JPS60230066A - プロトロンビン時間測定用試薬 - Google Patents
プロトロンビン時間測定用試薬Info
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- JPS60230066A JPS60230066A JP60072846A JP7284685A JPS60230066A JP S60230066 A JPS60230066 A JP S60230066A JP 60072846 A JP60072846 A JP 60072846A JP 7284685 A JP7284685 A JP 7284685A JP S60230066 A JPS60230066 A JP S60230066A
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- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2337/00—N-linked chromogens for determinations of peptidases and proteinases
- C12Q2337/10—Anilides
- C12Q2337/12—Para-Nitroanilides p-NA
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- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
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- G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明はトロンビン用の色原体基質を用いるプロトロン
ビン時間測定のための試薬に関する。
ビン時間測定のための試薬に関する。
プロトロンビン時間（以下ＦＴと略記する）の測定は最
もしばしば行われる凝固試験の一つである。クマリン誘
導体を用いる経口による血液凝固阻止物質療法を監視す
るのにＰＴを用いることにより、この試験は特に療法の
成果が治療範囲保持の監視に決定的に依存するとｉ５事
実ゆえに重要性が増大してきている。
もしばしば行われる凝固試験の一つである。クマリン誘
導体を用いる経口による血液凝固阻止物質療法を監視す
るのにＰＴを用いることにより、この試験は特に療法の
成果が治療範囲保持の監視に決定的に依存するとｉ５事
実ゆえに重要性が増大してきている。
ＦＴ測測定おいては血漿試料または血液試料を動物また
は人間の組織からの組織トロンボプラスチンを用いて活
性化する。組織トロンポプラこの因子が第Ｘ因子の活性
化を介してプロトロンビンからトロンビンを遊離させる
。次に保存的凝固分析においてはトロンビン測定は天然
の基質フイブリノゲンを用いる凝固時間測定により行わ
れる。組織トロンボプラスチンが外因性凝固経路のすべ
てのビタミンに依存性凝固因子■、■およびＸに対し高
い感度を有することが決定的に重要である、何故ならこ
れらはクマリン療法により低下されるからである。国際
標準として受容されているブリテイツシュコンノでラテ
イブトロンポプラステン（Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｃｏｍｐａ
ｒａ、ｔｉｖｅＴｈｒｏｍｂｏｐｌａＳｔｉｎ ）は高
い感度でこれら因子を検出する。
は人間の組織からの組織トロンボプラスチンを用いて活
性化する。組織トロンポプラこの因子が第Ｘ因子の活性
化を介してプロトロンビンからトロンビンを遊離させる
。次に保存的凝固分析においてはトロンビン測定は天然
の基質フイブリノゲンを用いる凝固時間測定により行わ
れる。組織トロンボプラスチンが外因性凝固経路のすべ
てのビタミンに依存性凝固因子■、■およびＸに対し高
い感度を有することが決定的に重要である、何故ならこ
れらはクマリン療法により低下されるからである。国際
標準として受容されているブリテイツシュコンノでラテ
イブトロンポプラステン（Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｃｏｍｐａ
ｒａ、ｔｉｖｅＴｈｒｏｍｂｏｐｌａＳｔｉｎ ）は高
い感度でこれら因子を検出する。
血液凝固阻止物質療法を監視するにはいわゆる第■、第
■および第Ｘ因子試薬が用いられる。
■および第Ｘ因子試薬が用いられる。
これらトロンボプラスチン試薬にはこれら因子ａ）今（
シｌ／ｒ 邊よレト ７−亦駈ｈシおｌｌｋト→Ｌ ヌ
、ナーλ’ｔｌ／ｒ 笛 Ｖ１３ｉＪ半およびフイブリ
ノゲンが添加される。ＦＴに決定的に影響する第Ｖ因子
は速やかに活性を失うので、前記した措置により血漿ま
たは血液試料はまたそれらを調べる前にある時間保存さ
れることもできる。
シｌ／ｒ 邊よレト ７−亦駈ｈシおｌｌｋト→Ｌ ヌ
、ナーλ’ｔｌ／ｒ 笛 Ｖ１３ｉＪ半およびフイブリ
ノゲンが添加される。ＦＴに決定的に影響する第Ｖ因子
は速やかに活性を失うので、前記した措置により血漿ま
たは血液試料はまたそれらを調べる前にある時間保存さ
れることもできる。
第■因子は生物学的半減期が最も短いので、クマリン誘
導体を用いる療法に最も速やかに応答する。それゆえ第
Ｘ因子感受性のトロンボプラスチンは患者の凝固阻止の
初期相を監視するのにも特に適当であると見做される。
導体を用いる療法に最も速やかに応答する。それゆえ第
Ｘ因子感受性のトロンボプラスチンは患者の凝固阻止の
初期相を監視するのにも特に適当であると見做される。
初期相における第Ｘ因子の監視も同様に指示され〔アイ
ヤー・エム（Ａｉａｃｈ Ｍ、 ）氏他、［トロンブ・
レス（Ｔｈｒｏｍｂ、Ｒｅｓ、） Ｊ第４７巻第６９〜
７１頁（１９９２年）参照〕、従って第Ｘ因子感受性も
熱望される。
ヤー・エム（Ａｉａｃｈ Ｍ、 ）氏他、［トロンブ・
レス（Ｔｈｒｏｍｂ、Ｒｅｓ、） Ｊ第４７巻第６９〜
７１頁（１９９２年）参照〕、従って第Ｘ因子感受性も
熱望される。
１ 凝固カスケードの活性化された因子にとっての低分
子色原体性はプチド基質の開発罠より近来古典的な凝固
基質としてのフイブリノゲンとの置換が可能である。従
って今日ではビタミンに依存性第Ｘおよび第■因子に対
する比較的特異・的な基質が存在する。血漿中の第Ｘ１
第■および第■因子の感度の良い測定法が開発され、そ
してＰＴ測測定個々の因子測定との間に比較的好都合な
相関を達成することができた。この個々の因子測定すべ
ての欠点は、それらがビタミンに依存性因子の１種のみ
を検出しそしてそれゆえ６因子すべてが低下した患者の
病態生理学的状況を反映しないことである。特、に、臨
界的な第■因子は今日でも特異的な色原体基質を用いて
直接ではなく、第Ｘ因子を介してのみ測定されうる。
子色原体性はプチド基質の開発罠より近来古典的な凝固
基質としてのフイブリノゲンとの置換が可能である。従
って今日ではビタミンに依存性第Ｘおよび第■因子に対
する比較的特異・的な基質が存在する。血漿中の第Ｘ１
第■および第■因子の感度の良い測定法が開発され、そ
してＰＴ測測定個々の因子測定との間に比較的好都合な
相関を達成することができた。この個々の因子測定すべ
ての欠点は、それらがビタミンに依存性因子の１種のみ
を検出しそしてそれゆえ６因子すべてが低下した患者の
病態生理学的状況を反映しないことである。特、に、臨
界的な第■因子は今日でも特異的な色原体基質を用いて
直接ではなく、第Ｘ因子を介してのみ測定されうる。
ヨーロッパ特許出願ＩＣＰ−Ａ−０，０１４，０３９号
にはＰＴを色原体基質を用いて測定する方法が記載され
ている。しかしながら合理的な測定時間を得ふためには
カルシウム再添加された血漿からトロンボプラスチン活
性化により得られるいわゆる血清試薬が必要である。血
清の前記した処理はすべての因子、特に外因性凝固径路
の完全な除去を保証しない。それゆえ前記した方法で調
製された血清と組み合せて使用されるトロンボプラスチ
ンは、この特許明細書に提案されているように、試薬に
直接トロンビンを添加する場合に特に伺ら高い因子感度
を有し得ない。
にはＰＴを色原体基質を用いて測定する方法が記載され
ている。しかしながら合理的な測定時間を得ふためには
カルシウム再添加された血漿からトロンボプラスチン活
性化により得られるいわゆる血清試薬が必要である。血
清の前記した処理はすべての因子、特に外因性凝固径路
の完全な除去を保証しない。それゆえ前記した方法で調
製された血清と組み合せて使用されるトロンボプラスチ
ンは、この特許明細書に提案されているように、試薬に
直接トロンビンを添加する場合に特に伺ら高い因子感度
を有し得ない。
西ドイツ特許Ａ第３．１１４３５０号には色原体基質を
用いてプロトロンビン時間を測定するためのもう一つの
方法および試薬が提案されている。
用いてプロトロンビン時間を測定するためのもう一つの
方法および試薬が提案されている。
充分に安定した試薬を得るためには、特別に調製された
トロンボプラスチンを使用すること力を必要である。こ
の出願で使用されているト０／ビン基質はすなわち既に
トロンボプラスチン中に含有されるプロテアーゼによる
非特異的加水チンについての修正された調製法によりこ
れらプロテアーゼは大部分が除去されて、従って試薬は
相当により良好な安定性を示す。しかしながらプロトロ
ンビン時間を測定するための凝固測定による方法を用い
て測光測定的に比較しうるゆえに、両方の型の試薬を同
じトロンボプラスチンから調製することが望ましい。さ
らに、トロンボプラスチンの１回の処理から測光測定試
薬および凝固測定試薬が同じく得られうる。
トロンボプラスチンを使用すること力を必要である。こ
の出願で使用されているト０／ビン基質はすなわち既に
トロンボプラスチン中に含有されるプロテアーゼによる
非特異的加水チンについての修正された調製法によりこ
れらプロテアーゼは大部分が除去されて、従って試薬は
相当により良好な安定性を示す。しかしながらプロトロ
ンビン時間を測定するための凝固測定による方法を用い
て測光測定的に比較しうるゆえに、両方の型の試薬を同
じトロンボプラスチンから調製することが望ましい。さ
らに、トロンボプラスチンの１回の処理から測光測定試
薬および凝固測定試薬が同じく得られうる。
驚くべきことに、トロンビンに対する比較的高い特異性
を有する色原体基質例えば１（−Ｄ−Ｐｂ０−Ｐｒｏ−
Ａｒｇ −（５−アミノ−２−ニトロ安息香酸）−イソ
プロピルアミドまたは他の５−アミノ−２−ニトロ安息
香酸誘導体例えば５−アミノ−２−ニトロ安息香酸−グ
リシンエチルエステルまたは５−アミノ−２−ニトロ安
息香酸−ネオλ・／４−ル丁？ ｆｕｒ−用いみならば
慣用のトロンボプラスチンを用いてかかる試薬が調製さ
れうる。
を有する色原体基質例えば１（−Ｄ−Ｐｂ０−Ｐｒｏ−
Ａｒｇ −（５−アミノ−２−ニトロ安息香酸）−イソ
プロピルアミドまたは他の５−アミノ−２−ニトロ安息
香酸誘導体例えば５−アミノ−２−ニトロ安息香酸−グ
リシンエチルエステルまたは５−アミノ−２−ニトロ安
息香酸−ネオλ・／４−ル丁？ ｆｕｒ−用いみならば
慣用のトロンボプラスチンを用いてかかる試薬が調製さ
れうる。
本発明はかかる試薬に関する。
第１表には、現在技術水準のトロンボプラスチン製剤に
よる種々のプロテアーゼのための色原体基質の加水分解
結果を示す。４０５Ｃｍでの吸光を測定することにより
、構造Ｈ−Ｄ−Ｐｈθ−Ｐｒｏ −Ａｒｇ−（５−アミ
ノ−２−ニトロ安息香酸）−Ｒ，Ｔｏｅ−Ｇｌｙ−Ｐｒ
ｏ−Ａｒｇ−（５−アミノ−２−二トロ安息香酸）−Ｒ
またはＢｏｃ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ −（５−アミ
ノ−２−ニトロ−安息香酸）−Ｒを有するトロンビン基
質がトロンボプラスチンによってほんのとるに足らぬ程
度にしか加水分解されず、一方大抵の他の基質およびま
た西ドイツ特許第３，１１５，３５０ Ａ１号で使用さ
れているトロ！ ンビン用の基質であるＴｏｓＧｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−
Ｔ） −二トロアニリンにおいても基質の速かな消費が
”記録されることが認識された。がくの如くすべてのト
ロンボプラスチンは高い蛋白分解活性を示す。実施にお
いては、Ｔｏｓ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−ｐ−ニトロ
アニリンのような基質を有するかかる試薬は非常に短時
間のみしか安定でないことを意味する、何故なら用いら
れた基質量が速やかに減少するからである。これに対し
例えばＨ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−（５−アミノ
−２−ニトロ−安息香酸）−イソプロピルアミドを有す
る試薬は相当により長期間安定でありそしてその安定性
は基質の加水分解によってではなくトロンボプラスチン
の安定性により限定される。
よる種々のプロテアーゼのための色原体基質の加水分解
結果を示す。４０５Ｃｍでの吸光を測定することにより
、構造Ｈ−Ｄ−Ｐｈθ−Ｐｒｏ −Ａｒｇ−（５−アミ
ノ−２−ニトロ安息香酸）−Ｒ，Ｔｏｅ−Ｇｌｙ−Ｐｒ
ｏ−Ａｒｇ−（５−アミノ−２−二トロ安息香酸）−Ｒ
またはＢｏｃ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ −（５−アミ
ノ−２−ニトロ−安息香酸）−Ｒを有するトロンビン基
質がトロンボプラスチンによってほんのとるに足らぬ程
度にしか加水分解されず、一方大抵の他の基質およびま
た西ドイツ特許第３，１１５，３５０ Ａ１号で使用さ
れているトロ！ ンビン用の基質であるＴｏｓＧｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−
Ｔ） −二トロアニリンにおいても基質の速かな消費が
”記録されることが認識された。がくの如くすべてのト
ロンボプラスチンは高い蛋白分解活性を示す。実施にお
いては、Ｔｏｓ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−ｐ−ニトロ
アニリンのような基質を有するかかる試薬は非常に短時
間のみしか安定でないことを意味する、何故なら用いら
れた基質量が速やかに減少するからである。これに対し
例えばＨ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−（５−アミノ
−２−ニトロ−安息香酸）−イソプロピルアミドを有す
る試薬は相当により長期間安定でありそしてその安定性
は基質の加水分解によってではなくトロンボプラスチン
の安定性により限定される。
それゆえかかる試薬の性質は同じトロンボプラスチンを
有する凝固試薬と良く匹敵しうる。
有する凝固試薬と良く匹敵しうる。
それゆえ本発明はトロンビン用の色原体基質が水性懸濁
液中でカルシウムイオンの存在下に １３７Ｃで１時間
当り初期濃度の０．００１２５倍より少ない程度まで蛋
白分解作用を有するトロンボプラスチンにより変換され
ることからなる、蛋白分解作用を有するトロンボプラス
チンおよびトロンビン用の色原体基質を少くとも含有す
るプロトロンビン時間を測光測定するための試薬に関す
る。
液中でカルシウムイオンの存在下に １３７Ｃで１時間
当り初期濃度の０．００１２５倍より少ない程度まで蛋
白分解作用を有するトロンボプラスチンにより変換され
ることからなる、蛋白分解作用を有するトロンボプラス
チンおよびトロンビン用の色原体基質を少くとも含有す
るプロトロンビン時間を測光測定するための試薬に関す
る。
トロンボプラスチンは人間の胎盤から得られるのが好ま
しい。
しい。
構造Ｔｏｓ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−（５−アミノ−
２−ニトロ−安息香酸）−Ｒまたはｔ（−Ｄ−Ｐｈｅ−
Ｐｒｏ −Ａｒｇ−（５−アミノ−２−ニトロ−安息香
酸）＝Ｒ（これら式中ＲはＮＴ（−Ｃ，Ｈ２ｎ＋１ （
ここでｎは１〜７である）であるか、ＮＨ−ベンジルで
あるかまたはα−アミノ基を介して結合したアミノ酸ま
たぼそのアルキルエステルの残基である〕を有する色原
体基質が使用されるのが好ましい。
２−ニトロ−安息香酸）−Ｒまたはｔ（−Ｄ−Ｐｈｅ−
Ｐｒｏ −Ａｒｇ−（５−アミノ−２−ニトロ−安息香
酸）＝Ｒ（これら式中ＲはＮＴ（−Ｃ，Ｈ２ｎ＋１ （
ここでｎは１〜７である）であるか、ＮＨ−ベンジルで
あるかまたはα−アミノ基を介して結合したアミノ酸ま
たぼそのアルキルエステルの残基である〕を有する色原
体基質が使用されるのが好ましい。
前記した試薬は（Ｌ５〜１０ミリモル／を好ましを含有
し５る。
し５る。
このものはさらにｐＨ７〜ａ５好ましくは７．６を有す
る［Ｌｏ ０５〜０．１ モル／を好ましくはＣＬ０２
５モル／ｌの濃度の緩衝溶液例えばトリス、）ＧＰＦｉ
Ｓ（Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）−ビはラジンーＮ’
−２−エタンスルホン酸）、グリシルグリシン、ＥＰＰ
Ｓ （４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ビハラジン
プロ／ぐンスルホン酸）およびイミダゾールなかんず＜
ＨｚｐｙｂＳを含有しうる。
る［Ｌｏ ０５〜０．１ モル／を好ましくはＣＬ０２
５モル／ｌの濃度の緩衝溶液例えばトリス、）ＧＰＦｉ
Ｓ（Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）−ビはラジンーＮ’
−２−エタンスルホン酸）、グリシルグリシン、ＥＰＰ
Ｓ （４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ビハラジン
プロ／ぐンスルホン酸）およびイミダゾールなかんず＜
ＨｚｐｙｂＳを含有しうる。
このものはまた０、０１〜０．２モル／を好ましくは１
０５モル／Ｌの濃度の中性塩好ましくは塩化ナトリウム
が添加されうる。
０５モル／Ｌの濃度の中性塩好ましくは塩化ナトリウム
が添加されうる。
かかる試薬はまた０、０１〜０．５岬／を好ましくは０
．２５１１ｖ／ｌの濃度のヘパリン抑制剤例えばプロタ
ミン塩またはポリブレン（Ｐｏ１ｙｂｒｅｎ）釈なかん
ずくポリブレン、をも含有しうる。
．２５１１ｖ／ｌの濃度のヘパリン抑制剤例えばプロタ
ミン塩またはポリブレン（Ｐｏ１ｙｂｒｅｎ）釈なかん
ずくポリブレン、をも含有しうる。
ａ１４１＃ｌ／神ＪｒｌｒＡ１０１ＪＪ−１９６＆ｎ佑
ＵＦＰヱ−１ｔ添加されることもできる。
ＵＦＰヱ−１ｔ添加されることもできる。
前記した試薬は第■、第■、第Ｘおよび第Ｖ因子が欠乏
した血漿を使用して第■、第■、第Ｘおよび第Ｖ因子の
測定に、または第■、第■および第Ｘ因子が欠乏した血
漿を使用して第■、第■および第Ｘ因子の測定に使用さ
れうる。
した血漿を使用して第■、第■、第Ｘおよび第Ｖ因子の
測定に、または第■、第■および第Ｘ因子が欠乏した血
漿を使用して第■、第■および第Ｘ因子の測定に使用さ
れうる。
下記第１表においてＡＮＢＡは５−アミノ−２−二トロ
安息香酸の略語である。
安息香酸の略語である。
実施例１に従い調製された試薬の吸光差は室温で９２時
間後である。基質濃度は５０μモル／ｌであり、トロン
ボプラスチンは製造者の記述に従い溶解させそして濃度
５％で添加された。
間後である。基質濃度は５０μモル／ｌであり、トロン
ボプラスチンは製造者の記述に従い溶解させそして濃度
５％で添加された。
以下の実施例により本発明をさらに説明する。
実施例 １
色原体基質を用いるプロトロンビン時間測定用試薬の調
製 ＰＨ７，６の１を中にＮａＣｔ５８４４ｒ、ＣａＣｌ２
１．４７ｆ 、 １Ｐ１ｃ８１１．９２ ｆ、ポリブレ
ン２５０ ｐｆおよびＨ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ
−（５−アミノ−２−ニトロ安息香酸）−イソプロピル
アミド−ＨＣｌ ６７．１岬を含有する水溶液７０−に
ヒトのドロンボブ２スチン４〜２０ｍを加えそしてこの
混合物を凍、１ 結乾燥した。
製 ＰＨ７，６の１を中にＮａＣｔ５８４４ｒ、ＣａＣｌ２
１．４７ｆ 、 １Ｐ１ｃ８１１．９２ ｆ、ポリブレ
ン２５０ ｐｆおよびＨ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ
−（５−アミノ−２−ニトロ安息香酸）−イソプロピル
アミド−ＨＣｌ ６７．１岬を含有する水溶液７０−に
ヒトのドロンボブ２スチン４〜２０ｍを加えそしてこの
混合物を凍、１ 結乾燥した。
添加されたトロンボプラスチンの量および活性に応じ水
２００＋ｄを用いての再構成後に正常血漿において４Ｄ
５ｎｍでの吸光変化０．１に対し２０〜４０秒なる時間
が得られた。
２００＋ｄを用いての再構成後に正常血漿において４Ｄ
５ｎｍでの吸光変化０．１に対し２０〜４０秒なる時間
が得られた。
実施例 ２
（１）参考曲線
試薬混合物は実施例１におけると同様である。
生理食塩溶液を用いて血漿の連続希釈物を調製しそして
プロトロンビン時間を測光測定した。
プロトロンビン時間を測光測定した。
血漿または希釈された血漿５０μｔに予熱したプラスチ
ックセル中試薬５００μｔを加えそして４０５ｎｍでの
吸光を時間の函数として記録した。
ックセル中試薬５００μｔを加えそして４０５ｎｍでの
吸光を時間の函数として記録した。
グラフから吸光増大０．１に達する時間を測定した。こ
の時間を血漿濃度の相関としてプロットした。凝固法と
同様にして正常値の１００〜５％の間の直線が得られた
。希釈されてない血漿の正常値は２９．４秒であった。
の時間を血漿濃度の相関としてプロットした。凝固法と
同様にして正常値の１００〜５％の間の直線が得られた
。希釈されてない血漿の正常値は２９．４秒であった。
病的な血漿では時 １間はかなり長くなる。
（２） 因子感度
第■、第■、第Ｘおよび第■因子に対する実施例１記載
の試薬の感度を第２表に示す。血漿を相当する欠乏血漿
で希釈しそして前記（１）項におけるようにして分析し
た。
の試薬の感度を第２表に示す。血漿を相当する欠乏血漿
で希釈しそして前記（１）項におけるようにして分析し
た。
第２表
プロトロンビン比率
正常値の−としての因子含量
因子 １００ ２５ １０
Ｘ １ １．５５ １．７５
■ １ １．２ ５．８
１ １ １．２ １．５６
ｙ １ １．７５ ′５．６５
試薬は示されている因子の減少に感度よく対応すること
が第２表から知られうる。
が第２表から知られうる。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １）その基質が水性懸濁液中でカルシウムイオンの存在
下に３７℃で１時間当り初期濃度のＱ、００１２５倍よ
り少ない程度迄トロンボプラスチンにより変換されるこ
とからなる、蛋白分解作用を有するトロンボプラスチン
およびトロンビン用の色原体基質を少くとも含有するプ
ロトロンビン時間を測光測定するための試薬。 ２）トロンボプラスチンか人間の胎盤から得られること
からなる前記特許請求の範囲第１項記載の試薬。 ３）色原体基質が構造Ｈ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ
−（５−アミノ−２−ニトロ安息香酸）−ＲまたはＴｏ
ｓ−Ｇｉｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ −（５−アミノ−２−二
トロ安息香酸〕−Ｂ〔これら式中ＲはＮＨ−ＣｎＨ２ｎ
＋１（ここでｎは１〜７である）であるか、ＮＨ−ベン
ジルであるかまたはα−アミン基を介して結合したアミ
ノ酸またはそのアルキルエステルの残基である〕を有す
ることからなる前記特許請求の範囲第１項記載の試薬。 ４）試薬が０．５〜１０ミリモル／を好ましくは５ミリ
モル／ｌの濃度のカルシウムイオンを含有することから
なる前記特許請求の範囲第１項記載の試薬。 ５） ｐＨ７〜ａ５好ましくは７．６カ有する０、００
５〜０．１モル／を好ましくは０．０２５モル／ｌの濃
度の緩衝溶液好ましくはトリス、）（ＥＰＦｉ８ （Ｎ
−（２−ヒドロキシエチル）−ビはラジンーＮ′−２
−エタンスルホン酸）、グリシルグリシン、ｗｐｐｓＣ
４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ビペラジンプロパ
ンスルホン酸ノまたはイミダゾールなかんず（ＨＥＰＩ
！ｉ８を含有することからなる前記特許請求の範囲第１
項記載の試薬。 ６）０．０１〜０．２モル／を好ましくは０．０５モル
／ｌの濃度の中性塩好ましくは塩化ナトリウムを含有す
ることからなる前記特許請求の範囲第１項記載の試薬。 ７〕 試薬ポリブレ７ （Ｐｏｌｙｂｒｅｎ）（Ｂ）を
ｏ、ｏｔ〜α５ｑ／ｌ好ましくは０．２５１１１’ｉ／
ｌの濃度で含有することからなる前記特許請求の範囲第
１項記載の試薬。 ８〕 添加された人間または動物の第Ｖ因子を含有する
ことからなる前記特許請求の範囲第１項記載の試薬。 ９）ｐＨ７〜ａ５を有する緩衝溶液に、水性懸濁液！ 中でカルシウムイオンの存在下に３７℃で１時間当り初
期濃度の０．００１２５倍以下の程度までトロンボプラ
スチンにより変換されるトロンビン用の色原体基質、蛋
白分解作用を有するトロンボプラスチンならびに適当な
場合は０．５〜１０ミリモル／ｌの濃度の溶性カルシウ
ム塩を加えそして場合によりその混合物を凍結乾燥する
ことからなる、蛋白分解作用を有するトロンボプラスチ
ンおよびトロンビン用の色原体基質を含有するプロトロ
ンビン時間を測光的に測定するための試薬の製法。 １０） 血漿の連結希釈物を調製し、蛋白分解作用を有
するトロンボプラスチン、カルシウムイオンの存在下に
３７℃で１時間当り初期濃度１７）０．００１２５倍以
下の程度までトロンボプラスチンにより変換されるトロ
ンビン用の色原体基質、ならびに適当な場合は０．５〜
１０ミリモル／ｌの濃度のカルシウムイオンを含有する
１溶液を加えそして定められた吸収増大に到達する時
間を測定することからなる、血漿中のプロトロンビン時
間の測光測定法。 １１）血漿を欠乏血漿で希釈することからなる前記特許
請求の範囲第１０項記載の方法。
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