JPH01228492A - エリスロポエチンの製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 恵呈上ｑ机几分立 本発明は、エリスロポエチン（以下ＥＰＯと略記する）
の製造のみならず、ＥＰＯの精製に際してのアフィニテ
ィークロマトグラフィ及びＥＰＯの測定に際しての免疫
学的測定法にも有効に利用されるモノクローナル抗ＥＰ
Ｏ抗体の調製法並びに該モノクローナル抗ＥＰＯ抗体を
用いてＥＰＯを製造する方法に関する。

皿來茨惺 赤血球生成促進因子として知られるＥＰＯを、モノクロ
ーナル抗ＥＰＯ抗体を結合してなる吸着剤を用いて、エ
リスロポエチン含有物より高純度で製造す石方法は、既
に提案されている（特開昭５９−１５５３９５号、特開
昭６０−４１６１４号）。これらの公知の方法は、ＥＰ
Ｏで免疫した実験動物、例えばマウスの肺臓細胞とミエ
ローマ細胞とを細胞融合させたハイブリドーマ細胞より
得られるモノクローナル抗ＥＰＯ抗体を結合した吸着剤
、例えばアフィゲルを用いてＥＰＯ含有物からＥＰＯを
取得することから成る。

なお、上記各方法で出発物質として用いるＥＰＯは、Ｅ
ＰＯ含有物、例えば貧血患者の尿より得た全尿タンパク
質粉末を、各種のクロマトグラフィ処理により、２５，
０００単位／ｍｇ（純度２８％）に精製した後、ＳＤＳ
電気泳動により、５０．０００単位／ｍｇ（純度５７％
）に精製したものであって、謂わば部分精製したＥＰＯ
である。

また、これらの方法においては、細胞融合により得られ
たハイブリドーマ細胞をスクリーニングして抗−ＥＰＯ
抗体産生ハイブリドーマを選出するのに、いわゆるソリ
ッドフェース法を（固相抗原結合分析）用いるものであ
る。

しかしながら、これらの公知方法では、それに使用する
モノクローナル抗ＥＰＯ抗体は、調製に際して、ＳＤＳ
電気泳動で部分精製したＥＰＯを抗原とするため、該抗
体にＥＰＯ溶液を吸着させる場合、それに先立って、こ
のＥＰＯｉ液を予めＳＤＳ　（ラウリル硫酸ナトリウム
）処理という煩雑な操作を行う必要があるという問題が
ある。

■が解決しようとする課題 本発明は、出発物質の抗原ＥＰＯとして、−船釣な各種
クロマトグラフィ等により精製された、或いは、特開昭
６０−４１６１４に開示されている方法で単離したＥＰ
Ｏを更にハイドロキシアパタイトを用いて精製された、
ＳＤＳを含まない、純度が６０％以上の純化ＥＰＯを用
いてハイブリドーマ細胞を得、該ハイブリドーマ細胞を
高純度（純度が９９％以上）のＥＰＯで作製した”Ｊ−
ＥＰＯを用いてスクリーニングして得られる抗−ＥＰＯ
抗体産生ハイブリドーマより産生されるモノクローナル
抗ＥＰＯ抗体を用いることにより、上述したＳＤＳ処理
を行うことなく、ＥＰＯ含有物から高純度のＥＰＯを製
造するための方法を提供することを課題とする。

また、本発明は、上記スクリーニングにより得られる抗
−ＥＰＯ抗体産生ハイブリドーマより、叙上のＥＰＯの
製造のみならず、ＥＰＯの精製に際してのアフィニティ
ークロマトグラフィ及びＥＰＯの測定に際しての免疫学
的測定法にも有効に利用されるモノクローナル抗ＥＰＯ
抗体を調製するための方法を提供することも課題とする
。

課題を解決するための　段 本発明において出発物質として用いる純度が６０％以上
の純化抗原ＥＰＯは、例えば貧血患者尿より特開昭６０
−４１６１４号公報に開示の方法で単離したヒトＥＰＯ
を更にハイドロキシアパタイトを用いて精製することに
より得ることができる。

本発明では、このようにして得られた純度が６０％以上
の純化ＥＰＯ標品を用いて、常法により免疫した実験動
物、例えばマウスの肺臓細胞とミエローマ（骨髄腫）細
胞とを細胞融合してハイブリドーマ細胞を作成する。次
いで、このハイブリドーマ細胞を、ＥＰＯと特異的に結
合し得る抗体を産生ずるハイブリドーマを選出するため
に、１２５Ｉ−ＥＰＯ（ヒト尿由来純化ＥＰＯをｌ０Ｄ
Ｏ−ＧＥＮ法にてｌ！Ｊで標識したものであって、９８
μＣｉ／μｇ　ＥＰＯの組成から成る）を用いてスクリ
ーニングを行う。

すなわち、高純度（純度が９９％以上）のＥＰＯで作製
した１２５Ｉ−ＥＰＯと特異的に結合する抗体がハイブ
リドーマ細胞の培養液中に存在することを確認して選出
を行う。

次に、このようにして選出した細胞のうち、１′１−Ｅ
ＰＯとの結合性の特に高いものについて継代培養を続け
て行い、限界希釈法にてモノクローン化を行って安定的
に抗体選出を行って抗−エリスロポエチン抗体産生ハイ
ブリドーマを得る。なお、得られた上記ハイブリドーマ
のＥＰＯの吸着−溶出能を実際°の抗体吸着カラムを用
いて検定する。

このようにして得られた抗−エリス、ロボエチン抗体産
生ハイブリドーマより目的のモノクローナル抗ＥＰＯ抗
体の産生は、常法によりマウス腹腔内で行う。

上述のようにして得られたモノクローナル抗ＥＰＯ抗体
は、それ自体でＥＰ○精製に際してのアフィニティーク
ロマトグラフィ並びにＥＰＯ測定に際しての免疫学的測
定法に利用することができる。

次に、上記モノクローナル抗ＥＰＯ抗体を用いてＥＰＯ
含有物から高純度ＥＰＯを製造するには、該抗体を例え
ばアフィゲルと結合させて作成した吸着剤に、例えば貧
血患者の尿から調製した全尿タンパク粉末をＰＢＳに溶
解し、透析を行って遠心欲得られる上清液を原料液とし
て接触させてＥＰＯを吸着させ、次いで溶出することに
より、吸着画分として高純度のＥＰＯを得ることができ
る。

この場合、ＥＰＯ原料液は、上記吸着剤に接触させるに
先立ってＳＤＳ処理を行う必要がない。

以下実施例により本発明及びその効果を具体的に説明す
る。

実施例１ ■抗原ＥＰＯの調製： 特開昭６０−４１６１４号公報に記載の方法に従って、
貧血患者尿より分離したＥＰＯ（貧血患者尿沼縮物をＳ
ＤＳ処理後、抗体吸着処理及びゲル濾過により取得した
ＥＰＯ標品）のＰＢＳ溶解物を氷冷し、−２０℃に冷却
した９９．５％エタノールの９倍量を添加してＥＰＯを
沈澱させた。この沈澱を一２０℃の９０％エタノール溶
液で洗浄した後、減圧下に乾燥し、０．０１ｍＭ　Ｃａ
Ｃ１ｇを含む１０ｍＭ　ＮａＰｉパンファー（ｐＨ６，
８）に溶解し、予め同じバッファーで平衡化したハイド
ロキシアパタイトカラムに通し、非吸着画分にＥＰＯを
回収した。得られたＥＰＯの純度は９９％であった。

■上記ＥＰＯによる　験動物の　　： 前記の方法にて調製した純化ＥＰＯを抗原として使用し
、°実験動物としてマウス（ＢＡＬＢ／ｃマウス）を用
い、このマウスに対し、次のとおり２週間間隔で３回免
疫を行った。

第１回免疫： ＰＢＳ中に純化ＥＰＯタンパク質を１ｍｇ／ｍ１で溶解
し、これに等量のフロイント完全アジュバントを混合し
て得たエマルジョン０．２ｍ　ｊｌ！をマウスに対し腹
腔内注射で投与した。

第２回免疫： ２週間後に同上のエマルシコン液１００μＮをマウスに
対し腹腔内注射で投与した。

第３回免疫： Ｐ、Ｂ　Ｓ中に純化ＥＰＯを０．５ｍｇ／ｍ　１で溶解
し、１ＯＯｐ７！をマウスに対し、２週間後に腹腔内投
与した。

■抗ＥＰＯ抗体産生ハイブリドーマの調製：ｉ）細胞融
合の作製 前記免疫処理終了から３日後に免疫マウスの肺細胞を無
菌的に摘出し、合成培養液（ＲＰ　Ｍ　Ｉ　１６４０液
）と１５％牛脂児血清（Ｆｅ２）との混合液で洗浄後、
該混合液中で肺臓細胞をハサミで細断して単細胞化を行
い、該混合液で２回洗浄した後、単細胞化した細胞をＲ
Ｐ　Ｍ　ｒ　１６４０液に分散した・細胞数は８　Ｘ　
１０”個であった。別にマウスのミエローマ細胞（Ｐ３
／ＮＳＩ／１−Ａｇ４−１）を前記ＲＰＭＩ及びＦｅ８
の混合溶液中で培養し、増殖した細胞をＲＰＭ　ｒ　１
６４０液で洗浄した。細胞数は４　Ｘ　１０”個であっ
た。

次に前記で調製した免疫マウス牌細胞とマウスミエロー
マ細胞とをＲＰ　Ｍ　Ｉ　１６４０液に分散し、混合し
た後、遠心し、上清を除去した。混合細胞をポリエチレ
ングリコール１５００の５０％溶液中で細胞融合させた
後、融合細胞をＨＴ培養液（ヒポキサンチン、チミジン
及び１５％牛脂児血清を含むＲＰ　Ｍ　Ｔ　１６４０液
）に混合し、混合液を８枚の９６穴マイクロタイタープ
レートにまいて２日目以降、ＨＡＴ培養液（ヒボキサン
チン、アミノプテリン、チミジン及び１５％牛脂児血清
を含むＲＰ　Ｍ　Ｉ　１６４０液）を添加゛して、各人
で２週間培養してＨＡ　Ｔ選択を行った。増殖したハイ
ブリドーマ細胞を２３６穴において確認した。

ｉｉ）上記ハイブリドーマ細胞のスクリーニングによる
選出 前記で得た２３６種類のハイブリドーマより特定の細胞
、すなわち、ＥＰＯと特異的に結合し得る抗体を産生ず
るハイブリドーマを選び出すために、”５ｌ−ＥＰＯ（
ヒト尿由来純化ＥＰＯをｌ０ＤＯ−ＧＥＮ法にてＩ門Ｉ
で標識したもの９８μＣｉ／μｇＥ　Ｐ　Ｏ）を用いて
１２５　ｒ　−Ｅ　Ｐ　Ｏと特異的に結合する抗体が、
ハイブリドーマ培養液中に存在することを確認して選出
した。

その結果、目的に適合したものとして２５種類の細胞が
選出され、そのうち”Ｊ−ＥＰＯとの結合値の高かった
もの８種についてハイプリｌ−マの継代培養を続け、限
界希釈法によりモノクローン化を行い、安定的に抗体産
出を行う５種のハイブリドーマ細胞（ｎ−＃２　、ｎ−
＃３　、ｎ−＃４　、ｎ−＃１）、ｎ−＃１６）を得た
。この５種類のうち、ＥＰＯ活性の吸着、溶出の最も良
好なｎ−＃２を採用してモノクローナル抗ＥＰ○抗体の
生産を行った。

■モノクローナル抗ＥＰＯ抗体の生産：前記のハイブリ
ドーマ細胞ｎ−＃２を用いて、抗体産生を行った。すな
わち、前記と同様にマウス腹腔内で抗体を生産させ、５
０％硫安分画に付した後、ＤＥ５２（ワットマン社製、
ＤＥＡＥ−セルロース）充填カラムを通し、０．１Ｍ〜
０．２Ｍ　ＮａＣｌ画分として精製免疫グロブリン（Ｉ
ｇ　Ｇ　）を得た。マウス３０匹を用い、９００ｍｇの
精製モノクローナル抗体を得た。

実施例２ 本例は実施例１で取得したモノクローナル抗ＥＰＯ抗体
を用いてＥＰＯを製造する態様を示したものである。

■抗体吸着カラムの作成： 市販のアフィゲル１０をガラスフィルター上で氷水冷却
下にイソプロパツールで洗浄し、さらに氷水で３回洗浄
してゲルを回収し、このゲルと、実施例１で得た抗体を
含む液（０，２Ｍ　ＮａＨＣＯｓ、ｐＨ８，３−０，３
Ｍ　ＮａＣ１）と等容量で混和し、４℃で５時間攪拌し
ながら結合反応を行った。反応後、遠心を行って結合物
を回収し、０．１Ｍ　ＮａＨＣＯｓと０．１５Ｍ　Ｎａ
Ｃｌノ混合液で２回洗浄後、Ｏ，１Ｍエタノールアミン
塩酸塩（ｐＨ８）と室温で１時間よく混合して抗体結合
ゲルを得た。

このゲルをカラム（１，６ｃｍ　Ｘ　５ｃｏ＋）に充填
し、吸着カラムを作成した。なお、上記抗体結合ゲルに
おけるアフィゲル１０に対する抗体（ＩｇＧ）の結合量
は約１５ｒａｇ／ｍ　ｌであった。

■ＥＰＯの製造： 出発原料としてＥＰＯ含有貧血患者尿濃縮物を用いた。

この濃縮物（分子量分画１００００で濃縮し、ＰＢＳに
て洗浄置換したもの）２００ｍＩｔを前記で作製した抗
体吸着カラム（１，６ｃ＋＊　Ｘ　５ＣＩ１）％床容量
１ｏＩ１）７！で予め、ＰＢＳ１００ｎｌＩ！、次イテ
０．２Ｍ酢酸と０．１５ＭＮａＣ＋との混合液１００ｒ
＠ｊ！　、さらニＰＢＳ１００ｍｊ！）順に２５ｍ　ｌ
　／ｈｒで流し、平衡化したもの）に対し、１０ｍ　ｌ
！　／ｈｒ　（７）流速で流した。次ニＰ　Ｂ　５５０
０ＩＷｊ！、０．５Ｍ　ＮａＣ１を含む１０ｍＭリン酸
１Ｗ街液（ｐＨ７，４ＨＯＯｍ　Ｉ！　。

０、１５Ｍ　ＮａＣ１）００ｍ　１．の１）ｍに３０ｍ
　ｉｉ！　／ｈｒでカラムを洗浄した後、０．２Ｍ酢酸
と０．１５Ｍ　ＮａＣ１との混合液を１０ｍ　（１／ｈ
ｒの流速で流し、溶出液として１５１を得た。

本溶液中にはタンパク質が１．８ＡＵ（ＯＤ２．０＝Ａ
Ｕ）ＲＩＡ活性測定で９５０００単位含まれており、原
液に比し、約２３００倍純度が向上した。さらに本溶液
を３．４Ｍ　　）リス溶液０．１ｒａｌを加え中和復水
に対し透析後、凍結乾燥を行った。次に、本凍結乾燥粉
末をＰＢＳ３Ｉ１７！に溶解し、予め前記と同じＰＢＳ
で平衡化したセファデックスＧ１００充填カラム（１，
２ｃａ＋　Ｘ　１２０ｃｍ　、床容積１３６ｍ　ｌ　）
に４ｍ　ｌ！　／ｈｒで前記溶液を通し、分子量による
分画を行い、高分子不純物を除去し、ＥＰＯ活性画分を
得た。本溶液中にはＥＰＯタンパク質が１．ＩＡＵ包含
され、８６０００単位が含まれていた。また、ＳＤＳポ
リアクリルアミ°ド電気泳動法により純度検定を行った
結果、不純タンパク質は認められなかった。

本例に示したように、本発明に従って調製したモノクロ
ーナル抗ＥＰＯ抗体を用いると、ＥＰＯ原料液をＳＤＳ
処理することなく、高純度のＥＰＯを分離、取得するこ
とが可能となる。

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. （１）６０％以上の純度を有する抗原エリスロポエチン
   （ＥＰＯ）で免役した実験動物の膵臓細胞とミエローマ
   細胞とを細胞融合させたハイブリドーマ細胞を、＾１＾
   ２＾５Ｉ−ＥＰＯを用いてスクリーニングすることによ
   り選出して、抗−ＥＰＯ抗体産生ハイブリドーマを得、
   次いで該抗−ＥＰＯ抗体産生ハイブリドーマよりモノク
   ローナル抗エリスロポエチン抗体を産生することを特徴
   とするモノクローナル抗エリスロポエチン抗体の調製方
   法。
2. （２）抗原ＥＰＯとして、モノクローナル抗エリスロポ
   エチン抗体を用いて単離したＥＰＯを更にハイドロキシ
   アパタイトを用いて精製し純化したＥＰＯを用いる請求
   項（１）記載の調製方法。
3. （３）請求項（１）又は（２）で得られたモノクローナ
   ル抗エリスロポエチン抗体を結合してなる吸着剤に、Ｅ
   ＰＯを吸着させた後、溶出して吸着画分としてＥＰＯ画
   分を取得することを特徴とする高純度エリスロポエチン
   の製造方法。