JPS6122952B2 - - Google Patents

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JPS6122952B2
JPS6122952B2 JP59054611A JP5461184A JPS6122952B2 JP S6122952 B2 JPS6122952 B2 JP S6122952B2 JP 59054611 A JP59054611 A JP 59054611A JP 5461184 A JP5461184 A JP 5461184A JP S6122952 B2 JPS6122952 B2 JP S6122952B2
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JP
Japan
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glycerin
nad
dihydroxyacetone
glycerol dehydrogenase
receptors
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JP59054611A
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JPS59183689A (ja
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Kazuo Adachi
Minoru Ameyama
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Roche Diagnostics GmbH
Original Assignee
Boehringer Mannheim GmbH
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Publication date
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Publication of JPS6122952B2 publication Critical patent/JPS6122952B2/ja
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    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0006Oxidoreductases (1.) acting on CH-OH groups as donors (1.1)
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12QMEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/26Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase
    • C12Q1/32Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase involving dehydrogenase
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12QMEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/61Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving triglycerides
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  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Description

【発明の詳现な説明】 本発明は新芏のNAD−独立性グリセリン
デヒドロゲナヌれに関する。グリセリンデヒドロ
ゲナヌれはゞヒドロキシアセトンの圢成䞋にグリ
セリンの反応を接觊する。
埓来公知のグリセリンデヒドロゲナヌれは補酵
玠ずしお酞化型のNADたたはNADPを必芁ずす
る、グリセリン−NAD−オキシドレダク
タヌれE.C.1.1.1.6、E.C.1.1.1.72たたはE.
C.1.1.1.156である。反応は次の反応匏によ぀お
衚わすこずができる 匏(1)は平衡反応である、すなわちNAD−
䟝存性グリセリンデヒドロゲナヌれは同様にしお
ゞヒドロキシアセトンからグリセリンの圢成を接
觊する。したが぀おグリセリンもしくはグリセリ
ンデヒドロゲナヌれ掻性を定量するために匏(1)を
利甚する堎合には過剰量のNADの添加に
より平衡をゞヒドロキシアセトンの偎ぞシフトさ
せる必芁がある。これはこの定量方法を盞察的に
手間ず費甚のかかるものずする。小さなグリセリ
ン量もしくはグリセリンデヒドロゲナヌれ掻性は
この方法では粟確には枬定するこずができない。
曎に氎玠を簡単にはNADから奜適な指
瀺薬−レドツクス系に移せないのが欠点である。
そのために氎玠をNADHからホルマザンの圢成䞋
にテトラゟリりム塩に移すためにもう぀の酵
玠、䟋えばゞアホラヌれが必芁である。
本発明の課題は、前蚘の欠点を持たず、したが
぀おグリセリンを簡単か぀安䟡に定量し、か぀少
量のグリセリンもできるかぎり定量的に怜出する
こずができる、新芏のグリセリンデヒドロゲナヌ
れを芋出すこずであ぀た。
この課題は本発明によるNAD−独立性グ
リセリンデヒドロゲナヌれの提䟛により解決され
る。新芏の酵玠は次の反応を接觊する新芏のグリ
セリンデヒドロゲナヌれである その際぀のプロトンおよび電子は補酵玠ずし
おのNADもしくはNADPを䞀緒に䜿甚せずに奜
適な氎玠受容䜓および電子受容䜓に移される。反
応(2)は完党にゞヒドロキシアセトン圢成の方向に
進行し、新芏酵玠はグリセリンをおよびトリグリ
セリドをグリセリンを遊離脂肪酞にけん化の埌簡
単か぀粟確に定量するのを可胜にする。
このようにしおきわめお少量のグリセリン、し
たが぀おたたトリグリセリドを定量するこずが可
胜である。本発明による酵玠を甚いおのグリセリ
ンもしくはトリグリセリドの埮量定量は終点方法
によるのみならず、動力孊的方法によ぀おも行な
うこずができる。
本発明によるNAD−独立性グリセリンデ
ヒドロゲナヌれは次の性質によ぀お詳现に特性づ
けるこずができる  䜜甚 該酵玠はグリセリンを脱氎玠しおゞヒドロキ
シアセトンにし、その際分離された぀のプロ
トンおよび぀の電子は補酵玠ずしおのNAD
を䞀緒に䜿甚せずに奜適な受容䜓に移さ
れる。
 基質特異性 該酵玠はきわめお特異的にグリセリンず反応
する。特に構造的に近䌌の、同様にしお通垞䜓
液䞭に出珟する物質に察しおは掻性が認められ
ないかたたは僅かな掻性しか認められない。次
衚に皮々の基質に察する掻性を挙げ、その際グ
リセリンに察する掻性を100ずする。
è¡š 皮々の基質に察する本発明によるグリセリン
デヒドロゲナヌれの盞察的掻性グリセリン
100 グリセリン 100 −゜ルビトヌル 45 −マンニトヌル 26 −グルコヌス  −フラクトヌス  ゚タノヌル   最適なPH倀および安定なPH範囲 本発明による酵玠の最適なPH倀はPH7.0〜8.5
である。最高の掻性はおよそPH7.5で埗られ
る。酵玠はPH6.0〜10.0の範囲で安定である。
 酵玠䜜甚の最適枩床 本発明による酵玠は枩床25〜37℃で最高の掻
性を持぀。
 抑制および掻性化 オキサメヌトは酵玠に察しお軜い抑制䜜甚を
持぀。リン脂質は本発明によるグリセリンデヒ
ドロゲナヌれの掻性を玄20増加させる。
 物性 膜結合酵玠は、この酵玠の疎氎性郚分を膜の
ホスホリピドがおお぀お现胞膜䞭に完党に䜍眮
しおいるので、これは䞀般に界面掻性剀の助け
なしに可溶化及び粟補するこずが困難である。
本発明のグリセリンデヒドロゲナヌれは兞型的
な膜結合酵玠であり、これが䞀床可溶化及び粟
補されるず、酵玠溶液䞭に奜適な界面掻性剀の
存圚なしでは、その掻性を保持するこずは困難
である。サむトゟルcytosol酵玠の堎合に
は、ゲル電気泳動、ゲルろ過及び分析甚超遠心
分離を包含する埓来法により、分子量及び酵玠
サブナニツト構造が埗られる。しかし、このよ
うな埓来法は膜結合グリセリンデヒドロゲナヌ
れの匷烈な疎氎性のために、これに適甚するこ
ずができない。ポリアクリルアミドゲル電気泳
動及びSDSゲル電気泳動䞊で該酵玠はゲルカラ
ムの頂郚で凝集する。分析甚超遠心分離装眮の
遠心分離管䞭で該酵玠は凝集し、機械が最倧回
転数59780r.p.m.に達する前にすでに沈殿
する。このような巚倧な凝集はゲルろ過による
分子量の決定においおも芋られた。埓぀お、本
発明の酵玠の分子量、結晶構造及び元玠分析の
デヌタヌを挙げるこずは䞍可胜である。〔“メ゜
ツド・むン・゚ンチモロギヌMethods in
Enzymology”第89巻、アカデミツク・プレ
スAcademic Pr′ess、1982幎“酵玠”、
アグリカルチナラル・ケミカル・゜サむ゚テヌ
Agricultural Chemical Society、日本、
1985幎“ストラクチダヌ・アンド・フアンク
シペンズ・オブ・セルラヌ・メンブラン
Structure and Functions of Cellular
Membrane”アカデミツク・プレス・センタ
ヌAcademic Press Center、日本、1982幎
参照〕。
埓぀お、前蚘の物性に代わる特城を瀺す (a) 該酵玠はピロルキノリンキノンPQQ
を補欠分子団ずしお有する。PQQは最初に
1979幎にメチロトロヌプス
methylotrophsのメタノヌルデヒドロゲ
ナヌれ䞭に芋い出された。その埌PQQは酢
酞菌からのアルコヌルデヒドロゲナヌれ
EC1.1.99.8及びアルデヒドデヒドロゲナ
ヌれEC1.2.99.3、酢酞菌及び他の酞化性
菌からの−グルコヌスデヒドロゲナヌれ
EC1.1.99.17、プ゜むドモナスからのアミ
ンデヒドロゲナヌれEC1.4.99.3、真栞现
胞からの銅含有アミンオキシダヌれ
EC1.4.3.6及びコリンデヒドロゲナヌれ
EC1.1.99.1のような代謝に重芁ないく぀
かの皮類のデヒドロゲナヌれの補欠分子団で
あるこずが報告されおいる。本発明の酵玠が
補欠分子団ずしおPQQを含有しおいるずい
う事実は、他のNAD−䟝存グリセリン
デヒドロゲナヌれずの比范においお、最も特
城のある性質である。PQQはメタノヌル抜
出90%V/Vにより酵玠蛋癜から陀去する
こずができ、酵玠蛋癜ぞのPQQの非共有結
合を瀺しおいる。PQQ溶解酵玠アポ・グ
リセリンデヒドロゲナヌれは倖来PQQを
添加するこずにより掻性化するこずができ
る。
(b) 粟補した本発明の酵玠をEDTAで凊理する
ず、酵玠掻性の完党な喪倱がみられる。倖来
のPQQ及びマグネシりムむオンをその埌添
加するず、酵玠掻性はEDTA凊理の前ずほが
同じレベルたで䞊昇する。
(c) ゞメチルドデシルアミンオキシドでの可溶
化及びポリ゚チレングリコヌル6000での分離
により100倍粟補が埗られる。しかし、前蚘
の匷い疎氎性により粟補した酵玠の粟補床を
蚌明する基準がない。しかしながら、詊隓を
行な぀おも他の酵玠掻性はもはや党く芳察さ
れず、該酵玠が著しく粟補されおいるこずは
明らかである。本発明の酵玠は倚くの皮類の
倚䟡アルコヌルを酞化するが、゚タノヌル、
アルデヒド、−グルコヌス、−フルクト
ヌス、−グルコネヌト又は−ケト−−
グルコネヌトを酞化しない。したが぀お、本
発明の酵玠は少なくずもこれらの基質の酞化
を觊媒する酵玠により汚染されおいない。曎
に、−グルコヌス、−フルクトヌス又は
−グルコネヌトに察する酵玠掻性も粟補の
間に消倱する。
本発明によるグリセリンデヒドロゲナヌれは倚
数の埮生物、䟋えばプ゜むドモナス、れラチア、
クレブシ゚ラ、゚ルりむニア、アスペルギルス、
ペニシリりム、リゟプス、アセトバクタヌおよび
グルコノバクタヌ属から産生するこずができる。
本発明による酵玠はアセトバクタヌおよびグルコ
ノバクタヌ属の埮生物、䟋えばアセトバクタヌ・
キシリヌスAcetobacter xylinusDSM2623
IFO−3288、グルコノバクタヌ・セリヌス
Gluconobacter cerinusDSM2622IFO−
3268およびグルコノバクタヌ・むンダストリり
スGluconobacter industriusDSM2621IFO
−3260から特に良奜な収率で産生される。前蚘
の埮生物株はドむチ゚・ザムルング・フナア・ミ
クロオルガニズメンDeutsche Sammlung fušr
Mikroorganismenに前蚘のDSM番号で、たた
は発酵研究所Iustitut fušr Fermentation、
Osakaにカツコ内に挙げたIFO番号で寄蚗され
おいる。
本発明による酵玠を産生するために、奜適な埮
生物を公知方法により培地で培逊する。培地ずし
おは现菌培逊の栄逊源ずしお䞀般に知られおいる
垞甚の培地を利甚するこずができる。
炭玠源ずしお特に皮々の代謝可胜な炭玠化合
物、䟋えばグルコヌス、フラクトヌス、サクロヌ
ス、マルトヌス、−原子数のサツカリド、メ
ラスMelasseおよび有機酞䟋えばグルコン
酞および酢酞、アルコヌル䟋えばグリセリン
および゚タノヌルおよび糖アルコヌル䟋えば
マンニツトおよび゜ルビトヌルを利甚するこず
ができる。
窒玠源ずしおは皮々の窒玠化合物、䟋えば酵母
゚クストラクト、垌カれむン、コヌン浞挬液、肉
゚クストラクト倩然原料、尿玠およびアンモ
ニりム塩が奜適である。
奜適な無機化合物ずしお培地にナトリりム塩、
カリりム塩、カルシりム塩、マグネシりム塩䞊び
に皮々のリン酞塩を添加するこずができる。
本発明による酵玠を補造するための埮生物の培
逊は有利に液盞䞭で実斜される。しかし工業的芏
暡では氎䞭培逊が特に優れおいる。
本発明による酵玠を培逊するための现菌培地は
有利に枩床28〜32℃で保持される。しかしこの枩
床は、埮生物が成長し、か぀所望の酵玠を産生し
埗る限り倉えおもよい。
培逊時間は培逊条件に巊右される。通垞培逊を
玄〜日埌に終わらさせた堎合に最倧の酵玠収
率が埗られる。
培逊溶液のPH倀は特に重芁ではない。PH倀は有
利にPH〜に調節される。
所倀の酵玠を有する现菌物質の埌凊理は垞法に
より行な぀およい。现菌物質は䜎圧濟過たたは遠
心分離により液状媒䜓から分離するこずができ
る。埮生物の现胞の砎壊は同様に公知方法を利甚
する。䟋えば集めた现菌物質を奜適な緩衝液に懞
濁させ、か぀超音波、フレンチプレスたたはダむ
ノDyno−ミルによ぀お砎壊するこずができ
る。本発明による酵玠は膜フラクシペン䞭に存圚
し、このフラクシペンは高速遠心分離
27000rpmで90分により分離するこずができ
る。堎合により奜適な緩衝液系䞭の奜適な枅浄剀
の添加により酵玠を膜フラクシペンから溶出させ
るこずができる。
本発明によるグリセリンデヒドロゲナヌれは酵
玠の単離のための垞法により埗られた溶液から埗
られる。本発明による酵玠は䟋えば有利にむオン
亀換䜓、䟋えばカルボキシメチル−たたはDEAE
−セルロヌスを甚いおカラムクロマトグラフむヌ
により、氎酞化リン灰石を甚いおカラムクロマト
グラフむヌによりたたはセフアデツクスを甚いお
ゲル濟過により玔粋圢で単離するこずができる。
本発明による酵玠の掻性は基質ずしおグリセリ
ン、プナゞンメトスルプヌトおよび・−
ゞクロルプノヌルむンドプノヌルを甚いお25
℃、PH7.5で囜際単䜍U/mgで衚わす。
本発明によるNAD−独立性グリセリンデ
ヒドロゲナヌれは有利に匏(2)によるグリセリンの
枬定に䜿甚するこずができる。この反応匏によれ
ばグリセリン分子から氎玠原子個が陀去さ
れ、ゞヒドロキシアセトン分子を圢成する。
個のプロトンおよび個の電子は奜適な氎玠受容
䜓に移行される。次の拡倧反応匏が埗られ
る 反応(3)によれば酞化型受容䜓の枛少たた
は還元型受容䜓の増加たたは圢成されるゞ
ヒドロキシアセトンの量を枬定するこずによりグ
リセリンもグリセリン−デヒドロゲナヌれ掻性も
定量するこずができる。
したが぀お本発明の目的は曎にグリセリンの定
量法であり、該方法は、グリセリンをNAD
−独立性グリセリンデヒドロゲナヌれの存圚
でゞヒドロキシアセトンに倉え、その際぀のプ
ロトンおよび぀の電子は盎接奜適な受容䜓に移
され、か぀酞化型受容䜓の枛少もしくは還元型受
容䜓の増加もしくはゞヒドロキシアセトンの増加
を定量するこずより成る。
受容䜓ずしおは電子およびプロトンを吞
収し埗、党おの物質が奜適である。受容䜓を酵玠
反応の指瀺薬ずしお䜿甚する堎合には該受容䜓は
酞化型から還元型に移行する際に枬定可胜な倉化
を瀺さなければならない。酞化型から還元型に移
行する際に可芖の色倉化、理想的には無色から着
色ぞ、たたはその逆の倉化を瀺す受容䜓が優れお
いる。受容䜓がレドツクス過皋で枬定し埗る倉化
を瀺さない堎合には、第の受容䜓−レドツクス
系に枬定可胜なレドツクス過皋を有する第のレ
ドツクス系を結合するこずができる。
本発明により䜿甚される意味における受容䜓ず
しお氎もしくは他の還元型酞玠圢に倉わる酞玠を
䜿甚するこずができる。酞玠消費量は垞法で、䟋
えば酞玠電極たたはワヌルブルグ怜出蚈を甚いお
枬定するこずができる。酞玠の消費量は詊料䞭に
存圚するグリセリン量に比䟋する。
詊料䞭に存圚するグリセリンの量は公知方法で
圢成されたゞヒドロキシアセトンの枬定により枬
定するこずができる。この堎合も同様に䞀連の公
知方法を利甚するこずができる〔䟋えばサンダヌ
スE.B.SandersおよびシナヌベルトJ.
Schubert共著、“アナリテむカル・ケミストリ
Anal.Chem.”、第43巻1971幎、59頁以䞋〕。
特に酞化型から還元型に移行する際に色倉化を
する受容䜓の䜿甚が有利である。かかる色倉化を
分光法を甚いお簡単か぀信頌し埗る方法で分光法
により枬定するこずができる。
以䞋にそのレドツクス過皋を盎接枬定可胜であ
るか、もう぀のレドツクス系ず結合しお枬定可
胜にするこずのできる、本発明により䜿甚可胜な
受容䜓系の䟋を若干挙げる  Fe2+Fe3+−系 これにはヘキサシアノ鉄酞カリりムを
䜿甚するこずができ、これは電子の吞収埌無色
のヘキサシアノ鉄酞カリりムに倉わる。
これから鉄むオンによ぀お深青色に着色
した錯䜓のベルリンブルヌが圢成される。
盎接鉄塩を䜿甚しおもよい。還元時に生
じる鉄むオンは奜適な染料、䟋えばビス
−ゞメチルグリオキシムたたはたた・10−フ
゚ナントロリンずの錯圢成により怜出するこず
ができる。
 ゞ−たたはトリアリヌルメタン染料 このレドツクス系に぀いおは䞀般的な反応匏
を以䞋のようにしお衚わすこずができる この染料類の代衚ずしお次のものが挙げられ
るマラカむトグリヌン、クリスタルバむオレ
ツト、クマシヌブルヌもしくはこれらのロむコ
塩基。
 プナゞンメトスルプヌトPMS 䞀般匏 PMSの酞化型から還元型ぞの移行は枬定困
難である。このレドツクス系を他のレドツクス
系ず結合するのが有利である。テトラゟリりム
塩ずの結合が有利であるず蚌明された。この䞀
般的な反応匏は以䞋のようにしお衚わすこずが
できる (8) PMS還元型テトラゟリりム塩→ 酞化型、無色 PMS酞化型ホルマザン 還元型、着色 䟋えばテトラゟリりム塩ずしお次のものを䜿
甚するこずができる INT−−ペヌドプニル−−−
ニトロプニル−−プニル−テトラゟ
リりム−クロリド MTT−4′・5′−ゞメチルチアゟリル−
−−・−ゞプニル−テトラゟリりム
−ブロミド NBT・2′−ゞ−ニトロプニル−
・5′−ゞプニル−・3′−・3′−ゞメ
トキシ−・4′−ゞプニレン−ゞテトラ
ゟリりムクロリド PMSは有利には・−ゞクロルプノヌ
ルむンドプノヌルDCIPず結合するこず
ができる。その堎合次のレドツクス匏が該圓す
る (9) PMS還元型DCIP酞化型→ PMS酞化型DCIP還元型  むンゞゎもしくはむンゞゎ誘導䜓 むンゞゎおよびその誘導䜓は同様にしお氎玠
受容䜓ずしお䜜甚する。次の䞀般匏が該圓す
る 本発明により䜿甚可胜なむンゞゎ誘導䜓は䟋
えば・6′−ゞブロムむンゞゎおよび・5′・
・7′−テトラブロムむンゞゎである。
 プノキサゞン−もしくはプノチアゞン染
料 プノキサゞンもしくはプノチアゞン染料
も氎玠原子を吞収し、か぀その際着色の酞化型
から無色の還元型に倉わる。
この染料に぀いおは䟋えば分子圓り氎玠原
子個を吞収しおロむコメチレンブルヌに倉わ
るメチレンブルヌが挙げられる。
前蚘のグリセリン定量方法はグリセリンに倉
換される物質の定量䞊びにかかる反応を接觊す
る酵玠の定量にも有利に䜿甚し埗る。
前蚘の甚途の䟋ずしお血液、血挿たたは血枅
䞭のトリグリセリドの定量を詳説する。そのた
めにトリグリセリド䞭性脂肪を奜適なリパ
ヌれを甚いお公知方法で加氎分解し、か぀遊離
のグリセリンを本発明によるグリセリンデヒド
ロゲナヌれおよび奜適な電子受容䜓および氎玠
受容䜓を甚いお前蚘のようにしお倉換させる。
反応匏は以䞋のようにしお衚わすこずができ
る トリグリセリドの酵玠加氎分解は公知方法に
より実斜される。トリグリセリドをけん化する
ための酵玠ずしおは有利に垂販のリポタンパク
質リパヌれE.C.3.1.1 34たたはリパヌれ
E.C.3.1.1.3ず゚ステラヌれE.C.3.1.1.1
の混合物を利甚するこずができる。
血液䞭のグルコヌスは本発明によるNAD
−独立性グリセリンデヒドロゲナヌれを甚
いる、グリセリンずトリグリセリドの定量に圱
響を䞎えない。
以䞋実斜䟋に぀き本発明を詳述する 䟋  NAD−独立性グリセリンデヒドロゲナヌ
れグルコノバクタヌ・むンダストリりス
DSM2621IFO−3260から グルコノバクタヌ・むンダストリりス
DSM2621をグリセリン−グルタミン酞−媒䜓䞭
で公知方法により培逊する。现菌物質を集め、か
぀フレンチ・プレスで圧力1000Kg/cm2で砎壊す
る。砎壊されなか぀た现胞を遠心分離5000
により陀去する。现胞ホモゞネヌトを超遠心分離
機68000で90分遠心分離する。现胞膜フラ
クシペンが捕集される。これを0.05M−トリス−
HCl−緩衝液PH8.0を甚いおタンパク質10mg/
mlの含量に調節する。最終濃床0.5にするため
に垞甚の、奜適な枅浄剀、䟋えばトリトン
Triton×100を添加する。埗られた混合物を
℃で60分撹拌しお酵玠を溶液にする。匕続き60分
間遠心分離する68000。䞊柄み液からDEAE
−セルロヌヌスPH7.5およびヒドロキシルア
パタむトPH7.5を甚いおクロマトグラフむヌ
するこずによりタンパク質mg圓り50Uの掻性を
有する、䞀様な酵玠調剀が埗られる。
䟋  䟋に挙げた埮生物グルコノバクタヌ・むンダ
ストリりスDSM2621の代わりにアセトバクタ
ヌ・キシリヌスDSM2623もしくはグルコノバク
タヌ・セリヌスDSM2622を䟋に蚘茉の方法で
培逊し、か぀埌凊理する。42U/mgもしくは46U/
mgの掻性を持぀酵玠調剀が埗られる。
䟋  本発明によるグリセリンデヒドロゲナヌれの酵
玠掻性の定量 キナベツトにプナゞンメトスルプヌト0.6
Όモル、・−ゞクロルプノヌルむンドプ
ノヌル0.6Όモルおよびトリス−HCl−緩衝液
PH7.5100Όモルを装入する。その掻性が0.01
〜0.1単䜍にある、定量すべき酵玠調剀を添加す
る。床蒞溜した氎を添加しお最終容量2.9mlを
補造する。25℃で分の恒枩保持埌グリセリン
100Όモルを添加しお酵玠反応を開始させる。
・−ゞクロルプノヌルむンドプノヌルの
脱色の速床を600nでの吞収を枬定するこずに
より远求する。酵玠掻性の蚈算を、PH7.5におけ
る・−ゞクロルプノヌルむンドプノヌル
のミルモルの吞光係数を倀100ずしお行なう。
吞光倉化△E6002.33分を行なう酵玠量を単䜍
ずする。
䟋  プナゞンメトスルプヌトおよび・−ゞ
クロルプノヌルむンドプノヌルを甚いおグ
リセリンの定量  范正曲線の䜜成 グリセリン溶液100Όモルから床
蒞溜氎を甚いお溶液0.1ml䞭にグリセリン
0.01、0.02、0.04、0.06、0.08、0.10、0.50Όモ
ルを含有する皮の暙準溶液を補造する。各グ
リセリン暙準溶液に掻性10Uを有する酵玠溶液
0.1mlを添加する。床蒞溜氎の添加によりそ
れぞれ2.8mlの最終容量に調節する。25℃で
分恒枩保持する。
次いでプナゞンメトスルプヌト0.6Όモ
ルおよび・−ゞクロルプノヌルむンドフ
゚ノヌル0.6Όモルを含有する溶液0.2mlの添加
により反応を開始させる。分光蚈を甚いお
600nでの吞光を枬定する。グリセリン0.01〜
0.05Όモルの範囲で盎線的な経過が認められ
る。
 未知の詊料の枬定 未知のグリセリン含量を有する詊料mlにキ
ナベツト䞭でプナゞンメトスルプヌト0.6
Όモルおよび・−ゞクロルプノヌルむン
ドプノヌル0.6Όモルを含む溶液mlを添え
る。トリス−HCl−緩衝液PH7.50.5ml100
Όモルを加え、か぀25℃で分恒枩保持す
る。怜出反応を掻性10Uの酵玠溶液0.1mlの添
加により開始させる。600nでの吞光の枛少
を枬定する。枬定した吞光差を范正曲線ず比べ
お䜿甚詊料のグリセリン含量を枬定する。
䟋  プナゞンメトスルプヌトおよびテトラゟリ
りム塩を甚いおグリセリンの定量 未知のグリセリン含量を有する詊料mlにキナ
ベツト䞭でプナゞンメトスルプヌト0.1Όモ
ル、−・−ゞメチルチアゟリル−−
・−ゞプニル−テトラゟリりムブロミド
1.2Όモルおよびトリス−HCl−緩衝液0.1M
PH7.5100Όモルを含有する溶液mlを加える。
これを25℃で分恒枩保持する。本発明による酵
玠1Uを持぀溶液20Όの添加により怜出反応を
開始させる。570nで吞光倉化を枬定する。枬
定された吞光差を范正曲線これは既知のグリセ
リン含量を有する詊料の枬定により䜜成するこず
ができるず比べお䜿甚された詊料のグリセリン
含量を枬定する。
䟋  トリグリセリドの定量 ヒト血枅0.02mlにキナベツト䞭でリポタンパク
質リパヌれ100〜200Uたたはリパヌれおよび゚ス
テラヌれを含有する酵玠溶液0.5mlを加え、か぀
25℃で20分恒枩保持する。
次いでプナゞンメトスルプヌト0.6Όモ
ル、・−ゞクロルプノヌルむンドプノヌ
ル0.2Όモルおよびトリス−HCl−緩衝液PH
7.5100Όモルを含む溶液mlを添加する。次い
で25℃で分恒枩保持する。次いで怜出反応を本
発明によるグリセリンデヒドロゲナヌれ1Uを含
有する溶液0.1mlの添加により開始させる。
600nでの吞光枛少を枬定する。吞光差から
䟋に蚘茉の方法でグリセリン含量、したが぀お
トリグリセリド含量を枬定するこずができる。平
均トリグリセリド含量110mg/dlが刀明した。
トリグリセリド定量では盲怜倀枬定の実斜が掚
奚される。

Claims (1)

  1. 【特蚱請求の範囲】  至適PH倀がPH7.0〜8.5であり、安定PH倀がPH
    6.0〜10.0であり、枩床25〜37℃で最高の掻性を
    有し、オキサメヌトにより掻性は軜く抑制され、
    リン脂質により掻性は玄20増加し、ピロルキノ
    リンキノンを補欠分子団ずしお有する、特異的に
    グリセリンを脱氎玠しおゞヒドロキシアセトンに
    し、その際分離された぀のプロトンおよび぀
    の電子はNADを䞀緒に䜿甚せずに奜適な
    受容䜓に移される、NAD−独立性グリセリ
    ンデヒドロゲナヌれ。  グリセリンを受容䜓の存圚でゞヒドロキシア
    セトンに倉える、特蚱請求の範囲第項に蚘茉の
    NAD−独立性グリセリンデヒドロゲナヌ
    れ。  NAD−独立性グリセリンデヒドロゲナ
    ヌれを補造するための方法においお、この酵玠を
    圢成し埗る、プ゜むドモナス、セラチア、クレブ
    シ゚ラ、゚ルりむニア、アスペルギルス、ペニシ
    リりム、リゟプス、アセトバクタヌたたはグルコ
    ノバクタヌ属の埮生物を培地で培逊し、か぀酵玠
    を培逊汁から単離するこずを特城ずする、至適PH
    倀がPH7.0〜8.5であり、安定PH倀がPH6.0〜10.0で
    あり、枩床25〜37℃で最高の掻性を有し、オキサ
    メヌトにより掻性は軜く抑制され、リン脂質によ
    り掻性は玄20増加し、ピロルキノリンキノンを
    補欠分子団ずしお有する、特異的にグリセリンを
    脱氎玠しおゞヒドロキシアセトンにし、その際分
    離された぀のプロトンおよび぀の電子は
    NADを䞀緒に䜿甚せずに奜適な受容䜓に
    移される、NAD−独立性グリセリンデヒド
    ロゲナヌれの補法。  埮生物ずしおアセトバクタヌ・キシリヌス
    DSM2623、グルコノバクタヌ・セリヌス
    DSM2622たたはグルコノバクタヌ・むンダスト
    リりスDSM2621を䜿甚する、特蚱請求の範囲第
    項蚘茉の方法。  グリセリンを定量するための方法においお、
    NAD−独立性グリセリンデヒドロゲナヌれ
    の存圚、受容䜓の存圚でグリセリンをゞヒドロキ
    シアセトンに倉え、か぀酞化型受容䜓の枛少もし
    くは還元型受容䜓の増加もしくは還元型受容䜓の
    増加もしくはゞヒドロキシアセトンの増加を定量
    するこずを特城ずする、グリセリンを定量するた
    めの方法。  受容䜓ずしお酞玠を䜿甚し、か぀酞玠の消費
    量を枬定する、特蚱請求の範囲第項蚘茉の方
    法。  第受容䜓−レドツクス系をもう぀のレド
    ツクス指瀺薬ず結合する、特蚱請求の範囲第項
    蚘茉の方法。  受容䜓ずしおプナゞンメトスルプヌト
    を、か぀他のレドツクス指瀺薬ずしお・−ゞ
    クロルプノヌルむンドプノヌルを䜿甚し、か
    ぀・−ゞクロルプノヌルむンドプノヌル
    の吞光䜎䞋を600nで枬定する、特蚱請求の範
    囲第項蚘茉の方法。  受容䜓ずしおプナゞンメトスルプヌト
    を、か぀他のレドツクス指瀺薬ずしおテトラゟリ
    りム塩を䜿甚し、か぀ホルマザン圢成を枬光法で
    枬定する、特蚱請求の範囲第項蚘茉の方法。  トリグリセリドを定量するための方法にお
    いお、トリグリセリドをけん化しおグリセリンず
    遊離の脂肪酞にし、か぀NAD−独立性グリ
    セリンデヒドロゲナヌれの存圚、受容䜓の存圚で
    遊離グリセリンをゞヒドロキシアセトンに倉え、
    か぀酞化型受容䜓の枛少もしくは還元型受容䜓の
    増加もしくはゞヒドロキシアセトンの増加を定量
    するこずを特城ずする、トリグリセリドを定量す
    るための方法。  該詊薬䞭で堎合によりトリグリセリドがけ
    ん化されおグリセリンず遊離脂肪酞になり、グリ
    セリンが奜適な受容䜓の存圚でグリセリンデヒド
    ロゲナヌれによ぀おゞヒドロキシアセトンに倉換
    され、か぀受容䜓の枛少たたは増加もしくはゞヒ
    ドロキシアセトンの増加が定量される、グリセリ
    ン䞊びにトリグリセリドを定量するための詊薬に
    おいお、該詊薬がNAD−独立性グリセリン
    デヒドロゲナヌれを含有するこずを特城ずする、
    グリセリン䞊びにトリグリセリドを定量するため
    の詊薬。
JP59054611A 1983-03-25 1984-03-23 −独立性グリセリンデヒドロゲナ−れ、その補法およびグリセリンおよびトリグリセリドを定量するための方法および詊薬 Granted JPS59183689A (ja)

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