に記載の方法に従って大腸菌を形質転換
させる。形質転換体の選択は、用いたプラスミドの薬剤
耐性を指標として行うことができる。たとえばベクター
としてpBR322を使用すれば、まず、アンピシリン耐性あ
るいはテトラサイクリン耐性で選択できる。
とする組み換えDNAを選択する。すなわち用いられる宿
主−ベクター系としては、染色体DNA断片をベクターに
連結したのち、形質転換することによって、その断片上
にセラペプターゼ類遺伝子の存在が確認できるものであ
ればいかなるものであってもよく、具体的には大腸菌宿
主−ベクター系が挙げられる。さらに具体的には、上記
で得られたベクターに染色体DNA断片を連結した組み換
えDNAを用いて、自体公知の方法、たとえばプロシーデ
ィグス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サ
イエンシズ・オブ・ザ・ユナイテッド・スティツ・オブ
・アメリカ（Proceedings of the National Academy of
Sciences of the United States of America（以下、P
roc.Nat.Acad.Sci.U.S.A.と略称することもある。），6
9,2110（1972）に記載の方法に従って大腸菌を形質転換
させる。形質転換体の選択は、用いたプラスミドの薬剤
耐性を指標として行うことができる。たとえばベクター
としてpBR322を使用すれば、まず、アンピシリン耐性あ
るいはテトラサイクリン耐性で選択できる。
さらにすでにアミノ酸配列の明らかになったセラペプ
ターゼ類のアミノ酸配列に対応すると考えられる塩基配
列をもったオリゴヌクレオチドを化学合成したのち、こ
れを32Pでラベルしてプローブとなし、たとえばそれ自
体公知のコロニーハイブリダイゼーション法［Grunstei
n Hognessの方法:Proc.Nat.Acad.Sci.U.S.A.72,3961（1
975）］によって、すでに得た薬剤耐性の形質転換体の
中から求めるクローンを二次スクリーニングすることが
できる。
ターゼ類のアミノ酸配列に対応すると考えられる塩基配
列をもったオリゴヌクレオチドを化学合成したのち、こ
れを32Pでラベルしてプローブとなし、たとえばそれ自
体公知のコロニーハイブリダイゼーション法［Grunstei
n Hognessの方法:Proc.Nat.Acad.Sci.U.S.A.72,3961（1
975）］によって、すでに得た薬剤耐性の形質転換体の
中から求めるクローンを二次スクリーニングすることが
できる。
プローブとしては、たとえばLee,I.S.らの報告［フェ
デレーション・プロシーディングス（Federation Proce
edings），44,March p.1057（1985）］に記載されたセ
ラチア・プロテアーゼのアミノ酸配列中の第42〜51番目
のアミノ酸配列（Glu−Asn−Gln−Thr−Trp−Asp−Gly
−Tyr−Lys−Val）から推測される塩基配列の逆鎖であ
る一般式５ ′ACTTTGTAX1CCGTCCCAX2GTTTGGTTTTC3′ ［Ｉ］ ［式中、X1はＴまたはＧを、X2はＴまたはＧをそれぞれ
示す。］の塩基配列で表わされるDNA,または、上記セラ
チア・プロテアーゼのアミノ酸配列中の第143〜147番目
のアミノ酸配列（Trp−Gln−Gly−Gln−Asp）から推測
される塩基配列の逆鎖である一般式５ ′TCY1TGY2CCY3TGCCA3′ ［II］ ［式中、Y1はＴまたはＣを、Y2はA,G,TまたはＣを、Y3
はまたはＣをそれぞれ示す。］の塩基配列で表わされる
DNAが挙げられる。
デレーション・プロシーディングス（Federation Proce
edings），44,March p.1057（1985）］に記載されたセ
ラチア・プロテアーゼのアミノ酸配列中の第42〜51番目
のアミノ酸配列（Glu−Asn−Gln−Thr−Trp−Asp−Gly
−Tyr−Lys−Val）から推測される塩基配列の逆鎖であ
る一般式５ ′ACTTTGTAX1CCGTCCCAX2GTTTGGTTTTC3′ ［Ｉ］ ［式中、X1はＴまたはＧを、X2はＴまたはＧをそれぞれ
示す。］の塩基配列で表わされるDNA,または、上記セラ
チア・プロテアーゼのアミノ酸配列中の第143〜147番目
のアミノ酸配列（Trp−Gln−Gly−Gln−Asp）から推測
される塩基配列の逆鎖である一般式５ ′TCY1TGY2CCY3TGCCA3′ ［II］ ［式中、Y1はＴまたはＣを、Y2はA,G,TまたはＣを、Y3
はまたはＣをそれぞれ示す。］の塩基配列で表わされる
DNAが挙げられる。
前記式［Ｉ］で表わされるDNAと式［II］で表わされ
るDNAとの両者を用いてもよい。
るDNAとの両者を用いてもよい。
これらプローブを使ったコロニーハイブリダイゼーシ
ョンによって陽性を示したクローンの塩基配列を、たと
えばマキサム・ギルバード（Maxam−Gilbert）法［Maxa
m,A.M.and Gilbert,W.,Proc.Nat.Acad.Sci.USA,74,560
（1977）］あるいはジデオキシ法［Messing,J.ら，ニュ
ークレイック・アシッズ・リサーチ（Nucleic Acids Re
seach），９,309（1981）］によって決定し、既知のア
ミノ酸配列との比較からセラペプターゼ類遺伝子の存在
を確認する。その結果、セラペプターゼ類遺伝子をコー
ドする全領域がカバーされていない場合には、陽性を示
したクローンから得られたプラスミドの挿入部を新たに
プローブとして再スクリーニングし、セラペプターゼ類
遺伝子全領域を含むDNA断片を調製する。
ョンによって陽性を示したクローンの塩基配列を、たと
えばマキサム・ギルバード（Maxam−Gilbert）法［Maxa
m,A.M.and Gilbert,W.,Proc.Nat.Acad.Sci.USA,74,560
（1977）］あるいはジデオキシ法［Messing,J.ら，ニュ
ークレイック・アシッズ・リサーチ（Nucleic Acids Re
seach），９,309（1981）］によって決定し、既知のア
ミノ酸配列との比較からセラペプターゼ類遺伝子の存在
を確認する。その結果、セラペプターゼ類遺伝子をコー
ドする全領域がカバーされていない場合には、陽性を示
したクローンから得られたプラスミドの挿入部を新たに
プローブとして再スクリーニングし、セラペプターゼ類
遺伝子全領域を含むDNA断片を調製する。
このようにして得られた形質転換体から、たとえばヌ
ークレイック・アシッズ・リサーチ，７,1513（1979）
に記載の方法に従って、プラスミドを抽出し、目的とす
るセラペプターゼまたはセラペプターゼ様抗炎症作用を
有するポリペプチドをコードするDNAが組み込まれたプ
ラスミドが得られる。
ークレイック・アシッズ・リサーチ，７,1513（1979）
に記載の方法に従って、プラスミドを抽出し、目的とす
るセラペプターゼまたはセラペプターゼ様抗炎症作用を
有するポリペプチドをコードするDNAが組み込まれたプ
ラスミドが得られる。
なかでも、式［Ｖ］で表わされる塩基配列を有するDN
Aを製造するには、後述の実施例で示したようにプラス
ミド例えば、pTSP25を制限酵素Pst Iで部分分解するこ
とにより得ることが出来る。
Aを製造するには、後述の実施例で示したようにプラス
ミド例えば、pTSP25を制限酵素Pst Iで部分分解するこ
とにより得ることが出来る。
同様にして式、［III］および［IV］で表わされる塩
基配列を有するDNAは上記プラスミドを材料に、それ自
体公知の方法、すなわち制限酵素によるフラグメントの
切り出しとライゲースを用いたフラグメントの連結およ
び必要であれば化学合成したDNAフラグメントの利用等
を組み合せて製造することが出来る。また全配列を化学
合成することも出来る。
基配列を有するDNAは上記プラスミドを材料に、それ自
体公知の方法、すなわち制限酵素によるフラグメントの
切り出しとライゲースを用いたフラグメントの連結およ
び必要であれば化学合成したDNAフラグメントの利用等
を組み合せて製造することが出来る。また全配列を化学
合成することも出来る。
塩基配列において、それらの一部の塩基を置換，挿
入，付加もしくは除去する方法としては、site−direct
ed mutagenesisの方法［メソッズ・イン・エンジーモロ
ジー（Methods in Enzymology）Vol.100,p.468（198
3）,Academic Press N.Y.］がよく利用される。
入，付加もしくは除去する方法としては、site−direct
ed mutagenesisの方法［メソッズ・イン・エンジーモロ
ジー（Methods in Enzymology）Vol.100,p.468（198
3）,Academic Press N.Y.］がよく利用される。
上記方法により、式［VI］で表わされるポリペプチ
ド，その部分ポリペプチドまたはそれらの一部のアミノ
酸残基が置換，挿入，付加もしくは除去されたポリペプ
チドをコードするDNAをも製造することができる。
ド，その部分ポリペプチドまたはそれらの一部のアミノ
酸残基が置換，挿入，付加もしくは除去されたポリペプ
チドをコードするDNAをも製造することができる。
このようにして得られたセラペプターゼまたはセラペ
プターゼ様抗炎症作用を有するポリペプチドをコードす
るDNAは、セラペプターゼまたはセラペプターゼ様抗炎
症作用を有するポリペプチドの産生のための構造遺伝子
として用いることができる。
プターゼ様抗炎症作用を有するポリペプチドをコードす
るDNAは、セラペプターゼまたはセラペプターゼ様抗炎
症作用を有するポリペプチドの産生のための構造遺伝子
として用いることができる。
また、このようにして得られた式［VI］で表わされる
ポリペプチドまたはその部分をコードするDNAは、該ポ
リペプチドの産生のための構造遺伝子として用いること
ができる。
ポリペプチドまたはその部分をコードするDNAは、該ポ
リペプチドの産生のための構造遺伝子として用いること
ができる。
次に、上記で得られたセラペプターゼまたはセラペプ
ターゼ様抗炎症作用を有するポリペプチドをコードする
DNAが組み込まれたプラスミドを用いて、形質転換体を
製造する。
ターゼ様抗炎症作用を有するポリペプチドをコードする
DNAが組み込まれたプラスミドを用いて、形質転換体を
製造する。
形質転換体を製造する際に用いられる宿主としては、
たとえばエシェリヒア（Escherichia）属菌，セラチア
属菌，バチルス（Bacillus）属菌，酵母などの微生物，
動物細胞などの真核生物細胞などが挙げられる。
たとえばエシェリヒア（Escherichia）属菌，セラチア
属菌，バチルス（Bacillus）属菌，酵母などの微生物，
動物細胞などの真核生物細胞などが挙げられる。
上記宿主としてのエシェリヒア属菌としては、たとえ
ばエシェリヒア・コリ（Escherichia coli）が挙げら
れ、具体的にはたとえばエシェリヒア・コリDH1株［ネ
イチャー（Nature）217,1110（1968）参照］，エシェリ
ヒア・コリJM103株［スクレイック・アシッズ・リサー
チ，９,309（1981）参照］，エシェリヒア・コリJA221
株［ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー
（Journal of Molecular Biology）120,517（1978）参
照］，エシェリヒア・コリRR I株［メソッズ・イン・エ
ンジン−モロジー，68,262（1979）］などが挙げられ
る。
ばエシェリヒア・コリ（Escherichia coli）が挙げら
れ、具体的にはたとえばエシェリヒア・コリDH1株［ネ
イチャー（Nature）217,1110（1968）参照］，エシェリ
ヒア・コリJM103株［スクレイック・アシッズ・リサー
チ，９,309（1981）参照］，エシェリヒア・コリJA221
株［ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー
（Journal of Molecular Biology）120,517（1978）参
照］，エシェリヒア・コリRR I株［メソッズ・イン・エ
ンジン−モロジー，68,262（1979）］などが挙げられ
る。
上記セラチア属菌としては、たとえばセラチア・マル
セッセンス（Serratia marcescens）が挙げられ、具体
的にはたとえばセラチア・マルセッセンスIFO3759,セラ
チア・マルセッセンスATCC21074,セラチア・マルセッセ
ンスIFO3046,セラチア・マルセッセンスIFO3735,セラチ
ア・マルセッセンスNo.87,セラチア・マルセッセンスNC
−４などが挙げられる。
セッセンス（Serratia marcescens）が挙げられ、具体
的にはたとえばセラチア・マルセッセンスIFO3759,セラ
チア・マルセッセンスATCC21074,セラチア・マルセッセ
ンスIFO3046,セラチア・マルセッセンスIFO3735,セラチ
ア・マルセッセンスNo.87,セラチア・マルセッセンスNC
−４などが挙げられる。
上記セラチア・マルセッセンスIFO3759株は、昭和33
年（1958年）９月23日に財団法人発酵研究所（IFO）に
寄託され、該IFO発行のインスティテュート・フォー・
ファーメンテーション・リスト・オブ・カルチャーズ19
84年第７版に掲載されている。セラチア・マルセッセン
スIFO3759株の菌学的性質は、ジャーナル・オフ・バク
テリオロジー（Journal of Bacteriology）11,76−77
（1926）に記載のそれと同じである。
年（1958年）９月23日に財団法人発酵研究所（IFO）に
寄託され、該IFO発行のインスティテュート・フォー・
ファーメンテーション・リスト・オブ・カルチャーズ19
84年第７版に掲載されている。セラチア・マルセッセン
スIFO3759株の菌学的性質は、ジャーナル・オフ・バク
テリオロジー（Journal of Bacteriology）11,76−77
（1926）に記載のそれと同じである。
上記セラチア・マルセッセンスATCC21074の菌学的性
質は、特公昭41−10193号公報，米国特許第3,691,014号
公報に記載されている。
質は、特公昭41−10193号公報，米国特許第3,691,014号
公報に記載されている。
上記セラチア・マルセッセンスNo.87株およびセラチ
ア・マルセッセンスNC−４株は、それぞれ昭和60年（19
85年）７月５日および昭和61年（1986年）４月17日に財
団法人発酵研究所（IFO）に受託番号IFO14454およびIFO
14504として寄託され、またこれら微生物は、それぞれ
昭和60年（1985年）11月７日および昭和61年５月29日に
通商産業省工業技術院微生物工業技術研究所（FRI）に
寄託され、ブタペスト条約に基づき番号FERM BP−1181
およびFERM BP−1182として保管されている。
ア・マルセッセンスNC−４株は、それぞれ昭和60年（19
85年）７月５日および昭和61年（1986年）４月17日に財
団法人発酵研究所（IFO）に受託番号IFO14454およびIFO
14504として寄託され、またこれら微生物は、それぞれ
昭和60年（1985年）11月７日および昭和61年５月29日に
通商産業省工業技術院微生物工業技術研究所（FRI）に
寄託され、ブタペスト条約に基づき番号FERM BP−1181
およびFERM BP−1182として保管されている。
上記セラチア・マルセッセンスNo.87およびセラチア
・マルセッセンスNC−４の菌学的性状は、バージーズ・
マニュアル・オブ・デターミネイティブ・バクテリオロ
ジー（Bergey′s Manual of Determinative Bacteriolo
gy）第８版に記載のセラチア・マルセッセンスのそれと
同じである。
・マルセッセンスNC−４の菌学的性状は、バージーズ・
マニュアル・オブ・デターミネイティブ・バクテリオロ
ジー（Bergey′s Manual of Determinative Bacteriolo
gy）第８版に記載のセラチア・マルセッセンスのそれと
同じである。
上記宿主としてのバチルス属菌としては、たとえばバ
チルス・サチルス（Bacillus subtilis）が挙げられ、
具体的にはたとえばバチルス・サチルスMI114［ジーン
（Gene），24,255（1983）］などが挙げられる。
チルス・サチルス（Bacillus subtilis）が挙げられ、
具体的にはたとえばバチルス・サチルスMI114［ジーン
（Gene），24,255（1983）］などが挙げられる。
上記宿主としての酵母としては、たとえばサッカロマ
イセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）AH22
R-［Proc.Nat.Acad.Sci.USA,80,1（1983）］などが挙げ
られる。
イセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）AH22
R-［Proc.Nat.Acad.Sci.USA,80,1（1983）］などが挙げ
られる。
上記動物細胞としては、たとえばマウスＬ細胞，チャ
イニーズ・ハムスター・オバリー（CHO）細胞,COS細胞
などが挙げられる。
イニーズ・ハムスター・オバリー（CHO）細胞,COS細胞
などが挙げられる。
上記エシェリヒア属菌またはセラチア属菌を形質転換
するには、自体公知の方法に従えばよく、たとえばPro
c.Nat.Acad.Sci.USA,69,2110（1972），ジーン，17,107
（1982）などに記載の方法に従って行われる。
するには、自体公知の方法に従えばよく、たとえばPro
c.Nat.Acad.Sci.USA,69,2110（1972），ジーン，17,107
（1982）などに記載の方法に従って行われる。
上記バチルス属菌を形質転換するには、自体公知の方
法に従えばよく、たとえばモレキュラー・アンド・ジェ
ネラル・ジェネティックス（Molecular ＆ General Gen
etics）168,111（1979）などに記載の方法に従って行な
われる。
法に従えばよく、たとえばモレキュラー・アンド・ジェ
ネラル・ジェネティックス（Molecular ＆ General Gen
etics）168,111（1979）などに記載の方法に従って行な
われる。
また酵母，動物細胞などの真核生物細胞の形質転換の
方法もそれら自体公知であり、たとえば米国特許4,399,
216号に記載の方法に従って行われる。
方法もそれら自体公知であり、たとえば米国特許4,399,
216号に記載の方法に従って行われる。
さらにセラペプターゼ類の発現を高めるためには、得
られたクローンからセラペプターゼ類遺伝子の全部ある
いは一部をきり出し、適当なプロモーター配列の下流に
つないでこれを宿主に導入することができる。さらに、
必要な場合は、プロモーターの下流にSD（シャインアン
ドダルガーノ）配列を挿入することもできる。
られたクローンからセラペプターゼ類遺伝子の全部ある
いは一部をきり出し、適当なプロモーター配列の下流に
つないでこれを宿主に導入することができる。さらに、
必要な場合は、プロモーターの下流にSD（シャインアン
ドダルガーノ）配列を挿入することもできる。
宿主として大腸菌やセラチア属菌を用いた場合には、
プロモーターとしては、たとえばトリプトファン（tr
p）プロモーター・バクテリオファージ由来のλPLプロ
モーター，ラクトース（lac）プロモーター，蛋白質鎖
伸長因子Tu（tufB）プロモーター,resAプロモーターな
どが挙げられる。
プロモーターとしては、たとえばトリプトファン（tr
p）プロモーター・バクテリオファージ由来のλPLプロ
モーター，ラクトース（lac）プロモーター，蛋白質鎖
伸長因子Tu（tufB）プロモーター,resAプロモーターな
どが挙げられる。
宿主としてバチルス属菌を用いた場合には、プロモー
ターとしてはたとえばSPO1プロモーター,vegプロモータ
ー,P1プロモーター（特開昭60−137291号公報参照）な
どが挙げられる。
ターとしてはたとえばSPO1プロモーター,vegプロモータ
ー,P1プロモーター（特開昭60−137291号公報参照）な
どが挙げられる。
宿主として酵母を用いた場合には、プロモーターとし
て、たとえばPHO5のプロモーター,GLDプロモーター,PGK
プロモーター,ADHプロモーター,PHO81プロモーターなど
が利用できる。
て、たとえばPHO5のプロモーター,GLDプロモーター,PGK
プロモーター,ADHプロモーター,PHO81プロモーターなど
が利用できる。
同様に宿主として動物細胞などの真核生物細胞を用い
た場合にも、その生成種に適応したプロモーターを適時
選択して利用することができる。
た場合にも、その生成種に適応したプロモーターを適時
選択して利用することができる。
このようにしてセラペプターゼ類をコードするDNAが
組み込まれたプラスミドで形質転換された形質転換体が
得られる。
組み込まれたプラスミドで形質転換された形質転換体が
得られる。
このようにして得られた形質転換体が細菌（エシェリ
ヒア属菌，セラチア属菌，バチルス属菌），酵母である
場合、該形質転換体を倍地に培養することにより、培養
物中にセラペプターゼ類を生成蓄積せしめ、これを採取
することにより、セラペプターゼ類を製造することがで
きる。
ヒア属菌，セラチア属菌，バチルス属菌），酵母である
場合、該形質転換体を倍地に培養することにより、培養
物中にセラペプターゼ類を生成蓄積せしめ、これを採取
することにより、セラペプターゼ類を製造することがで
きる。
宿主が細菌である形質転換体を培養する際、培養に使
用される培地としては、液体培地が適当であり、その中
には該形質転換体の生育に必要な炭素源，窒素源，無機
物その他が含有せしめられる。炭素源としては、たとえ
ばグルコース，デキストリン，可溶性澱粉，ショ糖な
ど、窒素源としては、たとえばアンモニウム塩類，硝酸
塩類，コーンスチープ・リカー，ペプトン，カゼイン，
肉エキス，大豆粕，バレイショ抽出液などの無機または
有機物質，無機物としてはたとえば塩化カルシウム，リ
ン酸二水素ナトリウム，塩化マグネシウムなどがあげら
れる。また酵母エキス，ビタミン類，生長促進因子など
を添加してもよい。とりわけ塩化カルシウム,2水和物を
約0.1％およびリン酸二水素ナトリウム・２水和物を約
２％含有する培地がプロテアーゼの生産に有利である。
また、培養するための温度,pH,時間などの条件は、セラ
ペプターゼ類の生産およびその活性が最高となるように
適宣に定められるが、一般に培養温度はセラチア属細菌
では約25〜35℃付近，エシェリヒア属菌またはバチルス
属菌では約20〜40℃付近，培養pHは微酸性から微アルカ
リ性で特に中性付近が望ましく、培養時間は２日間程度
が好ましい。
用される培地としては、液体培地が適当であり、その中
には該形質転換体の生育に必要な炭素源，窒素源，無機
物その他が含有せしめられる。炭素源としては、たとえ
ばグルコース，デキストリン，可溶性澱粉，ショ糖な
ど、窒素源としては、たとえばアンモニウム塩類，硝酸
塩類，コーンスチープ・リカー，ペプトン，カゼイン，
肉エキス，大豆粕，バレイショ抽出液などの無機または
有機物質，無機物としてはたとえば塩化カルシウム，リ
ン酸二水素ナトリウム，塩化マグネシウムなどがあげら
れる。また酵母エキス，ビタミン類，生長促進因子など
を添加してもよい。とりわけ塩化カルシウム,2水和物を
約0.1％およびリン酸二水素ナトリウム・２水和物を約
２％含有する培地がプロテアーゼの生産に有利である。
また、培養するための温度,pH,時間などの条件は、セラ
ペプターゼ類の生産およびその活性が最高となるように
適宣に定められるが、一般に培養温度はセラチア属細菌
では約25〜35℃付近，エシェリヒア属菌またはバチルス
属菌では約20〜40℃付近，培養pHは微酸性から微アルカ
リ性で特に中性付近が望ましく、培養時間は２日間程度
が好ましい。
宿主が酵母である形質転換体を培養する際、培地とし
ては、たとえばバークホールダー（Burkholder）最小培
地［Bostian,K.L.ら,Proc.Nat.Acad.Sci.USA,77,4505
（1980）］が挙られる。培養は通常約15℃〜40℃、好ま
しくは約24℃〜37℃で約10〜96時間、好ましくは約24〜
72時間行い、必要に応じて通気や撹拌を加える。
ては、たとえばバークホールダー（Burkholder）最小培
地［Bostian,K.L.ら,Proc.Nat.Acad.Sci.USA,77,4505
（1980）］が挙られる。培養は通常約15℃〜40℃、好ま
しくは約24℃〜37℃で約10〜96時間、好ましくは約24〜
72時間行い、必要に応じて通気や撹拌を加える。
動物細胞などの真核生物細胞を宿主として得られた形
質転換体は、公知の方法と同様に培養して、セラペプタ
ーゼ類を産生せしめる。
質転換体は、公知の方法と同様に培養して、セラペプタ
ーゼ類を産生せしめる。
たとえば、培養の際に用いられる培地としては、たと
えばEagleのMEM［H.Eagle:サイエンス（Science）130,4
32（1959）］,Dulbecooのmodified Eagle′s medium［O
rgad Laub ＆ William J.Rutter:ジャーナル・オブ・バ
イオロジカル・ケミストリー（Journal of Biological
Chemistry）258,6043（1983）］,HAT培地［Littlefiel
d,J.W.サイエンス145,709（1964）］が挙げられる。
えばEagleのMEM［H.Eagle:サイエンス（Science）130,4
32（1959）］,Dulbecooのmodified Eagle′s medium［O
rgad Laub ＆ William J.Rutter:ジャーナル・オブ・バ
イオロジカル・ケミストリー（Journal of Biological
Chemistry）258,6043（1983）］,HAT培地［Littlefiel
d,J.W.サイエンス145,709（1964）］が挙げられる。
培養は通常約30℃〜42℃、好ましくは約35℃〜37℃
で、約１〜10日間行う。
で、約１〜10日間行う。
培養物中に蓄積されたセラペプターゼ類は、当分野に
おける通常の方法、たとえば超音波破砕法，フレンチプ
レスを利用した破砕法，摩砕などの機械的破砕法，リゾ
チームなどの酵素による破砕法，塩酸グアニジンなどの
薬剤による方法で抽出する。次にこのようにして得られ
た抽出液や培養上清からそれ自体公知の分離精製手段、
たとえば沈殿剤による沈殿法，等電点沈殿法，塩析法，
透析法，イオン交換樹脂などの吸着剤を利用する方法，
ゲルろ過法，高速液体クロマトグラフィー等によっても
分離精製される。
おける通常の方法、たとえば超音波破砕法，フレンチプ
レスを利用した破砕法，摩砕などの機械的破砕法，リゾ
チームなどの酵素による破砕法，塩酸グアニジンなどの
薬剤による方法で抽出する。次にこのようにして得られ
た抽出液や培養上清からそれ自体公知の分離精製手段、
たとえば沈殿剤による沈殿法，等電点沈殿法，塩析法，
透析法，イオン交換樹脂などの吸着剤を利用する方法，
ゲルろ過法，高速液体クロマトグラフィー等によっても
分離精製される。
すなわち、たとえば本発明の方法で得られるセラペプ
ターゼ類含有液をたとえば硫酸ナトリウム，硫酸アンモ
ニウム，食塩等で塩析し、あるいは適宣の親水性有機溶
媒、たとえばアルコール類，アセトン等を添加してセラ
ペプターゼ類を分画沈殿させることもできる。そして本
発明の方法で得られるセラペプターゼ類は安定なので、
たとえば培養液のような希薄な含有液を減圧下に濃縮し
うる。また、たとえばリン酸カルシウム，アルミナ，ベ
ントナイト，イオン交換樹脂等による吸着および脱着，
クロマトグラフ法，蛋白沈殿剤たとえば核酸，タンニン
酸，リン・タングステン酸による沈殿法または重金属塩
による不純物の分離除去，等電点における沈殿法，電気
透析法等の精製手段を適用することも可能である。
ターゼ類含有液をたとえば硫酸ナトリウム，硫酸アンモ
ニウム，食塩等で塩析し、あるいは適宣の親水性有機溶
媒、たとえばアルコール類，アセトン等を添加してセラ
ペプターゼ類を分画沈殿させることもできる。そして本
発明の方法で得られるセラペプターゼ類は安定なので、
たとえば培養液のような希薄な含有液を減圧下に濃縮し
うる。また、たとえばリン酸カルシウム，アルミナ，ベ
ントナイト，イオン交換樹脂等による吸着および脱着，
クロマトグラフ法，蛋白沈殿剤たとえば核酸，タンニン
酸，リン・タングステン酸による沈殿法または重金属塩
による不純物の分離除去，等電点における沈殿法，電気
透析法等の精製手段を適用することも可能である。
本発明で得られたベクターに、セラペプターゼ類を菌
体外に分泌するシグナルペプチドをコードするDNA領域
が挿入されている場合には、該ベクターの形質転換体を
培養すると、目的とするセラペプターゼ類が菌体外に蓄
積されるので、産生されたセラペプターゼ類を採取する
のに好都合である。なお分泌を目的とする場合には、使
用宿主に適合したシグナル配列コード領域を用いればよ
い。
体外に分泌するシグナルペプチドをコードするDNA領域
が挿入されている場合には、該ベクターの形質転換体を
培養すると、目的とするセラペプターゼ類が菌体外に蓄
積されるので、産生されたセラペプターゼ類を採取する
のに好都合である。なお分泌を目的とする場合には、使
用宿主に適合したシグナル配列コード領域を用いればよ
い。
さらに、本発明のセラチア属菌以外の形質転換体を使
用すれば、形質転換体の培養の際、培地中にDNaseなど
の蛋白質が産生されないので、目的とするセラペプター
ゼ類を培養物から採取する際に、好都合である。
用すれば、形質転換体の培養の際、培地中にDNaseなど
の蛋白質が産生されないので、目的とするセラペプター
ゼ類を培養物から採取する際に、好都合である。
従来、セラペプターゼを生産することが知られている
エラチア属菌を上記形質転換体の宿主として用いた場合
については、本発明を用いることにより、セラペプター
ゼの生産力価を向上させることができる。
エラチア属菌を上記形質転換体の宿主として用いた場合
については、本発明を用いることにより、セラペプター
ゼの生産力価を向上させることができる。
このように、本発明の形質転換体を用いることによ
り、抗炎症剤などとして有用なセラペプターゼ類を工業
的に有用に生産することができる。
り、抗炎症剤などとして有用なセラペプターゼ類を工業
的に有用に生産することができる。
本発明方法で製造されたセラペプターゼおよびセラペ
プターゼ様抗炎症作用を有するポリペプチドは、たとえ
ば抗炎症剤として、特公昭41−10193号公報，米国特許
第3,691,014号公報に記載の方法と同様に用いることが
できる。
プターゼ様抗炎症作用を有するポリペプチドは、たとえ
ば抗炎症剤として、特公昭41−10193号公報，米国特許
第3,691,014号公報に記載の方法と同様に用いることが
できる。
本発明の式［VI］で表わされるポリペプチドまたはそ
の部分ポリペプチドは前記のセラペプターゼ類の製造法
と同様の方法で製造することができる。またその製造法
も、セラペプターゼ類の製造法と同様の有利な点を有し
ている。
の部分ポリペプチドは前記のセラペプターゼ類の製造法
と同様の方法で製造することができる。またその製造法
も、セラペプターゼ類の製造法と同様の有利な点を有し
ている。
本発明の式［VI］で表わされるポリペプチドまたはそ
の部分ポリペプチドは、セラペプターゼと同様の抗炎症
作用を有するので、セラペプターゼと同様の方法で抗炎
症剤として用いることができる。
の部分ポリペプチドは、セラペプターゼと同様の抗炎症
作用を有するので、セラペプターゼと同様の方法で抗炎
症剤として用いることができる。
なお、本明細書において、塩基やアミノ酸などを略号
で表示する場合、IUPAC−IUB Commission on Biochemic
al Nomenclatureによる略号あるいは当該分野における
慣用略号に基づくものであり、その例を次に挙げる。ま
た、アミノ酸に関し光学異性体がありうる場合は、特に
明示しなければＬ−体を示すものとする。
で表示する場合、IUPAC−IUB Commission on Biochemic
al Nomenclatureによる略号あるいは当該分野における
慣用略号に基づくものであり、その例を次に挙げる。ま
た、アミノ酸に関し光学異性体がありうる場合は、特に
明示しなければＬ−体を示すものとする。
DNA デオキシリボ核酸 Ａ アデニン Ｃ シトシン Ｇ グアニン Ｔ チミン Ala アラニン Arg アルギニン Asn アスパラギン Asp アスパラギン酸 Cys システイン Gln グルタミン Glu グルタミン酸 Gly グリシン His ヒスチジン Ile イソロイシン Leu ロイシン Lys リジン Met メチオニン Phe フェニルアラニン Pro プロリン Ser セリン Thr スレオニン Trp トリプトファン Tyr チロシン Val バリン 実施例 以下に、実施例を挙げて、本発明をさらに具体的に説
明する。
明する。
実施例１ セラチア・マルセッセンスの染色体DNAの単離 セラチア・マルセッセンスATCC21074を１％トリプト
ン（ディフコ社製，米国）,0.5％酵母エキス（ディフコ
社製）,0.5％ NaClおよび0.1％ブドウ糖,pH7.3からな
る40mlのＬ培地を含む200ml容三角フラスコで28℃,16時
間振とう培養した。得られた培養液の1mlを40mlのＬ培
地を含む200ml容三角フラスコに接種し、37℃で２時間
振とうして培養を行った。
ン（ディフコ社製，米国）,0.5％酵母エキス（ディフコ
社製）,0.5％ NaClおよび0.1％ブドウ糖,pH7.3からな
る40mlのＬ培地を含む200ml容三角フラスコで28℃,16時
間振とう培養した。得られた培養液の1mlを40mlのＬ培
地を含む200ml容三角フラスコに接種し、37℃で２時間
振とうして培養を行った。
得られた培養液（10ml）を遠心して菌体を集め、40mM
Tris・HC1 pH8.5−25mM EDTAで２回洗浄した。洗浄菌
体を1mlの40mM Tris・HC1 pH8.5−25mM EDTAに懸濁し、
これに0.1mlの10mg/mlリゾチーム溶液を加え、37℃で20
分間保温した。次に1mlの0.75％ザルコシルー40mM Tris
・HC1 pH8.5−25mM EDTAを加え、65℃で８分間処理した
のち0.1mlの5mg/mlリボヌクレアーゼ溶液を加え、37℃
で30分間保温した。さらに0.1mlの10mg/mlプロナーゼ溶
液を加え、37℃で１時間保温した。これをフェノール抽
出したのち、エタノールでDNAを沈でんさせた。沈でん
を0.5mlの10mM Tris・HC1 pH8.0−1mM EDTA（TE緩衝
液）に溶解し、同じ緩衝液に対して４℃で２日間透析し
て、DNA溶液を得た。
Tris・HC1 pH8.5−25mM EDTAで２回洗浄した。洗浄菌
体を1mlの40mM Tris・HC1 pH8.5−25mM EDTAに懸濁し、
これに0.1mlの10mg/mlリゾチーム溶液を加え、37℃で20
分間保温した。次に1mlの0.75％ザルコシルー40mM Tris
・HC1 pH8.5−25mM EDTAを加え、65℃で８分間処理した
のち0.1mlの5mg/mlリボヌクレアーゼ溶液を加え、37℃
で30分間保温した。さらに0.1mlの10mg/mlプロナーゼ溶
液を加え、37℃で１時間保温した。これをフェノール抽
出したのち、エタノールでDNAを沈でんさせた。沈でん
を0.5mlの10mM Tris・HC1 pH8.0−1mM EDTA（TE緩衝
液）に溶解し、同じ緩衝液に対して４℃で２日間透析し
て、DNA溶液を得た。
実施例２ セラペプターゼをコードする遺伝子のクローニング： （Ａ）ジーンライブラリーの調製： プラスミド（pUC12）1.0μｇを10ユニットの制限酵素
BamH Iで37℃,2時間分解し、これに0.1ユニットのアル
カリホスファターゼ（ワシントン社製，米国）を加えて
65℃で30分間処理したのち、フェノール抽出，エーテル
抽出後、冷エタノールを加えてDNAを沈殿させた。
BamH Iで37℃,2時間分解し、これに0.1ユニットのアル
カリホスファターゼ（ワシントン社製，米国）を加えて
65℃で30分間処理したのち、フェノール抽出，エーテル
抽出後、冷エタノールを加えてDNAを沈殿させた。
一方、実施例１で得られたセラチア・マルセットセン
スATCC21074の染色体DNA3μｇを10ユニットの制限酵素B
amH Iで37℃,1時間消化したのち、65℃で15分間処理
し、エタノール沈殿を行った。
スATCC21074の染色体DNA3μｇを10ユニットの制限酵素B
amH Iで37℃,1時間消化したのち、65℃で15分間処理
し、エタノール沈殿を行った。
このようにして得たBamH Iで分解したpUC12）（10n
g）とBamH Iで分解した染色体DNA（40ng）とをそれぞれ
水に溶解して混合し、これらをそれぞれ10nmolのATP,20
ユニットのT4DNAリガーゼ（ニューイングランド・バイ
オラブス社製，米国）およびリガーゼ緩衝液を含む反応
液（10μ）中で15℃で16時間反応させ、この反応液で
エシェリヒア・コリDH1またはエシェリヒア・コリJM103
を、Proc.Nat.Acad.Sci.USA,69,2110（1972）に記載の
方法に従って形質転換させるとアンピシリン耐性株が多
数得られた。
g）とBamH Iで分解した染色体DNA（40ng）とをそれぞれ
水に溶解して混合し、これらをそれぞれ10nmolのATP,20
ユニットのT4DNAリガーゼ（ニューイングランド・バイ
オラブス社製，米国）およびリガーゼ緩衝液を含む反応
液（10μ）中で15℃で16時間反応させ、この反応液で
エシェリヒア・コリDH1またはエシェリヒア・コリJM103
を、Proc.Nat.Acad.Sci.USA,69,2110（1972）に記載の
方法に従って形質転換させるとアンピシリン耐性株が多
数得られた。
（Ｂ）プローブの調製： プローブとして、前述のLee,I・S.らの報告「フェデ
レーション・プロシーディングス44,March p.1057（198
5）］のセラチア・プロテアーゼのアミノ酸配列をもと
にしてアミノ酸No.42〜No.51（Glu−Asn−Gln−Thr−Tr
p−Asp−Gly−Tyr−Lys−Val）から推測される塩基配列
の逆鎖である一般式［Ｉ］で表わされるDNA（４とおり
の化合物の混合物）およびアミノ酸No.143〜No.147（Tr
p−Gln−Gly−Gln−Asp）から推測される塩基配列の逆
鎖である一般式［II］で表わされるDNA（16とおりの化
合物の混合物）をCrea,R.らの報告［Proc.Nat.Acad.Sc
i.USA,75,5765（1978）］に従ってそれぞれ化学合成し
た。
レーション・プロシーディングス44,March p.1057（198
5）］のセラチア・プロテアーゼのアミノ酸配列をもと
にしてアミノ酸No.42〜No.51（Glu−Asn−Gln−Thr−Tr
p−Asp−Gly−Tyr−Lys−Val）から推測される塩基配列
の逆鎖である一般式［Ｉ］で表わされるDNA（４とおり
の化合物の混合物）およびアミノ酸No.143〜No.147（Tr
p−Gln−Gly−Gln−Asp）から推測される塩基配列の逆
鎖である一般式［II］で表わされるDNA（16とおりの化
合物の混合物）をCrea,R.らの報告［Proc.Nat.Acad.Sc
i.USA,75,5765（1978）］に従ってそれぞれ化学合成し
た。
このオリゴヌクレオチドに対して、T4ポリヌクレオチ
ドカイネースを用いて50μの反応液［オリゴヌクレオ
チド２μg,50mM Tris・HC1（pH7.6）,10mM MgCl2,10mM
メチルカプトエタノール,40μCiγ−32PATP,12ユニット
T4ポリヌクレオチドカイネース］中で37℃で10分間保温
し、さらに0.1mMATP2μ加えて37℃で20分間反応さ
せ、５′末端を32Pで標識した。
ドカイネースを用いて50μの反応液［オリゴヌクレオ
チド２μg,50mM Tris・HC1（pH7.6）,10mM MgCl2,10mM
メチルカプトエタノール,40μCiγ−32PATP,12ユニット
T4ポリヌクレオチドカイネース］中で37℃で10分間保温
し、さらに0.1mMATP2μ加えて37℃で20分間反応さ
せ、５′末端を32Pで標識した。
（Ｃ）コロニーハイブリダイゼーションによるスクリー
ニング： 実施例２（Ａ）で得た約700個のアンピシリン耐性テ
トラサイクリン感受性株のDNAをGrunstein−Hognessの
方法［Proc.Nat.Acad.Sci.USA,72,3961（1975）］でニ
トロセルロースフィルター上に固定した。
ニング： 実施例２（Ａ）で得た約700個のアンピシリン耐性テ
トラサイクリン感受性株のDNAをGrunstein−Hognessの
方法［Proc.Nat.Acad.Sci.USA,72,3961（1975）］でニ
トロセルロースフィルター上に固定した。
次に、Lawnらの方法［ヌークレイック・アシッズ・リ
サーチ９,6103（1981）］に従って、固定したDNAに実施
例２（Ｂ）で調製したプローブを会合させ、オートラジ
オグラフィーによって上記二種類のプローブの両方に反
応するクローンを１個単離した。これらのクローンから
プラスミドDNAをBirnboim−Dolyの方法［フークレイッ
ク・アシッズ・リサーチ７,1513（1979）］によって単
離した。得られたDNAをBamH Iで処理して挿入部を切り
出し、BamH Iで切り出せるプラスミドをpTSP20と命名し
た。これらプラスミドの制限酵素切断地図を第１図に示
す。
サーチ９,6103（1981）］に従って、固定したDNAに実施
例２（Ｂ）で調製したプローブを会合させ、オートラジ
オグラフィーによって上記二種類のプローブの両方に反
応するクローンを１個単離した。これらのクローンから
プラスミドDNAをBirnboim−Dolyの方法［フークレイッ
ク・アシッズ・リサーチ７,1513（1979）］によって単
離した。得られたDNAをBamH Iで処理して挿入部を切り
出し、BamH Iで切り出せるプラスミドをpTSP20と命名し
た。これらプラスミドの制限酵素切断地図を第１図に示
す。
第１図において、 はプラスミドpUC12由来のDNA断片を、 はセラチア・マルセッセンスATCC21074染色対由来のDNA
断片をそれぞれ示す。
断片をそれぞれ示す。
実施例３ 塩基配列の決定： pTSP20より単離した0.42kb Hind III−Pst I断片をMe
ssingらの方法［ヌクレイック・アシッズ・リサーチ，
９,309（1981）］に従って大腸菌ファージM13mp8および
M13mp9に挿入し、ジデオキシ法［Sangerら,Proc.Nat.Ac
ad.Sci.U.S.A,74,5463（1977）によって塩基配列を決定
した。
ssingらの方法［ヌクレイック・アシッズ・リサーチ，
９,309（1981）］に従って大腸菌ファージM13mp8および
M13mp9に挿入し、ジデオキシ法［Sangerら,Proc.Nat.Ac
ad.Sci.U.S.A,74,5463（1977）によって塩基配列を決定
した。
次の第１表にセラペプターゼの１番目から20番目をコ
ードする領域の塩基配列を示す。
ードする領域の塩基配列を示す。
本塩基配列より推測したアミノ酸配列は、Leeら［フ
ェデレーション・プロシーディグス44,March p.1057（1
985）］によって報告されたセラチア・プロテアーゼの
１番目から20番目までのアミノ酸配列と完全に一致し
た。したがってpTSP20はセラペプターゼをコードする遺
伝子を有することがわかった。
ェデレーション・プロシーディグス44,March p.1057（1
985）］によって報告されたセラチア・プロテアーゼの
１番目から20番目までのアミノ酸配列と完全に一致し
た。したがってpTSP20はセラペプターゼをコードする遺
伝子を有することがわかった。
実施例４ セラペプターゼをコードする遺伝子の再クローニン
グ： 実施例２でクローニングされたセラペプターゼをコー
ドする遺伝子にはＣ末端部分をコードする領域が欠損し
ていた。そこで本領域を得る目的でセラペプターゼ遺伝
子の再クローニングを行った。
グ： 実施例２でクローニングされたセラペプターゼをコー
ドする遺伝子にはＣ末端部分をコードする領域が欠損し
ていた。そこで本領域を得る目的でセラペプターゼ遺伝
子の再クローニングを行った。
プラスミドpBR322（１μｇ）を５ユニットの制限酵素
Hind IIIを用いて37℃で１時間分解し、これに0.1ユニ
ットのアルカリ性フォスファターゼ（ワシントン社製，
米国）を加えて65℃で30分間処理したのち、フェノール
抽出，エーテル抽出後、冷エタノールを加えたDNAを沈
でんさせた。
Hind IIIを用いて37℃で１時間分解し、これに0.1ユニ
ットのアルカリ性フォスファターゼ（ワシントン社製，
米国）を加えて65℃で30分間処理したのち、フェノール
抽出，エーテル抽出後、冷エタノールを加えたDNAを沈
でんさせた。
一方、実施例１で得られたセラチア・マルセッセンス
ATCC21074の染色体DNA3μｇを10ユニットの制限酵素Hin
d IIIを用いて37℃で１時間分解したのち65℃で15分間
処理しエタノール沈でんを行った。
ATCC21074の染色体DNA3μｇを10ユニットの制限酵素Hin
d IIIを用いて37℃で１時間分解したのち65℃で15分間
処理しエタノール沈でんを行った。
このようにして得たHind IIIで分解したpBR322（10n
g）とHind IIIで分解した染色体DNA（50ng）とをそれぞ
れ水に溶解して混合し、これらをそれぞれ10nmoleのAT
P,20ユニットのT4DNAリガーゼ（ニューイングランド・
バイオラブス社製，米国）およびリガーゼ緩衝液を含む
反応液（10μ）を15℃で16時間保温し、これを用いて
エシェリシア・コリDH1をProc.Nat.Acad.Sci.USA,69,21
10（1972）に記載の方法に従って形質転換させると、ア
ンピシリン（100μg/ml）を含む寒天プレートに合計600
0株の形質転換体が得られた。
g）とHind IIIで分解した染色体DNA（50ng）とをそれぞ
れ水に溶解して混合し、これらをそれぞれ10nmoleのAT
P,20ユニットのT4DNAリガーゼ（ニューイングランド・
バイオラブス社製，米国）およびリガーゼ緩衝液を含む
反応液（10μ）を15℃で16時間保温し、これを用いて
エシェリシア・コリDH1をProc.Nat.Acad.Sci.USA,69,21
10（1972）に記載の方法に従って形質転換させると、ア
ンピシリン（100μg/ml）を含む寒天プレートに合計600
0株の形質転換体が得られた。
上記のプレートにニトロセルロースフィルター（シュ
ライヒャー・シュール社製，米国）を接触させてコロニ
ーをフィルター上に移し、さらにフィルターをコロニー
面を上にして寒天プレート上で37℃,4時間保温して、コ
ロニーを生育させた。コロニーが生育したフィルターを
寒天プレートからはぎ取り、これを0.5N NaOHをしみ込
ませたろ紙の上にのせて10分間放置し、さらに1M Tris
−HC1 pH7.5−1.5M NaClをしみ込ませたろ紙の上にのせ
て５分間放置したのち30〜60分間風乾し、78℃で３時間
加熱してDNAをフィルター上に固定させた。
ライヒャー・シュール社製，米国）を接触させてコロニ
ーをフィルター上に移し、さらにフィルターをコロニー
面を上にして寒天プレート上で37℃,4時間保温して、コ
ロニーを生育させた。コロニーが生育したフィルターを
寒天プレートからはぎ取り、これを0.5N NaOHをしみ込
ませたろ紙の上にのせて10分間放置し、さらに1M Tris
−HC1 pH7.5−1.5M NaClをしみ込ませたろ紙の上にのせ
て５分間放置したのち30〜60分間風乾し、78℃で３時間
加熱してDNAをフィルター上に固定させた。
pTSP20の挿入断片中の0.9kb Pst I−BamH I断片上に
はセラペプターゼの93番目から391番目のアミノ酸をコ
ードする領域が存在する。そこでManiatisらの方法［モ
レキュラー・クローニング，ア・ラバラトリー・マニュ
アル（Molecular Cloning,A Laboratory Manual）（Col
d Spring Harbor Laboratory 1982年）］に従って本断
片をニックトランスレーションでラベル化し、これをプ
ローブとしてコロニーハイブリダイゼーションによるセ
ラペプターゼをコードする遺伝子のクローニングを行っ
た。その結果、４株の候補株が得られ、その１株から得
たプラスミドをpTSP21と命名した。本プラスミドの制限
酵素地図を第２図に示す。第２図において、 はプラスミドpBR322由来のDNA断片を、 はセラチア・マルセッセンスATCC 21074染色体由来のDN
A断片をそれぞれ示す。
はセラペプターゼの93番目から391番目のアミノ酸をコ
ードする領域が存在する。そこでManiatisらの方法［モ
レキュラー・クローニング，ア・ラバラトリー・マニュ
アル（Molecular Cloning,A Laboratory Manual）（Col
d Spring Harbor Laboratory 1982年）］に従って本断
片をニックトランスレーションでラベル化し、これをプ
ローブとしてコロニーハイブリダイゼーションによるセ
ラペプターゼをコードする遺伝子のクローニングを行っ
た。その結果、４株の候補株が得られ、その１株から得
たプラスミドをpTSP21と命名した。本プラスミドの制限
酵素地図を第２図に示す。第２図において、 はプラスミドpBR322由来のDNA断片を、 はセラチア・マルセッセンスATCC 21074染色体由来のDN
A断片をそれぞれ示す。
実施例５ セラペプターゼ遺伝子の塩基配列の決定： 実施例２で得たプラスミドpTSP20のセラチア・マルセ
ッセンスATCC 21074染色体由来のDNA断片のうちの2kb P
st I−BamH I断片および実施例４で得たプラスミドpTSP
21のセラチア・マルセッセンスATCC21074染色体由来のD
NA断片のうちの1.85kb Hind III−Pst I断片を各種の制
限酵素で切断した。このようにして得られた小断片をMe
ssingらの方法［ヌクレイク・アシッズ・リサーチ９,30
9（1981）］に従って各種の大腸菌ファージM13に挿入
し、ジデオキシ法［Sangerら,Proc.Nat.Acad.U.S.A.,7
4,5463（1977）］によって塩化配列を決定した。次に第
３図にセラペプターゼをコードする遺伝子を含むDNAの
塩基配列およびその塩基配列から推定したアミノ酸配列
を示す。第３図より明らかな様に、本セラペプターゼの
成熟たんぱくのアミノ酸配列はLeeら［フェデレーショ
ン・プロシーディグス，44,March p.1057（1985）］に
よってエドマン分解法を用いて明らかされたセラチア・
プロテアーゼのアミノ酸配列と一致した。
ッセンスATCC 21074染色体由来のDNA断片のうちの2kb P
st I−BamH I断片および実施例４で得たプラスミドpTSP
21のセラチア・マルセッセンスATCC21074染色体由来のD
NA断片のうちの1.85kb Hind III−Pst I断片を各種の制
限酵素で切断した。このようにして得られた小断片をMe
ssingらの方法［ヌクレイク・アシッズ・リサーチ９,30
9（1981）］に従って各種の大腸菌ファージM13に挿入
し、ジデオキシ法［Sangerら,Proc.Nat.Acad.U.S.A.,7
4,5463（1977）］によって塩化配列を決定した。次に第
３図にセラペプターゼをコードする遺伝子を含むDNAの
塩基配列およびその塩基配列から推定したアミノ酸配列
を示す。第３図より明らかな様に、本セラペプターゼの
成熟たんぱくのアミノ酸配列はLeeら［フェデレーショ
ン・プロシーディグス，44,March p.1057（1985）］に
よってエドマン分解法を用いて明らかされたセラチア・
プロテアーゼのアミノ酸配列と一致した。
実施例６ セラペプターゼ遺伝子全領域を含むプラスミドの構
築： プラスミドpTSP20にはセラペプターゼのＣ末端部分を
コードする領域が欠損しており、pTSP21にはセラペプタ
ーゼをコードする遺伝子のプロモーター部分が一部欠損
している。そこで両プラスミドからセラペプターゼ発現
プラスミドを次の様にして構築した。
築： プラスミドpTSP20にはセラペプターゼのＣ末端部分を
コードする領域が欠損しており、pTSP21にはセラペプタ
ーゼをコードする遺伝子のプロモーター部分が一部欠損
している。そこで両プラスミドからセラペプターゼ発現
プラスミドを次の様にして構築した。
（１）:pTSP21より単離した6.8kb BamH I断片をアル
カリ性フォスファターゼで処理し、pTSP20より単離した
2.3k BmamH I断片とT4DNAリガーゼで連結させたのち、
エシェリキア・コリDH1およびエシェリキア・コリJM103
の形質転換を行い、アンピシリン耐性の形質転換体を得
た。本形質転換体からプラスミドを単離し、これをpTSP
25と命名した。本プラスミドの制限酵素地図を第４図に
示す。第４図において、 はプラスミドpBR322由来のDNA断片を、 はセラチア・マルセッセンスATCC 21074染色体由来のDN
A断片をそれぞれ示す。
カリ性フォスファターゼで処理し、pTSP20より単離した
2.3k BmamH I断片とT4DNAリガーゼで連結させたのち、
エシェリキア・コリDH1およびエシェリキア・コリJM103
の形質転換を行い、アンピシリン耐性の形質転換体を得
た。本形質転換体からプラスミドを単離し、これをpTSP
25と命名した。本プラスミドの制限酵素地図を第４図に
示す。第４図において、 はプラスミドpBR322由来のDNA断片を、 はセラチア・マルセッセンスATCC 21074染色体由来のDN
A断片をそれぞれ示す。
（２）:pTSP21を制限酵素EcoR Vで切断したのちアル
カリ性フォスファターゼで処理し、これにpTSP20より単
離した1.0kb EcoR V断片をT4DNAリガーゼで連結させ、
エシェリキア・コリDH1およびエシェリキア・コリJM103
の形質転換を行った。アンピシリン耐性の形質転換体か
らプラスミドを単離し、これをpTSP26と命名した。本プ
ラスミドの制限酵素地図を第５図に示す。第５図におい
て、 はプラスミドpBR322由来のDNA断片を、 はセラチア・マルセッセンス ATCC21074染色体由来のDN
A断片をそれぞれ示す。
カリ性フォスファターゼで処理し、これにpTSP20より単
離した1.0kb EcoR V断片をT4DNAリガーゼで連結させ、
エシェリキア・コリDH1およびエシェリキア・コリJM103
の形質転換を行った。アンピシリン耐性の形質転換体か
らプラスミドを単離し、これをpTSP26と命名した。本プ
ラスミドの制限酵素地図を第５図に示す。第５図におい
て、 はプラスミドpBR322由来のDNA断片を、 はセラチア・マルセッセンス ATCC21074染色体由来のDN
A断片をそれぞれ示す。
実施例７ セラチア属菌株の形質転換体の製造法： 実施例４で得られたプラスミドpTSP21,実施例６で得
られたプラスミドpTSP25またはpTS26を用いて、ジー
ン，17,107（1982）に記載の方法に従って、セラチア・
マルセッセンスIFO 3759,セラチア・マルセッセンスNo.
87（IFO 14454,FERM P−8510）およびセラチア・マルセ
ッセンスATCC 21074を形質転換し、形質転換体セラチア
・マルセッセンスIFO3759/pTSP21,セラチア・マルセッ
センスIFO3759/pTSP25,セラチア・マルセッセンスIFO 3
759/pTSP26,セラチア・マルセッセンスNo.87/pTSP21,セ
ラチア・マルセッセンスNo.87/pTSP25,セラチア・マル
セッセンスNo.87/pTSP26,セラチア・マルセッセンスATC
C 21074/pTSP21,セラチア・マルセッセンスATCC 21074/
pTSP25,セラチア・マルセッセンスATCC 21074/pTSP26,
セラチア・マルセッセンスNC−4/pTSP21,セラチア・マ
ルセッセンスNC−4/pTSP25およびセラチア・マルセッセ
ンスNC−4/pTSP26をそれぞれ得た。
られたプラスミドpTSP25またはpTS26を用いて、ジー
ン，17,107（1982）に記載の方法に従って、セラチア・
マルセッセンスIFO 3759,セラチア・マルセッセンスNo.
87（IFO 14454,FERM P−8510）およびセラチア・マルセ
ッセンスATCC 21074を形質転換し、形質転換体セラチア
・マルセッセンスIFO3759/pTSP21,セラチア・マルセッ
センスIFO3759/pTSP25,セラチア・マルセッセンスIFO 3
759/pTSP26,セラチア・マルセッセンスNo.87/pTSP21,セ
ラチア・マルセッセンスNo.87/pTSP25,セラチア・マル
セッセンスNo.87/pTSP26,セラチア・マルセッセンスATC
C 21074/pTSP21,セラチア・マルセッセンスATCC 21074/
pTSP25,セラチア・マルセッセンスATCC 21074/pTSP26,
セラチア・マルセッセンスNC−4/pTSP21,セラチア・マ
ルセッセンスNC−4/pTSP25およびセラチア・マルセッセ
ンスNC−4/pTSP26をそれぞれ得た。
実施例８ セラペプターゼ発現プラスミドの構築： セラペプターゼの成熟たんぱくの１番目のアミノ酸
（アラニン）をコードする配列付近には制限酵素Xma II
Iの切断部位が存在する。そこでpTSP21より単離した4.0
kb Hind IIIフラグメントを制限酵素Xma IIIで部分切断
し、成熟たんぱくの１番目のアミノ酸（アニラン）より
５′末端側を除去した3.2kbXma III−Hind III断片を得
た。次に本断片をS1ヌクレアーゼを用いてその両端をfl
ush endに改変した。これに５′末端をリン酸化した合
成ヌクレオチドAATTCATGGCCおよびGGCCATGをT4DNAリガ
ーゼを用いて連結したのちEcoR Iで処理し、両端をEcoR
I部位に改変した。一方trpプロモーターを有する発現
プラスミドpTRP781（特開昭61−5096号公報参照）をEco
R Iで切断し、これに上記のEcoR I断片をT4DNAリガーゼ
で連結し、セラペプターゼの遺伝子がtrpプロモーター
に対して正方向であるプラスミドpTSP31を得た。本プラ
スミドの制限酵素地図を第６図に示す。第６図において はプラスミドpTSP781由来のDNA断片を、 はセラチア・マルセッセンスATCC21074染色体由来のDNA
断片をそれぞれ示す。
（アラニン）をコードする配列付近には制限酵素Xma II
Iの切断部位が存在する。そこでpTSP21より単離した4.0
kb Hind IIIフラグメントを制限酵素Xma IIIで部分切断
し、成熟たんぱくの１番目のアミノ酸（アニラン）より
５′末端側を除去した3.2kbXma III−Hind III断片を得
た。次に本断片をS1ヌクレアーゼを用いてその両端をfl
ush endに改変した。これに５′末端をリン酸化した合
成ヌクレオチドAATTCATGGCCおよびGGCCATGをT4DNAリガ
ーゼを用いて連結したのちEcoR Iで処理し、両端をEcoR
I部位に改変した。一方trpプロモーターを有する発現
プラスミドpTRP781（特開昭61−5096号公報参照）をEco
R Iで切断し、これに上記のEcoR I断片をT4DNAリガーゼ
で連結し、セラペプターゼの遺伝子がtrpプロモーター
に対して正方向であるプラスミドpTSP31を得た。本プラ
スミドの制限酵素地図を第６図に示す。第６図において はプラスミドpTSP781由来のDNA断片を、 はセラチア・マルセッセンスATCC21074染色体由来のDNA
断片をそれぞれ示す。
実施例９ エシェリキア・コリの形質転換体の製造法： 実施例４で得られたプラスミドpTSP21,実施例６で得
られたプラスミドpTSP25,pTSP26,実施例７で得られたプ
ラスミドpTSP31を用いて、Proc.Nat.Acad.Sci.USA.,69,
2110（1972）またはモレキュラー・クローニング・ア・
ラボラトリー・マニュアル［（Molecular Cloning,A La
boratory Manual）,Maniatisら,Cold Spring Harbor La
boratory,1982］に記載の方法に従ってエシェリキア・
コリDH1またはエシェリキア・コリJM103を形質転換し、
形質転換体エシェリキア・コリDH1/pTSP21,エシェリキ
ア・コリDH1/pTSP25,エシェリキア・コリDH1/pTSP26,エ
シェリキア・コリDH1/pTSP31,エシェリキア・コリJM103
/pTSP21,エシェリキア・コリJM103/pTSP25,エキェリキ
ア・コリJM103/pTSP26,エシェリキア・コリJM103/pTSP3
1をそれぞれ得た。
られたプラスミドpTSP25,pTSP26,実施例７で得られたプ
ラスミドpTSP31を用いて、Proc.Nat.Acad.Sci.USA.,69,
2110（1972）またはモレキュラー・クローニング・ア・
ラボラトリー・マニュアル［（Molecular Cloning,A La
boratory Manual）,Maniatisら,Cold Spring Harbor La
boratory,1982］に記載の方法に従ってエシェリキア・
コリDH1またはエシェリキア・コリJM103を形質転換し、
形質転換体エシェリキア・コリDH1/pTSP21,エシェリキ
ア・コリDH1/pTSP25,エシェリキア・コリDH1/pTSP26,エ
シェリキア・コリDH1/pTSP31,エシェリキア・コリJM103
/pTSP21,エシェリキア・コリJM103/pTSP25,エキェリキ
ア・コリJM103/pTSP26,エシェリキア・コリJM103/pTSP3
1をそれぞれ得た。
実施例10 セラペプターゼ遺伝子の発現： 実施例９で得られた形質転換体エシェリキア・コリJM
103/pTSP31をアピシリン（100μg/ml）添加のブレイン
ハート・インヒュジョン培地（BH I培地,Difco社）5ml
を含む試験管に接種し、37℃で６時間振とう培養し、そ
の培養液0.5mlを20mlのBH I培地を含む200ml容三角フラ
スコに移し、28℃で１日振とう培養した。得られた培養
液を遠心分離して集めた菌体50mM Tris HC1 pH8.0 50mM
NaC1で２回洗浄し、ドライアイス−エタノールで凍結
した。この凍結菌体を2mlの50mM Tris・HC1 pH8.0−50m
MNaC1に懸濁し、菌体を超音波破砕機で19.5KHz,2分間粉
砕したのち遠心分離し、抽出液を調製した。
103/pTSP31をアピシリン（100μg/ml）添加のブレイン
ハート・インヒュジョン培地（BH I培地,Difco社）5ml
を含む試験管に接種し、37℃で６時間振とう培養し、そ
の培養液0.5mlを20mlのBH I培地を含む200ml容三角フラ
スコに移し、28℃で１日振とう培養した。得られた培養
液を遠心分離して集めた菌体50mM Tris HC1 pH8.0 50mM
NaC1で２回洗浄し、ドライアイス−エタノールで凍結
した。この凍結菌体を2mlの50mM Tris・HC1 pH8.0−50m
MNaC1に懸濁し、菌体を超音波破砕機で19.5KHz,2分間粉
砕したのち遠心分離し、抽出液を調製した。
得られた抽出液の0.2mlに0.3mlの冷アセトンを加え遠
心分離した。その沈でんを120μの125mM Tris・HC1 p
H6.8−２％SDS−20％グリセロール−0.002％ブロムフェ
ノールブル−10％２−メルカプトエタノールを加えたの
ち100℃で10分間加熱し、遠心分離した。その上清の30
μを10％アクリルアミドゲル電気泳動（SDS−PAGE）
にかけた。電気泳動式トランスブロット装置（バイオ−
ラッド社製）を用いてアクリルアミドからニトロセルロ
ースフィルターにたんぱくを移し、通常の方法で調製し
たウサギの抗セラペターゼ特異抗体（生物化学実験法1
5,免疫学実験入門，松橋直，成内秀雄，臼井美津子著，
学会出版センターを参照）およびパーオキシダーゼ結合
ヤギ抗ウサギIgG（バイオ・ラッド社製）を用いたイム
ュン・ブロットアッセイシステム（バイオ・ラッド社
製）でセラペプターゼの定量を行ったところ、培養液１
当り250μｇのセラペプターゼが生成していることが
認められた。ここで得られた産物は、抗セラペプターゼ
抗体と反応することおよびSDS−PAGEでセラペプターゼ
の標準品と全く同じ挙動をすることから免疫学的にも、
分子量的にもセラペプターゼと判断された。
心分離した。その沈でんを120μの125mM Tris・HC1 p
H6.8−２％SDS−20％グリセロール−0.002％ブロムフェ
ノールブル−10％２−メルカプトエタノールを加えたの
ち100℃で10分間加熱し、遠心分離した。その上清の30
μを10％アクリルアミドゲル電気泳動（SDS−PAGE）
にかけた。電気泳動式トランスブロット装置（バイオ−
ラッド社製）を用いてアクリルアミドからニトロセルロ
ースフィルターにたんぱくを移し、通常の方法で調製し
たウサギの抗セラペターゼ特異抗体（生物化学実験法1
5,免疫学実験入門，松橋直，成内秀雄，臼井美津子著，
学会出版センターを参照）およびパーオキシダーゼ結合
ヤギ抗ウサギIgG（バイオ・ラッド社製）を用いたイム
ュン・ブロットアッセイシステム（バイオ・ラッド社
製）でセラペプターゼの定量を行ったところ、培養液１
当り250μｇのセラペプターゼが生成していることが
認められた。ここで得られた産物は、抗セラペプターゼ
抗体と反応することおよびSDS−PAGEでセラペプターゼ
の標準品と全く同じ挙動をすることから免疫学的にも、
分子量的にもセラペプターゼと判断された。
実施例11 セラチア・マルセッセンスでのセラチアプロテアーゼ
遺伝子の発現 実施例６で得たプラスミドpTSP26を用いて塩化カルシ
ウム法［Proc.Natl.Acad.Sci.USA,69,2110（1972）］で
セラチア・マルセッセンスNC−４を形質転換し、アンピ
シリン耐性の形質転換株を得た。
遺伝子の発現 実施例６で得たプラスミドpTSP26を用いて塩化カルシ
ウム法［Proc.Natl.Acad.Sci.USA,69,2110（1972）］で
セラチア・マルセッセンスNC−４を形質転換し、アンピ
シリン耐性の形質転換株を得た。
セラチア・マルセッセンスNC−４および形質転換株セ
ラチア・マルセッセンスNC−4/pTSP26をそれぞれ20mlの
ブレインハート・インヒュージョン培地を含む200ml容
三角フラスコで30℃,48時間振とう培養した。この培養
液を遠心分離して得られた培養上清を酸素液としてプロ
テアーゼ活性［Argric.Biol.Chem.,28,770（1964）］を
測定した。その結果を表１に示す。また生産されたプロ
テアーゼはSDS電気泳動後、抗セラペプターゼ抗体を反
応した。
ラチア・マルセッセンスNC−4/pTSP26をそれぞれ20mlの
ブレインハート・インヒュージョン培地を含む200ml容
三角フラスコで30℃,48時間振とう培養した。この培養
液を遠心分離して得られた培養上清を酸素液としてプロ
テアーゼ活性［Argric.Biol.Chem.,28,770（1964）］を
測定した。その結果を表１に示す。また生産されたプロ
テアーゼはSDS電気泳動後、抗セラペプターゼ抗体を反
応した。
以上の結果、本形質転換株は4.5mg/lのセラチアプロ
テアーゼを培地中に生産していることが明らかになっ
た。
テアーゼを培地中に生産していることが明らかになっ
た。
発明の効果 本発明のセラペプターゼまたはセラペプターゼ様抗炎
症作用を有するポリペプチドをコードするDNAが組み込
まれたプラスミドで形質転換された形質転換体は、高力
価にセラペプターゼまたはセラペプターゼ様抗炎症作用
を有するポリペプチドを産生するので、該形質転換体を
用いることにより、セラペプターゼまたはセラペプター
ゼ様抗炎症作用を有するポリペプチドを工業的に効率良
く生産することができる。
症作用を有するポリペプチドをコードするDNAが組み込
まれたプラスミドで形質転換された形質転換体は、高力
価にセラペプターゼまたはセラペプターゼ様抗炎症作用
を有するポリペプチドを産生するので、該形質転換体を
用いることにより、セラペプターゼまたはセラペプター
ゼ様抗炎症作用を有するポリペプチドを工業的に効率良
く生産することができる。
第１図は実施例２で得られたプラスミドpTSP20の制限酵
素切断地図を、第２図は実施例４で得られたプラスミド
pTSP21の制限酵素切断地図を、第３図は実施例５で得ら
れたセラペプターゼをコードする遺伝子の塩基配列およ
び該塩基配列から推定したアミノ酸配列を、第４図は実
施例６で得られたプラスミドpTSP25の制限酵素制限酵素
地図を、第５図は実施例６で得られたプラスミドpTSP26
の制限酵素切断地図を、第６図は実施例８で得られたpT
SP31の制限酵素切断地図をそれぞれ示す。
素切断地図を、第２図は実施例４で得られたプラスミド
pTSP21の制限酵素切断地図を、第３図は実施例５で得ら
れたセラペプターゼをコードする遺伝子の塩基配列およ
び該塩基配列から推定したアミノ酸配列を、第４図は実
施例６で得られたプラスミドpTSP25の制限酵素制限酵素
地図を、第５図は実施例６で得られたプラスミドpTSP26
の制限酵素切断地図を、第６図は実施例８で得られたpT
SP31の制限酵素切断地図をそれぞれ示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｎ 9/48 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 9/48 Ｃ１２Ｒ 1:43） (56)参考文献 特公 昭41−10193（ＪＰ，Ｂ２) Ｆｅｄｅｒａｔｉｏｎ ｐｒｏｃｅｅ ｄｉｎｇｓ，69ｔｈ ａｎｎｕａｌ ｗ ｅｅｔｉｎｇａｎａｈｅｉｍ ＣＡ，21 ｓｔ−26ｔｈ Ａｐｒｉｌ 1985，44 （４）Ｐ．1057
Claims (7)
- 【請求項１】そのＮ末端にMetを有していてもよい第３
図の第（１）番目から第（470）番目のアミノ酸配列を
有するポリペプチドをコードするDNA。 - 【請求項２】第３図の第（−33）番目から第（470）番
目のアミノ酸配列で表されるポリペプチドをコードする
特許請求の範囲第１項記載のDNA。 - 【請求項３】その５′末端にATGを、３′末端にTAA,TAG
およびTGAのコドンのうち一つまたはこれらの二つの連
続したものを有する第３図の第731番目から第2236番目
で表わされる塩基配列を含有する特許請求の範囲第１項
記載のDNA。 - 【請求項４】その５′末端にATGもしくは水素原子を、
３′末端にTAA,TAGおよびTGAのコドンのうちの一つまた
はこれらの二つの連続したものを有する第３図の第827
番目から第2236番目で表わされる塩基配列である特許請
求の範囲第１項記載のDNA。 - 【請求項５】第３図の第１番目から第2570番目で表わさ
れる塩基配列またはその部分配列を含有する特許請求の
範囲第１項記載のDNA。 - 【請求項６】そのＮ末端にMetを有していてもよい第３
図の第（１）番目から第（470）番目のアミノ酸配列を
有するポリペプチドをコードするDNAが組み込まれたプ
ラスミド。 - 【請求項７】そのＮ末端にMetを有していてもよい第３
図の第（１）番目から第（470）番目のアミノ酸配列を
有するポリペプチドをコードするDNAが組み込まれたプ
ラスミドで形質転換された形質転換体。
Applications Claiming Priority (6)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP25745085 | 1985-11-15 | ||
| JP60-257450 | 1985-11-15 | ||
| JP2612086 | 1986-02-07 | ||
| JP61-26120 | 1986-02-07 | ||
| JP61-128921 | 1986-06-02 | ||
| JP12892186 | 1986-06-02 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS63102684A JPS63102684A (ja) | 1988-05-07 |
| JP2611206B2 true JP2611206B2 (ja) | 1997-05-21 |
Family
ID=27285271
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP61266160A Expired - Fee Related JP2611206B2 (ja) | 1985-11-15 | 1986-11-07 | 遺伝子およびその利用方法 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0226800A3 (ja) |
| JP (1) | JP2611206B2 (ja) |
| KR (1) | KR870005093A (ja) |
| CN (1) | CN86107809A (ja) |
Families Citing this family (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0335854A3 (en) * | 1988-03-30 | 1990-08-29 | Monsanto Company | Regulated gene expression in gram-negative microorganisms |
| KR20010077591A (ko) * | 2000-02-03 | 2001-08-20 | 복성해 | 아라니콜라 프로테오리티쿠스에서 분리한 신규 금속성단백질 분해효소 및 그의 유전자 |
| CU23475A1 (es) | 2004-07-08 | 2009-12-17 | Ct Ingenieria Genetica Biotech | Composición farmacéutica conteniendo fragmentos polipeptídicos de serralisinas |
| CN103289978B (zh) * | 2013-05-21 | 2015-06-17 | 宁波希诺亚海洋生物科技有限公司 | 基因重组毕赤氏酵母高表达发酵生产舍雷肽酶的方法 |
| WO2020026274A1 (en) * | 2018-08-02 | 2020-02-06 | Indian Institute Of Technology, Delhi | Process for producing mature serratiopeptidase |
-
1986
- 1986-11-07 JP JP61266160A patent/JP2611206B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1986-11-12 EP EP86115740A patent/EP0226800A3/en not_active Withdrawn
- 1986-11-15 CN CN198686107809A patent/CN86107809A/zh active Pending
- 1986-11-15 KR KR860009671A patent/KR870005093A/ko not_active Application Discontinuation
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Ｆｅｄｅｒａｔｉｏｎ ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ，６９ｔｈ ａｎｎｕａｌ ｗｅｅｔｉｎｇａｎａｈｅｉｍ ＣＡ，２１ｓｔ−２６ｔｈ Ａｐｒｉｌ １９８５，４４（４）Ｐ．１０５７ |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| KR870005093A (ko) | 1987-06-04 |
| CN86107809A (zh) | 1987-07-15 |
| EP0226800A3 (en) | 1988-10-12 |
| JPS63102684A (ja) | 1988-05-07 |
| EP0226800A2 (en) | 1987-07-01 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |