JPS62181220A - 冷沈澱により抗血友病因子を製造し且つ得られる抗血友病因子製品の溶解度を改善するための方法 - Google Patents

冷沈澱により抗血友病因子を製造し且つ得られる抗血友病因子製品の溶解度を改善するための方法

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JPS62181220A JP61266504A JP26650486A JPS62181220A JP S62181220 A JPS62181220 A JP S62181220A JP 61266504 A JP61266504 A JP 61266504A JP 26650486 A JP26650486 A JP 26650486A JP S62181220 A JPS62181220 A JP S62181220A
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本主皿匹止且 本発明は、抗血友病因子（ＡＨＦ）の精製および／また
は濃縮方法に関する。さらに詳しくは、本発明は、冷沈
澱を使用して寒性沈澱した血漿から回収された最終ＡＨ
Ｆ製品の改良方法に関する。
血液凝固のプロセスは複雑な生物学的活動であり、そし
て正常な全血に見出されるいくつかの物質の相互作用を
含んでいる。血液凝固メカニズムに関連したある種の因
子がある種の個人には存在しないか、重大に欠乏してい
ることが知られている。例えば、古典的血友病（血友病
Ａ）はＡ　ＨＦ（因子■）の欠乏によっておこる病気で
ある。血友病Ｂとして知られる先天的血友病にかかって
いる個人では、血液は血漿トロンボプラスチン成分（Ｐ
ＴＣ，因子ＩＸ）が欠乏している。凝固メカニズムにお
いて重要であるいくつかの他の因子は因子■、■および
Ｘである。
過去において、血友病の治療は患者へ全血または血漿を
輸血することよりなっていた。より良い医学的プラクテ
ィスは、可能ならばいつでも患者へ彼が欠乏している血
液成分のを投与すべきことを指示する。血液の全般的不
足のため、血液をその種々の成分に分画し、それによっ
て個々の成分を必要な時患者の処置に使用できることが
有利である。
血液および血漿をその別々の成分またはその濃°縮物に
分画する種々の方法が知られている。アルコール分画方
法の発展についての業績は注目すべきものがある。特に
ＡＨＦの製造に関しては、最近の米国特許第４，３８３
．９８９号、４，３８６，０６８号、４゜３８７．０９
２号および第４，４０４，１３１号は高度に精製された
ＡＨＦの濃縮物を得る改良された方法を例証する。
不幸にも、Ａ　ＨＦの単離に関連する多数の問題が存在
する。ＡＨＦは、それ自体フィブリノーゲンおよびフィ
ブロネクチンのような、血漿中の他のタンパクと密接に
関連した糖タンパクである。
フィブリノーゲンおよびフィブロネクチンは最終ＡＨＦ
溶液中の夾雑物と考えられている。それ故最終製品中に
ＡＨＦの高い比活性を維持しながら、血漿からできるだ
け多くのフィブリノーゲンおよびフィブロネクチンを沈
澱除去することが必要である。また、ＡＨＦの低溶解度
は患者へ多量の流体の投与を必要とするから、高い溶解
度を持つ最終ＡＨＦ製品を得ることが有利である。多量
の流体は患者の心臓および循環に対するストレインであ
り、そして血友病患者を失われた血液因子の連続的置換
または注入に依存性とし、そして投与のため医師の助け
を必要とする。最終製品中の高いフィブリノーゲンおよ
びフィブロネクチン含量は所望より低い溶解度を招く。
種々の方法がこの分野でＡＨＦを単離するために知られ
ているが、しかしこれらの方法はしばしば実施するのに
極端に高価であり、そして最終ＡＨＦ製品に高い溶解度
、低いフィブリノーゲンおよびフィブロネクチン含量、
ＡＨＦの高い比活性、および最初の血漿からの高いＡＨ
Ｆ収率の最適な組合せを提供しない。それ故必要なのは
、これらすべての基準を満たし、そして禁止的に高価で
ないＡＨＦを単離する方法である。本発明はこれら要請
を満足させ、そして他の関連する利益を提供する。
本溌ｍ叉 本発明は、フィブリノーゲンおよびフィブロネクチンを
含む夾雑物の冷沈澱、および得られた上〆ｎ液からその
後の回収による、血漿の寒性沈澱溶°液からＡ　ＨＦを
単離する方法に存する。最初の冷沈澱ステップの間に方
性沈澱へカルシウムイオン源の添加は、フィブリノーゲ
ンおよびフィブロネクチンの所望の沈澱を助け、他方プ
ロセス中の種々のステップの一つにおいてポリエチレグ
リコール（ＰＥＧ）の添加は、最終ＡＨＦ製品の溶解度
を大きく増加し、そしてＰＥＧをいつ摩えるかによって
フィブリノーゲンおよびフィブロネクチン含量を低下さ
せるように作用し得る。生成するＡＨＦ製品は、他の方
法によって単離したＡ　ＨＦ製品よりもより少ない夾雑
物、より大きい溶解度およびより高い比活性を有する。
本発明方法は冷凍血漿から方性沈澱を形成することを含
む。方性沈澱を蒸留水に熔解し、低イオン強度の溶液を
つくる。カルシウムイオン源、好ましくは塩化カルシウ
ムが、しかしカルシウムイオン濃度を非活性化強度にす
るのに十分な量だけ添加される。カルシムラ塩が可溶性
であり、そして塩の陰イオン部分が無毒性でそしてキレ
ータ−でない限り、任念のカルシウム塩をカルシウムイ
オン源として使用することができる。フィブリノーゲン
およびフィブロネクチンが次にかきまぜながら溶液のｐ
Ｈを調節し、そして温度を下げることによって沈澱させ
られる。次にＡＨＦが沈澱および口過によって得られた
上清液から回収される。
フィブリノーゲンおよびフィブロネクチンの沈澱の後、
得られた混合物が遠心され、沈澱が捨てられる。上清液
のｐＨが最初に調節され、そして限外口過によっである
比重量／容積％（ｗ／ｖ％）へ濃縮される。塩化ナトリ
ウムの添加によって溶液のナトリウム濃度を調節しそし
てｐＨを調節した後、溶液のｐＨを約８０℃へ調節する
。グリシンへ加え、温度を下方へ約２℃に調節し、ＡＨ
Ｆを沈澱する。混合物を遠心し、そしてＡＨＦ沈澱をク
エン酸添加食塩水に懸濁し、その後ｐＨを関節する。口
過後、溶液を所望の力価へ希釈し、再び口遇し、バルク
ＡＨＦ溶液を得る。バルクＡＨＦ溶液を次に最終容器中
へ小分けし、冷凍乾燥し、加熱する。最終ＡＨＦｔ！！
品を約５℃で貯蔵する。
ＰＥＧを回収プロセスの種々の段階で様々の結果をもっ
て添加することができる。もしＰＥＧを最終口過ステッ
プの直前に加えるならば、主要な利益は／８解度の増大
であろう。ＰＥＧを回収プロセスの間のある点で添加す
る限り、それは最終ＡＨＦ／８液中に存在し、溶解度が
増加するであろう。
ＰＥＧはグリシン添加ステップの直前に加えることもで
きる。この時点のＰＥＧの添加は上清液からＡＨＦの沈
澱を助け、そして最終ＡＨＦｉ！Ｊ品の増大した溶解度
を与える。
代わりに、ＰＥＧは最初の冷沈澱の間、ｐＨおよび温度
調節ステップの中間において添加することができる。プ
ロセスのこの時点において添加されるＰＥＧの量は、Ａ
ＨＦがフィブリノーゲンおよびフィブロネクチンと一所
に沈澱しないように注意深く制御しなければならない。
Ｆ＞ＥＧが冷沈澱の間に添加される時は、後のＡＨＦ回
収ステップに対し調節がなされなければならない。特に
、生成する上清液の濃度は添加したＰＥＧの量に応じて
低い重量／容積パーセントとしなければならず、そして
ナトリウム濃度は最適結果のため高いレベルへ調節すべ
きである。その間にＰＥＧを添加することができるプロ
セスの三つの異なる段階のうち、最終製品中に減少した
フィブリノーゲンおよびフィブロネクチン含量と、そし
て最終製品の増大した溶解度を与えるため、後二者が好
ましい。
本発明の他の特徴および利益は、例示のため本発明の原
理を例証する以下の詳細な説明から明らかになるであろ
う。
しい貝　　のエ　な゛ 本発明は、ＡＨＦを寒性沈澱した血漿から回収する方法
に具体化される。該方法は、一般に、フィブリノーゲン
およびフィブロネクチンのような夾雑タンパクを沈澱除
去するため、寒性沈澱の冷沈澱と、沈澱および口過によ
る生成した上清液からＡＨＦの回収を含む。冷沈澱ステ
ップの間カルシウムイオン源の添加はフィブリノーゲン
およびフィブロネクチンの沈澱を増加させ、それによっ
て最終ＡＨＦ製品中のこれら夾雑物の最終濃度を低下さ
せる。回収プロセスの段階の一つにおいて添加されたポ
リエチレングリコール（ＰＥＧ）は最終ＡＨＦ製品の溶
解度を増大するであろう。回収プロセスのどの段階でＰ
ＥＧが添加されるかによって、それもフィブリノーゲン
およびフィブロネクチンまたはＡＨＦの沈澱を助けるで
あろう。
この方法は高い溶解度、高い比活性、低いフィブリノー
ゲンおよびフィブロネクチン濃度、そして高収率をもっ
た最終ＡＨＦ製品を有利に与える。
さらに詳しくは、本発明方法は冷凍血漿のボトルから出
発することを含む。実施例１に述べるように、寒性沈澱
はこの分野で既知の技術に従って、冷凍血漿から制御さ
れた環境において解凍することによって集められる。
寒性沈澱は２０℃〜３５℃、好ましくは約２３℃におい
て注入のため水に溶解される。０．００１ｍＭと１．０
ｍＭの間の最小カルシウム濃度を与えるのに十分な塩化
カルシウムが添加される。ｐＨが約６．５±０．２へ調
節され、そして溶液は混合下５℃と１５℃の間へ冷却さ
れる。
フィブリノーゲンおよびフィブロネクチン夾雑物を含ん
でいる生成する沈澱を遠心によって除去する。Ａ　Ｉ−
（Ｆを含んでいる上清液のｐ　Ｈを７．０±０．２へ調
節し、限外口過によって１．０Ｗ／ｖ％および４．ＯＷ
／ｖ％の間のタンパク濃度へ濃縮される。使用される限
外口過ユニット、公称１００゜０００の分子量カットオ
フを有するポリスルホンまたは均等の膜である。
限外口過後、リテネートを塩化ナトリウムで約１５０な
いし８００ｍＥｑ／ｆｆのナトリウム濃度へ調節され、
そしてｐＨが水酸化ナトリウムで７゜３±０．２へ調節
される。溶液！あたり、１．０ないし１１．０ｇのＰＥ
Ｇが添加される。溶液は次に８℃±０．５℃へ冷却され
、グリシンが１．３Ｍないし２．５Ｍの濃度へ添加され
る。溶液の温度はＡＨＦを沈′澱させるため混合下２℃
±２℃へ調節される。
生成した溶液を遠心し、今やＡＨＦを含んでいる沈澱は
クエン酸添加食塩暖衝液（塩化ナトリウム０．１２Ｍお
よびクエン酸ナトリウム０．２Ｍ）中に懸濁し、所望の
ＡＨＦ活性へ希釈される。溶液゛はもし必要ならば所望
のＡＨＦ活性へ再調節され、そして口過によって滅菌さ
れる。
生成するバルク溶液は最終容器へ小分けされ、冷凍乾燥
され、無菌条件下でシールされる。シールされたバイア
ルは次に減少されたビールスリスクのため加熱される。
実施例１に使用したＡ　１（Ｆ回収方法の結果が表１に
示されている。語表に見られるように、最終Ａ１８Ｆ盟
品の溶解度は非加熱形で５３秒、加熱形で６４秒であっ
た。比較のため、表５においてＰＥＧの添加なしの同じ
方法によって製造したＡＨＦの溶解度は加熱後４９２秒
であった。さらに表１に示すように、最終Ａ　ＨＦ　製
品のフィブリノーゲン含量は４１８ｎｇ／ａと比較的低
いレベルであり、他方ＡＨＦの比活性は３．４０ｕ、／
■タンパクと望ましく高いレベルであった。
冷沈澱ステップの間に添加されるカルシウムイオン源は
、該塩が可溶性で、そして陰イオン部分が無毒性でキレ
−クーでない限り、任意のカルシウム塩でよい。使用で
きないキレータ−の例はクエン酸カルシウムおよびシュ
ウ酸カルシウムである。例示のため、そして限定ではな
（、塩化カルシウムに加えて使用し得るカルシウム塩は
炭酸カルシウムおよびグルコン酸カルシウムである。
冷沈殿ステップの間にカルシウムイオンの添加はフィブ
リノーゲンおよびフィブロネクチン夾雑物の増加した沈
澱をもたらす。しかしながら、溶液が非反応性を保って
いるようにカルシウム塩の限定された量を添加しなけれ
ばならない。反応性溶液は凝固を生じ、溶液を使用不能
にするであろう。
実施例１におけるようにＡ　ＨＦ沈澱ステップの間にＰ
ＥＧを加える代わりに、ＰＥＧは実施例２〜４に示すよ
うに、フィブリノーゲンおよびフィブロネクチンの冷沈
澱の間に加えることができる。
実施例２Ａにおいて、Ａ　ＨＦ回収プロセスは、試薬お
よび溶液の同じ割合およびパーセンＩ・と、異なった絶
対容積および重量をもって、しかしＡ　ＨＦ回収プロセ
スのどの点でもＰＥＧの添加なしに、実施例１に使用さ
れたものと同し前述の基本プロ尋スを用いで実施された
。実施例２Ｂにおいて、Ａ　ＨＦ回収プロセスは実施例
１に類似の実質」ニ同様な態様で実施されたが、しかし
ＡＨＦ沈澱ステップの間０．９ｗ／ｖ％ＰＥＧ添加の代
わりに、０゜２５Ｗ／ｖ％ＰＥＧがプロセスの冷沈澱段
階のｐ■］調節と温度調節ステップの間に添加された。
■外口過濃縮とナトリウム濃度調節は実施例１と同じに
実施され、濃縮は３．０ｗ／ｖ％へ実施され、そしてナ
トリウム濃度は１６０ｍＥｑ／ｆｆへ調節された。表２
に見える結果の比較は、ＡＨＦ！！！品の比活性とフィ
ブリノーゲン含量に劇的な改善を示す。表２に示す結果
を得たテストは、充填、冷凍、凍結乾燥直前のバルクＡ
ＨＦサンプルについて実施された。ＰＥＧサンプルの比
活性は３．２１ｕ／ｍｇタンパクであり、他方ＰＥＧな
しのサンプルの比活性はたった２、３８ｕ／■タンパク
であった。同様に、ＰＥＧサンプルのフィブリノーゲン
含量は実質的により低い９３７．４ｍｇ％であった。
本発明のプロセスは冷沈澱ステップ中０．２５％ＰＥＧ
を使用し、そしてＡ　Ｉ−（Ｆ沈澱ステップの間ナトリ
ウム濃度の調節なしで実施し得るが、冷沈澱ステップの
間のＰＥＧの添加は上清液中の低りンパク濃度をもたら
し、これは代わりにナトリウム濃度調節を示唆する。こ
のように、実施例３において、ＡＨＦ回収プロセスは実
施例２におけるのと同じに実施されたが、しかしＡＨＦ
沈澱ステップの間のナトリウム濃度は１６０ｍＥｑ／Ｉ
！ではなく　６００ｍＥｑ／βへ調節される。充填、冷
凍および凍結乾燥直前のバルクＡＨＦのテストから得ら
れた表３に示した結果は、ＡＨＦサンプルの比活性およ
びフィブリノーゲン含量の両方の改善を示し、それらは
それぞれ３．４８ｕ／■および５６５、１■％であった
。一般に、ＡＨＦ沈澱ステップの間のナトリウム濃度は
１００ｍＥｑ／ｊ７ないし約８００ｍＥｑ／ｊ！の範囲
内に調節することができる。
冷沈澱ステップ中より高い濃度のＰＥＧの添加は、実施
例４および表４に示すように、もっと有利な結果を提供
する。実施例４において、０．５ｇ％のＰＥＧが実施例
３において加えられた０、２５ｇ％の代わりに冷沈澱の
間に添加された。ＡＨＦ沈澱ステップの間ＡＨＦ溶液を
３．０ｗ／ｖ％ではなく２．０Ｗ／ｖ％へａ縮したこと
を除き、ＡＨＦ沈澱の間ナトリウム濃度を６００ｍＥｑ
／ｊ！へ調節することを含む、プロセスの残りを通じ濃
度およびステップは同じであった。フィブリノーゲンお
よびフィブロネクチンの、冷沈澱の間添加されたＰＥＧ
のより高いパーセントにおいて、ＡＨＦ沈澱ステップの
間ＡＨＦ溶液の濃度は最適結果のため減少されなければ
ならない。表４に示すバルクＡＨＦについて実施された
テスト結果は、Ａ　ＨＦ製品の比活性５．０４ｕ／■と
、フィブリノーゲン含量２８１■％を示し、両者とも実
施例３で得られた結果よりも良い。
最終ＡＨＦｉ品中のＰＥＧの存在はＡＨＦ製品の溶解度
を改善する。厳格に溶解度観察からは、その存在は最終
ＡＨＦ製品に至るプロセスを通じ残るから、ＰＥＧを添
加する時は問題ではない。
実施例５および表５は、最終ＡＨＦ製品中の存在の溶解
度に対する影響を示す。実施例５において実施されたテ
ストは、所望の力価への希釈の直後そして最終口過プロ
セスの間の無菌口過ステップの直前にＡＨＦ沈澱した溶
液へ０．２ｇ％ＰＥＧの添加を含んでいた。表５は実施
例５に使用した方法と、そしてＰＥＧ添加なしの同じ方
法の実施例２Ｂに使用した方法との間の比較結果を示す
。ＰＥＧを含有するＡＨＦ製品の溶解度は、ＰＥＧを添
加しないＡＨＦ溶液の３５１秒に比較して、加熱前３０
１秒であった。同様に、加熱後のＰＥＧ溶液の溶解度は
、ＰＥＧ添加剤を含まない溶液の４９２秒に比較し、２
３４秒であった。勿論この段階において溶液へＰＥＧを
添加することはＰＥＧ無添加に比較して有利であるが、
フィブリノーゲンおよびフィブロネクチンの増加した沈
澱の利益は、ＰＥＧが冷沈澱ステップの間に添加される
実施例２〜４におけるように実施されないであろう。従
って実施例２．３および４の方法が好ましく、実施例４
に示した方法が最も好ましい。
ＡＨＦ回収プロセスにおける種々の段階におけるＰＥＧ
の添加の利益を例証したが、ＰＥＧ添加なしの、しかし
冷沈澱ステップ中溶解した寒性沈澱へカルシウムイオン
源を添加した実施例２Ｂに記載した方法は、それ自体こ
の分野において既知の現今のＡＨＦ回収技術を上進る有
意な前進であることが強調されなければならない。
以下の実施例は、ここに論じた具体例に従った本発明を
例証するであろう。
実施例１ 冷凍血漿１５／ｌがこの分野で既知の技術に従って制御
された環境において解凍された。遠心後、寒性沈澱に乏
しい血漿をジャケットつきステンレス鋼反応タンクへ集
めた。
得られた寒性沈１１ｇ６．０　ｋｇを２３℃で水２４ｋ
ｇに熔解した。０．６８ｍＭ塩化カルシウム溶液２．４
　ｋｇを最小カルシウム濃度５０μＭを与えるように加
えた。溶液のｐＨを酢酸１１０ｍｉ’の添加によって６
．５へ調節した。次に溶液を混合しながら循環水浴中に
おいて９℃へ冷却した。
生成した沈澱をベックマンモデルＪ６Ｂパケット遠心機
中において遠心によって除去した。Ｎａ０）ｌ　３７成
の添加によって上清液のｐＨを７．０へ調節し、そして
溶液を限外口過によって３　ｗ　／　ｖ％のタンバク濃
度へ濃縮した。使用した限外口過ユニ、７トは、ｔｏｏ
、ｏｏｏの公称分子量カットオフを持ったポリスルホン
膜であった。
限外口過後、リテネートをＮａＣ１４９，４ｇの添加に
よって１６０ｍＥｑ／ｆｆのナトリウム濃度へ調節した
。次にＩＮ水酸化すトリウム７蹴の添加によってｐ　Ｈ
を７．３へ８周節した。ＰＥ０６０ｇ（９゜０ｇ／ｊり
を添加し、溶液を循環水浴中で８℃へ冷却した。グリシ
ン０．８５　ｋｇを加え、その濃度を１．７Ｍとした。
次に溶液の温度を混合しながら循環水浴内において２℃
へ調節した。
得られた溶液をベックマン遠心機内において遠心し、沈
澱をクエン酸添加食塩緩衝液（塩化ナトリウム０．１２
Ｍおよびクエン酸ナトリウム０．０２Ｍ）１．９ｋｇ中
に懸濁し、溶液を６０　Ａ　ＨＦ単位／成へ希釈した。
溶液のｐ　ＨをＩＮ酢酸２ｍＪ！の添加によって６．８
へ調節し、そして溶液を口過によって清澄化した。溶液
をクエン酸添加食塩緩衝液３βの添加によって４０ＡＨ
Ｆ単位／淑のＡ　Ｉ−Ｉ　Ｆ活性へ再調節し、そして得
られた溶液を口過によって滅菌した。
得られたバルクＡ　ＨＦ溶液７．８４は３０献容器へ小
分けされ、Ａ　１８　Ｆ溶液１０淑が各容器へ収容され
た。次に容器が冷凍され、凍結乾燥され、そして熱処理
された。
Ａ　ＨＦ力価、　　ｕ／１ｎＪ２３４　　　３３ＡＨＦ
関連抗原、　　ｕ／ｄ　　　　　　５３　　　４９フイ
ブリノーゲン、　ｒｒｇ／設　　　　４６４３生物学的
　　　　　　　　　　　４１４　　４１８免疫学的　　
　　　　　　　　　　５０２　　５０１溶解度１秒　　
　　　　　　　　　５３６４フイブロネクチン、ｒｒｇ
／ｙｄｌ　　　　　　４．０　　３．５充填容積、淑　
　　　　　　　　　　　　　１０総タンパク、ｇ容器　
　　　　　　　　　　６．１水分３％　　　　　　　　
　　　　　　　　１．２ｐ　　Ｉ−１６・８ ポリエチレングリコール。
ｇ／１００　ｍ１２　　　　　　　　０．０６グリシン
、−〇、１８ 実施例２Ａ 実施例１に述べた同じプロセスを使用し、溶液中の試薬
の同じ割合およびパーセントであるが、しかし物質の異
なる絶対容積および重量をもってＡＨＦの回収を実施し
た。しかしながらＡＨＦ沈澱ステップは実施しなかった
。ＡＨＦ回収プロセスを通じＰＥＧは添加しなかった。
実施例２Ｂ 実施例１に述べた同じプロセスを使用し、溶液中の試薬
の同じ割合およびパーセントであるが、しかし物質の異
なる絶対容積および重量をもってＡ　Ｉ−（Ｆの回収を
実施した。しかしながらＡＨＦ沈澱ステップ中溶液溶液
たりＰＥＧ９．Ｏｇの添加の代わりに、フィブリノーゲ
ンおよびフィブロネクチンの最初の冷沈澱ステップの間
６．５へのｐＨｆ１節と９℃への温度調節ステップの間
にＰ　Ｅ　Ｇ　０．２５ｇ％を加えた。
実施例２Ａおよび２Ｂにおいて回収された製品の比活性
およびフィブリノーゲン含量テストの結果は表２に見ら
れる。
フィブリノーゲン、ｍｇ％　　１２７９．６　　　　９
３７．４実施例３ ＡＨＦ沈澱ステップ中ナトリウム濃度を１６０ｍ　Ｅ　
ｑ　／　１ではなく６００ｍＥｑ／βへ調節したことを
除き、実施例２Ｂに述べたようにＡ　ＨＦを回収した。
充填し、冷凍し、凍結乾燥直前に、バルクＡ　ＨＦ溶液
をナス１−シた。結果は表３に見られる。
夫−−１ フィブリノーゲン、ｌｌ１ｇ％　　　　５６５．１実施
例４ 冷沈澱ステップ中０．２５　ｇ％ＰＥＧではなく、０、
５０　ｇ％ＰＥＧを添加し、Ａ　ＨＦ沈澱ステップ中溶
液は３．０Ｗ／ｖ％総タンパクではなく、２．０ｗ　／
　ｖ％総タンパクへ濃縮されたことを除き、実施例３に
述べたようにＡＨＦが回収された。実施例３におけるよ
うに、Ａ　ＨＦ沈澱ステップ中のナトリウム濃度は６０
０ｍＥｑ／Ｊへ調節された。
実施例４において得られたバルクＡＨＦ溶液について実
施されたテスト結果は表４に見られる。
（以下余白） 表−」エ フィブリノーゲン、■％　　　　２８１実施例５ 冷沈澱ステップ中０．２５　ｇ％ＰＥＧを加える代わり
に、所望力価へ希釈直後そして無菌口過ステップが最終
口過プロセスの間に実施される直前に０．２ｇ％ＰＥＧ
がＡ　ＨＦ沈澱溶液へ加えられたことを除き、実施例２
Ａに述べたようにＡＨＦが回収された。次に０．２ｇ％
ＰＥＧの代わりに０．１ｇ％ＰＥＧを添加る同様な態様
の他のＡ　１８　Ｆ回収テストが次に実施された。回収
プロセスのどの段階でもＰＥＧが添加されない、二つの
他のＡ　ｆｌ　Ｆ回収テストも実施例２Ｂに述べたよう
に実施された。
実施例５において実施された四つの異なる実験において
得られた製品の溶解度テストの結果を、凍結乾燥製品の
加熱前および凍結乾燥した製品の加熱後において表５に
示す。
前出の実施例および説明は、本発明の理解を助けるため
に提供され、そして例示のみである。それらは本発明を
どのような形でも限定することを意図しない。当業者は
、特定の状況に応じて他の方法および／または材料を使
用することができ、そしてなお本発明の範囲および精神
内にとどまることを認識するであろう。従って、本発明
は請求の範囲を除き、限定されることを意図しない。

Claims (35)

    【特許請求の範囲】
  1. （１）（ａ）寒性沈澱した血漿を水中に低イオン強度を
    有する溶液を生成するように溶解し、 （ｂ）該溶液中のイオン化したカルシウムの濃度を非活
    性化濃度へ調節するようにカルシウムイオン源を添加し
    、 （ｃ）該溶液をｐＨ約６．０ないし約７．０へ調節し、
    （ｄ）該溶液の温度を、約５℃から約１５℃へ沈澱とＡ
    ＨＦ含有上清液を生成するのに十分な時間調節し、 （ｅ）前記ＡＨＦ含有上清液を回収し、 （ｆ）ＡＨＦを前記ＡＨＦ含有上清液から回収すること
    を含む血漿または血漿分画からＡＨＦを精製および濃縮
    する方法。
  2. （２）その中に前記寒性沈澱した血漿が溶解される水は
    、約２０℃ないし約３５℃の温度である特許請求の範囲
    第１項の方法。
  3. （３）前記水の温度は約２３℃である第２項の方法。
  4. （４）前記カルシウムイオン源はカルシウム塩である第
    １項の方法。
  5. （５）前記カルシウム塩は塩化カルシウムである第４項
    の方法。
  6. （６）前記溶液へ添加される塩化カルシウムの濃度は約
    ０．００１ｍＭないし１．０ｍＭである第５項の方法。
  7. （７）前記溶液へ添加される塩化カルシウムの濃度は約
    ０．０５ｍＭである第６項の方法。
  8. （８）前記溶液のｐＨはステップ（ｃ）において約６．
    ５へ調節される第１項の方法。
  9. （９）前記溶液の温度はステップ（ｄ）において約９℃
    に調節される第１項の方法。
  10. （１０）前記ステップ（ｅ）および（ｆ）は、（ａ）前
    記沈澱を前記ＡＨＦ含有上清液から分離し、（ｂ）前記
    ＡＨＦ含有上清液を所望の総タンパクレベルへ濃縮し、 （ｃ）前記ＡＨＦ含有上清液のナトリウム濃度を所望レ
    ベルへ調節し、 （ｄ）前記ＡＨＦ含有上清液へ所望のグリシン濃度を得
    るようにグリシンを沈澱剤として添加し、（ｅ）前記Ａ
    ＨＦ含有上清液の温度をＡＨＦを含む沈澱の生成を制御
    するために所望のレベルへ調節し、 （ｆ）ＦＨＦを前記沈澱から回収することよりなる第１
    項の方法。
  11. （１１）ステップ（ａ）における前記分離は遠心または
    ロ過によって行われる第１０項の方法。
  12. （１２）ステップ（ｂ）における前記濃縮は限外ロ過に
    よって行われる第１０項の方法。
  13. （１３）前記所望の濃度レベルは総タンパク約１．０ｗ
    ／ｖ％ないし総タンパク約４．０ｗ／ｖ％である第１０
    項の方法。
  14. （１４）前記所望の濃度レベルは総タンパク約２．５ｗ
    ／ｖ％ないし総タンパク約３．０ｗ／ｖ％である第１３
    項の方法。
  15. （１５）前記ナトリウム濃度はステップ（ｃ）において
    約１５０ｍＥｑ／ｌないし約８００ｍＥｑ／ｌへ調節さ
    れる第１０項の方法。
  16. （１６）前記ナトリウム濃度はステップ（ｃ）において
    約１６０ｍＥｑ／ｌへ調節される第１５項の方法。
  17. （１７）ステップ（ｄ）におけるグリシンの所望濃度は
    約１．３Ｍないし約２．５Ｍである第１０項の方法。
  18. （１８）ステップ（ｄ）におけるグリシンの所望濃度は
    約１．７Ｍである第１７項の方法。
  19. （１９）ステップ（ｅ）において温度は約０℃ないし約
    ４℃に調節される第１０項の方法。
  20. （２０）前記温度は約２℃に調節される第１９項の方法
    。
  21. （２１）前記ＡＨＦを含む沈澱は遠心またはロ過によっ
    て前記上清液から分離される第１０項の方法。
  22. （２２）回収プロセスの間に寒性沈澱した血漿へポリエ
    チレングリコール（ＰＥＧ）を添加することよりなる寒
    性沈澱した血漿もしくは血漿分画から回収したＡＨＦの
    溶解度を向上させる方法。
  23. （２３）前記回収プロセスは第１０項に述べたプロセス
    である第２２項の方法。
  24. （２４）ＰＥＧは第１０項の前記沈澱からＡＨＦを回収
    するステップ（ｆ）の間に添加される第２３項の方法。
  25. （２５）添加されるＰＥＧの量は約０．０１ｇ％ＰＥＧ
    ないし約０．５ｇ％である第２４項の方法。
  26. （２６）ＰＥＧは第１０項のステップ（ｃ）と（ｄ）の
    間に添加される第２２項の方法。
  27. （２７）ＰＥＧはＰＥＧ濃度が約０．１ｗ／ｖ％ないし
    約１．１ｗ／ｖ％になるように添加される第２６項の方
    法。
  28. （２８）ＰＥＧはＰＥＧ濃度が約０．９ｗ／ｖ％になる
    ように添加される第２７項の方法。
  29. （２９）ＰＥＧは第１項のステップ（ｃ）と（ｄ）の間
    に添加される第２３項の方法。
  30. （３０）添加されるＰＥＧの量は約０．１ｇ％ないし約
    ０．６ｇ％である第２９項の方法。
  31. （３１）添加されるＰＥＧの量は約０．５ｇ％である第
    ３０項の方法。
  32. （３２）ナトリウム濃度は第１０項のステップ（ｃ）に
    おいて約１５０ｍＥｑ／ｌないし約８００ｍＥｑ／ｌに
    調節される第２９項の方法。
  33. （３３）前記ナトリウム濃度は約６００ｍＥｑ／ｌに調
    節される第３２項の方法。
  34. （３４）ＡＨＦ製剤を該ＡＨＦ製剤の溶解度を増加させ
    るのに十分な量のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）と
    混合することよりなるＡＨＦ製剤の溶解度を増加させる
    方法。
  35. （３５）添加されるＰＥＧの量は、ＰＥＧ約０．０１ｗ
    ／ｖ％ないし約０．５ｗ／ｖ％を得るのに十分である第
    ３４項の方法。 （３５）添加されるＰＥＧの量は、ＰＥＧ約０．１ｗ／
    ｖ％を得るのに十分である第３５項の方法。
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