JPH0787790B2 - 新規な遺伝子ｄｎａおよびアルカリ性プロテア−ゼの製造法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明のDNAはバチルス・リケニホルミスに由来し、よ
り大量のアルカリ性プロテアーゼを分泌生産させるため
に使用されるDNAであつて、かつ該遺伝子DNAを含む組換
えDNAにより形質転換されたバチルス属細菌を用いてア
ルカリ性プロテアーゼを効率よく製造する方法に関する
ものである。

〔従来の技術〕

アルカリ性プロテアーゼは強アルカリ性領域でもポリペ
プチドを分解する能力をもつ酵素であり、たとえば洗浄
補助剤として洗剤などに添加され広く利用されている。

従来、アルカリ性プロテアーゼは該酵素の高生産性の細
菌、例えばバチルス・リケニホルミス、バチルス・アミ
ロリキエフアシエンス、バチルス・ズブチリス、バチル
ス・サツカリテイカスなどを培養して、その培養上清か
らアルカリ性プロテアーゼを回収する方法で製造されて
きた。しかしながら、これらの微生物はアルカリ性プロ
テアーゼの他に、アミラーゼ、中性プロテアーゼ、レバ
ンシユクラーゼ等の酵素も多量に菌体外に分泌するた
め、培養上清からアルカリ性プロテアーゼの回収・精製
には繁雑な工程を必要とする。さらに、アルカリ性プロ
テアーゼを洗剤に利用する場合にアレルギーを起こす夾
雑物質を生産することなどの問題もあつた。

〔発明が解決しようとする問題点〕

アルカリ性プロテアーゼの生産に使用されている微生物
は、通常、細胞内にアルカリ性プロテアーゼ遺伝子を１
個（１コピー）持つている。しかしながら、組換えDNA
の手法によつてアルカリ性プロテアーゼ遺伝子を単離
し、バチルス属細菌で保持されるベクタープラスミドに
連結した組換えプラスミドを作製してバチルス属細菌を
形質転換すると菌体内に多数のアルカリ性プロテアーゼ
遺伝子をもつ形質転換体を得ることができる。このよう
なバチルス属細菌を培養すると遺伝子増幅効果によつて
アルカリ性プロテアーゼの生産性のみを特異的に増大さ
せることができ、しかも、バチルス属細菌はタンパク質
を菌体外に分泌する性質を有するためアルカリ性プロテ
アーゼの回収・精製が非常に容易に行うことができるよ
うになる。また、アルカリ性プロテアーゼ以外のタンパ
ク質やアレルギーの原因物質などの生産能の低いバチル
ス属細菌に前記の組換えプラスミドを導入した形質転換
体を用いれば、培養物からのアルカリ性プロテアーゼの
回収・精製はさらに容易になる。

また、従来よりヒト成長ホルモンなどの異種生物由来の
有用タンパク質を大量生産するためにエシエリヒア・コ
リを宿主とする組換え体による生産が試みられている
が、エシエリヒア・コリには人体寄生性の問題やタンパ
ク質を菌体外に分泌しないために得られる製品へのエン
ドトキシンの混入の問題などがある。反面、バチルス属
細菌は従来から工業的に大量培養が行われ、その安全性
が確認されており、しかもタンパク質を菌体外に分泌す
る性質を有するので、前記のような問題を生じない。

バチルス・リケニホルミスはアルカリ性プロテアーゼを
大量に菌体外に分泌生産するので、アルカリ性プロテア
ーゼ遺伝子のプロモーター領域、菌体外分泌に関与する
領域等の塩基配列はタンパク質の大量生産に適した構造
になつているものと考えられるので、このような領域が
単離されれば上記の目的にも使用することができる。

バチルス・リケニホルミスのアルカリ性プロテアーゼ遺
伝子はヤコブスら〔M.Jacobs etal.:Nucleic Acids Re
s.,13,8913（1985）〕によつてバチルス・リケニホルミ
スNCIB 6816 からクローニングされ、その塩基配列が報
告されているが、アルカリ性プロテアーゼの発現に必要
なプロモーター領域を欠如しているため、クローニング
された遺伝子自体ではアルカリ性プロテアーゼを生産さ
せることができない。このような遺伝子では、強力な発
現制御領域をもつアルカリ性プロテアーゼ遺伝子の長所
を生かしたアルカリ性プロテアーゼや有用タンパク質の
生産を行うことができない。

本発明では、このような問題点を解決するために、アル
カリ性プロテアーゼを発現させる能力を有するプロモー
ター領域（以下プロモーターの全領域と記すこともあ
る）を有するアルカリ性プロテアーゼ遺伝子を提供し、
さらにこの遺伝子が挿入された組換えプラスミドで形質
転換されたバチルス属細菌を培養することによるアルカ
リ性プロテアーゼの製造法を提供することを目的とす
る。

〔問題点を解決するための手段・作用〕

バチルス・リケニホルミスのアルカリ性プロテアーゼ遺
伝子の発現に必要な領域を有する塩基配列をもつ遺伝子
DNAのクローニングは、たとえば次の手順で行われる。

遺伝子の供与体としては、バチルス・リケニホルミスが
使用される。この微生物を使用することは、たとえば洗
浄補助剤に適した性質を有するアルカリ性プロテアーゼ
を生産するために好適である。

また、アルカリ性プロテアーゼの生産能の高い菌株ほ
ど、強力なプロモーターを持つていることが期待できる
ので、突然変異処理などにより生産能の高くなつた菌株
を使用することが望ましい。本発明ではバチルス・リケ
ニホルミスの公知菌株をニトロソグアニジンを変異誘起
剤として変異させて、プロテアーゼ生産能の高くなつた
変異株を使用している。

選ばれたアルカリ性プロテアーゼ生産菌株からアルカリ
性プロテアーゼ遺伝子をクローニングするには、この生
産菌株の染色体DNAを制限酵素で切断して断片化したの
ちバチルス・ズブチリスで保持されるベクタープラスミ
ドに連結してバチルス・ズブチリスのプロテアーゼ低生
産株を形質転換し、得られた形質転換体の中からプロテ
アーゼ生産能が高められた菌株を選択する方法がある。
しかしバチルス・リケニホルミスのアルカリ性プロテア
ーゼ遺伝子においては周辺に特殊な塩基配列が存在する
ためと思われるので、この方法ではクローニングするこ
とができない。

本発明ではこの問題を克服するために、エシエリヒア・
コリを宿主とする組換え体を作成して、バチルス・リケ
ニホルミスのアルカリ性プロテアーゼ遺伝子と相同なDN
Aを利用したコロニー・ハイブリダイゼーシヨン法によ
つてバチルス・リケニホルミスのアルカリ性プロテアー
ゼ遺伝子をクローニングした。

コロニーハイブリダイゼーシヨンに用いるバチルス・リ
ケニホルミスのアルカリ性プロテアーゼ遺伝子と相同な
DNAとしては次のようなものを用いることができる。

すなわち、バチルス・リケニホルミスのアルカリ性プロ
テアーゼのアミノ酸配列が既に明らかになつている〔M.
Ottensen,I.Svendsen:Methods in Enzymology,19,199,A
cademic Press,New York（1979）〕ので、このうちの任
意の位置の連続する５個〜６個程度のアミノ酸の配列に
対応する塩基配列をもつ、通常、14個〜18個程度の塩基
からなる一本鎖のオリゴヌクレオチドを相同なDNAとし
て用いることができる。ただし、一つのアミノ酸に対応
するコドンはアミノ酸の種類に応じて１個〜６個存在す
るので、前記のオリゴヌクレオチドは通常複数種類とな
るので、前記のアミノ酸配列は、それに対応するオリゴ
ヌクレオチドの種類が最も少なくなる領域を選ぶことが
望ましい。例えば、Ｎ末端から134番目から138番目まで
のアミノ酸配列（Met-Lys-Gln-Ala-Val）に対応する「A
TGAA（Ｘ）CA（Ｙ）GC（Ｚ）GT（X,Y:互に同一もしくは
異ってＡまたはＧ、Z:T、Ｃ、ＡまたはＧ）」なる塩基
配列をもつ16種の14塩基のオリゴヌクレオチドの混合物
があげられる。オリゴヌクレオチドの合成は市販のDNA
合成機を使用するか、公知の固相ホスホトリエステル法
〔H.Ito etal.:Nucleic Acids Res.,10,1755（1982）〕
などによつて行うことができる。合成されたDNAは高速
液体クロマトグラフイーなどによつて精製したのち、γ
³²P‐ATPとT4ポリヌクレオチドキナーゼを用いて５′末
端を³²Pで標識する。一方、バチルス・リケニホルミス
の菌体から染色体DNAを調製する。染色体DNAは、菌体を
リゾチーム処理後ドデシル硫酸ナトリウムを加えて加熱
することにより溶菌させたのちクロロホルム抽出を行う
Marmurの方法〔J.Marmur:J.Mol.Biol.,3,208（1961）〕
などにより調製される。この染色体DNAを制限酵素で切
断して断片化する。ここで用いる制限酵素としては特別
のものを必要としないが、断片を連結して組換えプラス
ミドを作成するのに用いるベクターの中に１ケ所の認識
部位が存在する制限酵素が適している。例えば大腸菌の
プラスミドpBR322をベクターとして用いる場合にはEcoR
I HindIII、BamHI,pstI,PvuIIなどの制限酵素があげら
れる。しかしながら、例えばBglIIとBamHIはそれぞれ と異なる塩基配列を認識する制限酵素であるが、切断さ
れて生ずるDNA断片の末端はそれぞれ となり互いにA/T、G/Cのペアーを形成しうる４塩基から
なる粘着末端となるため、T4DNAリガーゼを作用させる
と互いに連結することができるので、このような制限酵
素を用いれば染色体DNAを切断する制限酵素と、ベクタ
ープラスミドを切断する制限酵素が異なつても差支えな
い。また、PvuIIやSmaIのようにDNAの両鎖を同じ位置で
切断して平滑末端を生ずる制限酵素の場合にも異なる制
限酵素を組合せて使用することができる。他方、エシエ
リヒア・コリで保持されるベクタープラスミド、例えば
pBR322やPUC19などを染色体DNAの切断に使用した制限酵
素あるいは互いに連結することができる切断末端を生ず
る制限酵素で切断して線状とし、次いでアルカリ性フオ
スフアターゼで処理して５′末端のリン酸を脱離させ
る。この脱リン酸処理により、あとで加えるT4DNAリガ
ーゼによりプラスミドが元の環状DNAに戻るのを防ぐ。
次いで、染色体DNA断片と脱リン酸化された線状プラス
ミドを混合し、T4DNAリガーゼを加えて反応させること
により両DNAの間でリン酸結合を形成させて環状の組換
えプラスミドを作製する。なお、制限酵素で切断した染
色体DNA断片をアガロースゲル電気泳動で分画したの
ち、DNAをニトロセルロースフイルターに移しとつたフ
イルターに対して、先に合成して³²Pで標識されたオリ
ゴヌクレオチドをハイブリダイズさせたのちオートラジ
オグラフイーを行うことによつてオリゴヌクレオチドと
相同性のある塩基配列をもつ染色体DNA断片を検出する
サザンハイブリダイゼーシヨン法〔E.M.Southern:J.Mo
l.Biol.,98、503（1975）〕により、アルカリ性プロテ
アーゼ遺伝子の存在する断片の長さを求めておけば、染
色体DNA断片を予め分画して、この長さの断片を濃縮し
て使用すれば、後で述べるコロニーハイブリダイゼーシ
ヨンを効率よく行うことができる。特定の長さの断片の
濃縮は、たとえば染色体DNA断片をアガロースゲル電気
泳動で分画したのち、目的の長さの断片の泳動位置に相
当する部分のゲルを切り出し、電気泳動溶出法〔T.Mani
atis etal.:Molecular Cloning,p.164,Cold Spring Har
bor Laboratory（1982）〕などによりDNA断片を溶出す
ることによつて行うことができる。

染色体DNA断片とベクタープラスミドとを連結して得ら
れた組換えプラスミドを、予めたとえばMnCl₂-CaCl₂処
理により外来DNAを受け入れやすくした宿主微生物エシ
エリヒア・コリに移入して組換えプラスミドを保有する
形質転換体を得る。形質転換体は、使用したベクタープ
ラスミドに存在する薬剤耐性遺伝子の発現、すなわち、
例えばpBR322にHindIIIで切断した染色体DNA断片を連結
して作成した組換えプラスミドが移入されたエシエリヒ
ア・コリがアンピシリンを含有する培地上でも生育でき
るようになることを利用して選択することができる。こ
のようにして選択された多数（通常3,000〜10,000）の
形質転換体の中からコロニーハイブリダイゼーシヨン
〔M.Grunstein,J.Walls:Methods in Enzymology,68,37
9,Academic Press Inc.,New York（1979）〕によつてア
ルカリ性プロテアーゼ遺伝子を保有する形質転換体が選
択される。アルカリ性プロテアーゼ遺伝子保有株を検出
するためのプローブとして、先に合成して³²Pで標識さ
れたオリゴヌクレオチドを用いると、オートラジオグラ
フイーによつてアルカリ性プロテアーゼ遺伝子保有株の
コロニーに対応する位置のフイルムがハイブリダイズし
たプローブの³²Pの放射線によつて感光して黒いシグナ
ルとして検出される。コロニーハイブリダイゼーシヨン
を行う前にコロニーが形成されたニトロセルロースフイ
ルターから、別の新しいニトロセルロースフイルターに
レプリカをとつておくことによつて、対応するアルカリ
性プロテアーゼ遺伝子保有株が得られる。

しかし、また一方、次のようなDNAを用いてコロニーハ
イブリダイゼーシヨンを行つてもバチルス・リケニホル
ミスのアルカリ性プロテアーゼ遺伝子をクローニングす
ることができる。

すなわち、バチルス・リケニホルミスのアルカリ性プロ
テアーゼと70％の相同性のあるアルカリ性プロテアーゼ
を生産するバチルス・アミロリキエフアシエンスのアル
カリ性プロテアーゼ遺伝子は、バチルス・リケニホルミ
スのアルカリ性プロテアーゼ遺伝子と塩基配列の上でも
相同性が高いものと推測される。バチルス・アミロリキ
エフアシエンスの一菌株ATCC23844株のアルカリ性プロ
テアーゼ遺伝子の塩基配列は既に明らかになつている。
〔J.Wells etal:Nucleic Acids Res.,11,7911（1983）
参照〕ので、この塩基配列の中で、アルカリ性プロテア
ーゼの成熟タンパクの部分に対応する領域のうちから連
続する14個〜18個程度の塩基配列を任意に選び、これと
同じ配列をもつ一本鎖のオリゴヌクレオチドを合成し
て、前記のバチルス・リケニホルミスのアルカリ性プロ
テアーゼ遺伝子のクローニングと全く同じ方法でバチル
ス・アミロリキエフアシエンスのアルカリ性プロテアー
ゼ遺伝子でクローニングする。次に、この遺伝子を用い
て、これと相同性があると推測されるバチルス・リケニ
ホルミスのアルカリ性プロテアーゼ遺伝子がクローニン
グされる。

バチルス・リケニホルミスのアルカリ性プロテアーゼ遺
伝子のクローニングは、コロニーハイブリダイゼーシヨ
ンのプローブとしてバチルス・アミロリキエフアシエン
スのアルカリ性プロテアーゼ遺伝子を使用する以外は、
基本的には前記のバチルス・リケニホルミスのアルカリ
性プロテアーゼ遺伝子のクローニングと同じ方法で行わ
れる。すなわち、バチルス・リケニホルミスの染色体DN
Aを制限酵素で切断したDNA断片あるいはアルカリ性プロ
テアーゼ遺伝子を含むDNA断片を濃縮した画分とベクタ
ープラスミドをT4DNAリガーゼで連結した組換えプラス
ミドを用いてエシエリヒア・コリLE392を形質転換して
得られる形質転換体の中からコロニー・ハイブリダイゼ
ーシヨンによつてアルカリ性プロテアーゼ遺伝子を保有
する形質転換体が選択される。コロニーハイブリダイゼ
ーシヨンに使用されるプローブは、バチルス・アミロリ
キエフアシエンスのアルカリ性プロテアーゼ遺伝子を保
有する形質転換体から抽出されたプラスミドを制限酵素
で切断し、アガロースゲル電気泳動で分画してアルカリ
性プロテアーゼ遺伝子を含む断片を調製し、ニツクトラ
ンスレーシヨン〔P.W.J.Rigby etal.:J.Mol.Biol.,113,
237（1977）〕によつて³²Pで標識されたものが用いられ
る。なお、この場合プローブのDNAすなわちバチルス・
アミロリキエフアシエンスのアルカリ性プロテアーゼ遺
伝子とバチルス・リケニホルミスのアルカリ性プロテア
ーゼ遺伝子は、塩基配列が完全に同じではないのでハイ
ブリダイゼーシヨンによつて形成されるハイブリツドの
安定性は、全く同じ塩基配列をもつDNAのハイブリツド
に比べて低くなるので、ハイブリダイゼーシヨンを行う
温度は通常の温度42℃よりも下げ、25〜30℃付近で行う
必要がある。

このようにしてコロニーハイブリダイゼーシヨンによつ
て選択された形質転換体がアルカリ性プロテアーゼ遺伝
子を保有することは、この形質転換体からプラスミドを
抽出して、適当な制限酵素、例えば染色体DNAの切断に
使用した制限酵素で切断し、コロニーハイブリダイゼー
シヨンに使用した標識DNAをプローブとして、サザン・
ハイブリダイゼーシヨンを行い、オートラジオグラフイ
ーでシグナルを与える断片が検出されることによつて確
められる。

さらに、この組換えプラスミド上に存在するアルカリ性
プロテアーゼ遺伝子がその全領域を含むかどうかは、組
換えプラスミドを制限酵素で切断して挿入されている染
色体DNA断片を切り出し、この断片をバチルス属細菌で
保持されるベクタープラスミド、例えばpUB110やバチル
ス属細菌とエシエリヒア・コリの両方で保持されるシヤ
トルベクター、例えばpHY300PLKなどに連結してバチル
ス・ズブチリスのプロテアーゼ低生産株を形質転換し
て、組換えプラスミドが導入された形質転換体のプロテ
アーゼ生産能が高くなるかどうかを見ることによつて確
められる。

本発明ではこのプロテアーゼ低生産株として、バチルス
・ズブチリスRM125〔T.Uozumi etal:Molec.Gen.Genet.,
152,65（1977）〕をＮ−エチル−Ｎ′−ニトロ−Ｎ−ニ
トロソグアニジン（NTG）で変異処理して得たバチルス
・ズブチリスPW10（微工研菌寄第9176号）を用いてい
る。この菌株は１％カゼインを含むニユートリエント寒
天平板（カゼインプレート）に接種して37℃で一晩培養
しても、プロテアーゼの作用によつて形成されるハロー
（混濁した環）を作らないので、プロテアーゼ生産能の
高くなつた形質転換体はハローを形成することで確認す
ることができる。

組換えプラスミドによるバチルス・ズブチリスの形質転
換は、リゾチーム処理によりプロトプラストを形成して
ポリエチレングリコール存在下でDNAを取り込ませるプ
ロトプラスト法〔S.Chang,S.N.Cohen:Molec.Gen.Gene
t.,168,111（1979）〕あるいはグルコース最小培地で生
育させることによりDNAを受け入れやすくなつたコンピ
テントセルを用いる方法〔D.Dubnan,R.D.Abelson:J.Mo
l.Biol.,56,209（1971）〕などによつて行われる。

バチルス・ズブチリスに導入して、プロテアーゼ生産能
が発現し、生産されたプロテアーゼがバチルス・リケニ
ホルミスのアルカリ性プロテアーゼと同じ性質、例え
ば、分子量や免疫学的性質が同じものであれば、アルカ
リ性プロテアーゼ遺伝子の全領域がクローニングされた
と判断される。しかし、バチルス・ズブチリスに移入し
てもプロテアーゼ生産能が発現しない場合には、遺伝子
の一部が欠如しているので、欠如した部分をクローニン
グするために再度コロニーハイブリダイゼーシヨンが行
われる。

この時には、組換えプラスミドを作成するのに使用する
染色体DNA断片は、はじめに用いられた制限酵素と異な
る種類のものを用いて切断されたものを使用すれば、こ
こでクローニングされたアルカリ性プロテアーゼ遺伝子
の一部を含む断片をプローブとしてコロニーハイブリダ
イゼーシヨンを行うことができ、この断片に隣接する領
域すなわちアルカリ性プロテアーゼ遺伝子のうちの欠如
している領域を含む遺伝子を保有する形質転換体を効率
良くスクリーニングすることができる。

このようにして隣接する遺伝子断片が得られれば、この
断片とはじめに得られた遺伝子断片とを連結して、アル
カリ性プロテアーゼ遺伝子の全領域を有する遺伝子を構
成することができる。勿論、あとで得られた組換えプラ
スミドに挿入された断片内にアルカリ性プロテアーゼ遺
伝子の全領域が含まれている場合には上記の操作は必ず
しも必要ではない。

前記のようにクローニングされた遺伝子あるいは再構成
された遺伝子がアルカリ性プロテアーゼ遺伝子の全領域
を含むことは、この遺伝子をバチルス属細菌で保持され
るベクタープラスミドに連結して、バチルス・ズブチリ
スのプロテアーゼ低生産株を形質転換して、アルカリ性
プロテアーゼの生産能が発現することを指標にして確め
られる。

このようして得られたアルカリ性プロテアーゼ遺伝子を
含む組換えプラスミドは、必要に応じてさらにアルカリ
性プロテアーゼの発現に不要な領域を除いて組換えプラ
スミドの縮小が行われる。このような組換えプラスミド
の縮小は塩基配列の決定の労力の軽減と組換えプラスミ
ドを保有する宿主細菌の負担を軽減して遺伝子の発現を
効率良く行わせるために有効である。

アルカリ性プロテアーゼ遺伝子の全領域を含むDNA断片
の塩基配列は、当該断片を含む組換えプラスミドを保有
するエシエリヒア・コリLE392あるいはバチルス・ズブ
チリスの対数増殖期の菌体からClewellとHelinskiの方
法〔D.B.Clewell,D.R.Helinski:Proc.Natl.Acad.Sci.,U
SA,62,1159（1969）〕などによつて組換えプラスミドを
抽出、精製し、制限酵素で切断してアルカリ性プロテア
ーゼ遺伝子を含む断片を回収して、M13ジデオキシチエ
インターミネーシヨン法〔J.Messing:Methods in Enzym
ol.,101,20、Academic Press,New York（1983）;F.Sang
er:Science,214,1205（1981）〕などによつて決定され
る。

また、組換えプラスミドを導入する際のバチルス属細菌
としては特に制限はないが、アミラーゼ、レバンシユー
クラーゼや中性プロテアーゼなどの生産能の低い菌株あ
るいは、アレルギーの原因物質の生産能の低い菌株を使
用して形質転換体を作製してこれを培養すれば、アルカ
リ性プロテアーゼの回収、精製がさらに容易に行うこと
ができるようになるので好ましい。

アルカリ性プロテアーゼ遺伝子の全領域を組む遺伝子DN
Aが連結された組換えプラスミドに移入して形質転換さ
れたバチルス属細菌を用いてアルカリ性プロテアーゼを
生産するには常法でよい。すなわち、炭素源、窒素源、
無機イオン、さらに必要に応じてビタミン等の微量有機
栄養源を含有する培地を用いて、好気的条件下でpH、温
度を適宜調節しながら所望のアルカリ性プロテアーゼが
蓄積されるまで培養を行えば良い。

培養液からのアルカリ性プロテアーゼの回収についても
通常の方法で行うことができる。すなわち、培養終了
後、遠心分離などの方法で菌体を除去した上清にエタノ
ールやアセトンなどの有機溶媒あるいは硫酸アンモニウ
ムなどの無機塩類を加えて生ずる沈殿を回収すれば良
い。

また、クローニングされたバチルス・リケニホルミスの
アルカリ性プロテアーゼ遺伝子を利用して成長ホルモン
などの異種生物由来の有用タンパク質を分泌生産するた
めには、アルカリ性プロテアーゼ遺伝子のプロモーター
の全領域、リボゾーム結合領域および構造遺伝子内の分
泌に関与する領域を含む組換えプラスミドに、該有用タ
ンパク質のアミノ酸配列に対応する暗記配列をもつDNA
断片を分泌に関与する領域の下流域に隣接して連結した
組換えプラスミドを作成して、バチルス属細菌に導入し
て得られる形質転換体を培養すれば良い。

〔実施例〕

以下、実施例によりさらに具体的に本発明を説明する
が、本発明はこれらに限定されるべきものではない。

なお、本発明で使用する制限酵素およびT4ポリヌクレオ
チドキナーゼ、T4DNAリガーゼ、アルカリ性フオスフア
ターゼ、DNAポリメラーゼＩなどのDNA修飾酵素はすべて
市販品として入手でき、例えば宝酒造株式会社、東洋紡
績株式会社などより購入することができる。またベクタ
ープラスミドも市販されているものであるが、本発明で
は市販品の他、当該プラスミドを保有するエシエリヒア
・コリあるいはバチルス・ズブチリスから抽出して精製
したものを使用している。

実施例１ バチルス・アミロリキエフアシエンスのアルカリ性プロ
テアーゼ遺伝子のクローニング （１）プローブ用オリゴヌクレオチドの合成と³²Pによ
る標識 バチルス・アミロリキエフアシエンスATCC23844のアル
カリ性プロテアーゼ遺伝子の塩基配列はJ.A.Wellsらに
よつて報告されている〔J.A.Wells etal.:Nucleic Acid
s Res.,11,7911（1983）〕。報告された塩基配列のうち
アルカリ性プロテアーゼの成熟タンパクのＮ末端から８
番目から13番目のアミノ酸に対応する領域にある、ATCA
CAAATTAAAGCCなる塩基配列をもつ16個の塩基からなるオ
リゴヌクレオチドをプローブとして選び、固相ホスホト
リエステル法によつて合成した。オリゴヌクレオチドの
合成には、Pharmacia P-L Biochemicals社製の５種の
３′−クロロフエニルリン酸保護デオキシジヌクレオチ
ド（GC、AA、TT、CAおよびAT）と同仁化学研究所製の完
全保護デオキシモノヌクレオチド（Ａ）および和光純薬
工業製のポリスチレンサポート保護ヌクレオシド（Ｃ−
レジン）を用いた。

5.5mg（0.55μモル）のＣ−レジンに1M臭化亜鉛のジク
ロルメタン−イソプロパノール（85:15、V/V）溶液0.6m
lを加え室温（20〜30℃）で３分間反応させたのち、反
応液を除き1mlのジクロルメタン−イソプロパノール（8
5:15V/V）でレジンを洗浄した。前記の操作をさらに２
回繰返したあと、レジンをさらに1mlのジクロルメタン
−イソプロパノール（85:15V/V）で３回、1mlの0.5Mト
リエタノールアミン−酢酸（pH7.5）で３回、1mlの乾燥
ピリジンで２回、1mlの乾燥テトラヒドロフランで２回
で順次洗浄した。洗浄後のレジンを減圧乾燥したのち、
100mMのGC溶液（0.45Mトリメチルベンゼンスルホニルニ
トロトリアゾリド−乾燥ピリジン溶液に溶解）を55μｌ
加え、37℃で40分間反応させてＣ−レジンに塩基を付加
した。次に反応液を除き、1mlの乾燥ピリジンで洗浄
後、キヤツピング溶液（乾燥テトラヒドロフラン：無水
酢酸：乾燥ピリジン＝7:1:2、V/V）に溶解した33.3mg/m
lジメチルアミノピリジンを0.6ml加えて室温で５分間反
応させて未反応の５′−水酸基をアセチル化した。反応
液を除いたあと1mlのジクロルメタン−イソプロピルア
ルコール（85:15V/V）でレジンを４回洗浄した。これま
での工程で、レジンに３個の塩基が結合したGCC−レジ
ンが得られた。これまでの一連の工程を１サイクルとし
て、各サイクルで塩基が付加されたレジンを次のサイク
ルの出発物質として、所定のジヌクレオチドまたはモノ
ヌクレオチドすなわち、AA、Ａ、TT、AA、CA、CA、ATを
付加する反応を順次繰返すことによつてATCACAAATTAAAG
CC−レジンが合成された。

このようにして合成されたオリゴヌクレオチドが固定さ
れたレジンを1mlの乾燥ピリジンで３回洗浄後、0.5Mテ
トラメチルグアニジン−0.5Mニトリロベンズアルドキシ
ムの50％ジオキサン溶液300μｌを加えて、37℃で18時
間保ち、レジンからオリゴヌクレオチドを切り出すと共
にリン酸基の脱保護を行つた。次に反応液を回収し、レ
ジンを500μｌの50％ピリジンで２回洗浄した洗浄液と
混合して減圧乾燥した。これに28％アンモニア水0.6ml
を加えて55℃で６時間保ち塩基の脱保護を行つた。減圧
下でアンモニアを除き、さらに等容のエーテルで抽出を
行つたのち約100μｌまで濃縮し、これに2.6μｌの2Mト
リエチルアミン−酢酸（pH7.0）を加えた。この溶液を
ゾルバツクスODSのカラム（DuPont社製）を用いた高速
液体クロマトグラフイーにかけ、50mMトリエチルアミン
−酢酸（pH7.0）溶液中10-40％のアセトニトリル直線濃
度勾配によつて分画し、メインピークに相当する画分を
回収した。回収した画分を減圧乾燥したのち1mlの80％
酢酸を加えて室温で20分間保ち５′末端の脱保護を行
い、減圧下で酢酸を除いて精製オリゴヌクレオチド160
μｇを得た。

このようにして得た精製オリゴヌクレオチド96ngにγ³²
P‐ATP（5000Ci/m mol Amersham社製）100μCi、T4ポリ
ヌクレオチドキナーゼ2.2ユニツトおよびキナーゼ緩衝
液（50mMトリス−塩酸緩衝液pH7.5、10mMMgCl₂、10mMジ
チオスレイトール、濃度は最終濃度）を加えた反応液30
μｌを37℃で60分間保ち、５′末端を³²Pで標識した。
反応液に20μｇの酵母tRNAと75μｌのエタノールを加え
てオリゴヌクレオチドを沈殿させ、遠心分離により回収
した沈殿をエタノールで洗浄し、乾燥後、100μｌのTE
緩衝液（10mMトリス−塩基緩衝液pH8.0、1m MEDTA）に
溶解して、５′末端が標識されたオリゴヌクレオチドの
溶液（0.3μCi/μｌ）を得た。

（２）染色体DNAの調製 20mlのニユートリエントブロス（肉エキス0.5wt％、ポ
リペプトンS 1wt％、NaCl0.5wt％、pH7.0）にバチルス
・アミロリキエフアシエンスATCC23844を寒天斜面から
１白金耳接種し、37℃で一晩前培養を行つた。次いでそ
の5mlを500mlの同培地に接種して約2.5時間培養し、得
られた菌体を遠心分離により集めた。この菌体を50mlの
150mM NaCl/100mM EDTA溶液（pH8）で洗浄後、25mlの同
溶液に懸濁し、10mgのリゾチーム（Sigma社製）を加え
て37℃で30分間保持した。次いで20％ドデシル硫酸ナト
リウム（SDS）2.5mlを加えてゆつくりと混合したのち60
℃で10分間保ち溶菌させた。溶菌液を室温まで冷却後、
5M過塩素酸ナトリウム6.6mlとクロロホルム−イソアミ
ルアルコール（24:1,V/V）混合液31.6mlを加え、ゆつく
りと混合して均一なエマルジヨンとした。これを10,000
rpm、10分間遠心分離にかけて水層、中間層、有機層の
三層に分け、水層を採取した。この水層に２倍容のエタ
ノールを加え、生じた糸状沈殿をガラス棒に巻き取り、
この沈殿を70％および99.5％エタノールで順次洗浄した
のち減圧乾燥した。これを15mlの0.1×SSC（１×SSCは1
50mM NaCl、15mMクエン酸三ナトリウムに相当し、0.1×
SSCの数字は各成分の１×SSCに対する濃度比を表わす。
すなわち0.1×SSCは１×SSCの1/10の濃度の溶液である
ことを示す。以下この表示方法に準ずる）に溶解後10×
SSC1.5mlを加え、これに、90℃で10分間加熱処理して混
在するDNaseを失活させた5mg/mlのRNaseA（Sigma社製）
165μｌを加えて37℃で30分間保ち混入するRNAを分解し
た。RNaseAを除くために等容器のフエノール−クロロホ
ルム（1:1,V/V,0.1M Tris−塩酸緩衝液pH7.5で飽和）を
加えてゆつくりと混合して均一なエマルジヨンを形成さ
せ、遠心分離を行つて分離する水層を採取した。この水
層に等容のクロロホルム−イソアミルアルコール（24:
1,V/V）を加えて前記同様抽出を行つて水層を採取する
操作を２回繰返した。このようにして得られた水層に２
倍容のエタノールを加えて生じた糸状沈殿を前記と同様
にして回収して、エタノール洗浄及び乾燥した。これを
10mlのTE緩衝液に溶解して染色体DNA溶液（DNA5.6mg）
を得た。

（３）アルカリ性プロテアーゼ遺伝子の存在する染色体
DNA断片の長さの算出 前記（２）で得られた染色体DNA60μｇと120ユニツトの
HindIII及びHindIII反応緩衝液（10mM Tris−塩酸緩衝
液pH7.5、7mMMgCl₂、60mM NaCl、濃度は最終濃度）を含
む反応液600μｌを37℃で３時間保持してDNAを切断した
のち、2.5倍量のエタノールを加えてDNAを沈殿させた。
遠心分離により沈殿を回収して、180μｌのTE緩衝液に
溶解して染色体DNAのHindIII断片溶液を得た。この溶液
15μｌをアガロースゲル電気泳動で分画した。この時、
DNA断片の長さを算出するための分子量マーカーとして
λフアージDNAをHindIIIで切断したDNA1μｇを同時に泳
動した。泳動後、ゲルを１μg/mlのエチジウムブロミド
溶液に浸漬してDNAを染色したのち、ゲルの３倍容の0.2
5NHCl、0.5N NaOH-1M NaClおよび0.5M Tris−塩酸緩衝
液（pH7.5）‐3M NaClで15分間、２回ずつ順次処理して
DNAを変性させた。このゲルにニトロセルロースフイル
ターを密着させ紙を通じてゲルの下より20×SSCを供
給しながら約16時間放置してニトロセルロースフイルタ
ーにDNAを移しとつた。このフイルターを乾燥後、減圧
下80℃で２時間処理してDNAをフイルターに固定した。

このフイルターをビニール袋に収納し、プレハイブリダ
イゼーシヨン溶液〔５×Denhardt液（１×Denhardt液は
0.02wt％フイコール、0.02wt％牛血清アルブミン、0.02
wt％ポリビニルピロリドン）、５×SSC、50mMリン酸緩
衝液pH6.5、100μg/ml変性サケ***DNA〕20mlを加えて
ビニール袋を密封し、55℃で一晩保持してプレハイブリ
ダイゼーシヨンを行つた。次いで、ビニール袋からプレ
ハイブリダイゼーシヨン溶液を除き、ハイブリダイゼー
シヨン溶液〔組成はプレハイブリダイゼーシヨン溶液と
同じ〕4mlと、前記（１）で得られた³²Pで標識されたオ
リゴヌクレオチド２μCiを95℃で５分間熱処理後、急冷
した溶液を加えてビニール袋を密封した。袋中の溶液を
よく混合したのち、37℃で約16時間保持してハイブリダ
イゼーシヨンを行つた。その後、フイルターをとり出し
約200mlの４×SSC-0.1％SDS溶液中で室温で10分間ずつ
３回洗浄し、乾燥後、フイルターにＸ線フイルムを密着
させて−80℃で16時間感光させた。Ｘ線フイルムを、現
像して黒化した部分を分子量マーカーの泳動位置と比較
して、アルカリ性プロテアーゼ遺伝子の存在する染色体
DNA断片の長さを算出すると2.8kb（kbはキロ塩基対の
略、以下同じ）であつた。

（４）染色体DNA断片の分画 前記（３）で調製された染色体DNAのHindIII断片の溶液
150μｌ（DNA50μｇ）をアガロースゲル電気泳動で分画
し、エチジウムブロミドで染色したのち、ゲルに紫外線
ランプを照射し、分子量マーカーのλフアージDNAの断
片の位置より算出される1.8〜4.5kbの断片に相当する位
置のゲル片を切り出した。

このゲル片を透析膜に入れTE緩衝液2mlを満たしてシー
ルしたのち、トリス・ホウ酸緩衝液（90mMトリズマベー
ス、90mMホウ酸、4mM EDTA、pH8.3）中で100V、１時間
電気泳動を行つてDNAをゲルから溶出させた。溶出液を
回収して2.5倍量のエタノールを加えてDNAを沈殿させ、
遠心分離により沈殿を回収して、乾燥後、40μｌのTE緩
衝液に溶解して1.8〜4.5kbの染色体DNA断片約８μを得
た。

（５）ベクタープラスミドの調製 プラスミドpBR322を保有するエシエリヒア・コリLE392
（ATCC33572）を１のNZYM培地〔NZアミン・タイプＡ
（和光純薬工業）1wt％、ポリペプトンS0.5wt％、NaCl
0.5wt％ 10mMMgCl₂、pH7.2〕に50μg/mlのアンピシリン
を加え培地で37℃で10⁹菌体/mlまで培養し、これにクロ
ラムフエニコールを100mg加え、さらに16時間培養し
た。遠心分離により集めた菌体からClewellとHelinski
の方法〔D.B.Clewell,D.R.Helinski:Proc.Natl.Acad.Sc
i.,USA,62,1159（1969）〕によつて粗プラスミド画分の
抽出及びCsCl−エチジウムブロミド平衡密度勾配遠心分
離（日立分離用超遠心分離機85P、ローターRP83T、33,0
00rpm、40時間、20℃）による分画を行いプラスミド画
分を得た。この画分を等容のイソプロパノールで抽出し
てエチジウムブロミドを除去したのち、TE緩衝液１に
対して１時間ずつ２回透析して精製プラスミドpBR322を
1.5mg得た。

このプラスミドpBR322 20μｇを40ユニツトのHindIIIと
37℃で３時間反応させて切断後、エタノール沈殿および
乾燥を行い200μｌの10mMトリス−塩酸緩衝液pH8.0に溶
解した。これに0.2ユニツトの大腸菌アルカリ性フオフ
スアターゼを加えて65℃で30分間反応させた。反応後、
等容のフエノール・クロロホルム（1:1,V/V）を加えて
５分間振とうして抽出した。遠心分離により二層を分離
し、水層を採取した。この水層を再度フエノール・クロ
ロホルム抽出したのち、等容のクロロホルム・イソアミ
ルアルコール（24:1,V/V）で同様に２回抽出した。水層
に500μｌのエタノールを加えてDNAを沈殿させ、遠心分
離により沈殿を回収して乾燥後、100μｌの水に溶解し
た。このようにしてHindIIIで切断され、５′末端が脱
リン酸化された線状のベクタープラスミドpBR322を得
た。

（６）組換えプラスミドの作製 前記（４）で得られた1.8〜4.5kbの染色体DNA断片約４
μｇ（20μｌ）と、前記（５）で得られたHindIIIで切
断され５′末端が脱リン酸化された線状のベクタープラ
スミドpBR322 2μｇ（10μｌ）とを混合し、これに0.8
ユニツトのT4DNAリガーゼおよびリガーゼ緩衝液〔66mM
Tris−塩酸緩衝液pH7.6、6.6mMMgCl₂、10mMジチオスレ
イトール、2mM ATP、濃度は最終濃度〕を加えた反応液4
0μｌを５℃で16時間保ち、両DNAを連結して組換えプラ
スミドを作製した。

（７）組換えプラスミドによるエシエリヒア・コリの形
質転換およびアルカリ性プロテアーゼ遺伝子保有株の選
択 エシエリヒア・コリLE392をNZYM培地5mlに接種して一晩
培養した前培養液0.2mlを、20mlのNZYM培地に接種して3
7℃で2.5時間培養した。遠心分離により菌体を集め10ml
の10mM NaClで洗浄後、10mlのMn-Ca溶液（70mMMnCl₂、3
0mMCaCl₂、40mM酢酸ナトリウムpH5.6）に懸濁して氷中
で15分間保つたのち、遠心分離で菌体を集め0.5mlのMn-
Ca溶液に懸濁して、DNAを受け入れやすくした細胞を得
た。この懸濁液0.4mlに、前記（６）で得られた組換え
プラスミド溶液30μｌ（DNA約4.5μｇ）を加えて混合
し、氷中で60分間保つたのち、37℃で２分間加温して細
胞に組換えプラスミドを取込ませた。これにNZYM培地1.
6mlを加えて37℃で30分間振とうしたのち、25μg/mlの
アンピシリンを含むNZYM寒天平板上にニトロセルロース
フイルターを敷いたプレート上に100μｌずつ塗布し
た。このプレートを37℃で一晩培養し、アンピシリン耐
性となつた形質転換体のコロニーを7900個得た。次に、
このフイルターをマスターフイルターとして、この上に
新しいニトロセルロースフイルターを密着させてレプリ
カをとつた。両フイルターを新しい寒天平板（25μg/ml
アンピシリン含有NZYM培地）上に移して37℃で一晩培養
し、マスターフイルターをのせたプレートは保存した。
一方、レプリカフイルターは200μg/mlのクロラムフエ
ニコールを含むNZYM寒天平板に移し、さらに37℃で一晩
培養を継続した。

次いで、このフイルターを次の４種の溶液で湿めらせた
紙の上で、順次、10分間ずつ保ち菌体内のDNAを溶出
させフイルター上に吸着させた。４種の溶液として、
0.5N NaOH1M Tris−塩酸緩衝液pH8.00.5M Tris−塩
酸緩衝液pH8.0−1M NaCl２×SSCをそれぞれ用いた。
このように処理したフイルターを乾燥し、前記（３）と
同様の操作でDNAをフイルターに固定した。

次いでこのフイルターを用いて、前記（１）で得られた
³²Pで標識されたオリゴヌクレオチドをプローブとして
前記（３）と同じ方法でプレハイブリダイゼーシヨン、
ハイブリダイゼーシヨンおよびオートラジオグラフイー
を行つた結果、オートラジオグラム上に１個のシグナル
が検出された。このシグナルに対応する形質転換体をマ
スターフイルターからとりアルカリ性プロテアーゼ遺伝
子を含む組換えプラスミドを保有する形質転換体を得
た。

（８）アルカリ性プロテアーゼ遺伝子を含む組換えプラ
スミドの同定 前記（７）で得られた形質転換体から、pBR322と同じ方
法でプラスミドを調製すると、13kbの長さのプラスミド
が得られ、このプラスミドをpAMP3（第１図参照）と命
名した。pAMP3を、第１図に記載の制限酵素で切断し、
アガロースゲル電気泳動で分画して検出された断片のサ
イズを算出した結果をもとにして、第１図の制限酵素地
図が作成され、このプラスミドはベクタープラスミドpB
R322 2分子と２つの染色体DNAのHindIII断片（2.8kbと
1.4kb）が連結されたものであることがわかつた。

２つの染色体DNA断片のうち、2.8kbの断片（第１図にお
ける斜線部分）がサザン・ハイブリダイゼーシヨンでプ
ローブのオリゴヌクレオチドとハイブリダイズし、前記
（３）で算出された長さと一致することから、この断片
にアルカリ性プロテアーゼ遺伝子が含まれていると判断
された。

なお、組換えプラスミドpAMP3を保有するエシエリヒア
・コリLE392（pAMP3）は微工研菌寄第9175号として工業
技術院微生物工業技術研究所に寄託されている。

実施例２ バチルス・リケニホルミスのアルカリ性プロテアーゼ遺
伝子のクローニング （１）プローブ用DNA断片の調製と³²Pによる標識 実施例１で得られた組換えプラスミドpAMP3をHindIIIで
切断して得られる2.8kbの断片には、バチルス・アミロ
リキエフアシエンスのアルカリ性プロテアーゼ遺伝子が
存在するので、この断片をプローブとして用いた。

30μｇのpAMP3を、60ユニツトのHindIIIと37℃で３時間
反応させて切断したのち、2.5倍容のエタノールを加え
てDNAを沈殿させた。遠心分離により沈殿を回収し、150
μｌのTE緩衝液に溶解してアガロースゲル電気泳動によ
り分画した。エチジウムブロミドでゲルを染色し、紫外
線ランプを照射すると３本のバンドが検出された。これ
らのうち、2.8kbの長さをもつ真中のバンドを切り出
し、実施例１（４）と同様に電気泳動法でDNAを溶出さ
せ、エタノール沈殿によりDNAを回収した。DNAを乾燥後
60μｌのTE緩衝液に溶解して約６μｇのDNA断片溶液を
得た。

このDNA断片溶液10μｌ（DNA約１μｇ）にα³²P‐dCTP
（410Ci/mmol、Amersham社製）50μCi、120ng/ml DNase
I（ベーリンガー・マンハイム・山之内社製）2.5μｌお
よびニツクトランスレーシヨン緩衝液〔50mM Tris−塩
酸緩衝液pH7.8、5mMMgCl₂、10mM2−メルカプトエタノー
ル、15μg/ml牛血清アルブミン、0.6mM dATP、0.6mM dG
TP、0.6mM dTTP、濃度は最終濃度〕を加えた反応液50μ
ｌを27℃で30分間保温したのち、５ユニツトのDNAポリ
メラーゼＩを加えて14℃で、さらに60分間ニツクトラン
スレーシヨン〔P.W.J.Rigby etal.:J.Mol.Biol.,113、2
37（1977）〕を行つて³²Pで標識されたDNAを合成した。

この反応生成液に20μｇの酵母tRNAと125μｌのエタノ
ールとを加えてDNAを沈殿させ、遠心分離によりDNAを回
収して乾燥後、100μｌのTE緩衝液に溶解して³²Pで標識
されたプローブDNA（0.2μCi/μｌ）を得た。

（２）遺伝子供与体の調製 バチルス・リケニホルミスの公知菌株を検索し、プロテ
アーゼ生産能の高い菌株としてIFO12196株を選んだ。

バチルス・リケニホルミスIFO12196をＮ−エチル−Ｎ′
−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジンを変異誘起剤として
通常に行われる変異処理を行い、カゼイン1wt％を含む
ニユートリエントアガー（肉エキス0.5wt％、ペプトン1
wt％、NaCl0.5wt％、寒天1.5wt％、pH7.0）上で大きな
ハローを形成する変異株HP19611を誘導して、アルカリ
性プロテアーゼ遺伝子の供与体とした。バチルス・リケ
ニホルミスHP19611は微工研菌寄第9177号として工業技
術院微生物工業技術研究所に寄託されている。

（３）染色体DNAの調製 バチルス・リケニホルミスHP19611の染色体DNAは、実施
例１（２）と全く同じ方法で調製し、9.7mgの染色体DNA
を得た。

（４）アルカリ性プロテアーゼ遺伝子の存在する染色体
DNA断片の長さの算出 前記（３）で得られた染色体DNA60μｇと120ユニツトの
EcoRI及びEcoRI反応緩衝液〔100mM Tris−塩酸緩衝液pH
7.5、7mMMgCl₂、50mM NaCl、7mM2−メルカプトエタノー
ル、0.01wt％牛血清アルブミン、濃度は最終濃度〕を含
む反応液600μｌを37℃で３時間保持してDNAを切断した
のち、2.5倍量のエタノールを加えてDNAを沈殿させた。
遠心分離により沈殿を回収して、180μｌのTE緩衝液に
溶解して染色体DNAのEcoRI断片溶液を得た。この溶液15
μｌを、実施例１（３）と全く同じ方法で電気泳動およ
びニトロセルロースフイルターへのDNAの転写、固定を
行つた。

このようにして作成されたフイルターを用いてハイブリ
ダイゼーシヨンを行つた。フイルターをビニール袋に収
納してプレハイブリダイゼーシヨン溶液〔50％ホルムア
ミド、５×Denhardt液、５×SSC、50mMリン酸緩衝液pH
6.5、1wt％グリシン、500μg/ml変性サケ***DNA〕20ml
を加えて密封して、42℃で一晩保持してプレハイブリダ
イゼーシヨンを行つた。

次いで、ビニール袋からプレハイブリダイゼーシヨン溶
液を除き、ハイブリダイゼーシヨン溶液〔50％ホルムア
ミド、１×Denhardt液、５×SSC、20mMリン酸緩衝液pH
6.5、100μg/ml変性サケ***DNA、10％デキストラン硫
酸ナトリウム〕4mlと、前記（１）で得られた³²Pで標識
されたプローブDNA2μCiを95℃で５分間熱処理後急冷し
た溶液を加えてビニール袋を密封した。袋の中の溶液を
よく混合したのち、25℃で16時間保持してハイブリダイ
ゼーシヨンを行つた。

その後、フイルターをとり出し約200mlの２×SSC−0.1
％SDS溶液中で室温で10分間ずつ３回洗浄後、乾燥して
実施例１（３）と同様にオートラジオグラフイーを行つ
た。オートラジオグラムのシグナルの位置からバチルス
・リケニホルミスのアルカリ性プロテアーゼ遺伝子の存
在する染色体DNA断片の長さは3.4kbと算出された。

（５）染色体DNA断片の分画 前記（４）で得られた染色体DNAのEcoRI断片溶液150μ
ｌ（DNA50μｇ）を用いて実施例１（４）と同様の処理
を行つて、３〜4kbの染色体DNA断片約５μｇ（25μｌ）
を得た。

（６）ベクタープラスミドの調製 実施例１（５）で得られたプラスミドpBR322 20μｇ
を、40ユニツトのEcoRIと37℃で３時間反応させて切断
した。以後、実施例１（５）と同様の処理を行つて、Ec
oRIで切断され、５′末端が脱リン酸化された線状のベ
クタープラスミドpBR322を得た。

（７）組換えプラスミドの作製 前記（５）で得られた３〜4kbの染色体DNA断片約４μｇ
（20μｌ）と、前記（６）で得られたEeoRIで切断され
５′末端が脱リン酸化された線状のベクタープラスミド
pBR322 2μｇ（10μｌ）とを混合し、実施例１（６）と
同様にT4DNAリガーゼを作用させて組換えプラスミドを
作製した。

（８）組換えプラスミドによるエシエリヒア・コリの形
質転換およびアルカリ性プロテアーゼ遺伝子保有株の選
択 前記（７）で得られた組換えプラスミド溶液30μｌ（DN
A約4.5μｇ）を用いて、実施例１（７）と同様にMn-Ca
処理されたエシエリヒア・コリLE392を形質転換して、
アンピシリン耐性の形質転換体のコロニーを5800個得
た。コロニーが形成されたフイルターを実施例１（７）
と同様に処理してDNAの固定を行つたのち、前記（４）
と同じ条件でハイブリダイゼーシヨンを行い、オートラ
ジオグラム上に６個のシグナルを検出した。

これらのシグナルに対応する６株の形質転換体をマスタ
ーフイルターから分離し、実施例１（８）と同様にして
これらの形質転換体の保有する組換えプラスミドの同定
を行うと、これらにはすべてプローブのバチルス・アミ
ロリキエフアシエンスのアルカリ性プロテアーゼ遺伝子
とハイブリダイズする3.4kbのEcoRI断片が挿入されてい
た。これらのうちの１株の保有する組換えプラスミドを
pLP3（第２図参照）と命名した。このプラスミドを保有
するエシエリヒア・コリLE392（pLP3）は微工研菌寄第9
178号として工業技術院微生物工業技術研究所に寄託さ
れている。

組換えプラスミドpLP3に含まれる3.4kbのEcoRI断片を、
バチルス属細菌で保持されるベクタープラスミドpUB110
に連結してバチルス・ズブチリスに導入してもアルカリ
性プロテアーゼの発現は見られないので、この断片には
アルカリ性プロテアーゼ遺伝子の一部しか含まれていな
いと判断された。また、組換えプラスミドpLP3をEcoRI
とBglIIで切断して、前記（４）と同様にしてサザンハ
イブリダイゼーシヨンを行うと第２図に示される斜線部
分の1.2kbの断片にプローブがハイブリダイズするの
で、この断片のEcoRI部位に隣接する領域にアルカリ性
プロテアーゼ遺伝子の欠如している部分が存在すること
がわかる。そこで、この欠如した部分を改めてクローニ
ングするために再度組換えプラスミドを作製してコロニ
ーハイブリダイゼーシヨンを行つた。

バチルス・リケニホルミスHP19611の染色体DNA20μｇ
と、40ユニツトのBglIIおよびBglII反応緩衝液〔10mM T
ris−塩酸緩衝液pH7.5、7mMMgCl₂、100mM NaCl、7mM2−
メルカプトエタノール、濃度は最終濃度〕を含む反応液
200μｌとを37℃で３時間保持してDNAを切断し、65℃で
10分間加熱処理したのち、500μｌのエタノールを加え
てDNAを沈殿させた。遠心分離により沈殿を回収し、乾
燥後100μｌの水に溶解して染色体DNA断片を調製した。

一方、ベクタープラスミドはpBR322 20μｇと40ユニツ
トのBamHIおよびBamHI反応緩衝液〔10mM Tris−塩酸緩
衝液pH8.0、7mMMgCl₂、100mM NaCl、2mM2−メルカプト
エタノール、0.01wt％牛血清アルブミン、濃度は最終濃
度〕を含む反応液200μｌを37℃で３時間保持してDNAを
切断後、実施例１（５）と同様の処理を行つて、BamHI
で切断され５′末端が脱リン酸化された線状のベクター
プラスミドpBR322を調製した。

このようにして調製された染色体DNA断片４μｇと、Bam
HIで切断され５′末端が脱リン酸化されたベクタープラ
スミドpBR322 2μｇとを混合し、実施例１（６）と同様
にT4DNAリガーゼを作用させて組換えプラスミドを作製
した。

この組換えプラスミド溶液20μｌ（DNA3μｇ）を用いて
実施例１（７）と同様にMn-Ca処理されたエシエリヒア
・コリLE392を形質転換してアンピシリン耐性の形質転
換体のコロニーを7900個得た。

コロニーが形成されたフイルターを実施例１（７）と同
様に処理したのち、前記（４）と同様の方法でハイブリ
ダイゼーシヨンを行つた。ただし、プローブには、組換
えプラスミドpLP3をEcoRIとBglIIで切断して前記（１）
と同様の方法で分画して得られた1.2kbの断片をニツク
トランスレーシヨンによつて³²Pで標識されたDNAを用
い、ハイブリダイゼーシヨンは42℃で行つた。また、フ
イルターの洗浄は２×SSC−0.1％SDS溶液中での洗浄を
行つたあと、さらに0.1×SSC−0.1％SDS溶液中で42℃で
15分間ずつ２回洗浄を行つた。

このようにして、オートラジオグラム上に１個のシグナ
ルを検出した。このシグナルに対応する形質転換体をマ
スターフイルターから分離し、保有する組換えプラスミ
ドを実施例１（８）とと同様の方法で固定すると第３図
の制限酵素地図で示される9.6kbのプラスミドであるこ
とが示され、この組換えプラスミドをpLP35と命名し
た。この組換えプラスミドpLP35を保有するエシエリヒ
ア・コリLE392（pLP35）は微工研菌寄第9179号として工
業技術院微生物工業技術研究所に寄託されている。

前記の³²Pで標識された1.2kbのEcoRI-BglII断片をプロ
ーブとして組換えプラスミドpLP35に対するサザン・ハ
イブリダイゼーシヨンを行うと第３図の斜線部分を含む
断片にハイブリダイズするので、アルカリ性プロテアー
ゼ遺伝子のうちの欠如していたEcoRI部位に隣接する領
域が含まれていることがわかる。

実施例３ バチルス・リケニホルミスのアルカリ性プロテアーゼ遺
伝子の発現の確認 実施例２で得られた組換えプラスミドpLP35にアルカリ
性プロテアーゼ遺伝子の全領域が含まれていることを確
かめるために、バチルス属で保持されるベクタープラス
ミドに連結してバチルス・ズブチリスPW10を形質転換し
て、形質転換体によるプロテアーゼの生産能を調べた。

実施例２で得られた組換えプラスミドpLP35には、第３
図における斜線部分の断片（1.2kb）とそれに反時計回
りの方向に隣接する2.0kbのEcoRI断片（第３図における
しもふり部分）にまたがつてアルカリ性プロテアーゼ遺
伝子が存在すると推定される。

しかし、これらの断片のうち、斜線部分の断片の一方の
末端は、染色体DNAのBglII切断末端とベクタープラスミ
ドpBR322のBamHI切断末端が連結されたものであるため
制限酵素による特異的な切断が困難である。そのため
に、この断片と同じ断片をもつ組換えプラスミドpLP3と
pLP35からアルカリ性プロテアーゼ発現用の組換えプラ
スミドを作製した。

バチルス属で保持されるベクタープラスミドには、エシ
エリヒア・コリとバチルス属との両方で保持されるシヤ
トルベクターpHY300PLK（宝酒造の商品）を使用した。p
HY300PLKは２種の薬剤耐性遺伝子をもち、エシエリヒア
・コリではアンピシリン耐性とテトラサイクリン耐性の
両形質が発現し、バチルス属細菌ではテトラサイクリン
耐性の形質を発現するものである。アルカリ性プロテア
ーゼ発現用組換えプラスミド作製手順の概略を第４図に
示す。

組換えプラスミドpLP3 30μｇ、60ユニツトのEcoRI、60
ユニツトのBglIIおよびEcoRI反応緩衝液を含む反応液30
0μｌを37℃で３時間保持してプラスミドを切断したの
ち、750μｌのエタノールを加えてDNAを沈殿させた。遠
心分離により沈殿を回収し、150μｌのTE緩衝液に溶解
して実施例２（１）と同様にアガロースゲル電気泳動に
より断片を分画して1.2kbの断片約４μｇを得た。

一方、シヤトルベクターpHY300PLK5μｇ、10ユニツトの
EcoRI、10ユニツトのBglIIおよびEcoRI反応緩衝液を含
む反応液50μｌを37℃で３時間保持してプラスミドを切
断し、65℃で10分間加熱処理したのち、125μｌのエタ
ノールを加えてDNAを沈殿させた。遠心分離により沈殿
を回収し、乾燥後25μｌの水に溶解してベクターDNA溶
液を得た。

前記の1.2kbの断片0.25μｇとベクターDNA1μｇとを混
ぜ、0.4ユニツトのT4DNAリガーゼおよびリガーゼ緩衝液
を加えた反応液20μｌを５℃で16時間保ち両DNAを連結
した。

このようにして得られたDNA溶液10μｌ（DNA0.625μ
ｇ）を用いて実施例１（７）と同様にMn-Ca処理された
エシエリヒア・コリLE392を形質転換した。

得られたアンピシリン耐性の形質転換体のうちから10株
を選び保有するプラスミドを抽出し、EcoRIとBglIIで切
断して生ずる断片をアガロースゲル電気泳動で調べると
すべて1.2kbの断片とベクタープラスミドの4.9kb断片が
検出された。このうちの１株の保有するプラスミドをpH
LP301（第４図参照）と命名した。

次いで、組換えプラスミドpHLP301 10μｇを20ユニツト
のEcoRIと37℃で３時間反応させて切断し、65℃で10分
間加熱処理したのち、2.5倍容のエタノールを加えてDNA
を沈殿させた。遠心分離により沈殿を回収し、乾燥後50
μｌの水に溶解し、EcoRIで切断されたpHLP301を得た。

一方、組換えプラスミドpLP35 10μｇ、20ユニツトのEc
oRI、20ユニツトのPvuIIおよびEcoRI反応緩衝液を含む
反応液100μｌを37℃で３時間保持しDNAを切断した。pL
P35をEcoRIで切断すると5.0kb、2.6kb、2.0kbの３本の
断片を生じたが、今必要とされる断片は2.0kbの断片
（第４図における斜線部分）である。pLP35にEcoRIとPv
uIIを同時に作用させると、３本のEcoRI断片のうち不要
な２本の断片はPvuIIによつてさらに切断され、一方の
末端が平滑末端となつた断片を生じ、EcoRIで切断され
たpHLP301とは連結されなくなるため、必要な2.0kbの断
片の連結の効率が高まる。このようにして切断されたDN
A溶液を65℃で10分間加熱処理したのち250μｌのエタノ
ールを加えてDNAを沈殿させた。遠心分離により沈殿を
回収し、乾燥後50μｌの氷に溶解した。

このようにして得られた両DNA溶液10μｌ（DNA2μｇ）
ずつを混合し、0.8ユニツトのT4DNAリガーゼおよびリガ
ーゼ緩衝液を加えた反応液40μｌを５℃で16時間保ちDN
Aを連結した。

このようにして得たDNAを用いてプロテアーゼ低生産株
バチルス・ズブチリスPW10を形質転換した。形質転換は
次のようにプロトプラスト法にて行つた。

バチルス・ズブチリスPW10をニユートリエントブロス5m
lに接種して一晩培養した前培養液0.3mlを30mlのニユー
トリエントブロスに接種して37℃で1.5時間培養後、遠
心分離によつて菌体を集め2.5mlのSMMP〔２×SMMと４倍
濃度のPenassay broth（Difco社製）を1:1で混合したも
の、２×SMMは1Mシユクロース、0.04Mマレイン酸、0.04
MMgCl₂、pH6.5〕に懸濁し、5mgのリゾチームを加えて37
℃で２時間保持してプロトプラストを形成させた。遠心
分離によりプロトプラストを集め、4mlのSMMPで１回洗
浄したのち1.5mlのSMMPに懸濁してプロトプラスト懸濁
液を得た。

このプロトプラスト懸濁液0.5mlに前記で得られた連結D
NA溶液20μｌ（DNA2μｇ）と２×SMMに溶解した40％ポ
リエチレングリコール4000 1.5mlを加えて、しずかに混
合しながら２分間保ちプロトプラストにDNAをとり込ま
せた。次にこれに5mlのSMMPを加えて混合したあと遠心
分離によりプロトプラストを集め、1mlのSMMPに懸濁し
て30℃で1.5時間保持した。

このプロトプラスト液を20μg/mlのテトラサイクリンを
含むDM3再生培地〔0.5Mコハク酸ナトリウムpH7.3、0.5w
t％グルコース、0.5wt％カザミノ酸、0.5wt％酵母エキ
ス、0.01wt％牛血清アルブミン、0.35wt％リン酸二カリ
ウム、0.15wt％リン酸一カリウム、20mMMgCl₂、0.8wt％
寒天〕上に100μｌずつ塗布し、37℃で２日間保持して
コロニーを形成させた。

このようにして得られたテトラサイクリン耐性の形質転
換体約3000株を20μg/mlのテトラサイクリンを含むカゼ
インプレート〔1wt％カゼインを含むニユートリエント
ブロス寒天平板〕にレプリカして37℃で16時間培養して
ハローを形成する株を４株得た。

それら４株からそれぞれ保有するプラスミドを抽出する
と、すべて8.1kbの長さをもつプラスミドを保有してい
た。このうちの１株の保有するプラスミドをpHLP351
（第４図参照）と命名し、EcoRI、BglII、SmaI、EcoRI
＋BglII、EcoRI＋SmaIおよびBglII＋SmaIで切断して生
ずる断片の長さを調べて第４図に示される制限酵素地図
を得、計画した発現用プラスミドが作製されていること
が確認された。

前記のように、組換えプラスミドpHLP351を保有するバ
チルス・ズブチリスPW10がカゼインプレート上でハロー
を形成するようになることから、pHLP351に挿入されて
いる遺伝子断片内にアルカリ性プロテアーゼ遺伝子の全
領域が含まれていると判断される。

アルカリ性プロテアーゼ遺伝子保有組換えプラスミドpH
LP351の縮小 実施例３で得られた組換えプラスミドpHLP351に挿入さ
れている染色体DNA断片は3.2kbにも及ぶ。

一方、バチルス・リケニホルミスのアルカリ性プロテア
ーゼは分子量約27,500ダルトンであり、このタンパクの
生産を指令する遺伝子は分泌に必要な領域およびプロモ
ーター領域を含めても2kbあれば十分であると考えられ
たので、不要と思われる断片を欠失させてプラスミドの
縮小を行い、２種の縮小プラスミドを作製した。プラス
ミド縮小の手順の概略を第５図および第６図に示す。

（１）組換えプラスミドpHLP352の作製とバチルス・ズ
ブチリスへの導入 組換えプラスミドpHLP351 5μｇ、20ユニツトのSmaIお
よびSmaI反応緩衝液〔10mM Tris−塩酸緩衝液pH8.0、7m
MMgCl₂、20mM KCl、7mM2−メルカプトエタノール、0.01
wt％牛血清アルブミン、濃度は最終濃度〕を含む反応液
50μｌを37℃で３時間保持したのち、20ユニツトのBglI
Iと５μｌの10倍濃度のBglII反応緩衝液を加えてさらに
37℃で３時間反応させてプラスミドを切断し、65℃で10
分間加熱処理したのち、125μｌのエタノールを加えてD
NAを沈殿させた。

一方、ベクタープラスミドpHY300PLK5μｇを前記と同様
に処理してDNAを切断し沈殿させた。

両DNAの沈殿を遠心分離により回収してそれぞれ25μｌ
の水に溶解し、各10μｌずつを混合し、0.8ユニツトのT
4DNAリガーゼとリガーゼ緩衝液を加えた反応液40μｌを
５℃で16時間保ちDNAを連結した。

この連結DNA溶液５μｌ（DNA0.5μｇ）を用いて、実施
例１（７）と同様にMn-Ca処理したエシエリヒア・コリL
E392を形質転換し、373株のアンピシリン耐性の形質転
換体を得た。

このうち48株からプラスミドを抽出し、SmaIとBglIIで
切断して4.9kbと2.0kbの断片が生ずるプラスミドを保有
する菌株を７株得た。

これらのうちの１株の保有するプラスミドをpHLP352
（第５図参照）と命名した。このプラスミドに挿入され
ている染色体DNA断片はpHLP352に挿入されている染色体
DNA断片からEcoRIとSmaIで切断されて生ずる1.2kbの断
片（第５図における白抜き二本線部分）を欠失させたも
のである。

この組換えプラスミドを保有するエシエリヒア・コリLE
392（pHLP352）は微工研菌寄第9180号として工業技術院
微生物工業技術研究所に寄託されている。

次いで、前記の組換えプラスミドpHLP352 0.2μｇを用
いて、実施例３と同様にしてプロトプラスト法によりバ
チルス・ズブチリスPW10を形質転換し、23株のテトラサ
イクリン耐性形質転換体を得た。

この23株の形質転換体をテトラサイクリン含有カゼイン
プレートに接種して37℃で16時間培養するとすべての菌
株がハローを形成した。

またこのうち５株の保有するプラスミドを調べるといず
れもpHLP352を保有していることが確められた。

pHLP352を保有するバチルス・ズブチリスPW10（pHLP35
2）は微工研菌寄第9181号として工業技術院微生物工業
技術研究所に寄託されている。

（２）組換えプラスミドpULP354の作製ベクタープラス
ミドpUB110 5μｇ、20ユニツトのBamHI、20ユニツトのP
vuIIおよびBamHI反応緩衝液を含む反応液50μｌを37℃
で３時間保持してDNAを切断し、65℃で10分間加熱処理
したのち125μｌのエタノールを加えて沈殿させた。遠
心分離により沈殿を回収して25μｌの水に溶解した。

この溶液10μｌと、前記（１）でSmaIとBglIIで切断し
たpHLP351の溶液10μｌを混合し、前記（１）と同様にT
4DNAリガーゼを作用させてDNAの連結反応を行つた。

得られたDNA0.2μｇを用いて実施例３と同様にしてプロ
トプラスト法によりバチルス・ズブチリスPW10の形質転
換を行つた。プロトプラストを150μg/mlのカナマイシ
ンを含むDM3再生培地で再生させて、229株のカナマイシ
ン耐性（Km^r）の形質転換体を得た。

これら229株の形質転換体を10μg/mlのカナマイシンを
含むカゼインプレートにレプリカして37℃で16時間培養
すると４株のハローを形成する株が得られた。

これらの４株の保有するプラスミドを調べるとすべて6.
3kbのプラスミドを保有していた。これらのうちの１株
の保有するプラスミドをpULP354（第６図参照）と命名
した。

このプラスミドに挿入されている染色体DNA断片（第６
図における斜線部分）は前記（１）で得た組換えプラス
ミドpHLP352に挿入されている染色体DNA断片と同じもの
である。

pULP354を保有するバチルス・ズブチリスPW10（pULP35
4）には微工研菌寄第9182号として工業技術院微生物工
業技術研究所に寄託されている。

実施例５ 縮小組換えプラスミドを保有するバチルス・ズブチリス
形質転換体によるアルカリ性プロテアーゼの生成 バチルス・リケニホルミスHP19611、バチルス・ズブチ
リスPW10、ベクタープラスミドpHY300PLKを保有するバ
チルス・ズブチリスPW10（pHY300PLK）、縮小組換えプ
ラスミドpHLP352を保有するバチルス・ズブチリスPW10
（pHLP352）、ベクタープラスミドpUB110を保有するバ
チルス・ズブチリスPW10（pUB110）および縮小組換えプ
ラスミドpULP354を保有するバチルス・ズブチリスPW10
（pULP354）をそれぞれニユートリエントブロス20mlを
含む100ml容三角フラスコに接種し、37℃で24時間およ
び48時間振とう培養した。pHY300PLKおよびpHLP352を保
有する菌株の培地には20μg/mlのテトラサイクリンを、
またpUB110およびpULP354を保有する菌株の培地には10
μg/mlのカナマイシンを加えた。

得られた培養液を遠心分離し、その上清のプロテアーゼ
活性を測定した。プロテアーゼ活性はカゼインを基質と
して用いるUeharaらの方法〔H.Uehara etal.:J.Bacteri
ol.,119,82（1974）〕に従い、37℃でpH7.0およびpH10.
0で測定し、１分間に１μｇのチロシンを遊離する酵素
量を１ユニツトとして活性を表示した。第１表に結果を
示す。

第１表に示されるように縮小組換えプラスミドを保有す
る２種の形質転換体はいずれも宿主であるバチルス・ズ
ブチリスPW10やベクタープラスミドを保有する菌株に比
較して顕著に高いアルカリ性プロテアーゼを生産した。
特にバチルス・ズブチリス（pULP354）は、DNA供与体で
あるバチルス・リケニホルミスHP19611を上回るアルカ
リ性プロテアーゼ生産性を示した。

次にバチルス・ズブチリスPW10（pHLP352）、バチルス
・ズブチリスPW10（pULP354）およびバチルス・リケニ
ホルミスHP19611の培養上清を抗原として、市販のアル
カリ性プロテアーゼであるズブチリシン・カールスベル
グ（Sigma社製）に対する抗血清を用いた免疫二重拡散
法によるプロテアーゼの同定を行つたところ、各菌株の
産生するプロテアーゼの沈降線は互いに融合し、これら
の形質転換体の産生するプロテアーゼはバチルス・リケ
ニホルミス型のものであることが確められた。

なお、縮小組換えプラスミドpHLP352に挿入されている
2.0kbの染色体DNA断片をプローブとして、バチルス・リ
ケニホルミスHP19611の染色体DNAをSmaIとBglIIで切断
して得られる断片に対してサザン・ハイブリダイゼーシ
ヨンを行うと、2.0kbの断片にハイブリダイズが認めら
れ、pHLP352の挿入断片はバチルス・リケニホルミスHP1
9611の染色体DNAに由来するものであることが認められ
た。

前記の結果より、縮小組換えプラスミドpHLP352あるい
はpULP354に挿入されている2.0kbの染色体DNA断片に
は、バチルス・リケニホルミスHP19611のアルカリ性プ
ロテアーゼの全領域が含まれていることが明らかとなつ
た。

実施例６ バチルス・リケニホルミスHP19611のアルカリ性プロテ
アーゼ遺伝子の塩基配列の決定 バチルス・リケニホルミスHP19611のアルカリ性プロテ
アーゼ遺伝子の塩基配列は、実施例２で得られた２種の
組換えプラスミドpLP3およびpLP35の挿入断片の塩基配
列から決定された。

実施例２で得られた形質転換体エシエリヒア・コリLE39
2（pLP3）およびエシエリヒア・コリLE392（pLP35）を
それぞれ実施例１（５）と同様に培養して精製プラスミ
ドをそれぞれpLP3 1.2mgおよびpLP35 0.7mg得た。

pLP3 30μｇに、60ユニツトのEcoRI、60ユニツトのBglI
IおよびEcoRI反応緩衝液を加えた反応液300μｌを37℃
で３時間保持してDNAを切断したのち、750μｌのエタノ
ールを加えてDNAを沈殿させた。遠心分離により沈殿を
回収し、150μｌのTE緩衝液に溶解して実施例２（１）
と同様にアガロースゲル電気泳動で分画して1.2kbのEco
RI-BglII断片約４μｇを得た。

一方、pLP35 30μｇに60ユニツトのSmaIとSmaI反応緩衝
液を加えた反応液300μｌを37℃で３時間保持したの
ち、60ユニツトのBglIIと30μｌの10倍濃度のBglII反応
緩衝液を加えてさらに37℃で３時間保持してDNAを切断
した。以後前記pLP35の場合と同様に分画して0.8kbのSm
aI-EcoRI断片約２μｇを得た。

このようにして得られた両断片の塩基配列を、M13ジデ
オキシ−チエインターミネーシヨン法〔J.Messing:Meth
ods in Enzymol.,101,20,Academic Press,New York（19
83）;F.Sanger:Science,214,1205（1981）〕に従つ決定
した。

前記２種の断片およびそれらをさらに制限酵素San3AI,H
aeIII,AluIで切断して得られる断片をM13フアージmp18
あるいはmp19に連結して、エシエリヒア・コリJM109
（後記のM13シークエンシングキツトの付属品として購
入される）を形質転換して多数の組換えフアージを得
た。

一方、２×TY培地（バクトトリプトン1.6wt％、酵母エ
キス1wt％、NaCl0.5wt％、pH7.4）中で37℃で一晩培養
した前培養液15μｌを、1.5mlの２×TY培地に植菌した
ものに、前記の組換えフアージのプラークを移植して37
℃で５時間培養後、遠心分離によりフアージ粒子を含む
上清を得た。

この上清1mlに20wt％ポリエチレングリコール6000-2.5M
NaClを0.2ml加えて15分間放置してフアージを沈殿させ
た。遠心分離により沈殿を回収し、100μｌのTE緩衝液
に懸濁後、50μｌのフエノール（TE緩衝液飽和）を加え
て良く混合してDNAを抽出した。遠心分離により水層を
回収し、これに1/10容の3M酢酸ナトリウムと２倍容のエ
タノールを加えてDNAを沈殿させた。遠心分離により沈
殿を回収し、乾燥後30μｌのTE緩衝液に溶解して一本鎖
のフアージDNA溶液（DNA量１〜２μｇ）を得た。

この一本鎖DNAとM13シークエンスキツト（宝酒造製）お
よびα³²P‐dCTP（410Ci/mmol,Amersham社製）を用いて
相補鎖の合成反応を行つた。ホルムアミド色素溶液〔95
Vol％ホルムアミド、0.1wt％キシレンシアノール、0.1w
t％ブロムフエノールブルー〕を加えて反応停止後、３
分間煮沸、急冷し、８％ポリアクリルアミドゲルを用い
て電気泳動を行つた。電気泳動を行つた後、ゲルを乾燥
させオートラジオグラフイーを行い、オートラジオグラ
ム上の塩基配列を解析して各断片の塩基配列を決定した
のち、これらを連結してアルカリ性プロテアーゼ遺伝子
の塩基配列を決定した。この結果得られた塩基配列を第
７図に示す。

ここに得られた結果によれば、224番目から1360番目に
ポリペプチドをコードする領域があるが、この領域内で
ヤコブスらの報告したバチルス・リケニホルミスNCIB68
16の遺伝子と７ケ所の塩基の相違があつた。すなわち、
HP19611株のアルカリ性プロテアーゼ遺伝子における268
番目、733番目、793番目、795番目、820番目、842番目
および910番目の塩基がそれぞれNCIB6816株の遺伝子で
はＡ→Ｃ、Ｇ→Ａ、Ｇ→Ａ、Ａ→Ｇ、Ｇ→Ａ、Ｔ→Ａ、
Ｃ→Ｔとなつている。また、終止コドン（1361番目から
1363番目のTAA）の下流域の1388番目のＡはNCIB6816株
の遺伝子では欠除している。さらに、最も大きな相違は
NCIB6816株からクローニングされた遺伝子に欠如してい
た１番目から115番目までの115塩基対が本発明でクロー
ニングされたHP19611株のアルカリ性プロテアーゼ遺伝
子には付加されていることである。この領域の欠如して
いるNCIB6816株の遺伝子ではアルカリ性プロテアーゼが
発現せず、この領域が付加されているHP19611の遺伝子
では実施例５に示されたようにアルカリ性プロテアーゼ
が発現することから、この領域が遺伝子の発現に不可欠
の領域であると考えられる。また、タンパク合成の開始
に必要なリボゾーム結合領域と思われる配列（GGAGG）
が209番目から213番目に見い出され、メツセンジヤーRN
A合成の開始に必要な−35領域及び−10領域と思われる
配列がそれぞれ149番目から154番目（TTAACA）および17
2番目から177番目（TATATT）に見い出される。したがつ
て、バチルス・リケニホルミスのアルカリ性プロテアー
ゼ遺伝子の発現に必要なプロモーター領域は１番目から
208番目までの領域に存在し、プロモーターの全領域を
含むDNAとはこの領域の全部を含むDNAの他、この領域の
一部を欠如させたものであつてもアルカリ性プロテアー
ゼを発現させる能力を保持しているような領域を含むDN
Aを言う。また、1389番目から1419番目には転写の終結
部位に見られるステムーループ構造をとることのできる
配列をもつターミネーター構造が見られる。

なお、224番目から1360番目のポリペプチドをコードす
る領域のうち539番目以降の配列から導かれるアミノ酸
配列は５個のアミノ酸を除いて文献〔M.Ottersen,I.Sve
ndsen:Methods in Enzymology,19,199,Academic Press,
New York（1979）〕に報告されているズブチリシン・カ
ールスバーグのアミノ酸配列と一致していることから53
9番目から1360番目までが成熟タンパクをコードしてい
る領域と判断される。したがつて224番目から538番目ま
でが分泌に関与する領域であると思われる。

〔発明の効果〕

バチルス・リケニホルミスのアルカリ性プロテアーゼ遺
伝子の発現に必要なプロモーターの全領域を含むアルカ
リ性プロテアーゼ遺伝子が挿入された組換えプラスミド
ならびにこの組換えプラスミド形質転換されたバチルス
属細菌が得られたことによつて、アルカリ性プロテアー
ゼの生産に際して、アルカリ性プロテアーゼの生産能を
特異的に高めるような培養を行うことが可能となり、こ
れに伴いアルカリ性プロテアーゼの精製も容易に行うこ
とが可能となつた。

また、アルカリ性プロテアーゼ遺伝子のプロモーター領
域ならびにタンパクの分泌に関与する領域を含む遺伝子
が単離され、その塩基配列が明らかにされたことによつ
て、この領域の下流域に隣接して成長ホルモンなどの有
用タンパク質のアミノ酸配列に対応する塩基配列をもつ
DNA断片を連結した組換えプラスミドを構築することが
可能となり、この組換えプラスミドを安全性の高いバチ
ルス属細菌に導入した形質転換体を培養することによつ
て該有用タンパク質の大量分泌生産を安全に実施するこ
とが可能となつた。

【図面の簡単な説明】

第１図は組換えプラスミドpAMP3の制限酵素地図、第２
図は組換えプラスミドpLP3の制限酵素地図、第３図は組
換えプラスミドpLP35の制限酵素地図、第４図は組換え
プラスミドpHLP351の構築方法を説明する模式図、第５
図は組換えプラスミドpHLP352の構築方法を説明する模
式図、第６図は組換えプラスミドpULP354の構築方法を
説明する模式図、第７図はバチルス・リケニホルミスHP
19611のアルカリ性プロテアーゼ遺伝子の全領域を含むD
NAの塩基配列を示す図である。 なお、第１図から第６図において、一本線部分はベクタ
ープラスミドの領域、二本線部分は染色体DNAに由来す
る領域、矢印はベクタープラスミド上の薬剤耐性遺伝子
の存在する領域を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:125） (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:10） (Ｃ１２Ｎ 9/56 Ｃ１２Ｒ 1:19） Ｃ１２Ｒ 1:125） (Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡ Ａ Ｃ１２Ｒ 1:10）

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】バチルス・リケニホルミスのアルカリ性プ
   ロテアーゼ遺伝子において、アルカリ性プロテアーゼを
   発現させる能力を有する、下記のヌクレオチド配列から
   なるプロモータ領域を有することを特徴とする新規な遺
   伝子DNA。