KR100307186B1

KR100307186B1 - 한국형씨(c)형간염바이러스의항원결정부위융합단백질인유비엔에스40i12-ii(ubns4e12-ii)의정제방법

Info

Publication number: KR100307186B1
Application number: KR1019940001238A
Authority: KR
Inventors: 박천길; 최형배; 김규돈
Original assignee: 성재갑; 주식회사 엘지씨아이
Priority date: 1994-01-25
Filing date: 1994-01-25
Publication date: 2001-11-30
Also published as: KR950023726A

Abstract

본 발명은 대장균에서 발현된 한국형 C 형 간염 바이러스의 항원 결정부위 융합단백질인 UBNS4E12-Ⅱ 단백질을 정제하는데 있어서, 세포의 파쇄 및 가용성 단백질의 제거, 단백질 봉입체회수 및 세척, 봉입체 용해, 이온 교환 크로마토그라피, 황산암모늄을 이용한 단백질의 침전 및 세척, 젤 여과 크로마토그라피 및 제 2 회의 투석을 포함하는 정제방법에 관한 것이다.

Description

한국형 씨(C)형 간염 바이러스의 항원 결정부위 융합 단백질인 유비엔에스4이12-II(UBNS4E12-Ⅱ)의 정제방법

제 1 도는 본 발명에 따라 재조합 대장균으로부터 UBNS4E12-Ⅱ 단백질을 정제하는 정제과정의 개요를 도시한 것이고,

제 2 도는 본 발명에 따른 정제 과정중 각 단계에서 얻어지는 조생성물 및 최종 정제된 UBNS4E12-Ⅱ 단백질을 SDS-폴리아크릴아미드젤 전기영동(SDS-PAGE)한 결과를 나타낸 것이고,

제 3 도는 봉입체 용해액을 이온 교환 크로마토그라피하여 얻은 용출액을 SDS-PAGE로 확인한 결과를 나타낸 것이고,

제 4 도는 정제된 UBNS4E12-Ⅱ 단백질을 젤 여과 HPLC 하여 얻은 크로마토그람을 나타낸 것이고,

제 5 도는 정제된 UBNS4E12-Ⅱ 단백질의 밀도를 세슘 클로라이드를 이용한 초고속 원심 분리에 의해 측정한 결과를 나타낸 것이고,

제 6 도는 UBNS4E12-Ⅱ 단백질 용액내의 우레아를 제거하기 전과 제거한 후의 CD(circular dichroism)스펙트럼을 비교하여 나타낸 것이고,

제 7-A 도는 S-200 수지를 이용한 젤 여과 크로마토그라피의 크로마토 그람을 나타낸 것이고,

제 7-B 도는 세파로즈 CL-4B 수지를 이용한 젤 여과 크로마토그라피의 크로마토그람을 나타낸 것이고,

제 8 도는 용액의 pH에 따른 황산 암모늄(15%)에 의한 단백질의 침전 강도를 SDS-PAGE 로 확인한 결과를 나타낸 것이며,

제 9 도는 pH 5·6 에서 황산암모늄의 농도에 다른 단백질의 침전 정도를 SDS-PAGE 로 확인한 결과를 나타낸 것이며,

제 10 도는UBNS4E12-Ⅱ 단백질에 포함된 NA4E, E1G 및 E2E 단백질의 아미노산 서열 및 이를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 나타낸 것이다.

본 발명은 유전자 재조합 대장균에서 봉입체로 생산된 한국형 C 형 간염 바이러스(KHCV)의 재조합 특이 항원인 UBNS4E12-Ⅱ 단백질의 정제방법에 관한 것이다.

바이러스성 간염은 간염 바이러스의 감염에 의해 발별하는 간 질환으로서 그 주된 발병체로서 A 형 간염 바이러스(HAV), B 형 간염 바이러스(HBV), 델타 간염 바이러스(HDV), 사이토메갈로 바이러스(CMV) 및 엡슈타인 바 바이러스(EBV) 등이 확인되었다. 1973년 초에 HAV 와 HVB가 확인되어 부분적인 특이성 연구가 이루어진 후 이들 바이러스에 대한 진단 방법들이 꾸준히 발전되어 왔다. 그러나 진단방법의 개선에도 불구하고 HAV와 HBV에 음성으로 확인되는 환자들에서 간염 증세가 계속 확인되었으며 이러한 사실로부터 HAV, HBV 와는 다른 바이러스성 발병체가 존재하는 것으로 추측되어 왔다. 1975년 HAV 또는 HBV에 기인하지 않으며, 수혈과 관련되어 발생하는 간염의 경우를 설명하기 위해 비A 비B형 간염(non-A non-B Hepatitis, NANBH)이라는 용어가 처음으로 사용되었다(Feinstone et al., New Engl. J. Med. 292, 454-457(1975). 그후 비A비B 형 간염 바이러스(NANBH 바이러스)에 대한 연구들이 집중적으로 이루어져 1989년에는 그를 분리 및 동정하였다.(Choo, Q.L. et al., Science 244, 359-362(1989)). NANBH 바이러스는 수혈에 의해 감염되는 간염의 약 90%를 차지하고 있으며(Alter, H. J., et al., Lancet 2, 838-841(1975)), 더 나아가 헌혈자의 1 내지 6%가 NANBH 보균자로 간주된다. 또한 감염환자의 40 내지 50%가 만성 간염으로 발전하고 또 그중 20% 정도가 간경변 및 간암으로 까지 진전된다는 것이 알려졌다(Dienstag, J.L. and Alter, H.J., Semin. Liver. Dis. 6, 67-81(1986)). 1985년 미국의 카이론(Chiron)사는 NANBH 환자의 혈장을 침팬지에 감염시켜 NANBH 바이러스의 분리회수가 가능함을 보고한 바 있고(Breadley, D.W. et al., Gastroenterology 88, 773-779(1985)), 츄들은 이 바이러스가 양성 가닥 리보헥산(RAN) 바이러스로서 약 10,000 개의 염기로 이루어져 있으며 약 3010 내지 3011 개의 아미노산으로 이루어진 단백질을 코딩하는 하나의 오픈리딩프레임(ORF)을 가지는 것으로 보고하였다(Choo, Q.L. et al., Science 244, 359-362(1989); Choo, Q.L. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 2451-2455(1991)).

이러한 사실에 의거하여 본 출원인은 한국형 HCV 에 대한 진단시약을 개발하기 위해 한국형 HCV의 전체 유전자 중 외피 단백질 항원 결정 부위들을 비구조 4 단백질의 항원결정 부위들과 융합시킨 다음 대장균에서 유비퀴틴 유전자와 융합시켜 재조합 단백질 UBNS4E1E2 및 UBNS4E12-Ⅱ를 발현시켰으며(본 출원인의 선행 한국 특허출원 제 93-7230 호 및 본 출원과 동일자 특허출원 제 94-1237 호 참조), UBNS4E1E2 단백질의 정제방법을 출원한 바 있다(본 출원인의 선행 한국 특허출원 제 93-7229 호 참조).

상기에서 발현된 UBNS4E12-Ⅱ 단백질(유비퀴틴, NS4E, E1G 및 E2E 단백질이 차례로 융합된 단백질: 제 10 도 참조)은 봉입체(inclusion body)의 형태로 대장균에서 발현되다. 본 발명자들은 발현된 UBNS4E12-Ⅱ 단백질의 정제방법을 개발하기 위해 일반적으로 대장균에서 봉입체로 발현되는 재조합 단백질을 정제하는데 사용될 수 있는 가능한 방법들이 이용하여 연구를 시작하였다. 이를 위해 봉입체 용해 후, pH 3.5, 5.0, 5.6, 6.5, 7.0, 7.5, 8.0, 8.5 및 9.3에서 각각 음이온 교환 크로마토그라피 및 양이온 교환 크로마토그라피를 수행하였다. 이 과정에서 본 발명자들은 UBNS4E12-Ⅱ 단백질이 보통의 단백질과는 달리 위의 각 pH에서 이온교환 크로마토그라피를 위해 사용된 에스-세파로스(S-Sepharose, Pharmacia)젤과 큐-세파로스(Q-Sepharose, Pharmacia)젤에 전혀 흡착되지 않음을 발견하였다. 또한 분획 가능 단백질 범위(fractionation range)가 250K 인 S-200젤 여과 크로마토그라피에서도 단량체의 크기가 약 32K인 UBNS4E12-Ⅱ가 이론상의 용출 범위에서 용출되지 않고 250K 이상인 단백질들이 선택성 없이 용출되는 부분(void)에서 용출됨을 발견하였다. 상기 사실들로부터 본 발명자들은 UBNS4E12-Ⅱ 단백질이 단량체 이상의 형태로 존재함을 알게 되었다. 이에 본 발명자들은 세포의 파쇄 및 가용성 단백질의 제거, 단백질 봉입체회수 및 세척, 봉입체 용해, 이온 교환 크로마토그라피, 황산암모늄을 이용한 단백질의 침전 및 세척, 젤 여과 크로마토그라피 및 2 회의 투석 과정을 통하여 고순도의 UBNS4E12-Ⅱ를 회수할 수 있는 방법을 개발하였고, 정제된 UBNS4E12-Ⅱ의 밀도를 측정한 결과 상기 단백질이 입자형으로 존재함을 확인하였다.

본 발명의 목적은 입자형으로 존재하는 한국형 C 형 간염 바이러스의 항원결정기 융합 단백질인 UBNS4E12-Ⅱ를 효율적으로 정제하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명을 보다 상세히 설명하면 다음과 같다.

KHCV UBNS4E12-Ⅱ 단백질이 발현된 세포 침전물을 초음파로 처리하여 분쇄한 후 원심분리하여 상층액인 가용성 단백질을 제거하고 불용성 침전물인 봉입체를 얻는다. 상기 단계에서 봉입체와 함께 회수된 오염 단백질을 제거하기 위해 에틸렌디아민 테트라아세트산(EDTA) 및 페닐 메틸 설포닐플루오라이드(PMSF)를 표함하는 완충용액을 사용하여 봉입체를 세척한다.

상기에서 회수 및 세척된 봉입체는 우레아를 사용하여 용해시킬 수 있다. 사용되는 우레아의 양은 봉입체를 충분히 녹여줄 수 있는 양이어야 하며, 본 발명에서는 6 내지 10M, 바람직하게는 8M의 우레아 용액을 사용한다.

이어서, 봉입체 용액을 원심분리하여 얻은 상층액을 이온 교환 크로마토그라피한다. 이온 교환 크로마토그라피 단계는 UBNS4E12-Ⅱ 단백질을 제외한 다른 대장균 유래 단백질은 이온 교환 크로마토그라피의 수지에 흡착시키고 UBNS4E12-Ⅱ 단백질은 용출시키기 위한 정제상의 한 단계로서 양이온 교환 크로마토그라피 음이온 교환 크로마토그라피를 이용할 수 있다. UBNS4E12-Ⅱ 단백질의 정제를 위해서는 양이온 교환 크로마토그라피의 수지로서 에스-세파로스 및 음이온 교환 크로마토그라피의 수지로서 큐-세파로스가 바람직하다. 양이온 교환 크로마토그라피 수행시 완충용액이 pH는 3.5 내지 6.0의 범위내일 수 있고, pH 4.0이 바람직하다. 음이온 교환 크로마토그라피 수행시 완충용액의 pH는 9.0 내지 10.5일 수 있고 바람직하게는 pH 10.3이다. 완충용액의 완충제로서는 양이온 교환크로마토그라피의 경우는 시트르산이 바람직하고, 음이온 교환 크로마토그라피의 경우는 에탄올아민과 사이클로헥실아미노 프로판설폰산(CAPS)을 사용할 수 있으며, CAPS가 바람직하다. 완충용액내의 우레아 농도는 6M 내지 8M, 바람직하게는 6M이다.

이온 교환 크로마토그라피에서 용출된 단백질 용액을 젤 여과 크로마토그라피 단계에 적용하려면 용액의 부피는 10배 이상 줄여야한다. 일반적으로 단백질 용액을 농축하기 위해서는 한외 여과 농축 방법을 사용하나 UBNS4E12-Ⅱ 단백질은 그와 같이 농축하면 막에 흡착되는 성질이 있어 소실되는 양이 많다. 따라서, 본 발명에서는 황산 암모늄을 이용하여 단백질을 침전 시킨 후 다시 적당 부피로 용해하는 침전 방법을 이용한다. 사용할 수 있는 황산암모늄의 양은 침전시키고자 하는 단백질 용액의 15% 이상이며, 바람직하게는 15%가 사용된다. 이 때 용액의 pH는 5N 염산 용액으로 4.0 내지 6.0 으로 조절하며, pH 5.6으로 조정하는 것이 바람직하다.

침전된 단백질을 원심 분리하여 회수하고 적당량의 완충용액을 넣어 용해한다. 이때, 완충용액중의 우레아 농도는 8M 내지 10M, 바람직하게는 8M 이고, 완충욕액의 pH는 9.0 내지 10.0, 바람직하게는 pH 9.3이다.

최종 순도 90% 이상인 정제된 UBNS4E12-Ⅱ 단백질을 얻기위해 젤 여과 크로마토그라피 단계를 수행한다. 수지로서는 분획 가능 범위가 2000K 이상인 수지가 사용될 수 있으며, 바람직하게는 세파로스 CL-4B(Pharmacia)가 사용된다. 사용되는 완충용액의 pH 범위는 8.5 내지 10.5 이며, 바람직하게는 pH 9.3 이다. 또한, 완충용액 중의 우레아 농도는 6M 내지 8M, 바람직하게는 6M이다.

이어서, 변성된 단백질을 원상화하기 위하여 투석에 의해 단백질 용액내의 우레아를 제거한다. 투석에 사용되는 완충용액의 pH 범위는 9.0 내지 10.0 이며, 바람직하게는 pH 9.5이다. 또한 완충제로는 에탄올아민 또는 CAPS가 사용된다.

마지막으로, 단백질 용액의 pH를 중성에 가깝게 하기 위하여 2차 투석을 수행하며, 투석시 사용되는 완충용액의 pH 범위는 6.8 내지 7.8, 바람직하게는 pH 7.3 이다. 또한 완충제로는 트리스, 인산염 완충식염수(PBS) 및 하이드록시에틸 피페라진 에탄설폰산(HEPES), 바람직하게는 HEPES가 사용된다. 최종 정제된 단백질의 밀도를 측정하여 UBNS4E12-Ⅱ 단백질의 형태가 입자임을 확인할 수 있다.

본 발명은 하기 실시예에 의거하여 보다 구체적으로 설명한다. 하기 실시예는 본 발명을 구체적으로 설명하기 위해 예시한 것으로서 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

하기 실시예에서 사용된 완충 용액의 조성을 특별한 언급이 없는 한 다음과 같다.

·완충용액 1 : 20mM 트리스, 1mM EDTA, 1mM PMSF, 150mM NaCl, pH 8.0

·완충용액 2 : 8M 우레아, 20mM 에탄올아민, 1mM EDTA, 1mM PMSF, pH 10.3

·완충용액 3 : 6M 우레아, 20mM CAPS, 1mM EDTA, 1mM PMSF, pH 10.3

·완충용액 4 : 6M 우레아, 20mM 에탄올아민, 150mM NaCl, 1mM EDTA, 1mM PMSF, pH 9.6

·완충용액 5 : 20mM 에탄올아민, 1mM EDTA, 1mM PMSF, pH 9.6

·완충용액 6 : 20mM HEPES, 150mM NaCl, pH 7.3

·완충용액 7 : 6M 우레아, 20mM 시트르산, 1mM EDTA, 1mM PMSF, pH 4.0

[실시예 1]

단계 1 : 세포파쇄 및 가용성 단백질의 제거

UBNS4E12-Ⅱ 단백질이 발현된 벡터 ptrpH-UBNS4E12-Ⅱ 를 포함하는 대장균 W3110(ptrpH-UBNS4E12-Ⅱ) 동일자 특허출원 제 94-1237호 참조)의 배양후 세포 침전물 약 20g(젖은 무게)에 200ml의 완충용액 1을 가하여 현탁시킨 후, 얼음 중탕안에서 초음파 분쇄기(ultrasonic homogenizer 4710: Cole-Parmer, USA)로 50%의 출력과 50%의 효율 사이클(duty-cycle)에서 약 2분간 초음파 처리하여 세포를 파괴시켰다. 이렇게 하여 얻은 세포 균질액을 고속 원심분리기(Beckman J2-21M, Rotor JA14)로 10000 rpm에 30분간 원심분리하여 상층액인 가용성 단백질을 제거하고 불용성 침전물인 봉입체를 얻었다.

단계 2 : 불용성 침전물의 세척

상기 단계 1에서 얻은 불용성 침전물에 약 200ml의 상기 완충용액 1을 넣어 균질화기(heavy-duty homogenizer: Cole-Parmer, USA)를 이용하여 현탁시킨 후, 고속 원심 분리기로 10000 rpm에서 30분간 원심분리하여 침전물인 봉입체를 회수하였다.

단계 3 : 봉입체의 용해

단계 2에서 얻은 봉입체를 150ml의 완충용액 2에서 약 1시간동안 상온에서 용해시켰다. 용해 후 고속 원심 분리(10000 rpm/ 40분)하여 용해되지 않은 침전물을 제거하고 상층액 만을 취했다.

단계 4 : 음이온 교환 크로마토그라피

단계 3의 상층액 150ml에 동량의 완충용액 3을 넣은 후 완충용액 3으로 평형화한 큐-세파로스 컬럼(Pharmacia, XK 50/20)에 분당 2ml의 속도로 통과시켰다.

단계 5 : 황산 암모늄을 이용한 단백질의 침전 및 회수

단계 4에서 큐 세파로스 컬럼을 통과한 단백질 용액 300ml에 450g의 황산 암모늄을 넣은 후 6N 염산 용액을 이용하여 pH를 5.6으로 조정하였다. 약 10분간 방치한 후 고속 원심 분리(10000 rpm/30분)하여 침전물을 얻었다.

단계 6 : 우레아를 사용한 침전물의 용해

단계 5 에서 얻은 침전물에 30ml의 완충용액 2를 넣어 침전물을 용해하였다. 용해후 고속 원심분리(10000 rpm/30분)하여 상층액을 얻었다.

단계 7 : 세파로스 CL-4B젤 여과 크로마토그라피

단계 6의 상층액 30ml를 완충용액 4로 평형화한 세파로스 CL-4B 수지 컬럼(Pharmacia, XK 50/100)에 분당 2ml의 속도로 통과시키면서 젤 여과 크로마토그라피를 하였고 용출되는 단백질을 각 10ml의 분획들로 수집하였다. 이 분획들을 15% SDS-PAGE 하여 순수한 UBNS4E12-Ⅱ 단백질만을 포함하는 특정 분획 80ml를 별도로 수집하였다.

단계 8 : 1차 투석

단계 7에서 수집한 UBNS4E12-Ⅱ 단백질 용액을 투석만(Spectrum, USA, molecular cut: 10000-12000)에 넣은 후, 4L의 완충용액 5가 들어 있는 용기에서 12시간 동안 투석하여 우레아를 제거하였다.

단계 9 : 2차 투석

단계 8에서 1차 투석한 단백질 용액을 4L 의 완충용액 6이 들어 있는 용기에서 12 시간동안 재차 투석하였다. 이렇게 하여 약 100mg의 UBNS4E12-Ⅱ 단백질을 얻었으며, 정제된 UBNS4E12-Ⅱ 단백질을 SDS-PAGE 하여 분석한 결과 90% 이상의 순도를 보였다.

본 정체 과정 중 각 단계에서 얻은 조생성물 및 최종 정제된 UBNS4E12-Ⅱ 단백질을 15% SDS-PAGE 하여 그 결과를 제 2 도에 나타내었다. 제 2 도에서 제 1 열은 표준 분자량의 단백질을, 제 2 열은 세포 파쇄 후에 회수된 전체 단백질을, 제 3 열은 세척 및 용해된 봉입체를 원심분리하여 얻은 상층액을, 제 4 열은 이온 교환 크라마토그라피에서 용출되는 단백질을, 제 5 열은 젤 투과 크로마토그라피에서 용출되는 UBNS4E12-Ⅱ 단백질을 나타낸다.

[실시예 2] 음이온 교환 크로마토그라피

실시예 1의 단계 1,2,3을 거친 단백질 용액에 같은 부피의 완충용액 7을 넣어 희석한 후, 완충용액 7로 평형화한 큐-세파로스 컬럼(pharmacia: XK 50/20)에 분당 2ml의 속도로 통과시켰다. 통과된 단백질 용액을 SDS-PAGE 하여 그 결과를 제 3 도에 나타내었다.

제 3 도에서 제 1 열은 표준 분자량의 단백질을, 제 2 열은 세척 및 용해된 봉입체를 원심분리하여 얻은 상층액을, 제 3 열은 실시예 1의 단계 4에서 큐-세파로스 이온 교환 수지로부터 직접 용출된 단백질을, 제 4 열은 본 실시예의 큐-세파로스 이온 교환 수지로부터 직접 용출된 단백질을 각각 나타낸다.

확인예 1 : 최종 정제된 UBNS4E12-Ⅱ 단백질의 젤 여과 HPLC.

실시예 1의 단계 7을 거친 UBNS4E12-Ⅱ 단백질의 균질성을 확인하기 위해 완충용액 4를 용출액으로 하고 바이오-젤(Bio-Gel) SEC 50-XL 컬럼(BIO-RAD)을 사용하여 젤 여과 HPLC를 수행하였다. 크로마토그람(제 4 도)으로 부터 정제된 UBE1E2 단백질이 균질하게 존재함을 확인하였다.

확인예 2 : 정제된 UBNS4E12-Ⅱ 단백질의 밀도 측정

입자형의 UBNS4E12-Ⅱ 의 밀도를 세슘 클로라이드를 이용한 초고속 원심분리에 의해 측정하였다. 실시예 1의 단계 9에서 얻은 UBNS4E12-Ⅱ 단백질 용액 0.5 ml를 세슘 클로라이드로 밀도가 1.13 내지 1.45로 형성될 수 있게 준비된 20ml의 초고속 원심분리용기에 넣은 후 4 시간동안 원심 분리하였다(BECKMAN L8-80 초고속 원심분리기 : rotor Ti 70). 원심분리 후, 용기안의 용액을 각 0.5 ml의 분획으로 회수하여 각 분획의 무게를 측정하였고 분획내의 UBNS4E12-Ⅱ의 상대적인 양을 효소면역측정법(ELISA, 본 출원인의 선행 특허출원 제 92-10039 호 참조)에 의해 측정하였다. 측정결과 UBNS4E12-Ⅱ 단백질의 밀도는 1.21 내지 1.27로 측정되었다(제 5 도). 이 결과를 통해 정제된 UBNS4E12-Ⅱ 단백질의 형태가 입자형임을 확인하였다. 이 결과를 제 5 도에 나타내었으며, 제 5 도에서 가로축은 분획의 번호이며 세로축은 각 분획의 밀도와 흡광도를 나타낸 것이다.

확인예 3 : 우레아 제거 전후의 정제된 UBNS4E12-Ⅱ 단백질의 2 차 구조비교

실시예 1의 단계 7에서 얻은 UBNS4E12-Ⅱ 단백질과 단계 9에서 얻는 UBNS4E12-Ⅱ 단백질의 2 차 구조를 CD를 찍어 비교하였다. 비교 결과 우레아가 제거된 UBNS4E12-Ⅱ 단백질은 우레아가 있는 상태에서보다 더 규칙적인 2 차 구조를 갖는 것으로 확인되었다(제 6 도).

확인예 4 : UBNS4E12-Ⅱ 단백질의 이온 교환 수지에 대한 흡착 여부 확인

실시예 1의 단계 1,2,3 을 거친 단백질 용액내의 UBNS4E12-Ⅱ의 이온 교환 수지에 대한 흡착 조건을 확인하기 위하여 큐-세파로스와 에스-세파로스 수지를 이용하여 다음과 같은 pH 에서 흡착 여부를 확인하였다. 확인결과, 일반적인 단량체의 단백질이 흡착될 수 있는 아래의 pH 에서 UBNS4E12-Ⅱ 단백질은 흡착되지 않음을 확인하였다. 따라서, UBNS4E12-Ⅱ 단백질은 이온 교환수지에 흡착시키지 않는 반면, 다른 대장균 유래 오염 단백질은 수지에 흡착시켜 제거할 수 있다.

pH 완충제

4.2 시트르산

5.6 아세트산

5.8 L-히스티딘

7.1 비스-트리스 프로판

7.2 인산염

7.6 트리에탄올아민

8.0 트리스

8.5 디에탄올아민

9.3 에탄올아민

비교예 1 : 젤 여과 크로마토그라피 수행시 젤 수지의 종류에 따른 용출형태(elution pattern)의 비교

실시예 1의 단계 6을 거친 단백질 용액을, S-200과 세파로스 CL-4B로 각각 충진시키고 완충용액 4로 평형화한 젤 여과 컬럼(Pharmacia, XK 50/100)에 넣어 그 용출 형태를 비교하였다.

제 7-A 도는 S-200을 사용하였을 때의 용출형태로 UBNS4E12-Ⅱ 단백질이 보이드(void) 부분에서 용출됨을 보여주며, 제 7-B 도는 세파로스 CL-4B를 사용하였을 때의 용출 형태로서 UBNS4E12-Ⅱ 단백질이 이 수지의 용출 범위에서 용출됨을 보여 준다. 비교결과 UBNS4E12-Ⅱ 단백질이 250 KD 이상의 크기로 존재함을 확인하였다.

비교예 2 : 황산 암모늄 침전시 pH 조건의 확인

실시예 1의 단계 4 에서 얻은 단백질 용액의 pH를 1N 염산으로 다양하게 조절한 후, 용액 부피의 15%가 되게 황산 암모늄을 넣어 단백질이 침전되는 pH 를 확인하였다. 제 8 도는 각 시료를 SDS-PAGE 한 결과로서 제 1 열은 표준 분자량 단백질의 시료를, 제 2 열은 침전화하기 전의 단백질을, 제 3 열은 pH 10.3 에서 형성된 침전물을, 제 4 열은 pH 9.0 에서 형성된 침전물을, 제 5 열은 pH 8.0 에서 형성된 침전물을, 제 6 열은 pH 7.0 에서 형성된 침전물을, 제 7 열은 pH 6.0 에서 형성된 침전물을, 제 8 열은 pH 5.0 에서 형성된 침전물을, 제 9 열은 pH 4.0 에서 형성된 침전물을 각각 나타낸다. 제 8 도의 결과로부터 UBNS4E12-Ⅱ 단백질이 pH 6 이하에서 황산암모늄에 의해 침전됨을 확인하였다.

비교예 3 : 황산 암모늄 침전시 사용되는 황산 암모늄 양의 결정

실시예 1의 단계 4 에서 얻은 단백질 용액을 1N 염산으로 pH 5.6이 되게 조절한 후, 다양한 양의 황산 암모늄을 넣어 단백질의 침전여부를 확인하였다. 각 시료를 SDS-PAGE 하여 제 9 도에 나타내었다. 제 9 도에서 제 1 열은 표준 분자량 단백질의 시료를, 제 2 열은 처리전의 단백질을 제 3,4,5,6,7 및 8 열은 황산암모늄의 부피 % 가 각각 0,5,10,15,30 및 40 일 때의 침전물을 나타낸다.

제 9 도의 결과로부터, UBNS4E12-Ⅱ 단백질을 침전시킬 수 있는 황산 암모늄의 양은 단백질 용액의 부피에 대해 15% 이상이어야 함을 확인하였다.

Claims

대장균에서 발현된 한국형 C 형 간염바이러스의 항원 결정부위 융합 단백질인 UBNS4E12-Ⅱ 단백질을 정제하는데 있어서,

가) 세포를 파쇄시켜 가용성 단백질을 제거하고 봉입체를 회수 및 세척하는 단계,

나) 우레아를 이용하여 봉입체를 용해시킨 후 원심 분리하여 상층액을 회수하는 단계,

다) 이온 교환 수지로서 에스-세파로스 또는 큐-세파로스를 사용한 이온 교환 크로마토그라피에 의해 UBNS4E12-Ⅱ 단백질을 용출시키는 단계,

라) 황산 암모늄을 이용하여 단백질을 침전시킨 후 우레아를 이용하여 용해시키는 단계,

마) 분획가능 범위가 2000K 이상인 수지 및 pH 8.5 내지 10.5인 완충액을 사용하여 젤 여과 크로마토그라피하는 단계,

바) 우레아를 제거하기 위한 1 차 투석 단계, 및

사) 단백질 용액의 pH 조정을 위한 2차 투석 단계를 포함하는 방법.
제 1 항에 있어서, 나) 단계의 우레아 농도가 6 내지 8M인 방법.
제 1 항에 있어서, 다) 단계의 이온 교환 수지로 에스-세파로스를 사용하고, 6 내지 8M 의 우레아를 포함하는 pH 3.5 내지 6.0 의 완충액을 사용하여 용출시키는 방법.
제 1 항에 있어서, 다) 단계의 이온 교환 수지로 큐-세파로스를 사용하고, 6 내지 8M 의 우레아와 완충제로서 에탄올아민 또는 CAPS 를 포함하는 pH 9.0 내지 10.5 의 완충액을 사용하여 용출시키는 방법.
제 1 항에 있어서, 라) 단계의 침전시 황산 암모늄의 용액내 최종 농도가 15% 이상이고 용액의 pH가 4.0 내지 6.0 방법.
제 1 항에 있어서, 마) 단계의 젤 여과 수지로 세파로스 CL-4B 를 사용하고, 에탄올 아민 또는 CAPS 를 완충제로서 포함하는 완충액을 사용하여 용출시키는 방법.
제 1 항에 있어서, 바) 단계에서 사용되는 완충액이 완충제로서 에탄올아민 또는 사이클로헥실아미노 프로판설폰산(CAPS)을 포함하는 pH 9.0 내지 10.5 의 완충액인 방법.
제 1 항에 있어서, 사) 단계에서 사용되는 완충액이 완충제로서 트리스, 인산염 완충 식염수(PBS) 또는 하이드록시에틸 피레라진 에탄설폰산(HEPES)을 포함하는 pH 6.8 내지 7.8 의 완충액인 방법.