JP2721699B2 - 肝炎蛋白質の精製 - Google Patents

肝炎蛋白質の精製

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Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、ピチア・パストリス（Pichia pastoris）
酵母菌体からのＢ型肝炎表面抗原の精製方法に関する。
（従来の技術） Ｂ型肝炎ウイルスはＢ型肝炎として知られている感染
症を引き起こす。このウイルスによる慢性感染は肝硬変
及び肝臓癌を引き起こす可能性がある。
現在、Ｂ型肝炎ウイルスに感染した個体の治療法はな
い。従って、現在の医学的処置法はワクチンによる予防
が中心となっていっる。
ワクチンの活性成分は、Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原と
して知られているポリペプチドである。このポリペプチ
ドは天然のＢ型肝炎ウイルスの表面に存在している。
このペプチドを生産する一つの方法としては、Ｂ型肝
炎ウイルスに感染した個体の血液からそれを単離する方
法がある。しかし、現在ではAIDSのような血液製品から
の感染する病気に対する恐怖のために、この方法は用い
られなくなってきた。
別法として遺伝子工学によってＢ型肝炎表面抗原を生
産する方法がある。Ｂ型肝炎表面抗原の遺伝子を、例え
ば酵母、細菌、もしくはホ乳類細胞のいずれにもクロー
ニングすることができる。
遺伝的に改変された細胞は、Ｂ型肝炎表面抗原ポリペ
プチドが発現されそして粒子に組み立てられることがで
きるような方法によって増殖させることができる。
Ｂ型肝炎表面抗原ポリペプチドは組み換え体細胞によ
って十分に生産することができるけれども、細胞からの
ポリペプチドの回収及びその精製に利用されている現在
の方法にはまだ問題が存在している。
例えば、最も一般的に用いられているＢ型肝炎表面抗
原の精製方法は、密度勾配遠心分離法である。しかし、
この方法は、多量の塩化セシウム及びスクロースの使用
のみならず超遠心分離器及びその精製の程度や量に応じ
て種々のローターの使用を必要としており、そして、そ
れゆえこの方法は生産コストが高いという観点から適当
であるとは言えない。
1987年７月28日発行の米国特許第4,683,293号明細書
には、遺伝的に改造されたピチア・パストリス株により
生産されるＢ型肝炎表面抗原のような親油性蛋白質はカ
オトロピック塩を含む細胞溶解緩衝液の使用によって選
択的に回収できることが開示されている。そのような方
法は親油性蛋白質の精製において大きな利点があると考
えられるが、ワクチンの精製における使用に適した形態
のＢ型肝炎表面抗原としてそのような蛋白質の回収を可
能とする全体的方法についてはまだ改善の必要がある。
従って、酵母菌体からのＢ型肝炎表面抗原粒子を、ワ
クチンに直接入れることのできるぐらい十分に精製され
た状態で回収するための工業的規模での実施が可能とな
るような全体的方法を開発することは当分野に価値ある
寄与をすると考えられる。
（発明が解決しようとする課題） 本発明の目的は、ワクチンに直接入れることのできる
ぐらいに十分な純度のＢ型肝炎表面抗原粒子を回収する
ための方法であって、且つ工業的規模での実施を可能と
するような方法を提供することである。
本発明の他の観点は以下の記載により明らかにされる
であろう。
（課題を解決するための手段） 本発明は； ａ）カオトロピック化合物の存在下で酵母細胞を溶解す
ること及びＢ型肝炎表面抗原を含む上澄液を溶解した細
胞ペレットから分離すること； ｂ）工程（ａ）で得られたＢ型肝炎表面抗原を含んでい
る上澄液を、脂質及び夾雑蛋白質を前記Ｂ型肝炎表面抗
原上澄液から沈澱させるための適当な条件にすること、
及び沈澱した残渣を前記Ｂ型肝炎表面抗原上澄液から除
去すること； ｃ）工程（ｂ）で得られたＢ型肝炎表面抗原を含む上澄
液を濃縮及び限外濾過（diafiltration）すること； ｄ）工程（ｃ）で得られたＢ型肝炎表面抗原を含んでい
る残留物（レテンテート）をシリカと接触させること； ｅ）非−Ｂ型肝炎表面抗原蛋白質を、６〜８の範囲のpH
を有する適当な緩衝液で前記シリカから洗い流すこと； ｆ）前記Ｂ型肝炎表面抗原をシリカから9.5〜11.0の範
囲のpHを有し及び尿素を0.5〜８モル濃度で含んでいる
適当な緩衝液で溶出すること； ｇ）工程（ｆ）で得られたＢ型肝炎表面抗原を含んでい
る画分を、Ｂ型肝炎表面抗原粒子を夾雑物から分離する
のに適当な分子量除去限界を有するゲル濾過にかけるこ
と； ｈ）工程（ｇ）で得られたＢ型肝炎表面抗原を含んでい
る画分を陰イオン交換樹脂に接触させること；及び ｉ）Ｂ型肝炎表面抗原粒子を陰イオン交換樹脂から６〜
９の範囲のpHを有する適当な緩衝液で溶出すること； からなる方法によって酵母細胞からＢ型肝炎表面抗原粒
子を回収、精製することができることを発見して完成さ
れた。
本発明の方法はＢ型肝炎表面抗原を発現することので
きる如何なる形質転換酵母においても使用できる。適当
な形質転換酵母の代表的な例は、カンヂダ（Candid
a）、コロエケラ（Kloeckera）、サッカロマイセス（Sa
ccharomyces）、シゾサッカロマイセス（Schizosacchar
omyces）、ロドトルラ（Rhodotorula）、ハンゼヌラ（H
ansenula）、トルロプシス（Torulopis）、ピチア（Pic
hia）及びクルイベロマイセス（Kluyveromyces）属に属
する酵母からなる群から選択することができる。特に好
ましい酵母はピチア・パストリス（Pichia pastoris）
である。
典型的には、酵母は、この分野ではよく知られている
ような資化性窒素源、無機塩、適当なpHをともなう分子
状酸素及び他の制御因子を用いる好気的液体発行条件下
で、適当な炭素エネルギー源で増殖させることにより培
養される。酵母を増殖させる正確な方法は本発明の実施
において重要な意味はない。
当業者には明らかなように、Ｂ型肝炎ウイルスゲノム
は３種類の異なったＢ型肝炎表面抗原ポリペプチドを生
産することが知られている。これらの変種は一般にＳ−
型、プレS1−型及びプレS2−型と呼ばれている。本方法
はポリペプチドのこれらの型のいずれからなる粒子であ
っても回収、精製が可能であり、例えば、粒子がＢ型肝
炎表面抗原ポリペプチドの混合物からなっていてもよ
い。
本明細書で用いられているＢ型肝炎表面抗原という用
語はＳ−型、プレS1−型及びプレS2−型の粒子並びにそ
れらの混合物を意味している。
本発明の第１工程はカオトロピック塩（米国特許第4,
683,293号）の存在下で酵母細胞を溶解することであ
る。典型的には、細胞はビーズミル中でのホモゲナイゼ
ーションにより溶解される。
本明細書で用いられている“カオトロピック化合物”
という用語は尿素及びその陰イオンが水に無機性基の移
動を与える塩のような化合物を意味している。そのよう
な塩には、チオシアネート陰イオン、ヨウ化物及び臭化
物のようなハロゲン化物陰イオン、過塩素酸塩のような
ハイポハライト陰イオン、並びに例えばリチウム、カル
シウム及びバリウムのような陽イオンが含まれる。
適当なカオトロピック化合物の代表的な例は、チオシ
アン酸ナトリウム、チオシアン酸カリウム、ヨウ化ナト
リウム、ヨウ化カリウム、次亜塩素酸ナトリウム、塩化
リチウム、臭化リチウム、塩酸グアニジン、グアニジニ
ウムチオシアネート、尿素、及びそれらの類似物であ
る。この中ではチオシアン酸カリウムが好ましい。
カオトロピック化合物は約１〜約８モル濃度で存在す
ることが好ましい。
更に、カオトロピック化合物は約６〜約８の範囲のpH
を維持するために緩衝されていることが好ましい。当業
者には明らかなように、６〜８の範囲内にpHを維持でき
る緩衝系は数多く存在している。選択された塩と相溶性
であるそれらの緩衝系の如何なるものでも本発明に使用
することができる。現時点では好ましい緩衝剤はリン酸
ナトリウムである。
もし必要ならば、プロテアーゼ阻害剤をカオトロピッ
ク化合物媒体中に存在させることができる。適当なプロ
テアーゼ阻害剤の代表的な例は、フッ化フェニルメチル
スルホニル、及びジイソプロピルフルオロホスフェート
からなる群から選択することができる。
典型的にはカオトロピック化合物による細胞溶解は、
蛋白質分解を最小にするために０〜10℃の温度範囲で行
われる。
酵母細胞を溶解した後、Ｂ型肝炎表面抗原を含む上澄
液を更に精製する前に溶解した細胞ペレットから分離す
ることが好ましい。この分離は遠心分離又は他の慣用的
方法によって行うことができる。
カオトロピック化合物による抽出によって得られた溶
解された細胞ペレットは、細胞ペレット中に残っている
残留Ｂ型肝炎表面抗原を取り除くために６〜８の範囲の
pHを有する緩衝液で更に洗浄することが好ましい。
もし必要ならば、緩衝されたカオトロピック化合物を
その細胞ペレットを洗浄するために使用することができ
る。
溶解された細胞ペレットを洗浄した後、溶解された細
胞ペレットと結合していた細胞破砕物から分離して得ら
れた上澄液を更に精製するために先に得られた上澄液と
一緒にすることが好ましい。
精製の次の工程は、Ｂ型肝炎表面抗原を含んでいる上
澄液を、脂質及び夾雑蛋白質をＢ型肝炎表面抗原を含ん
でいる上澄液から沈殿させるために適当な条件にするこ
とである。この沈殿を引き起こす一つの適当な方法は上
澄液を45〜55℃、好ましくは47〜50℃の温度範囲で10〜
30分間の間加熱することである。
上澄液から脂質及び夾雑蛋白質を沈殿させるための他
の適当な方法は酸の存在下で上澄液を加熱する方法であ
る。
Ｂ型肝炎表面抗原を含む上澄液のpHを約5.0〜約6.0の
範囲内のpHまで下げるのに十分な酸を添加しなければな
らない。
本工程で使用できる酸は無機酸又は有機酸のどちらで
もよい。適当な酸は、塩酸、硫酸、リン酸、酢酸、蓚
酸、硝酸、過塩素酸、又は蟻酸からなる群より選択する
ことができる。
酸性化処理は好ましくは30℃よりも高くない温度、更
に好ましくは20℃を越えない温度で行い、即ち４〜30℃
の範囲、更に好ましくは４〜20℃の範囲である。
沈殿工程の後、沈殿した細胞成分をＢ型肝炎表面抗原
を含む上澄液から分離することが好ましい。これは遠心
分離やデカンテーションのような如何なる慣用的分離技
術によっても行うことができる。
もし酸性化が沈殿工程で行われるならば、更に精製す
る前にＢ型肝炎表面抗原を含んでいる上澄液を十分な塩
基で処理して約６〜８の範囲、好ましくは約6.5のpHに
戻すことが好ましい。
pHを約６〜８に戻すのに使用される特定の塩基は本発
明の実施において特に意味はない。適当な塩基の代表的
な例は水酸化カリウム、水酸化ナトリウム、水酸化アン
モニウムからなる群から選択することができる。
精製の次の工程は、Ｂ型肝炎表面抗原を含んでいる上
澄液を濃縮、限外濾過することである。濃縮及び限外濾
過は、Ｂ型肝炎表面抗原を膜通過させないが、夾雑ペプ
チド及び電解質は通過させるのに十分な分子量排除限界
を有する膜を用いて行われる。
5000〜500,000、好ましくは75,000〜100,000の範囲内
の分子量排除限界を有する如何なる市販の濃縮膜でもこ
の工程に使用することができる。
濃縮膜はカオトロピック化合物の除去にも使用するこ
とが好ましい。これは６〜８の範囲内のpHを有するカオ
トロピックを含まない緩衝溶液１〜２倍体積を最初の濃
縮の後のＢ型肝炎表面抗原を含んでいる上澄液に添加
し、再び濃縮工程を繰り返すことによって行うことがで
きる。
同体積の緩衝液の各々の添加はＢ型肝炎表面抗原を含
んでいる溶液中のカオトロピック化合物の濃度を約50％
の率で希釈している。従って、これらの添加はカオトロ
ピック塩をＢ型肝炎表面抗原を含んでいる溶液から段階
的に除去している。
精製の次の工程は、Ｂ型肝炎表面抗原を含んでいる上
澄液をシリカによる吸着クロマトグラフィーにかけるこ
とである。
吸着クロマトグラフィーはカラム法又はバッチ法によ
って行うことができる。本方法ではバッチ法が好まし
い。本発明の方法に使用できる適当なシリカは有効表面
積が100mm2/gm〜500mm2/gmの範囲内である粒子状シリカ
水和物またはシリカ無水物のどちらでもよい。適当な粒
子状シリカは商標名アエロシル（Aerosil）380としてニ
ュージャージー（New Jersey）のデグッサ・コープ（De
Gussa Corp）から販売されている。
バッチ法において、粒子状シリカは十分な水中に分散
して、40〜60重量％のシリカを含むシリカスラリーを調
製する。
そして、そのシリカスラリーをＢ型肝炎表面抗原を含
んでいる上澄液と接触させる。
使用されるシリカは以下に示す量でなければならな
い。即ち、最初の粒子濃度が溶解された細胞の抽出物か
らの全抽出蛋白質の１％以上であるとき、上澄液中に存
在するＢ型肝炎表面抗原活性1mg毎について50〜100mgの
シリカを上澄液に添加する。好ましくは、最初の粒子濃
度が１％以上であるときは存在するAUSRIA活性1mg毎に
ついて約60mgのシリカを添加する。溶解された細胞抽出
物中の粒子濃度が１％未満であるとき、シリカの量は減
少した粒子濃度に比例して増加させなければならない。
AUSRIA II分析キットはシカゴ（Chicago,IL）のアボ
ット・ラボラトリーズ（Abbott Laboratories）から販
売されている。
Ｂ型肝炎表面抗原を含んでいる上澄液をシリカ溶液と
接触させた後、生成した混合物を15分〜４時間の間一緒
に撹拌することが好ましい。
Ｂ型肝炎表面抗原を含んでいる溶液を適当な時間シリ
カと接触させた後、その上澄液をシリカと結合したＢ型
肝炎表面抗原と分離することが好ましい。これは遠心分
離やデカンテーションのような慣用的技術により行うこ
とができる。
精製の次の工程はシリカから夾雑蛋白質を除去するこ
とである。これは６〜８の範囲、好ましくは約7.2のpH
を有する緩衝溶液でシリカを洗浄することによって行う
ことができる。当業者には明らかなように、pHを６〜８
の範囲に維持するための数多くの緩衝系が存在してい
る。これらの緩衝系のいずれであっても本発明において
使用できる。本発明において好ましい緩衝系はリン酸ナ
トリウム−塩化ナトリウム緩衝系である。
そのシリカを数回、１回につき５〜15倍の体積の緩衝
液で洗浄して、夾雑蛋白質の除去を確実にすることが好
ましい。夾雑蛋白質の除去を監視する一つの方法は各洗
浄液の280nmでの吸光を測定することである。吸光が変
化せず最小値となったとき、洗浄工程は終了する。
夾雑蛋白質をシリカから除去した後、Ｂ型肝炎表面抗
原はシリカを0.5〜３モル濃度の尿素を含む適当な緩衝
液と接触させることによって溶出することができる。
適当な緩衝液は9.5〜11の範囲のpHを有している。当
業者には明らかなように、pHを9.5〜11の範囲に維持で
きる数多くの緩衝系が存在している。これらの緩衝系の
いずれであっても本発明において使用できる。本発明に
おいて好ましくは、緩衝系は炭酸ナトリウム−炭酸水素
ナトリウム緩衝液である。
もしバッチ法が用いられているならば、尿素を含む８
〜12倍体積の緩衝液を１〜４時間、好ましくは約２時間
の間シリカと接触させることが好ましい。接触時間経過
後、Ｂ型肝炎表面抗原を含んでいる上澄液をシリカから
分離し、次の精製工程に用いる。
シリカを尿素を含む８〜12倍体積の緩衝液で更に溶出
することが好ましい。得られた追加のＢ型肝炎表面抗原
を含んでいる画分を先のＢ型肝炎表面抗原を含んでいる
画分と一緒にして、次の精製工程に用いる。
もしカラム法が用いられているならば、クロマトグラ
フィーカラムを粒子状シリカで充填して、Ｂ型肝炎表面
抗原を含んでいる上澄液をカラムと接触させる。夾雑蛋
白質は上記のバッチ法で述べた６〜８の範囲のpHを有す
る緩衝液でシリカから洗浄した。Ｂ型肝炎表面抗原は上
記のバッチ法で述べたように9.5〜11の範囲のpHを有す
る尿素緩衝液で溶出することができる。
そして、好ましくは、Ｂ型肝炎表面抗原を含んでいる
画分は尿素を除去するために更に限外濾過される。限外
濾過システムにはＢ型肝炎表面抗原が通過できないよう
な分子量排除限を有している膜を用いなければならな
い。
適当な膜は5,000〜500,000の範囲内の分子量排除限界
を有しているものである。
尿素は、６〜８の範囲のpHを有する尿素を含まない追
加の緩衝液をＢ型肝炎表面抗原を含んでいる画分に限外
濾過の間に添加して、画分を繰り返し限外濾過すること
によってＢ型肝炎表面抗原を含んでいる画分から除去さ
れる。これらの追加の緩衝液を伴う繰り返し限外濾過は
尿素を溶解から段階的に希釈している。
精製の次の工程はＢ型肝炎表面抗原を含んでいる画分
をゲル濾過することである。
ゲル濾過は、アガロースゲルが充填されたクロマトグ
ラフィーカラムで行うことが好ましい。カラムの充填に
使用できる他の適当な極性マトリックスは、限定はされ
ないがデキストランゲル及びポリアクリルアミドゲルか
らなる群から選択することができる。
ゲル濾過の充填剤として使用される極性マトリックス
は少なくとも100万の分子量排除限界を有しなければな
らない。
Ｂ型肝炎表面抗原を含んでいる画分をクロマトグラフ
ィーカラムに接触させる前に、カラムは適当な緩衝液で
平衡化して、Ｂ型肝炎表面抗原が充填剤に吸着すること
を防がなければならない。適当な緩衝液は、６〜９のpH
範囲を有している。当業者には明らかなように、pHを６
〜９の範囲に維持するための数多くの緩衝液が存在して
いる。これらの緩衝系のいずれであっても本発明におい
て使用できる。本発明において好ましい緩衝液はトリス
（ヒドロキシメチル）−アミノメタン（TRIS）クロリド
緩衝液である。
カラムを平衡化後、Ｂ型肝炎表面抗原を含んでいる画
分をカラム中の充填剤と接触させなければならない。
カラムの平衡化に使用した緩衝液は、夾雑蛋白質及び
Ｂ型肝炎表面抗原の両方をカラムから洗浄するのにも使
用する。
当業者には明らかなように、大きな分子量を有する分
子はカラムを最初に通過し、小さな分子が続いて出る。
カラムは、Ｂ型肝炎表面抗原が溶出するまで、適当な緩
衝液で連続的に洗浄しなければならない。
溶出液中のＢ型肝炎表面抗原の存在はＢ型肝炎表面抗
原に対して感度のある如何なる市販されている分析キッ
ト又はゲル電気泳動によっても検出することができる。
そのような適当なキットの一つはアボット・ラボラトリ
ーズから市販されているAUSRIA IIである。
Ｂ型肝炎表面抗原を有していることについて陽性の画
分を一緒にプールして、必要に応じて濃縮される。濃縮
の適当な手段の一つは限外濾過である。
次に、Ｂ型肝炎表面抗原を含んでいる画分はイオン交
換クロマトグラフィーによる更なる精製が行われる。精
製は陰イオン交換リガンドで行うことが好ましい。本方
法においては陰イオン交換リカンドがジエチルアミノエ
チル陽イオンであることが好ましい。
当業者には明らかなように、陰イオン交換リガンドは
ポリアクリルアミドゲル樹脂又はセルロースやデキスト
ランのような炭水化物ポリマー樹脂に導入され、クロマ
トグラフィーカラムはこの充填剤で充填される。カラム
配置は、限定はされないが慣用的な垂直流れ又は半径方
向流れのどちらであってもよい。セルロースが好ましい
樹脂である。
Ｂ型肝炎表面抗原を陰イオン交換樹脂に接触させる前
に、樹脂は６〜９範囲のpHを有している適当な緩衝液で
平衡化しなければならない。
数多くの緩衝液がこの範囲のpHを維持できる。これら
の緩衝液のいずれであっても本発明において使用でき
る。本発明において好ましくはトリス−塩酸緩衝液であ
る。
平衡化後、Ｂ型肝炎表面抗原を含んでいる画分を陰イ
オン交換樹脂と接触させなければならない。
Ｂ型肝炎表面抗原は直線勾配溶出によって陰イオン交
換樹脂から溶出することが好ましい。これはイオン強度
の直線的変化又はpHの直線的変化によって行うことがで
きる。最初、カラムは平衡化工程で使用されたと同一の
緩衝系で洗浄した。溶媒組成は緩衝系に電解質を導入す
ることによりゆっくりと変化し、そして電解質の濃度が
約0.3モル濃度までゆっくりと上昇する。
本発明においては電解質は塩化ナトリウムが好ましい
が、他の電解質でも同様に使用できる。
勾配溶出の結果えられた種々の画分についてＢ型肝炎
表面抗原の含量を測定することが好ましい。これはゲル
濾過の流出液を測定したのと同じようにして行うことが
できる。
Ｂ型肝炎表面抗原を含んでいるこれらの画分は一緒に
プールされる。もし必要ならば、得られたプールされた
Ｂ型肝炎表面抗原を含んでいる画分は限外濾過で濃縮し
てもよい。
以上に概説された精製方法により得られるＢ型肝炎表
面抗原は、少なくともワクチンに直接含ませることがで
きる程度の純度である。
以下に述べる実施例は本発明の利点を更に説明するた
めに示されている。しかし、本発明を決して限定するも
のと解釈してはならない。
実施例１ 本実施例は形質転換されたピチア・パストリス（Pich
ia pastoris）により生産されるＢ型肝炎表面抗原の精
製における本発明のユティリティーを示している。
ピチア・パストリスGS115［ノーザン・リジオナル・
リサーチ・センター（Northern Regional Research Cen
ter）（イリノイ、ペオリア、米国農務省）に寄託番号N
RRL Y−15851にて1984年８月31日に寄託］の細胞カルチ
ャーをベクターpBSAG151［寄託番号NRRL B−18021にて1
985年10月22日に寄託］で形質転換した。
ピチア・パストリスの培養は慣用的な方法によって細
胞濃度264g/L湿重量まで培養した。
1900mlの培養液を培養槽から分離した。この培養液を
8500rpm（RCF、rave＝7700）で約10分間遠心分離し、そ
の上澄液を捨てた。
3Mの濃度のチオシアン酸カリウム及び10mMのリン酸ナ
トリウムを含むカオトロピック緩衝液を抽出工程のため
に調製した。プロテアーゼ阻害剤、フッ化フェニルメチ
ルスルホニルも1mMの濃度で添加した。得られた緩衝液
のpHは7.5である。
溶解工程は、ビーズミル中で500mlの0.5mmガラスビー
ズ存在下でペッレトからの500gの細胞を1500mlのカオト
ロピック緩衝液中で撹拌することにより行った。
細胞−ビーズの混合物を15分間、12,500rpm（rave＝1
6,000、RCF）で遠心分離した。上澄液を細胞−ビーズ混
合物からデカンテーションにより分離して、次の精製に
用いた。
細胞−ビーズ混合物は1,000mlのカオトロピック緩衝
液で追加の洗浄を行った。得られた上澄液は細胞−ビー
ズ混合物から分離し、次の精製に用いた。
カオトロピック化合物による抽出は４℃の温度で行っ
た。他の全ての工程も特に述べない限りは４℃で行っ
た。これは蛋白質分解を最少にするためである。
上澄液を一緒にして、その上澄液を室温まで湯浴中で
暖めることにより沈殿を起こさせた。上澄液が室温に一
旦達したならば、１規定のリン酸を上澄液のpHを7.5か
ら５に下げるために上澄液に添加した。次に、その溶液
を室温で約30分間放置した。この時間の間に、夾雑蛋白
質及び脂質はＢ型肝炎表面抗原を含んでいる上澄液から
沈澱させられる。
上澄液を４℃に冷却し、12,500rpmで10分間遠心分離
した。その上澄液を沈澱した破砕物から分離するために
デカントした。
上澄液のpHを１規定の水酸化ナトリウムを添加するこ
とにより6.5まで上げた。
この時点で、Ｂ型肝炎表面抗原を含んでいる上澄液は
3,120mlであった。AUSRIA IIアッセイを行った。このア
ッセイは上澄液中に236mgのＢ型肝炎表面抗原があるこ
とを示した。これは80.5％の回収率である。
次に、Ｂ型肝炎表面抗原を含んでいる溶液を分子量排
除限界100,000を有するアミコン（Amicon）のホローフ
ァイバー限外濃過システムで濃縮、限外濾過を行った。
最初に約0.5リッターまで濃縮して後、pH7.5のリン酸
ナトリウム緩衝液１リッターをＢ型肝炎表面抗原を含ん
でいる上澄液に添加して、得られた混合物を更に濃縮し
た。これはチオシアン酸カリウムが溶液から希釈される
まで２回繰り返した。
チオシアン酸カリウムがＢ型肝炎表面抗原を含んでい
る上澄液から限外濾過により除去されて後、再度AUSRIA
IIアッセイを405mlの残留物について行った。このアッ
セイによれば、231mgのＢ型肝炎表面抗原が含まれ、78.
8％の回収率であることが示された。
次に、Ｂ型肝炎表面抗原を含んでいる上澄液は有効表
面積380m2/gを有するシリカにバッチ結合させた。
これは以下の方法により行った。最初に、乾燥シリカ
を残留水で50％スラリー（乾燥重量／体積）として調製
した。これによりスラリーm1当たり50mgのシリカを含む
混合物を調製した。
シリカスラリー275mlをＢ型肝炎表面抗原を含んでい
る上澄液に添加し、そしてその混合物を室温で２時間ゆ
っくりと撹拌した。
次に、肝炎−シリカ混合物を４℃に冷却し、5,000rpm
（rave＝2500でRCF）で10分間遠心分離した。その上澄
液は捨てた。
次に、シリカは、0.15M NaClを含むpH7のリン酸緩衝
液500mlで洗浄した。洗浄液は捨てた。リン酸緩衝液に
よる洗浄工程は、上澄液の280nmでの吸光が変化しない
最小値になるまで続けた。
次に、Ｂ型肝炎表面抗原は25mM炭酸ナトリウム、25mM
炭酸水素ナトリウム、及び１モル尿素を含む緩衝液でシ
リカから溶出した。緩衝液の最終的pHは10である。
肝炎−シリカ混合物を500mlの尿素緩衝液中に入れ
て、室温で２時間撹拌した。
シリカ／肝炎を含んでいる緩衝された尿素溶液を４℃
に冷却し、5,000rpmで15分間遠心分離した。上澄液をデ
カントして、次の精製工程に用いた。
シリカは第１回目と同じように緩衝された尿素溶液50
0mlで第２回目の溶出を行った。得られた上澄液は最初
の上澄液と一緒にして、尿素を除去するために濃縮及び
限外濾過工程に付した。
この時点では、Ｂ型肝炎表面抗原を含んでいる上澄液
は分子量排除限界100,000の膜を有するアミコンホロー
フィルターダイアフィルトレーションシステムにおいて
濃縮された。
最初に約100mlに濃縮して後、pH7.5の10mMリン酸ナト
リウム緩衝液200mlをＢ型肝炎表面抗原を含んでいる上
澄液に添加して、更に濃縮を行った。この工程は尿素を
除去する効果がある。この手順を、Ｂ型肝炎表面抗原を
含んでいる画分から尿素の89％を除去できるように２回
繰り返した。
限外濾過の後、Ｂ型肝炎表面抗原を含んでいる画分を
16,000rpmで15分間遠心分離した。
この時点でAUSRIA IIアッセイを行った。アッセイは
肝炎234mgが存在し、64.5％の回収率であることを示し
た。
次に、Ｂ型肝炎表面抗原を含んでいる上澄液をゲル濃
過にかけた。
市販されているセファロース（Sepharose）CL4Bサイ
ズ排除カラムを使用した。このカラムは２リッターの体
積有しており、分子量排除限界20×106を有するアガロ
ースゲルが充填されている。
そして、Ｂ型肝炎表面抗原を含んでいる画分をこのカ
ラムと接触させた。肝炎はpH8の25mMトリス−塩酸でカ
ラムから溶出した。
カラムから溶出した画分を集めて、Ｂ型肝炎表面抗原
含量についてアッセイした。ポリアクリルアミドゲル電
気泳動分析に基づくＢ型肝炎表面抗原活性を有する画分
をプールして、後の精製に用いた。使用したアッセイは
アボットラボラトリーズから市販されているAUSRIA II
アッセイ試験である。
プールした画分は全体で170mgのＢ型肝炎表面抗原活
性があり、これは63.1％の回収率に相当する。
そして、このＢ型肝炎表面抗原を含んでいる画分はア
ミコンYM30フィルターを用いて濃縮した。
次に、濃縮されたＢ型肝炎表面抗原を含んでいる画分
はイオン交換クロマトグラフィーにかけた。
イオン交換クロマトグラフィーはセルロース支持体マ
トリックスに結合されているジエチルアミノエチルカチ
オンを用いるカラムにおいて行った。このカラムはpH8
のトリス−クロリド緩衝液で平衡化した。
樹脂を平衡化した後、Ｂ型肝炎表面抗原を含んでいる
画分のプールをイオン交換クロマトグラフィー樹脂に接
触させた。
そして、Ｂ型肝炎表面抗原は、濃度が０から3Mまで変
化する塩化ナトリウムを有するpH8のトリス−クロリド
緩衝液を使用して直線勾配溶出により溶出した。
クロマトグラフィーカラムから溶出した画分を集め
て、前記のようにＢ型肝炎表面抗原についてアッセイし
た。Ｂ型肝炎表面抗原活性を示す画分のサンプルを銀染
色し、得られたゲルをＢ型肝炎表面抗原の存在と純度を
確認するために分析した。
Ｂ型肝炎表面抗原を保持している画分を一緒にプール
した。更に、AUSRIA IIアッセイを行ったところ、Ｂ型
肝炎表面抗原63mgが含まれ、回収率42％であることが確
認された。生成物の純度は約95％であった。
Ｂ型肝炎表面抗原を含んでいる溶液0.2ミクロンフィ
ルターで濃過し、−70℃で保存した。
この実施例は、Ｂ型肝炎表面抗原蛋白質が酵母細胞か
ら本発明により回収できることを示している。
この実施例は単に本発明の実施を説明するために提示
されたものであり、本発明の範囲及び特許請求の範囲を
限定するものとして理解してはならない。
本発明の思想及び構成から遊離することのない種々の
変更や改変は特許による保護が求められている範囲に入
るものと思われる。

Claims (21)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】ピチア・バストリス（Pichia pastoris）
    細胞からＢ型肝炎表面抗原を生産する方法であって、 ａ）緩衝されたカオトロピック化合物の存在下にて前記
    酵母細胞を溶解して、溶解された細胞からＢ型肝炎表面
    抗原を含む上澄液を分離し、 ｂ）工程（ａ）で得られたＢ型肝炎表面抗原を含む上澄
    液から脂質及び夾雑蛋白質を沈殿させるために適切な条
    件に上澄液を供し、 ｃ）工程（ｂ）で得られたＢ型肝炎表面抗原を含む上澄
    液を限外濾過し、 ｄ）工程（ｃ）で得られたＢ型肝炎表面抗原を含む残留
    物（レテンナート）をシリカと接触させ、 ｅ）Ｂ型肝炎表面抗原を吸着しているシリカから６〜８
    の範囲内のpHを有する緩衝液を用いて夾雑蛋白質を洗い
    流し、 ｆ）Ｂ型肝炎表面抗原を、0.5から８モル濃度の尿素を
    含み9.5〜11.0の範囲内のpHを有する緩衝された溶出液
    によりシリカから溶出し、 ｇ）工程（ｆ）で得られたＢ型肝炎表面抗原を含む画分
    を、Ｂ型肝炎表面抗原が夾雑蛋白質から分離されるのに
    適切なゲル濾過に供し、そして ｈ）工程（ｇ）で得られたＢ型肝炎表面抗原を含む画分
    を、Ｂ型肝炎表面抗原が夾雑蛋白質から分離されるため
    に適切な陰イオン交換クロマトグラフィー工程に供する ことからなる前記方法。
  2. 【請求項２】酵母細胞をガラスビーズ破砕により溶解す
    る、請求項１記載の方法。
  3. 【請求項３】カオトロピック化合物がチオシアン酸ナト
    リウム、チオシアン酸カリウム、ヨウ化ナトリウム、ヨ
    ウ化カリウム、次亜塩素酸ナトリウム、塩化リチウム、
    臭化リチウム、塩酸グアイジン、チオシアン酸グアニジ
    ウム、及び尿素からなる群から選択される、請求項１又
    は２記載の方法。
  4. 【請求項４】カオトロピック化合物が１モル濃度〜８モ
    ル濃度で存在する、請求項３記載の方法。
  5. 【請求項５】カオトロピック塩が６〜８の範囲内のpHを
    有する緩衝系により緩衝されている、請求項４記載の方
    法。
  6. 【請求項６】脂質及び夾雑蛋白質の沈殿が、Ｂ型肝炎表
    面抗原を含む上澄液を45〜55℃の範囲の温度で10分から
    30分間加熱することによりなされる、請求項１〜５の何
    れか１項記載の方法。
  7. 【請求項７】脂質及び夾雑蛋白質の沈殿が、Ｂ型肝炎表
    面抗原を含む上澄液を４〜30℃の範囲の温度に加熱し、
    且つ上澄液のpHを4.5〜5.5の範囲に下げるのに十分な量
    の酸を添加することによりなされる、請求項１〜５の何
    れか１項記載の方法。
  8. 【請求項８】酸が塩酸、硫酸、リン酸、酢酸、蓚酸、硝
    酸、過塩素酸及び蟻酸からなる群から選択される、請求
    項７記載の方法。
  9. 【請求項９】沈殿の後、Ｂ型肝炎表面抗原を含む上澄液
    のpHを６〜８の範囲まで上げるのに十分な塩基を添加す
    る、請求項７又は８記載の方法。
  10. 【請求項１０】限外濾過が5,000〜500,000の範囲内の分
    子量排除限界を有する膜を用いて行われる、請求項１〜
    ９の何れか１項記載の方法。
  11. 【請求項１１】シリカが100m2/gm〜500m2/gmの範囲内の
    有効表面積を有する、請求項１〜10の何れか１項記載の
    方法。
  12. 【請求項１２】最初の粒子濃度が溶解細胞抽出物からの
    全抽出蛋白質の１％以上である場合、Ｂ型肝炎表面抗原
    を含む上澄液中に存在するＢ型肝炎表面抗原活性1mg毎
    について50〜100mgのシリカを使用する、請求項11記載
    の方法。
  13. 【請求項１３】最初の粒子濃度が溶解細胞抽出物からの
    全抽出蛋白質の１％未満である場合、Ｂ型肝炎表面抗原
    を含む上澄液中に存在するＢ型肝炎表面抗原活性1mg毎
    について１％当たり50〜100mgのシリカ基本量に相当す
    るようにシリカを比例して増加させて使用する、請求項
    11記載の方法。
  14. 【請求項１４】シリカが、40〜60重量％のシリカを含む
    シリカスラリーとして存在している、請求項11、12又は
    13記載の方法。
  15. 【請求項１５】Ｂ型肝炎表面抗原を含む画分を、アガロ
    ースゲル、デキストランゲル及びポリアクリルアミドゲ
    ルからなる群から選択される極性マトリックス上のゲル
    濾過に供する、請求項１〜14の何れか１項記載の方法。
  16. 【請求項１６】極性マトリックスが少なくとも100万の
    分子量排徐限界を有する、請求項15記載の方法。
  17. 【請求項１７】Ｂ型肝炎表面抗原が６〜９の範囲内のpH
    を有する緩衝液により極性マトリックスから溶出され
    る、請求項16記載の方法。
  18. 【請求項１８】イオン交換クロマトグラフィーがジエチ
    ルアミノエチルカチオンを用いる陰イオン交換樹脂によ
    り行われる、請求項１〜17の何れか１項記載の方法。
  19. 【請求項１９】Ｂ型肝炎表面抗原が６〜９の範囲内のpH
    を有する緩衝液及び０モル濃度から0.3モル濃度までの
    範囲の電解質を使用することにより陰イオン交換樹脂か
    ら溶出される、請求項18記載の方法。
  20. 【請求項２０】（ａ）酵母細胞が３モル濃度のチオシア
    ン酸カリウム及び7.5のpHを有するリン酸緩衝液の存在
    下で溶解され、 （ｂ）沈殿がpHを5.0まで下げるのに十分な濃度を有す
    るリン酸の存在下にて20℃の温度で行われ、 （ｃ）沈殿の後、Ｂ型肝炎表面抗原を含む溶液のpHを6.
    5まで上げるのに十分な水酸化ナトリウムが添加され、 （ｄ）Ｂ型肝炎表面抗原を含む上澄液は、7.5のpHを有
    するリン酸緩衝液の存在下にて100,000の分子量排除限
    界を有する膜上で源外濾過され、 （ｅ）Ｂ型肝炎表面抗原を含む上澄液は、上澄液中に存
    在するＢ型肝炎表面抗原活性1mg毎についてシリカ60mg
    が使用されることとなるように十分量の50重量％シリカ
    スラリーと触媒させられ、 （ｆ）夾雑蛋白質は、0.15M NaClを含みpH7のリン酸で
    緩衝された塩緩衝系によりシリカから洗い流され、 （ｇ）Ｂ型肝炎表面抗原は、１モル濃度の尿素及び10.1
    のpHを有する炭酸塩−炭酸水素塩緩衝液によりシリカか
    ら溶出され、 （ｈ）工程（ｇ）で得られたＢ型肝炎表面抗原を含む画
    分は、８のpHを有するトリス−クロリド緩衝液の存在下
    にて100,000の分子量排除限界を有する膜上で限外濾過
    され、 （ｉ）ゲル濾過は20×100の分子量排除限界を有するア
    ガロースゲル上で行われ、且つＢ型肝炎表面抗原は８の
    pHを有するトリス−クロリド緩衝液によりアガロースゲ
    ルから溶出され、そして （ｊ）イオン交換クロマトグラフィーはジエチルアミノ
    エチルカチオンを用いて行われ、且つＢ型肝炎表面抗原
    は０モルから0.3モルまでの範囲の濃度の塩化ナトリウ
    ムを有するトリス−クロリド緩衝液によりカチオンから
    溶出される、請求項１記載の方法。
  21. 【請求項２１】酵母細胞がpBSAG151（NRRL B−18021）
    で形質転換されたピチア・パストリス（Pichia pastori
    s）GS115（NRRL Y−15851）である、請求項１〜20の何
    れか１項記載の方法。
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