JP2726826B2 - 酵素およびその製造方法 - Google Patents

酵素およびその製造方法

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Description

【発明の詳細な説明】 新規な補酵素非依存型Ｌ−ソルボソン脱水素酵素は、
Ｌ−ソルボソンの２−ケト−グロン酸（以下、２−KGA
と称す）への酸化を触媒する。２−KGAは、ビタミンＣ
の製造のための重要な前駆体である。
微生物を用いてＬ−ソルボソンを２−KGAに変換する
反応は知られている。微生物の無細胞抽出物を用いたＬ
−ソルボソンからの２−KGAの生産は、いくつかの先行
文献中に報告されている。米国特許第3,907,639号にお
いて、アセトバクター（Acetobacter）属、シュウドモ
ナス（Pseudomonas）属、エシエリチア（Escherichia）
属、セラチア（Serratia）属、バシラス（Bacillus）
属。スタフイロコツカス（Staphylococcus）属、アエロ
バクター（Aerobacter）属、アルカリゲネス（Alcalige
nes）属、ペニシリウム（Penicillium）属、カンジダ
（Candida）属およびグルコノバクター（Gluconobacte
r）属に属する微生物は、前記の様な変換を行ないうる
ことが報告されている。更に北村等のEurp.J.Appl.Micr
obiol.,2,1（1975）は、グルコノバクター・メラノゲネ
ス（Gluconobacter melanogenes）IFO3293から発見され
たＬ−ソルボソン酸化酵素が、酵素活性の発現のために
補酵素および電子受容体のいずれも必要としないことを
報告している。マコーバー（Makover）等のBiotechnol.
Bioeng.17,1485（1975）は、シュウドモナス・プチーダ
（Pseudomonas putida）ATCC21812の特定の分画中にＬ
−ソルボソン脱水素酵素活性が存在していることを報告
しているが、該Ｌ−ソルボソン脱水素酵素がシュウドモ
ナス・プチーダから均質な蛋白質の形態で単離されたと
の報告はない。従って、該酵素の物理化学的性質は、特
定されていなかった。
本発明は補酵素非依存型Ｌ−ソルボソン脱水素酵素の
活性を有する新規な酵素および該酵素の製造方法に関す
る。特定の微生物の細胞の細胞膜画分から単離され、精
製された酵素が、Ｌ−ソルボソンの２−KGAへの酸化に
おいて触媒作用をすることが見出された。本発明は、こ
の知見に基づいて完成されてされたものである。
本発明の目的は、Ｌ−ソルボソンを２−KGAに転換す
る補酵素非依存型Ｌ−ソルボソン脱水素酵素の活性を有
する新規な酵素を提供することに有る。他の目的は、新
規なＬ−ソルボソン脱水素酵素を細胞内で産生し得るシ
ュウドモナス属に属する微生物またはその変異株を培養
し、該酵素を前記細胞から純粋な形で単離することによ
る新規なＬ−ソルボソン脱水素酵素の製造方法を提供す
ることに有る。この単離は、該細胞の破壊、および破壊
された細胞からの無細胞抽出物、好ましくは微生物の細
胞膜画分からの単離および精製により行なうことができ
る。
後述する実施例により調製された新規な補酵素非依存
型Ｌ−ソルボソン脱水素酵素の精製試料の物理化学的性
質は、以下のとおりである。
１）酵素活性 Ｌ−ソルボソン脱水素酵素、すなわち本発明の酵素
は、電子受容体の存在下におけるＬ−ソルボソンの２−
KGAへの酸化において触媒作用を下記反応式に従ってす
る： 該酵素は、電子受容体として酸素を利用しない。しか
しながら、電子受容体として振る舞うことができるいか
なる通常の化合物も、本発明の酵素と共にＬ−ソルボソ
ンを２−KGAに酸化する為に用いることができる。電子
受容体としては、2,6−ジクロロフエノリンドフエノー
ル（以下、DCIPと称す）、フエナジンメソサルフエー
ト、ウルスター青、フエリシアン化物、補酵素Ｑ、チト
クロームＣ等を用いることができる。
酵素活性の測定 酵素活性の測定は、25℃において、DCIPの600nmにお
ける吸光度の減少を分光光学的に測定することにより行
なった。１分間当り、１μモルのDCIPの還元を触媒する
酵素量として、酵素活性の１ユニツトを定義した。DCIP
のpH7.0における吸光係数は、9.45mM-1を採用した。
基本反応混合物は、0.3％のトライトン（Triton）Ｘ
−100を含む6mlの0.1Mリン酸カリウム緩衝液（pH7.
0）、0.45mlの2.5mMDCIP及び10.35mlの水を混合するこ
とにより調製した。1cmの光路長を有するキユベツト
に、0.4mlの基本反応混合物、20μｌの10mMフエナジン
メソサルフエイト、10μｌの酵素溶液および20μｌの11
0mM Ｌ−ソルボソン溶液を入れた。対照のキユベツト
には、酵素溶液の代わりに10μｌの水を加えていること
を除き、すべての試薬を入れた。反応は、基質を添加す
ることにより開始した。
２）基質特異性 本酵素の基質特異性は、上記１）に記載したと同じ酵
素検定方法において、Ｌ−ソルボソンに替えて種々の基
質溶液（10mM）を各20μｌ用いることにより測定した。
この測定の結果を第１表に示す。本発明の酵素が、種々
のアルデヒド化合物類に作用することが明らかになっ
た。
３）至適pH 該Ｌ−ソルボソン脱水素酵素の反応速度とpHとの間の
相関をリン酸カリウムおよびトリス−HC1緩衝液中で測
定した。結果を第２表に示す。該酵素は、約7.0と約8.0
との間のpH範囲において、最も高い酵素活性を示した。
４）pH安定性 精製された該酵素を種々のpHの緩衝液に加え、４℃に
て24時間置いた。残存活性を、上記１）に記載の標準測
定条件下で測定した。測定結果を第３表に示す。精製さ
れた該酵素は、アルカリ性pHにおいて相対的に安定であ
り、酸性度の増大に従って不安定となった。
５）熱安定性 精製された該酵素を種々の温度において10mMのリン酸
カリウム緩衝液（pH7.0）中で10分間処理し、次いで直
ちに氷水にて冷却した。
残存活性を上記１）に記載の標準検定条件下で測定し
た。結果を第４表に示す。この酵素は、不安定であっ
て、30℃における10分間の処理によって約２分の１の活
性を失なった。
６）至適温度 Ｌ−ソルボソン脱水素酵素の酵素活性を、上記１）に
記載の反応系で10℃から40℃までの温度において測定し
た。結果を第５表に示す。この酵素は、約20℃と約40℃
との間の至適温度を示した。
７）分子量 比活性51.5ユニツト/mg蛋白質を有する精製された該
酵素をドデシル硫酸ナトリウム（SDS）で処理し、サブ
ユニツトの分子量をSDS−ポリアクリルアミドゲル電気
泳動により分析した。該酵素は、分子量47,000±5,000
の単一の均質なサブユニツトからなることが示された。
８）Km値の測定 上記１）に記載の方法において、Ｌ−ソルボソンの種
々の濃度について酸化反応速度を測定し、Ｌ−ソルボソ
ンについての見掛けのミハエリス定数（Km）を決定し
た。Km値は、DCIPおよびフエナジンメソサルフエイトを
電子受容体として、13±2mMと計算された。
ａ）金属イオンの影響 上記１）に記載の検定方法を用いて、酵素活性に対す
る種々の金属イオンの影響を試験した。測定結果を第６
表に示す。Cu2+およびMn2+が該酵素を強く阻害した。
10）阻害剤の影響 上記１）に記載の検定方法を用いて酵素活性に対する
阻害剤の影響を試験した。結果を第７表に示す。アジ化
ナトリウムとモノヨウ化酢酸とが酵素活性をわずかに阻
害した。
11）補欠分子族 精製した該酵素の吸収スペクトルは、約350nmにピー
クを、また380−420nmの可視領域に広い肩を示した。こ
れらの極大吸収値は、ピロロキノリンキノン（以下PQQ
と称す）を補欠分子族とするキノプロテイン酵素の特徴
である。
12）酵素活性に対するPQQ添加の効果 上記１）に記載の検定方法を用いて酵素活性に対する
PQQ添加の効果を試験した。結果を第８表に示す。PQQの
添加により顕著な酵素活性の上昇が観察された。
13）精製方法 補酵素非依存型Ｌ−ソルボソン脱水素酵素の精製は、
公知の方法により、更にはイオン交換クロマトグラフイ
ー、吸着クロマトグラフイー、ゲル−ロ過、ゲル−電気
泳動、塩析、透析などのそれぞれ公知の方法の組合せに
より行なうことができる。
本発明により提供される補酵素非依存型Ｌ−ソルボソ
ン脱水素酵素は、適当な微生物を培養し、細胞を破壊
し、破壊した細胞の無細胞抽出物、好ましくは微生物の
膜画分から単離、精製することにより調製することがで
きる。
本発明において用いられる微生物は、シュウドモナス
属に属する微生物またはその変異株、好ましくはシュウ
ドモナス・プチーダである。
本発明において用いられるシュウドモナス属に属する
微生物は、天然から単離することができ、また微生物寄
託機関（culture collections）から入手可能である。
それらから誘導された変異株もまた本発明において用い
ることができる。
本発明に使用される変異株は、野生株を紫外線照射、
Ｘ線照射、γ線照射、または亜硝酸もしくは他の適当な
突然変異原との接触等の変異誘発要因によって処理する
ことにより、または自然的突然変異により生ずるクロー
ンを単離することによって得ることができる。これらの
野生株またはその変異株の突然変異は、その目的のため
にそれ自体当業者によく知られたいずれの方法によって
も起こすことができる。これらの方法の多くは、例えば
“化学的変異原”田島、吉田および賀田編、講談社サイ
エンス社（東京、日本）1973年発行などの種々の出版物
が記載されている。
本発明に最も好適に使用される菌株の例は、シュウド
モナス・プチーダATCC21812およびその類似物でる。シ
ュウドモナス・プチーダATCC21812は、アメリカン タ
イプ カルチヤー コレクシヨン（American Type Cult
ure Collection）（12301パークローン ドライブ、ロ
ツクヴイル、メリーランド20852、米国（Parklawn Driv
e,Rockville,Maryland20852,U.S.A.））より入手可能で
ある。
該微生物は、適当な栄養源が供給された液体培地中で
好気性条件下にて培養できる。培養は、4.0から約8.0、
好ましくは5.5から7.5のpHにて行なうことができる。培
養時間は栄養培地に依存するが、好ましくは約10から10
0時間である。培養を行なう好ましい温度範囲は、約10
℃から40℃、好ましくは25℃から35℃である。
培地は、通常、栄養源、例えばグリセロール、Ｄ−マ
ンニトール、Ｄ−ソルビトール、エリスリトール、リビ
トール、キシリトール、アラビトール、イノシトール、
ヅルシトール、Ｄ−リボース、Ｄ−フラクトース、Ｄ−
フコース、Ｄ−グルコース、グルコン酸塩、マルトース
およびシユクロース、好ましくは、Ｄ−ソルビトールま
たはグリセロールなどの同化し得る炭素源；例えばペプ
トン、酵母抽出物、ソイビーンミールおよびコーンスチ
ープリカーなどの有機物質ならびに例えば硫酸アンモニ
ウム、塩化アンモニウム、硝酸カリウムなどの無機物質
等の消化可能な窒素源；ビタミン類ならびに微量元素を
含むことが必要である。
以下に、培養後の微生物からＬ−ソルボソン脱水素酵
素を単離、精製する態様の概略を記載する。
（１）細胞を発酵液から遠心分離により収集する。
（２）細胞を緩衝溶液中に懸濁させ、ホモジナイザー、
超音波発振器またはリゾチームによる処理等の方法によ
って細胞を破壊し、細胞の破壊溶液を得る。
（３）Ｌ−ソルボソン脱水素酵素を、破壊された細胞の
無細胞抽出物、好ましくは微生物の細胞膜画分から単離
し、精製する。
本発明により与えられるＬ−ソルボソン脱水素酵素
は、Ｌ−ソルボソンから２−KGAを生成させるための触
媒として有用である。該反応は、約５から約10までのpH
値において、例えばDCIP、フエナジンメソサルフエイ
ト、ウルスター青、フエリシアン化物、補酵素Ｑ、チト
クロームＣなどの電子受容体の存在下で、リン酸緩衝
液、トリス−HCl緩衝液等の溶媒中にて行なわれる。反
応を行なわせるために好ましい温度範囲は、約10℃から
約50℃である。pHおよび温度を、それぞれ約7.0−8.0お
よび30℃に設定した場合に、通常反応は最良の結果をも
たらす。
溶媒中のＬ−ソルボソンの濃度は、他の反応条件に依
存して変化するが、一般的には約10−100g/L、最も好ま
しくは約30−40g/Lであることが必要である。
反応において、該酵素は、適当な担体に固定化させた
状態でも使用することができる。この分野において一般
に知られているいかなる酵素の固定手段を用いてもよ
い。例えば酵素を、反応性の基を有するレジンの膜また
は顆粒等に直接に結合してもよく、また、例えばグルタ
ールアルデヒド等の双反応性基を有する架橋化合物を介
してレジンに結合させてもよい。
以下の実施例は、本発明を示すものである。
実施例１ Ｌ−ソルボソン脱水素酵素の精製 （１）シュウドモナス・プチーダATCC21812の培養 シュウドモナス・プチーダの寒天斜面培養物を、5ml
の培地を含む試験管に植菌し30℃で２日間、試験管振盪
機上で（280r.p.m.）培養した。該培地は、グリセロー
ル70g/l,酵母エキス（オリエンタル社製）15g/l、及びM
gSO4・7H2O2.5g/lを含有する。2mlの本培養物を100mlの
同培地を含む500mlの三角フラスコに接種し30℃で、20
時間、回転振盪機上（180r.p.m.）で培養した。このよ
うにして得られた培養物400mlを、20lの同培地を含む30
lの発酵槽に接種した。発酵槽は、30℃、250r.p.m.で撹
拌し20l/分で通気した。40時間培養後、培養物を遠心分
離（8,000r.p.m.、10,000xg）し、菌体を採取した。20l
の培養液から、920g（湿重量）の菌体が得られた。該菌
体は、使用するまで−20℃で凍結した。
（２）膜画分の調製 シュウドモナス・プチーダの凍結菌体（760g、湿重
量）を融解し、3,800mlの0.85％の食塩水に懸濁した。
ついで、細胞懸濁液をダイノミル細胞破砕器（ウイリー
A.バチヨウフエン社、バーゼル）によりガラスビーズ
（直径0.1mm）存在下に４℃にて、2,000r.p.m.で４分間
破砕した。このようにして調製した破砕液を1,800xgに
て10分間遠心し細胞残渣およびガラスビーズを除去し
た。得られた上清を80,000xgにて遠心し、沈殿物を膜画
分として集めた（266g）。
（３）Ｌ−ソルボソン脱水素酵素の膜画分からの溶出 該膜画分（266g、湿重量）を1,100mlの１％トライト
ンＸ−100を含む50mM燐酸カリ緩衝液、pH7.0、に、懸濁
し、15時間撹拌した後、80,000xgで１時間、遠心分離し
上清を得た。得られた上清を20lの0.1％トライトンＸ−
100を含有する10mM燐酸カリ緩衝液、pH7.0、に透析後、
DEAE−セフアロースCL−6B（フアルマシア・フアイン・
ケミカルズ）カラムクロマトグラフイーに供した。
（４）DEAE−セフアロースCL−6Bカラムクロマトグラフ
イー（Ｉ） 上記透析済上清を、あらかじめ（３）に記したと同様
の緩衝液にて平衡化しておいたDEAE−セフアロースCL−
6Bカラム（直径3.8、長さ30cm）にかけた。同様の緩衝
液で、カラムを洗浄したのち、該酵素を食塩濃度を0.5M
までにした直線濃度勾配により溶出した。
（５）DEAE−セフアロースCL−6Bカラムクロマトグラフ
イー（II） 前記工程で得られた活性画分を合し、（３）に記した
と同様の緩衝液に、15時間透析し、次に、同じ緩衝液で
平衡化しておいたDEAR−セフアロース（ジエチルアミノ
エチル−アガロース）カラム（直径2.5、長さ25cm）に
かけた。同様の緩衝液で、カラムを洗浄したのち、該酵
素を食塩濃度を0.3Mまでにした直線濃度勾配により溶出
した。
（６）DEAE（ジエチルアミノエチル−ポリビニル タイ
プ）−トヨパール650s（東洋ソーダ社製）カラムクロマ
トグラフイー 前記工程で得られた活性画分を合し、（３）に記した
と同様の緩衝液に、15時間透析し、次に、同じ緩衝液で
平衡化しておいたDEAE−トヨパール650s（直径2.0、長
さ20cm）にかけた。同様の緩衝液でカラムを洗浄した
後、該酵素を食塩濃度0.1Mまでにした直線濃度勾配によ
り溶出した。
（７）ハイドロキシアパタイトHCA100S（三井東圧社
製）カラムクロマトグラフイー 前記工程で得られた活性画分を合し、0.1％トライト
ンＸ−100を含有する1mM燐酸カリ緩衝液（pH7.0）に15
時間透析し、次に同様の緩衝液で平衡化しておいたハイ
ドロキシアパタイトHCA100Sカラム（直径2.0、長さ10c
m）にかけた。該酵素は、同一の緩衝液で溶出された。
（８）TSK−ゲル（ポリビニル タイプ）トヨパールHW6
0s（東洋ソーダ社製）カラムクロマトグラフイーＩおよ
びII 前記工程で得られた活性画分を合し、メンブランフイ
ルター（ダイアフローPM−30、アミコン；ポリスルフオ
ン タイプ；分画分子量30,000以下）少量になるまで濃
縮した。ついで、本濃縮液をTSK−ゲル トヨパールHW6
0s（直径1.5、長さ80cm）カラムにかけた。緩衝液とし
ては、0.1％トライトンＸ−100を含有する10mM燐酸カリ
緩衝液、pH7.0を用いた。カラムは同一の緩衝液で展開
した。活性画分を合して濃縮し、再び同一のカラムにて
展開した。
Ｌ−ソルボソン脱水素酵素の精製工程の概要を第９表
に示した。
（９）電気泳動による分析 51.5ユニツト/mg蛋白質の比活性を有する精製された
酵素をドデシル硫酸ナトリウム（SDS）処理し、SDS−ポ
リアクリルアミド電気泳動法により、本酵素の精製度を
分析した。その結果、本酵素は、分子量47,000±5,000
からなる単一で均一なサブユニツトからなることが明ら
かとなった。
（10）反応生成物の同定 0.4mlの精製酵素液、0.05mlの0.5M燐酸カリ緩衝液（p
H7.0）、0.05mlの0.5ML−ソルボソン溶液および0.02ml
の0.2Mフエナジンメソサルフエイト溶液からなる反応混
合液を20℃で60分間保温した。反応生成物は、薄層クロ
マトグラフイーおよび高分解能液体クロマトグラフイー
により分析した。その結果、生成物は２−ケト−Ｌ−グ
ロン酸であることが、対照試料との比較で明らかになっ
た。
実施例２ 前記の実施例１の工程（１）から（８）に記載したと
同様の方法によって調製した精製された補酵素非依存型
Ｌ−ソルボソン脱水素酵素（全活性、206ユニツト）5ml
と、1mlの0.5M燐酸カリ緩衝液（pH7.0）と、1mlの1M L
−ソルボソン溶液、0.2mlの0.2Mフエナジンメソサルフ
エイト溶液および2.8mlの水からなる反応混合液を、ゆ
るやかに撹拌しながら保温した。その結果、２−KGA
は、350MG/時間の割合で生成した。

Claims (5)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】電子受容体の存在下にＬ−ソルボソンに作
    用して２−ケト−Ｌ−グロン酸を生成せしめ、シュウド
    モナス（Pseudomonas）属に属する微生物に由来する、
    均質な蛋白質としての補酵素非依存型Ｌ−ソルボソン脱
    水素酵素であって、該蛋白質が以下の理化学的性質 ａ）補欠分子属：ピロロキノリンキノン ｂ）至適pH:約７−約８ ｃ）至適温度：約20℃−約40℃ ｄ）分子構造：ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルア
    ミドゲル電気泳動による測定において47,000±5,000の
    分子量を有する単一の均質なサブユニツトからなる ｅ）温度安定性：約30℃より高い温度で不安定 ｆ）阻害：Cu2+およびMn2+のイオンにより阻害される を有することを特徴とする補酵素非依存型Ｌ−ソルボソ
    ン脱水素酵素。
  2. 【請求項２】シュウドモナス・プチーダ（Pseudomonas
    putida）ATCC21812またはその変異株の膜結合型酵素で
    ある請求項１記載の補酵素非依存型Ｌ−ソルボソン脱水
    素酵素。
  3. 【請求項３】補酵素非依存型Ｌ−ソルボソン脱水素酵素
    を細胞内で産生し得るシュウドモナス属に属する微生物
    またはその変異株を培地中で培養し、細胞を破壊し、破
    壊した細胞の無細胞抽出物、好ましくは微生物の膜画分
    から該酵素を単離し、精製することを特徴とする、電子
    受容体の存在下にＬ−ソルボソンに作用して２−ケト−
    Ｌ−グロン酸を生成せしめ、シュウドモナス（Pseudomo
    nas）属に属する微生物に由来する、均質な蛋白質とし
    ての補酵素非依存型Ｌ−ソルボソン脱水素酵素であっ
    て、該蛋白質が以下の理化学的性質 ａ）補欠分子族：ピロロキノリンキノン ｂ）至適pH:約７−約８ ｃ）至適温度：約20℃−約40℃ ｄ）分子構造：ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルア
    ミドゲル電気泳動による測定において47,000±5,000の
    分子量を有する単一の均質なサブユニツトからなる ｅ）温度安定性：約30℃より高い温度で不安定 ｆ）阻害：Cu2+およびMn2+のイオンにより阻害される を有する補酵素非依存型Ｌ−ソルボソン脱水素酵素の製
    造方法。
  4. 【請求項４】微生物がシュウドモナス・プチーダATCC21
    812またはその変異株である請求項３記載の製造方法。
  5. 【請求項５】Ｌ−ソルボソンを触媒の存在下で酸化する
    ことからなり、該触媒が、電子受容体の存在下にＬ−ソ
    ルボソンに作用して２−ケト−Ｌ−グロン酸を生成せし
    め、シュウドモナス（Pseudomonas）属に属する微生物
    に由来する、均質な蛋白質としての補酵素非依存型Ｌ−
    ソルボソン脱水素酵素であって、該蛋白質が以下の理化
    学的性質 ａ）補欠分子族：ピロロキノリンキノン ｂ）至適pH:約７−約８ ｃ）至適温度：約20℃−約40℃ ｄ）分子構造：ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルア
    ミドゲル電気泳動による測定において47,000±5,000の
    分子量を有する単一の均質なサブユニツトからなる ｅ）温度安定性：約30℃より高い温度で不安定 ｆ）阻害：Cu2+およびMn2+のイオンにより阻害される を有する補酵素非依存型Ｌ−ソルボソン脱水素酵素であ
    ることを特徴とする２−ケト−Ｌ−グロン酸の製造方
    法。
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