JPS60200167A - 化学発光法による過酸化水素の定量法 - Google Patents

化学発光法による過酸化水素の定量法

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JPS60200167A JP59056719A JP5671984A JPS60200167A JP S60200167 A JPS60200167 A JP S60200167A JP 59056719 A JP59056719 A JP 59056719A JP 5671984 A JP5671984 A JP 5671984A JP S60200167 A JPS60200167 A JP S60200167A
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    • Y10T436/206664Ozone or peroxide

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は化学発光法による過酸化水素の定量法に関する
ものである。
ルミノール法、ルシゲニン法などの化学発光法による過
酸化水素の定量法は旧知の方法として有名であるが、こ
才りらの方法は反応がアルカリ性下で行われないと、過
酸化水素の定量として感度が十分に出ないという欠点が
ある。オた、化学発光法を臨床検査分野における生化学
検査に用いる場合は、血清、尿などの生体試料中の成分
の影IP?強く受け、発光活性が減弱するばかりでなく
、測定値にバラツキが生じ信頼がおかれていない。この
ため生体試料を少くして用いるなど種々工夫がなされて
いるが、逆に試料量減少のために測定感度を低下させる
という矛盾を有する。
本発明者等は生体試料の妨害ケ受けることなく、化学発
光法により過酸化水素を高感度に定量する方法を見出す
ために、種々鋭意検討したところ、修酸ジエステル類と
螢光物質と過酸化水素との反応では血清成分の影響を受
けることなく、発光量を測定することが可能であること
を見出した。ところがこの反応は有機溶媒中で行なう必
要があるため、一般に水系で行なわれる臨床検査分野の
分析に共存させることは困難である。したがって、水系
反応で生成した過酸化水素を酸化触媒を介して被酸化性
の非螢光物質に反応させて、螢y(:、物質を得、この
螢光物質?酸化触媒の阻害条件下に修酸ジエステルと過
酸化水素とを反応させると、血清中のカタラーゼの影響
を受けることなく、高感度に過酸化水素を定量すること
が可能でるることを見出し、本発明に到達した。すなわ
ち本発明は過酸化水素を含む試料に、酸化触媒を介して
被酸化性の非螢光物質を反応させて、非螢光物質全螢光
物質に転換させ、次いで酸化触媒の阻害条件下に該螢光
物質を蓚酸ジエステル類および過酸化水素と反応させ、
生成する発光量を測定することによシ、試料中の過酸化
水素を定量すること全特徴とする化学発光法による過酸
化水素の定量法である。
本発明方法を反応式で示すと次の通りである。
非螢光物質。Lot 、匠よ25顔、螢ヵウ、□□、o
@@@(1)螢光物質+蓚酸ジエステル+H,0!→h
)十生成物・会・(2)すなわち被酸化性の非螢光物質
を過酸化水素、例えば生体成分より生成する過酸化水素
によって、酸化触媒の存在下に螢光物質に転換させ(第
1反応〕、次いで酸化触媒全阻害条件下、例えば阻害剤
を加えて酸化触媒を阻害させた後、生成した螢光物質?
蓚酸ジエステル類と改めて加えた過酸化水素の存在下に
発光させ(第2反応)、この発光量を測定することによ
り第1段反応での過酸化水素の定量を行なう。
本発明における過酸化水素?含む試料とは、過酸化水素
自体、または生体試料、例えば血液またけ尿中の成分、
例えば尿酸、コレステロール、グルコース、クレアチニ
ン、ポリアミン等から生成した過酸化水素を含む試料金
いう。
本発明において使用する被酸化性の非螢光物質としては
ロイコフルオレセイン(フルオレシン入2.7−シクロ
ロフルオレシンージアセテートなどがある。非螢光物質
の使用量は一般に0.001〜5mMである。
本発明において使用する酸化触媒としては、ペルオキシ
ダーゼ、ミクロペルオキシダーゼ、ヘミン、へ1チンな
どがある。酸化触媒の使用量は一般に1〜100単位で
ある。
本発明において使用する蓚酸ジエステル類としては、ビ
ス(2,4,6−)リクロロフェニル)オキザレート(
以下TCPOと略記する)、ビス(2,4−ジニトロフ
ェニル)オキザレートなどがある。
蓚酸ジエステル類の使用量は一般に0.1〜50mMで
ある。
本発明の酸化触媒の阻害剤としては、シアン化カリウム
、シアン化ナトリウム、ナトリウムアジド、スルフフィ
ト、フルオライド、フェロシアナイド、ヒドロキシフェ
ニルヒドラジン、213 Vメルカプトプロパツール、
酢酸エチル、アセトニトリル、エタノール、アセトンな
トカある。
本発明では第1反応を水系で行なうことが必要である。
この反応は通常約20〜40℃、pH5〜9で行なう。
第1反応終了後、酸化触媒は阻害されなければならない
。失活されない酸化触媒が存在していると第2反応にお
いて、改めて加えられた過酸化水素と残存する非螢光物
質が反応して、過剰量の螢光物質を生成してしまう。第
1反応系には10−6〜10”−’Mのシクロデキスト
リンを添加すると、非螢光物質の安定化ならびに生成し
た螢光物質の発光性の増加が見られる。
また本発明では酸化触媒(ペルオキシダーゼ)存在下に
、非螢光物質(ロイコフルオレセイン)の酸化を防ぐた
めに、硫酸亜鉛、・7水和物を望ましくは約0.04 
q/−終濃度になるように、第1反応系に添加すること
が好ましい。
本発明の第2反応は水を含む有機溶媒中で行なう。有機
溶媒としては、例えば酢酸エチル、アセトン、アセトニ
トリルなどが挙げられる。有機溶媒は単独でもあるいF
12種以上の混合物であってもよい。第2反応は通常約
20〜40℃、アルカリ性下、pH8〜12で行なう。
第2反応系に添刀口する過酸化水素の量は一般に0.1
〜50mMである。
第2反応系で生じた発光活性は通常の測定法に従って測
定する。例えばピークの発光量をルミフォトメーターT
D4000 (ラボザイエンス社製〕にてカウントする
。発光活性では発光値は常に反応の時間あたりで表現さ
れるため、その1ま反応速度を表現している。
本発明では生体試料の妨害を受けることなく、化学発光
法により過酸化水素を高感度に定量することができる。
従来の知見ではビス(2,4,6−)リクロロフェニル
〕オキザレートと螢光物質による過酸化水素の足置性は
感度が悪く、通常10〜10”−’M以上でないと検出
されない。ところが本発明では被酸化性の非螢光物質を
選択することで、10−”M−1で過酸化水素を測定す
ることが可能となる。また本発明では第1反応を水系中
で行ない螢光物質を生成するに際し、ペルオキシダーゼ
などの酵素による酸化を行なえば、付随する過酸化水素
・生成系反応、例えばグルコース定量におけるグルコー
スオキシダーゼなどを損うことなく、温和な条件で過酸
化水素、ひいてはグルコースの定量を行なうことができ
る。
本発明では、生体試料中の成分から共存する反応によっ
て生成する微量の過酸化水素を高感度に、特に10−o
〜10−5Mの範囲で測定することが可能である。また
生体成分分析に際して、水系の反応全阻害することなく
、安定な螢光物質を生成させ、かつ生体試料中のカタラ
ーゼなどの妨害により生成した過酸化水素を減じること
なく、真に定量的にかつ高感度に生体成分の分析全行な
うことができる。本発明では特に第2反応が生体試料中
の妨害物質の影響を受けないので、感度の高い発光活性
を得ることができる。
本発明の方法は、試料中の過酸化水素の定置のみならず
、種々の酸化酵素反応を共存させて、生体試料中の種々
の成分、例えば尿酸、コレステロール、クレアチニン、
ポリアミン等の微量成分の定量を行なうことができる。
次に本発明ヲ災施例により説明する。
実施例1 バイヤルに0.1−の濃度既知の過酸化水素、0.1−
の10単位/−のペルオキシダーゼ、0.1−のo、2
岬/ meの硫酸亜鉛拳7水和物、0.2−のh澗フル
オレシンを加えた25mMのリン酸緩衝液を加え、25
℃で5分間反応させた。反応後、直ちに混合溶媒(酢酸
エチルニホウ酸緩衝液ニア七トニトリル=1:1:8、
容量比)に、2mM過酸化水素、40 mMホウ酸緩衝
液(pH10,5)、0.5mMTCPOを溶解させた
溶液0.5−を加えた。次いで3秒後、発光強度全測定
した。その結果を第1図に示す。図中、縦軸は発光強度
(相対値)、横軸は過酸化水素濃度(M)k示す。
第1図から明らかなように、10−@M〜10−@Mの
過酸化水素の定量が可能である。
参考例1 混合溶媒(酢酸エチルニホウ酸緩衝g、ニアセトニトリ
ル=1:1:8、容量比ンに、2mM過酸化水素、40
mMホウ酸緩衝液(pH10,5)、0.5mM TC
POおよび0.A%の8−アニリノナフタレンスルホン
酸および種々の濃度の血清を添加した。3秒後に発光強
度を測定した。その結果を第2図に示す。図中、縦軸は
発光強度(相対値)、横軸は血清濃度(希釈率)を示す
第2図から明らかなように、蓚酸ジエステル類(TCP
O)と螢光物質(8−アニリノナフタレンスルホン酸)
による過酸化水素の反応では、発光活性は1/100容
以下の濃度の血清量まで影響を受けない。この1/10
0容の血清貴社通常の臨床検査に用いる試料として十分
である。このことは蓚酸ジエステルと螢光物質と過酸化
水素との反応による発光が血清中の成分から生成する過
酸化水素の定量において、好筐しい化学発光分析法でお
ることを示している。
【図面の簡単な説明】
第1図は本発明方法による過酸化水素濃度(M)と発光
強度(相対値)との関係會示す。 第2図は本発明の第2反応における血清濃度(希釈率)
と発光強度(相対値)との関係を示す。 特許出願人 東洋紡績株式会社 第111ffl 過−齢化水素(M) 第21!1 手続補正書(自発) 1、 事件の表示 昭和59年特許願第56710号 2 発明の名称 化学発光法による過酸化水素の定量法 a 補正をする者 事件との関係 特許出願人 大阪市北区党島況二丁目2番8号 明和1書の「発明の詳細な説明」の柵 5 補正の内容 (1) 明細書第4頁第11〜12行目〆 y□ ”t ゛・ [ジアセテートなどがある。」の次に「これらの化合物
の他にもロイコローダミン、IJイコエオシンなどの還
元型が酸化されることにより発螢光する群とホモバニリ
ン酸、p−クレゾール、3−(f)−ヒドロキシフェニ
ル)プロピオン酸、ヂラミンなどの過酸化水素の存在下
に酸化縮合して発螢光するn′tなどがある。Jを挿入
する。 (2) 同第9頁第6行目と第7行目との間に、次の実
施例2および実施例3をl+17入する。 「実施例 λ バイヤルに0.4m Qの脱イオン水にといた10mM
p−クレゾールを加えたあと2.6m[の25mMリン
酸バッフy f)I−17,0を加える。これに1mQ
の5 U / m uペルオキシダーゼを1−記バッフ
ァーにといて加え、各濃度に希釈したII、 O。 をザンプルとして加え、1時間30°Cでインキュベー
トする。かくして発螢光した溶1ff10.5m9に0
.5m Qの0.Im M T CP O+0.4m 
M Il、 O,をアセトニトリル中で混合した溶液を
注射器を使つて注入し、25℃にてその発光のピークを
カウントする。こうして得られた発光活性を測定しよう
とした1120え濃度に対してプロットし、5XIO−
7M−10−’Mの範囲で直線をえた。 上記の反応は、p−クレゾールの酸化綜合による発螢光
物質のT CP O+ Il、 0.を添加した時の発
光反応に基づいている。 実施例 a

Claims (1)

    【特許請求の範囲】
  1. 過酸化水素ケ含む試料に、酸化触媒を介して被酸化性の
    非螢光物質ケ反応させて、非螢光物質を螢光物質に転換
    させ、次いで酸化触媒の阻害条件下に該螢光物質を修酸
    ジエステル類および過酸化水素と反応させ、生成する発
    光f#ヲ測定することにより、試料中の過酸化水素を定
    量することを特徴とする化学発光法による過酸化水素の
    定量法。
JP59056719A 1984-03-21 1984-03-24 化学発光法による過酸化水素の定量法 Granted JPS60200167A (ja)

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